CN113166434A - 交联透明质酸、透明质酸水凝胶及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种粉末状交联透明质酸和其制备方法，以及利用所述粉末状交联透明质酸制备的交联的透明质酸水凝胶和其制备方法。根据本发明的所述交联的透明质酸水凝胶显示出优异的流变性质，并且便于批量生产且具有优异的质量一致性。

Description

交联透明质酸、透明质酸水凝胶及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种交联透明质酸、透明质酸水凝胶及其制备方法。

背景技术

透明质酸是生物聚合物材料，其包括由N-乙酰基-D-葡糖胺和D-葡糖醛酸组成的重复单元的线性连接，并且已知其在动物胎盘、眼球中的玻璃体液、关节的滑液或鸡冠等中普遍存在。另外，已知透明质酸通过链球菌属微生物(例如，马疫链球菌(Streptococcusequi)、兽疫链球菌(Streptococcus zooepidemicus)或葡萄球菌属(Staphylococcus spp)微生物的发酵产生。

是一种交联透明质酸注射剂，仅一次注射就可以维持6个月的效果，目前在美国市售。

包括通过用含有福尔马林的水溶液从鸡冠中提取透明质酸而得到的交联透明质酸，由于与透明质酸连接的蛋白质经福尔马林轻度交联，其具有低粘弹性(专利文献1)。所述轻度交联的透明质酸与交联透明质酸组合，从而制备具有用于人体关节腔适当的粘弹性的交联透明质酸的组合

其中，所述交联透明质酸进一步经交联剂二乙烯基砜(DVS)而进一步交联，因此具有增强的粘弹性。

但是，现有交联透明质酸无法过滤，因此去除凝胶里含有的异物需要投入诸多努力，并且为了洗涤交联剂需要大量的洗涤缓冲液。另外进一步地，在通过每批制备配置制备出的透明质酸的粘弹性等流变性质方面，现有交联透明质酸具有极大的差距，因此其质量一致性存在许多问题。因此，存在质量控制不易，批量生产需要复杂的工序且花费大量费用的问题。

现有技术文献

专利文献

(专利文献1)美国专利号4,713,448

(专利文献2)韩国专利公开号10-2017-0090965

发明内容

技术问题

本发明一方面涉及一种节省费用且适合批量生产的粉末状交联透明质酸的制备方法。

本发明另一方面涉及一种粉末状交联透明质酸，其节省费用且适合批量生产。

本发明另一个方面涉及一种显示出优异的流变性质且具有优异的质量一致性的交联的透明质酸水凝胶的制备方法。

本发明另一个方面涉及一种交联的透明质酸水凝胶，其显示出优异的流变性质且具有优异的质量一致性。

技术方案

本发明提供一种节省费用且适合批量生产的粉末状交联透明质酸的制备方法。

本发明中所述粉末状交联透明质酸的制备方法包括：

制备水溶液，所述水溶液包括透明质酸、其盐或它们的混合物；

将交联剂添加至所述水溶液中，从而使透明质酸进行交联反应；

将乙醇添加至所述水溶液中，从而使透明质酸固化成颗粒。

在一具体实施方式中，所述交联反应可以是将交联剂添加至包括透明质酸、其盐或它们混合物的水溶液中后，在10℃至40℃，例如在25℃至35℃下，2至8小时，例如在4至6小时，以50至350rpm，例如以150至350rpm，例如以250rpm进行搅拌，从而使其交联的反应。

在本发明的所述方法中，将乙醇添加至所述水溶液中时，所述乙醇的添加速率可以是20mL/min至1000mL/min。

在本发明的所述方法中，将乙醇添加至所述水溶液中的过程中，相对于混合液总体积的乙醇的体积变化速率可以是0.5％(v/v)/min至35％(v/v)/min。

在本发明的一些实施例中，基于1g透明质酸、其盐或它们的混合物，所述水溶液可以包括10μl至500μl的交联剂。

在本发明的一些实施例中，所述水溶液和添加至所述水溶液中的乙醇的体积比例可以是1：1至10。

在本发明的一些实施例中，可以进一步包括使包括透明质酸颗粒的水溶液进行交联反应的步骤。所述步骤可以是通过添加至水溶液中的交联剂而持续交联反应的步骤。在所述步骤中，包括透明质酸颗粒的水溶液可以与水溶液中反应后剩余的交联剂进一步进行交联反应。

在一具体实施方式中，所述进一步的交联反应可以是将包括透明质酸颗粒的水溶液在15至30℃，例如在25℃下24小时及其以内以50至350rpm，例如以250rpm进行搅拌，从而使其交联的反应。在所述进一步的交联反应中的搅拌速率，可以与添加乙醇前的交联反应中的搅拌速率相同。

在本发明的一些实施例中，可以进一步包括利用乙醇或包括乙醇的溶液洗涤所述通过交联反应后固化为透明质酸颗粒而获得的交联透明质酸，或所述通过进一步与水溶液中剩余的交联剂进行交联反应而获得的交联透明质酸。

在本发明的一些实施例中，所述粉末状交联透明质酸可以显示出D90为小于或等于80μm的粒度分布。

在本发明的一些实施例中，所述粉末状交联透明质酸可以显示出D10为2.5μm至6μm，D50为8μm至20μm以及D90为25μm至80μm的粒度分布。

本发明提供一种通过上述方法来制备的粉末状交联透明质酸。

在本发明的一些实施例中，所述交联透明质酸可以显示出与市售商品，例如，与

相似的粘弹性、至少同等的稳定性以及至少同等的修饰度(MoD，Degree ofModification)。在本发明的一些实施例中，所述交联透明质酸相比于天然透明质酸(HA)或

可以显示出悬垂修饰度(pendant MoD)(％)、交联修饰度(crosslink MoD)(％)以及总修饰度(total MoD)(％)的增加。

在本发明的一些实施例中，可以通过HPLC系统来分析透明质酸(HA)的修饰度(MoD，Degree of Modification)。在所述分析方法中，作为多糖类(polysaccharide)的HA(葡糖醛酸与N-乙酰-D-氨基葡萄糖的重复结构)被透明质酸酶(hyaluronidase)分解，从而形成更小的聚合物，并且经交联剂修饰的HA和未修饰的HA可以通过比较色谱图差异和修饰度来进行区分。在所述分析方法中，在pH5.0、36℃条件下利用透明质酸酶(通过Streptomyces hyalurolyticus获得的透明质酸酶)分解透明质酸(HA)后，利用DionexCarboPac PA100(Thermo Scientific)HPLC柱在UV吸光度(232nm)下测量分解的糖单位。透明质酸被酶完全分解后变为四聚体(Tetramer)和六聚体(Hexamer)，并且交联的透明质酸分离为略大于四聚体和六聚体的糖单位，和及其以上的低聚物(Oligomer)等而显示色谱图。可以通过每个色谱图的面积来求得修饰度(MoD)，八聚体(Octamer)及其以上低聚物的峰(peak)可以通过交联修饰度(crosslink MoD)(％)来区分，除四聚体和六聚体主峰(mainpeak)外的小于八聚体的低聚物的峰可以通过悬垂修饰度(pendant MoD)(％)来区分，并且二者之和可用作总修饰度(total MoD)(％)。

产生的交联反应越多，交联透明质酸就可能显示出修饰度的增加，并且通过过多的交联反应而制备的透明质酸可能形成为无法吸收充分的水的结构。在本发明的一些实施例中，所述交联透明质酸可以显示出0.1％至10％的总修饰度。另外，满足所述修饰度的交联透明质酸具有可以吸收充分的水的结构，并显示出能够表现出充分的水合作用的粘弹性值。

本发明提供一种交联的透明质酸水凝胶的制备方法，其显示出优异的流变性质且具有优异的质量一致性。

本发明中所述交联的透明质酸水凝胶的制备方法包括：

制备水溶液，所述水溶液包括透明质酸、其盐或它们的混合物；

将交联剂添加至所述水溶液中，从而使透明质酸进行交联反应；以及

将乙醇添加至所述水溶液中，从而使透明质酸固化成颗粒；

持续所述包括透明质酸颗粒的水溶液的交联反应，从而制备粉末状交联透明质酸；以及

将所述制备的粉末状交联透明质酸进行水合。

在本发明的所述方法中，将所述乙醇添加至所述水溶液中时，乙醇的添加速率可以是20mL/min至1000mL/min。

在本发明的所述方法中，将所述乙醇添加至所述水溶液中的过程中，相对于混合液总体积的乙醇的体积浓度变化速率可以是0.5％(v/v)/min至35％(v/v)/min。

在本发明的一些实施例中，所述进行水合的步骤可以是将所述粉末状交联透明质酸添加至水或包括水的溶液中的步骤。

在本发明的一些实施例中，所述粉末状交联透明质酸可以基于1mL的水或包括水的溶液，以5mg至15mg的量添加。

在本发明的一些实施例中，所述交联的透明质酸水凝胶可以显示出D90为小于或等于240μm的粒度分布。

在本发明的一些实施例中，所述交联的透明质酸水凝胶可以显示出D10为25μm至40μm，D50为70μm至110μm以及D90为190μm至240μm的粒度分布。

在本发明的一些实施例中，所述方法可以进一步包括使用过滤器来过滤所述交联的透明质酸水凝胶。

在本发明的一些实施例中，所述过滤后的交联的透明质酸水凝胶可以显示出D90为小于或等于120μm的粒度分布。

在本发明的一些实施例中，所述过滤后的交联的透明质酸水凝胶可以显示出D10为10μm至30μm，D50为35μm至65μm以及D90为80μm至120μm的粒度分布。

本发明提供一种通过上述方法制备的交联的透明质酸水凝胶。

在本发明的一些实施例中，所述交联的透明质酸水凝胶的弹性可以是30至200Pa，其粘性可以是10至100Pa。

本发明提供一种无定形的交联的透明质酸水凝胶。所述透明质酸水凝胶的X射线粉末衍射图谱(XRD)可以如图5。

在本发明的一些实施例中，所述透明质酸水凝胶可以显示出D90为小于或等于120μm的粒度分布。

在本发明的一些实施例中，所述透明质酸水凝胶的力度分布可以是D10为10μm至30μm，D50为35μm至65μm以及D90为80μm至120μm。

在本发明的一些实施例中，所述交联的透明质酸水凝胶的弹性可以是30至200Pa，其粘性可以是10至100Pa。

在本发明的一些实施例中，所述交联的透明质酸水凝胶的弹性可以是100至150Pa，其粘性可以是10至60Pa。

在本发明的一些实施例中，所述交联的透明质酸水凝胶在25℃下保存8个月时，其弹性减少率可以小于或等于30％。在本发明的一些实施例中，所述交联的透明质酸水凝胶在30℃下保存8个月时，其弹性减少率可以小于或等于25％。在本发明的一些实施例中，所述交联的透明质酸水凝胶在40℃下保存8个月时，其弹性减少率可以小于或等于40％。在本发明的一些实施例中，所述交联的透明质酸水凝胶在60℃下保存8个月时，其弹性减少率可以小于或等于90％。

在本发明的一些实施例中，所述交联的透明质酸水凝胶在25℃下保存8个月时，其粘性减少率可以小于或等于35％。在本发明的一些实施例中，所述交联的透明质酸水凝胶在30℃下保存8个月时，其粘性减少率可以小于或等于20％。在本发明的一些实施例中，所述交联的透明质酸水凝胶在40℃下保存8个月时，其粘性减少率可以小于或等于18％。在本发明的一些实施例中，所述交联的透明质酸水凝胶在60℃下保存8个月时，其粘性减少率可以小于或等于50％。

由于温度、酶等因素，透明质酸的聚合物链被分解和减少，从而其粘弹性和流变性质(Rheological properties)降低，随之其粘性补充(Viscosupplementation)性能可能降低。相比与此，交联的透明质酸具有改善的抗分解性，因此与非交联的透明质酸相比，其在体内的维持时间可以得到提高。在本发明的一些实施例中，所述交联的透明质酸水凝胶与透明质酸相比，其抗分解性可以得到提高，并且与非交联的透明质酸相比，其抗分解性可以得到提高。

有益效果

本发明中粉末状交联透明质酸具有均匀的交联度，且可以用少量的洗涤液容易地进行洗涤，并具有优异的质量一致性。另外，利用所述粉末状交联透明质酸来制备的交联的透明质酸水凝胶，可以使用具有小孔径的过滤器来容易地去除异物，并且具有优异的质量一致性。因此，根据本发明的粉末状交联透明质酸以及利用所述粉末状交联透明质酸来制备的交联的透明质酸水凝胶，适合批量生产且节省费用。

附图说明

图1是显示作为原料物质的透明质酸钠和根据实施例1-1至1-3的粉末状交联透明质酸的粒度分布图。在所述图1中，纵轴表示体积密度(volume density)(％)，横轴表示粒度(μm)。

图2是显示根据实施例6和实施例10的交联的透明质酸水凝胶的粒度分布图。在所述图2中，纵轴表示通道(Channel)(％)，横轴表示粒度(μm)。

图3是显示根据实施例2的粉末状交联透明质酸的X射线粉末衍射分析结果的图。在图3中，纵轴表示强度(cps)，横轴表示2θ(°)。

图4是显示根据实施例6的交联的透明质酸水凝胶的X射线粉末衍射分析结果的图。在图4中，纵轴表示强度(cps)，横轴表示2θ(°)。

图5是显示根据实施例10的过滤后的交联的透明质酸水凝胶的X射线粉末衍射分析结果的图。在图5中，纵轴表示强度(cps)，横轴表示2θ(°)。

图6显示对根据实施例12的透明质酸水凝胶，测量随时间和温度变化的弹性(Pa，在2.5Hz、25℃下)。

图7显示对根据实施例12的透明质酸水凝胶，测量随时间和温度变化的粘性(Pa，在2.5Hz、25℃下)。

图8显示对根据实施例13的透明质酸水凝胶，测量随时间和温度变化的弹性(Pa，在2.5Hz、25℃下)。

图9显示对根据实施例13的透明质酸水凝胶，测量随时间和温度变化的粘性(Pa，在2.5Hz、25℃下)。

图10显示针对对比产品

测量随时间和温度变化的弹性(Pa，在2.5Hz、25℃下)。

图11显示针对对比产品

测量随时间和温度变化的粘性(Pa，在2.5Hz、25℃下)。

具体实施方式

以下对本发明进行详细说明。

本发明中的所有技术术语具有与本发明所属领域的技术人员所通常理解的含义相同的含义，除非另外定义。另外，虽然本说明书中列出了最佳的方法或测试样品，但是与此类似或等同的方法或测试样品也包括在本发明的范畴之内。本说明书中作为参考文献的所有出版物的全部内容，作为参考整体并入本说明书中。

在本说明书中，当DX为Y时是指，将粉末状的透明质酸、透明质酸凝胶或交联的透明质酸水凝胶的粒度由累积曲线表示时，以粒度的升序累积后，X％(％基于数、体积或重量计算)所在的点的粒度为Y。例如，D10是指，将粉末状的透明质酸、透明质酸凝胶或交联的透明质酸水凝胶的粒度以升序累积后10％所在的点的粒度，D50是指，将粉末状的透明质酸、透明质酸凝胶或交联的透明质酸水凝胶的粒度以升序累积后50％所在的点的粒度，D90是指，将粉末状的透明质酸、透明质酸凝胶或交联的透明质酸水凝胶的粒度以升序累积后90％所在的点的粒度。

粒度分布DX基于数、体积或重量中的哪一项来显示在总累积粒子中的百分比，根据用于测量粒度分布的方法而不同。测量粒度分布的方法以及与其相关的％类型，在所述领域的技术人员中为已知。例如，当用已知的激光衍射法测量粒度分布时，DX中的X值可以表示根据体积平均计算的百分比。所述领域的技术人员已知，通过特定方法所得到的粒度分布测量结果可能与以基于通过常规实验的经验从其它技术得到的结果具有相关性。例如，激光衍射法通过对粒子的体积产生反应来提供体积平均粒度，当密度恒定时，其对应于重量平均粒度。

本说明书中的粘弹性是指储能模量(storage modulus，G’)和损耗模量(lossmodulus，G”)。所述粘弹性通过旋转型流变仪测量，动态粘弹性通过直径为20mm的几何形状(Geometry)测量，并且几何形状和板(Plate)之间的测量间隙(GAP)为0.5mm，温度保持恒定在25℃直至分析结束，使用控制程序(control program)以利用频率振荡(frequencyoscillation)，并将频率范围设置在0.1至10Hz后，测量储能模量和损耗模量。在本说明书中，储能模量G’可以用弹性来表示，损耗模量G"可以用粘性来表示损失的能量。

本发明中的粉末状交联透明质酸的制备方法包括：

制备水溶液，所述水溶液包括透明质酸、其盐或它们的混合物；

将交联剂添加至所述水溶液中，从而使透明质酸进行交联反应；以及

将乙醇添加至所述水溶液中，从而使透明质酸固化成颗粒。

在所述方法中，将乙醇添加至水溶液中时，所述乙醇在一段时间内缓慢添加。

根据本发明的制备方法，因在一段时间内将乙醇缓慢添加至水溶液，所以形成具有均匀粒度的细颗粒状的固体透明质酸，并且所述固态透明质酸颗粒与交联剂反应，从而进行均匀的交联反应。由此，可以形成交联度均匀的粉末状交联透明质酸，并且可以在每个制备工序中获得具有粉末程度的细粒度，同时粒度、粘性以及弹性等物理性质适当且均匀的交联透明质酸。结果，可以再现性地重复批量生产具有能够显出最佳效果的粒度、粘性以及弹性的交联透明质酸。

可以调节将乙醇添加至所述水溶液中的速率，使得通过添加乙醇而形成的固体透明质酸以颗粒形式形成。具体地，可以通过调节基于所述乙醇添加速率的总反应液的乙醇浓度变化率，制备出具有所需的固体透明质酸粒度和物理性质的交联透明质酸。

在本发明的一些实施例中，所述制备包括透明质酸、其盐或它们混合物的水溶液的步骤，可以通过将所述透明质酸、其盐或它们的混合物添加至包括碱性物质的碱性水溶液中来制备。

在本说明书中，所述透明质酸可以是指透明质酸本身，透明质酸的盐或它们的混合物。因此，包括透明质酸的水溶液可以是指，包括透明质酸、其盐或它们的混合物的水溶液。另外，透明质酸颗粒可以是指利用透明质酸、其盐或它们的混合物而形成的颗粒。

所述透明质酸的盐可以是适用于生物体的任意盐形式，具体地可以是碱盐、碱土金属盐、氨基酸盐、与有机碱形成的盐或它们的混合物。例如，透明质酸的盐可以选自由透明质酸钠、透明质酸钙、透明质酸钾、透明质酸镁、透明质酸锌、透明质酸钴、透明质酸四丁基铵盐、透明质酸二乙醇胺、透明质酸环己胺以及它们任意组成的组合。在一具体实施方式中，所述透明质酸的盐可以是透明质酸钠。

所述透明质酸或其盐的分子量可以是约100000Da至约6000000Da，并且在一具体实施方式中，所述透明质酸或透明质酸钠的分子量可以是约100000Da至约6000000Da，具体地可以是约500000Da至约6000000Da，更具体地可以是约1000000Da至约4000000Da。

所述透明质酸包括所属领域已知的任意透明质酸，并且可以利用从任意材料得到的透明质酸。所述透明质酸可以是来源于动物(例如，动物胎盘、鸡冠)，发酵时产生透明质酸的任意微生物(例如，葡萄球菌属(Staphylococcus)微生物、链球菌属(Streptococcus)微生物)的透明质酸。

在一具体实施方式中，所述透明质酸是微生物来源的透明质酸，例如，链球菌属(Streptococcus)微生物来源的透明质酸。微生物来源透明质酸可以不受限于动物来源透明质酸中的病毒或材料质量一致性问题，因此作为药物来制备时，在质量控制方面具有良好的优点。

包括透明质酸、其盐或它们的混合物的水溶液可以是，包括已知能够用于制备交联透明质酸的任意碱性物质的碱性水溶液。例如，所述碱性水溶液可以是pH9至13的碱性水溶液，所述碱性水溶液可以是含有氢氧化钠的水溶液、含有氢氧化钾的水溶液或含有氨的水溶液，并且在一具体实施方式中，所述碱性水溶液可以是含有氢氧化钠的水溶液。

在本发明的一些实施例中，包括透明质酸、其盐或它们混合物的水溶液可以包括，基于总体积的约0.5％(w/v)至5％(w/v)的透明质酸、其盐或它们的混合物，具体地，可以包括约1％(w/v)至4％(w/v)的透明质酸、其盐或它们的混合物。在一具体实施方式中，包括所述透明质酸、其盐或它们混合物的水溶液可以包括约2％(w/v)的透明质酸钠。

在本发明的一些实施例中，当所述水溶液将氢氧化钠作为碱性材料而包括在其中，并通过添加透明质酸钠来制备时，所述水溶液可以包括0.2M及其以上的钠离子。

在本发明的一些实施例中，所述水溶液可以进一步包括交联剂。所述交联剂可以是具有一个或多个官能团的化合物，具体地，可以是具有至少一个醛基、碳二亚胺、环氧基或乙烯基砜基的化合物。更具体地，所述交联剂可以是具有两个及其以上环氧基的化合物或二乙烯基砜。例如，所述交联剂可以是1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDCI·HCl)、1-环己基-3-(2-吗啉基乙基)碳二亚胺对甲苯磺酸盐、1-环己基-3-(2-吗啉基乙基)碳二亚胺盐酸盐、戊二醛、二乙烯基砜(divinyl sulfone)、丁二醇二缩水甘油醚(1,4-butanediol diglycidyl ether：BDDE)、乙二醇二缩水甘油醚(ethylene glycoldiglycidyl ether：EGDGE)、1,6-己二醇二缩水甘油醚(1,6-hexanediol diglycidylether)、丙二醇二缩水甘油醚(propylene glycol diglycidyl ether)、聚丙二醇二缩水甘油醚(polypropylene glycol diglycidyl ether)、聚丁二醇二缩水甘油醚(polytetramethylene glycol diglycidyl ether)、新戊二醇二缩水甘油醚(neopentylglycol diglycidyl ether)、聚甘油聚缩水甘油醚(polyglycerol polyglycidyl ether)、二甘油聚缩水甘油醚(diglycerol polyglycidyl ether)、甘油聚缩水甘油醚(glycerolpolyglycidyl ether)、三羟甲基丙烷聚缩水甘油醚(tri-methylpropane polyglycidylether)、1，2-(双(2,3-环氧丙氧基)乙稀(1,2-(bis(2,3-epoxypropoxy)ethylene)、季戊四醇聚缩水甘油基醚(pentaerythritol polyglycidyl ether)、山梨糖醇聚缩水甘油基醚(sorbitol polyglycidyl ether)或它们的混合物，在一实施方案中，所述交联剂可以是丁二醇二缩水甘油醚、二乙烯基砜或它们的混合物。一实施方案中，所述交联剂可以是丁二醇二缩水甘油醚(BDDE)。在一实施方案中，所述交联剂可以是二乙烯基砜(DVS)。

在本发明的一些实施例中，基于1摩尔的透明质酸、透明质酸的盐或它们的混合物，所述水溶液可以包括0.005摩尔至1摩尔的交联剂，具体地可以包括0.01摩尔至0.8摩尔的交联剂。

在本发明的一些实施例中，基于1g的透明质酸、其盐或它们的混合物，所述水溶液可以包括10μl至500μl的交联剂，具体地可以包括50μl至400μl的交联剂。

在本发明的一些实施例中，在通过将乙醇添加至所述水溶液中来制备包括固体透明质酸颗粒的混合液的步骤中，基于1体积的包括透明质酸、其盐或它们混合物的水溶液，所述乙醇可以约1至约10体积来添加。具体地，当制备所述混合液时，所述水溶液与添加的乙醇体积比例可以是1：1至10，更具体地可以是约1：2至8。通过以所述范围添加乙醇，使用所述固体形式透明质酸颗粒制备的透明质酸凝胶可以显示出优异的流变性质，并且可以在预防或治疗关节炎方面显示出优异的效果。

在本发明的一些实施例中，将乙醇添加至所述包括透明质酸、其盐或它们混合物的水溶液中时，乙醇的添加速率可以是恒定的或可变的。具体地，乙醇的添加速率可以是恒定的。

在本发明的一些实施例中，在将乙醇添加至所述包括透明质酸、其盐或它们混合物的水溶液中的处理过程中，可以不间断地搅拌所述水溶液和乙醇的混合液。具体地，在所述添加乙醇的处理过程中，混合液可以约50rpm至300rpm，更具体地，可以约50rpm至250rpm搅拌。

在本发明的一些实施例中，所述混合液的搅拌速率可以是恒定的或可变的。具体地，所述混合液的搅拌速率可以是恒定的。

在本发明的一些实施例中，将乙醇添加至所述水溶液中时，所述乙醇可以在一段时间内缓慢添加。透明质酸是线型聚合物，其具有被乙醇脱水后提取为线(线团)形式的性质。具体地，可以将乙醇缓慢地添加至所述水溶液中，使得不形成纤维状(线团)的透明质酸固体或块形式的透明质酸固体。更具体地，可以将乙醇缓慢地添加至水溶液中，使得透明质酸以诸如粉末之类的细颗粒形式沉淀。当所述乙醇的添加速率超过以下范围时，会提取为纤维状透明质酸，因而在洗涤时无法调节pH，因此不容易洗涤，并且最终生成的物质可能会褐变，或因粘弹性变低而成为液态。将乙醇添加至所述水溶液中时，所述乙醇的添加速率可以是约20mL/min至1000mL/min。具体地，所述乙醇的添加速率可以是约20mL/min至700mL/min，更具体地，所述乙醇的添加速率可以是约20mL/min至500mL/min。当以所述速率添加乙醇时，透明质酸不会结块，并且可以诸如粉末之类的细颗粒形式沉淀。

在本发明的一些实施例中，当添加所述乙醇时，相对于含有透明质酸的水溶液和包括乙醇的混合液的体积，乙醇的体积变化速率可以是约0.5％(v/v)/min至35％(v/v)/min。

如上所述，当乙醇在一段时间内缓慢添加时，透明质酸颗粒可以均匀的细颗粒形式沉淀。

另外，以均匀的细颗粒形式获得的透明质酸在交联反应之后，可以用乙醇或包括乙醇的溶液洗涤，并且在洗涤的过程中粉末状交联透明质酸能够几乎不出现溶胀现象或使其最小化。因此，当洗涤交联剂或杂质时，用少量的洗涤液就可以充分洗涤，并且因为可以提高交联透明质酸的物理性质均匀性，所以能够批量生产且节省费用。

在本发明的一些实施例中，可以通过所述固体透明质酸颗粒与交联剂反应来进行交联反应，并且可以通过所述交联反应形成细颗粒的粉末状交联透明质酸。所述细颗粒的粉末状交联透明质酸可以具有均匀的粒度且显示出均匀的交联度。

在本发明的一些实施例中，所述固态透明质酸颗粒和所述交联剂的交联反应可以在约20至40℃下进行约6至24小时。在所述反应条件下，由于可以使透明质酸的分解最小化，因此可以形成具有长链长的交联透明质酸。另外，可以形成显示出适合关节炎治疗的交联度且具有优异的物理性质的交联透明质酸。

在本发明的一些实施例中，细粉末形式的交联透明质酸的D90可以小于或等于80μm。

在本发明的一些实施例中，所述均匀的细粉末形式交联透明质酸的D10可以是约2.5μm至6μm，D50可以是约8μm至20μm，D90可以是约25μm至80μm。

在本发明的一些实施例中，所述细粉末形式交联透明质酸的粒度可以通过激光粒度分析法来测量，具体地，可以通过干法来进行。

在本发明的一些实施例中，所述粉末状交联透明质酸可以是无定形的，并且X射线粉末衍射分析图谱可以显示出晕圈(Halo)图谱。具体地，所述粉末状交联透明质酸的X射线粉末衍射图谱(XRD)可以如图3。

在本发明的一些实施例中，所述粉末状交联透明质酸可以是无定形的，并且其粒度的D10可以是约2.5μm至6μm，D50可以是约8μm至20μm，D90可以是约25μm至80μm。

在本发明的一些实施例中，在进行所述交联反应之后，可以将混合液的pH调节至小于9以终止交联反应。例如，在进行所述交联反应之后，可以通过添加盐酸(HCl)将混合液的pH调节至大于或等于6且小于9，终止交联反应。

在本发明的一些实施例中，所述交联反应终止之后，所述细颗粒的粉末状交联透明质酸可以通过过滤获得。即，本发明中的粉末状交联透明质酸具有粉末形式，如果不搅拌会沉入溶液中，因此可以通过简单的过滤处理，将粉末状交联透明质酸容易地分离于液体而获得。

在本发明的一些实施例中，所述方法可以进一步包括洗涤粉末状交联透明质酸。通过所述洗涤，残留在粉末状交联透明质酸中的交联剂和杂质可以被去除。所述洗涤可以使用乙醇或包括乙醇的溶液进行一次或多次，例如，所述洗涤可以使用约70％(w/w)、约95％(w/w)的乙醇水溶液进行数次。例如，所述获得的粉末状交联透明质酸可以通过相互交换约70％(w/w)、约95％(w/w)的乙醇水溶液来进行3次至5次洗涤。

在本发明的一些实施例中，所述洗涤步骤可以在小于pH9的条件下进行，具体地，可以在pH6至小于pH9的条件下进行。

本发明中所述洗涤步骤相比于现有方法，使用的是乙醇或诸如乙醇水溶液之类的包括乙醇的溶液，而不是诸如纯水或磷酸缓冲液之类的水溶液缓冲液，因此可以抑制交联透明质酸在洗涤过程中的溶胀现象，从而便于质量控制，并且因在洗涤过程中几乎不出现溶胀现象或使其最小化，所以能够用少量的洗涤液充分去除交联剂和杂质，从而可以容易地批量生产。

在本发明的一些实施例中，所述方法可以进一步包括洗涤之后干燥所述粉末状交联透明质酸。所述干燥可以是真空干燥，并且可以在约35℃至约70℃下进行约10至40小时。

本发明提供一种粉末状交联透明质酸，其通过以下方法来制备：

制备水溶液，所述水溶液包括透明质酸、其盐或它们的混合物；

将交联剂添加至所述水溶液中，从而使透明质酸进行交联反应；以及

将乙醇添加至所述水溶液中，从而使透明质酸固化成颗粒，

其中，所述乙醇在一段时间内缓慢添加至所述水溶液中。

所述方法可以进一步包括使包括透明质酸颗粒的水溶液进行交联反应。所述步骤可以是使包括透明质酸颗粒的水溶液的交联反应持续的步骤。

通过所述方法来制备的粉末状交联透明质酸易于处理成细颗粒，并且具有均匀的交联度。另外，在洗涤过程中不溶胀且维持诸如粉末之类的细颗粒形式，因此可以容易地洗涤和批量生产。

另外，在洗涤过程中可以容易地洗涤对粉末状交联物的交联剂(例如，NaOH、未反应的BDDE)且可以调节pH，并且随后可以诱导最终凝胶的适当粘弹性，以及可以最小化和抑制根据pH的交联透明质酸的变性，即褐变反应。

本发明中的粉末状交联透明质酸的粒度分布可以显示出D90为约小于或等于80μm的粒度分布。

本发明中的所述均匀的细粉末形式交联透明质酸可以显示出D10为约2.5μm至6μm，D50为约8μm至20μm，D90为约25μm至80μm的粒度分布。

在本发明的一些实施例中，所述细粉末形式交联透明质酸的粒度可以通过激光粒度分析法来测量，具体地，可以通过干法来进行。

本发明中的粉末状交联透明质酸可以是无定形的，并且X射线粉末衍射分析图谱可以显示出晕圈图谱。具体地，所述粉末状交联透明质酸的X射线粉末衍射图谱(XRD)可以如图3。

所述粉末状交联透明质酸的制备方法和所述交联透明质酸的物理性质如以上所述。

本发明提供一种交联的透明质酸水凝胶的制备方法，其显示出优异的流变性质且便于去除异物，以及节省费用且适合批量生产。

本发明中所述交联的透明质酸水凝胶的制备方法包括：

制备水溶液，所述水溶液包括透明质酸、其盐或它们的混合物；

将交联剂添加至所述水溶液中，从而使透明质酸进行交联反应；以及

将乙醇添加至所述水溶液中，从而使透明质酸固化成颗粒；

持续所述包括透明质酸颗粒的水溶液的交联反应，从而制备粉末状交联透明质酸；以及

将所述粉末状交联透明质酸进行水合。

在所述方法中，将乙醇添加至水溶液中时，所述乙醇在一段时间内缓慢添加至所述水溶液中。

所述粉末状交联透明质酸的制备方法和所述交联透明质酸的物理性质如以上所述。

根据本发明的制备方法来制备的交联的透明质酸水凝胶具有适合关节炎的预防或治疗的流变性质。另外，所述交联的透明质酸水凝胶可以用过滤器进行过滤，从而可以容易地去除异物，因此配置成医药品时可以容易地控制杂质，并且在节省费用和批量生产方面具有明显优异的优点。另外，所述交联的透明质酸水凝胶具有优异的质量一致性，并且通过每批配置来制备的交联的透明质酸水凝胶的流变性质几乎相同，因而显示出均匀的物理性质且具有优异的再现性。

在本发明的一些实施例中，所述交联的透明质酸水凝胶的弹性(储能模量，G’)和粘性(损耗模量，G”)显示出适合用作人体滑液补充剂的范围。

所述交联的透明质酸水凝胶可以具有约30至200Pa的弹性和约10至100Pa的粘性，具体地，可以具有约100至150Pa的弹性和约10至60Pa的粘性。本发明中交联的透明质酸水凝胶可以具有约30至200Pa的弹性和约10至100Pa的粘性，并且可以通过过滤器来对其进行过滤处理。

本发明中交联的透明质酸水凝胶可以具有约30至200Pa的弹性，约10至100Pa的粘性以及D90为小于或等于240μm的粒度，更具体地，可以显示出D10为约25μm至40μm，D50为约70μm至110μm，D90为约190μm至240μm的粒度分布，或D10为约10μm至30μm，D50为约35μm至65μm，D90为约80μm至120μm的粒度分布，并且可以通过过滤器来对其进行过滤处理。

在所述交联的透明质酸水凝胶的制备方法中，制备粉末状交联透明质酸的步骤如以上所述。

在本发明的一些实施例中，将所述粉末状交联透明质酸进行水合的步骤可以是将所述粉末状交联透明质酸与水或包括水的溶液进行混合的步骤。其中，所述包括水的溶液可以是缓冲液，具体地，可以是磷酸缓冲液。

所述粉末状交联透明质酸相对于所述水或包括水的溶液，以约5mg/mL至约15mg/mL的浓度添加。当所述粉末状交联透明质酸以上述浓度添加至水或包括水的溶液中时，交联的透明质酸凝胶显示出适合关节炎治疗的粘性和弹性，并且由于显示出可过滤程度的流变特性，因此便于去除异物，随之容易进行质量控制，并且可以在填充注射器时显示出适当的注射压力。

在本发明的一些实施例中，所述方法可以进一步包括均化所述交联的透明质酸水凝胶。所述均化可以使用均质机进行，所述交联的透明质酸水凝胶可以利用均质机以约小于或等于7000rpm，例如，以约2000至约7000rpm被均化约3分钟至约20分钟。

在本发明的一些实施例中，所述方法可以进一步包括利用具有约5μm至30μm孔径(pore size)的过滤器来过滤交联的透明质酸水凝胶。所述交联的透明质酸水凝胶可以通过具有小孔的过滤器来进行过滤，以容易地从透明质酸水凝胶去除异物，从而便于质量控制，且降低异物混入所带来的危险性，并且保持水凝胶的物理性质不变，从而使粒度和粒度分布的均匀性得到提升，因此可以显示出质量的大幅提高。

在本发明的一些实施例中，所述利用过滤器的过滤可以在减压状态或真空状态下进行，具体地，可以在约80kPa至20kPa的压力下进行。

在本发明的一些实施例中，所述利用过滤器的过滤可以进行一次或多次，具体地，可以进行一次或两次。即使利用过滤器的过滤处理次数增加，透明质酸水凝胶的性质也可以维持，并且粒度有可能减少。

在本发明的一些实施例中，在进行所述利用过滤器的过滤处理之前，透明质酸水凝胶可以显示出D90为约小于或等于240μm的粒度分布。

在本发明的一些实施例中，在进行所述利用过滤器的过滤处理之前，透明质酸水凝胶可以显示出D10为约25μm至40μm，D50为约70μm至110μm，D90为约190μm至240μm的粒度分布。

在本发明的一些实施例中，在进行所述利用过滤器的过滤处理之前，交联的透明质酸水凝胶可以是无定形的，并且X射线粉末衍射分析图谱可以显示出晕圈图谱。具体地，所述透明质酸水凝胶的X射线粉末衍射图谱(XRD)可以如图4。

本发明的交联的透明质酸水凝胶中的凝胶为无定形，并且X射线粉末衍射图谱(XRD)如图4，且显示出D90为小于或等于240μm的粒度分布，更具体地，可以显示出D10为约25μm至40μm，D50为约70μm至110μm，D90为约190μm至240μm的粒度分布。可以通过过滤器来对所述交联的透明质酸水凝胶进行过滤处理。

在本发明的一些实施例中，在进行所述利用过滤器的过滤处理之后，交联的透明质酸水凝胶可以显示出D90为约小于或等于120μm的粒度分布。

在本发明的一些实施例中，在进行所述利用过滤器的过滤处理之后，透明质酸水凝胶可以显示出D10为约10μm至30μm，D50为约35μm至65μm，D90为约80μm至120μm的粒度分布。

在本发明的一些实施例中，在进行所述利用过滤器的过滤处理之后，交联的透明质酸水凝胶可以是无定形的，并且X射线粉末衍射分析图谱可以显示出晕圈图谱。具体地，所述透明质酸水凝胶的X射线粉末衍射图谱(XRD)可以如图5。

在本发明的交联的透明质酸水凝胶中，凝胶为无定形，并且X射线粉末衍射图谱(XRD)如图5，且显示出D90为小于或等于120μm的粒度分布，更具体地，可以显示出D10为约10μm至30μm，D50为约35μm至65μm，D90为约80μm至120μm的粒度分布。可以通过过滤器来对所述交联的透明质酸水凝胶进行过滤处理。

在本发明中，所述交联的透明质酸水凝胶的粒度可以是通过激光粒度分析法来测量的。

在本发明中，所述交联的透明质酸水凝胶的粒度可以是通过湿法来测量的。

在本发明的一些实施例中，所述过滤步骤可以在均化步骤之后进行。

在本发明的一些实施例中，所述方法可以进一步包括对所述交联的透明质酸水凝胶进行灭菌。所述灭菌可以在约100℃或更高的温度下进行约10分钟或更长时间，具体地，可以在约121℃或更高的温度下进行约15分钟或更长时间。

在本发明的一些实施例中，所述灭菌可以在将透明质酸水凝胶填充至注射器之前或填充至注射器之后进行，具体地，可以在将所述交联的透明质酸凝胶填充至注射器之后进行。

本发明提供一种粉末状交联透明质酸，

其通过以下方法来制备：

制备水溶液，所述水溶液包括透明质酸、其盐或它们的混合物；

将交联剂添加至所述水溶液中，从而使透明质酸进行交联反应；以及

将乙醇添加至所述水溶液中，从而使透明质酸固化成颗粒；

持续所述包括透明质酸颗粒的水溶液的交联反应，从而制备粉末状交联透明质酸；以及

将所述粉末状交联透明质酸进行水合。

在所述方法中，将乙醇添加至水溶液中时，所述乙醇可以在一段时间内缓慢添加。

所述透明质酸水凝胶具有适合减轻退变性关节炎导致的疼痛以及其预防和治疗的流变性质。另外，所述交联的透明质酸水凝胶可以用具有小孔径的过滤器进行过滤，从而可以容易地去除异物，因此配置成医药品和医疗器械时可以容易地控制杂质，并且在节省费用和批量生产方面具有明显优异的优点。另外，所述交联的透明质酸水凝胶具有优异的质量一致性，并且通过每批配置来制备的交联的透明质酸水凝胶的流变性质几乎相同，因而显示出均匀的物理性质且具有优异的再现性。

本发明中交联的透明质酸水凝胶可以显示出D90为约小于或等于240μm的粒度分布。

本发明中交联的透明质酸水凝胶可以显示出D10为约25μm至40μm，D50为约70μm至110μm，D90为约190μm至240μm的粒度分布。

本发明中交联的透明质酸水凝胶可以是无定形的，并且X射线粉末衍射分析图谱可以显示出晕圈图谱。具体地，所述透明质酸水凝胶的X射线粉末衍射图谱(XRD)可以如图4。

根据本发明的实施例，交联的透明质酸水凝胶可以利用具有约5μm至30μm孔径(pore size)的过滤器来进行过滤。

本发明中过滤后的交联的透明质酸水凝胶可以显示出D90为约小于或等于120μm的粒度分布。

本发明中过滤后的交联的透明质酸水凝胶可以显示出D10为约10μm至30μm，D50为约35μm至65μm，D90为约80μm至120μm的粒度分布。

本发明中过滤后的交联的透明质酸水凝胶可以是无定形的，并且X射线粉末衍射分析图谱可以显示出晕圈图谱。具体地，所述过滤后的交联的透明质酸水凝胶的X射线粉末衍射图谱(XRD)可以如图5。

在本发明中，所述粉末状交联透明质酸颗粒，交联的透明质酸水凝胶的制备方法，粉末状交联透明质酸颗粒的物理性质以及交联的透明质酸水凝胶的物理性质如以上所述。

在本发明的一些实施例中，所述过滤步骤之后获得的透明质酸水凝胶可以具有30至200Pa的弹性和10至100Pa的粘性，具体地，可以具有100至150Pa的弹性和10至60Pa的粘性。

本发明提供一种由所述交联的透明质酸水凝胶填充的注射器。当所述注射器施用于人体时，可以显示出适当的压力，并且由于交联的透明质酸凝胶优异的流变性质，可以在减轻退变性关节炎导致的疼痛以及其预防和治疗方面显示出优异的效果。

[实施例]

下面，将参考以下实施例详细描述本发明，但以下实施例仅用于描述本发明，本发明的范围并不限于这些实施例。

实施例1

实施例1-1

将丁二醇二缩水甘油醚(BDDE)混入0.2至0.3M NaOH水溶液(pH>9)，以制备透明质酸钠(Na-HA，分子量：1.0至4.0MDa)的浓度达到2％(w/v)的反应物。此时，BDDE与透明质酸钠的比例为100μl(BDDE)/1g(HA)。

在室温下搅拌所述反应物以溶解透明质酸钠，从而制备250mL的包括透明质酸钠的水溶液(Na-HA solution)，并在25至35℃下以250rpm搅拌4至6小时，从而使其进行交联反应。将乙醇添加至所述包括透明质酸钠的水溶液中，直至包括透明质酸钠的水溶液和乙醇的体积比例达到1：5，此时为了不使透明质酸钠结块，以20mL/min的速率添加了乙醇。

透明质酸钠以粉末形式沉淀后，在25℃下以250rpm搅拌24小时或更短时间，从而使其进行交联反应。所述交联反应之后，通过添加小于或等于2.0M的HCl溶液来调节pH(pH6.0至小于9.0)，从而终止反应。通过过滤，回收固化的交联透明质酸。通过交替地交换95％(w/w)的乙醇和70％(w/w)的乙醇，数次洗涤固化的交联透明质酸。洗涤之后，将回收的交联的透明质酸在小于或等于60℃的温度下真空干燥24小时或更短时间，从而去除乙醇和水分后获得了粉末形式的交联透明质酸。

实施例1-2

将乙醇以80mL/min的速率添加至包括透明质酸钠的水溶液中，除此之外，通过与实施例1-1相同的方法，获得了粉末形式的交联透明质酸。

实施例1-3

将乙醇以200mL/min的速率添加至包括透明质酸钠的水溶液中，除此之外，通过与实施例1-1相同的方法，获得了粉末形式的交联透明质酸。

实施例2

将乙醇添加至包括透明质酸钠的水溶液中，直至包括透明质酸钠的水溶液和乙醇的体积比例达到1：3，除此之外，通过与实施例1-1相同的方法，制备了粉末形式的交联透明质酸。

实施例3

将乙醇添加至包括透明质酸钠的水溶液中，直至包括透明质酸钠的水溶液和乙醇的体积比例达到1：7，除此之外，通过与实施例1-1相同的方法，制备了粉末形式的交联透明质酸。

实施例4

代替BDDE将DVS作为交联剂而添加至100μl(DVS)/1g(HA)的比例，并且将乙醇添加至包括透明质酸钠的水溶液中，直至包括透明质酸钠的水溶液和乙醇的体积比例达到1：3，除此之外，通过与实施例1-1相同的方法，制备了粉末形式的交联透明质酸。

实施例5

将通过实施例1-1制备的粉末形式的交联透明质酸以10至15mg/mL的量添加到PBS(Phosphate buffered saline)中，从而获得水凝胶。用均质机将所述水凝胶以小于或等于7000rpm的速率进行均化。对于所述均化的凝胶，在121℃下灭菌20分钟或更短时间，从而获得交联的透明质酸水凝胶。

实施例6

将通过实施例2制备的粉末形式的交联透明质酸以10至15mg/mL量溶解于PBS，从而获得水凝胶。用均质机将所述水凝胶以小于或等于7000rpm的速率进行均化。对于所述均化的凝胶，在121℃下灭菌20分钟或更短时间，从而获得交联的透明质酸水凝胶。

实施例7

将通过实施例3制备的粉末形式的交联透明质酸以10至15mg/mL的量溶解于PBS，从而获得水凝胶。用均质机将所述凝胶以小于或等于7000rpm的速率进行均化。对于所述均化的水凝胶，在121℃下灭菌20分钟或更短时间，从而获得交联的透明质酸水凝胶。

实施例8

将通过实施例4制备的粉末形式的交联透明质酸以10至15mg/mL的量溶解于PBS，从而获得水凝胶。用均质机将所述凝胶以小于或等于7000rpm的速率进行均化。对于所述均化的水凝胶，在121℃下灭菌20分钟或更短时间，从而获得交联的透明质酸水凝胶。

实施例9

将通过实施例2制备的粉末形式的交联透明质酸以6至8mg/mL的量溶解于PBS，从而获得水凝胶。用均质机将所述凝胶以小于或等于7000rpm的速率进行均化。对于所述均化的水凝胶，在121℃下灭菌20分钟或更短时间，从而获得交联的透明质酸凝胶。

实施例10

通过与实施例2相同的方法，制备了粉末形式的交联透明质酸。

将制备的粉末形式的交联透明质酸以10至15mg/mL的量溶解于PBS，从而获得水凝胶。用均质机将所述凝胶以小于或等于7000rpm的速率进行均化。所述均化的水凝胶通过在减压过滤装置中使用S.S过滤装置(Solid suspension Filtering,with joint)来进行过滤，其中，过滤器使用了小于或等于25μm的尼龙滤纸(Nylon Filter paper)，并且在约小于或等于80kPa的压力下进行过滤。将过滤的水凝胶灭菌20分钟或更短时间，从而获得交联的透明质酸水凝胶。

实施例11

通过与实施例2相同的方法，制备了粉末形式的交联透明质酸。

将制备的粉末形式的交联透明质酸以10至15mg/mL的量溶解于PBS，从而获得水凝胶。通过在减压过滤装置中使用S.S过滤装置，依次过滤两次所述均化的水凝胶，其中，过滤器使用了小于或等于25μm的尼龙滤纸，并且在约小于或等于80kPa的压力下进行过滤。将过滤的水凝胶在121℃下灭菌20分钟或更短时间，从而获得交联的透明质酸水凝胶。

比较例1

在含有8至12％(w/w)比例乙醇的0.8至1.2％(w/w)氢氧化钠水溶液中，添加透明质酸钠后使其完全溶解，然后以50至100μl/透明质酸钠1g的比例添加BDDE并进行混合。所述混合终止后，在约40至50℃的反应温度下，使其交联反应约6小时或更短的时间。反应终止后，将水凝胶形式的交联透明质酸用PBS溶液进行透析。用蒸馏水洗涤透析后所得的水凝胶，以去除BDDE，然后将中和的水凝胶用95％(w/w)的乙醇水溶液萃取，从而获得粉末状的透明质酸一次交联产物。

对所述透明质酸一次交联产物进行了二次交联反应。将所述粉末状透明质酸一次交联产物以1：4至6的重量比混合至0.8至1.2％(w/w)的氢氧化钠水溶液中，并使其完全溶解。将BDDE以50至100μl/一次交联产物1g的比例添加到所得的反应混合物后进行混合。所述混合终止后，在约40至50℃的反应温度下，使其交联反应约12小时或更短的时间。反应终止后，将生成的二次交联产物用PBS溶液透析约12至24小时。用蒸馏水洗涤透析后所得的颗粒，以去除BDDE，然后将中和的水凝胶用95％(w/w)的乙醇水溶液萃取，从而获得粉末状的透明质酸二次交联产物。

将所述透明质酸一次交联产物和透明质酸二次交联产物以9：1的重量比添加至PBS溶液中，并使最终浓度达到2％(w/w)，以制备凝胶，然后对所述凝胶施加物理力，使其通过500μm筛孔大小的筛以进行粉碎处理，从而获得最终的交联透明质酸。

实验例1：透明质酸水凝胶的粘弹性测量(1)

测量通过所述实施例制备的交联的透明质酸水凝胶的粘弹性。利用旋转型流变仪Kinexus Pro Rheometer(Malvern，Worchestershire，UK)测量了粘弹性。

使用直径为20mm的几何形状(Geometry)以测量动态粘性，并且几何形状和板(Plate)之间的测量间隙(GAP)为0.5mm，温度保持恒定在25℃直至分析结束。使用控制程序(control program)以利用频率振荡(frequency oscillation)，并将频率范围设置在0.1至10Hz后，测量了等于2.5Hz的储能模量G’和损耗模量G”。

根据实施例的水凝胶的粘弹性测量结果如表1，并且在表1中弹性是指储能模量G'，粘性是指损耗模量G”。

【表1】

实验例2：透明质酸水凝胶的粘弹性测量(2)

根据实施例10和比较例1的方法，另制备三次交联的透明质酸水凝胶。针对所述每个交联的透明质酸水凝胶，与实验例1相同地测量了粘弹性，并且将其平均值和标准偏差示于下表2。

【表2】

从表2中可以看出，根据实施例10的方法，交联的透明质酸水凝胶的弹性和粘性显示出相当低的标准偏差值，因此每批配置显示出几乎恒定的物理性质。与此相反，根据比较例1的方法，交联的透明质酸凝胶的弹性和粘性在每次制备时显示出较大的差异。

因此可以看出，根据本发明可以制备具有均匀物理性质的交联的透明质酸水凝胶。

实验例3：粉末形式的交联透明质酸的粒度分析

用粒度分析仪(Mastersizer 3000，Malvern公司，England)以干法分析了在实施例1-1至实施例1-3使用的原料物质，即粉末形式的透明质酸钠(分子量：1.0至4.0MDa)，以及根据实施例1-1至实施例1-3的粉末形式的交联透明质酸的粒度，其结果如所述图1和表3。

【表3】

如所述图1和表3所示，根据实施例1-1至1-3的粉末状交联透明质酸相比于作为原料物质的透明质酸钠，以更细的粉末状交联物而获得。

另外，其粒度显示出随着乙醇添加速率的增加而增加的倾向，并且确认到在粒度分布上D90值的增加。

实验例4：交联的透明质酸水凝胶的粒度分析

用粒度分析仪(Microtrac，Montgomeryville，PA)以湿法测量了实施例6、实施例10以及实施例11中的交联的透明质酸水凝胶的粒度，并将其结果示于图2和表4。

【表4】

如图2和表4，交联的透明质酸水凝胶可以过滤，并且通过过滤其粒度减少，从而显示出更加均匀的粒度分布。

因此可以看出，交联的透明质酸水凝胶通过过滤处理变得更加均化，从而其粒度的一致性得到提高。

实验例5：交联的透明质酸凝胶的XRD结构分析

通过X射线衍射分析确认了根据实施例2的粉末状交联透明质酸以及根据实施例6和10的交联的透明质酸水凝胶的物理状态。使用半定量(RIR)(Semi-Quantitative)法，对通过测量的XRD光谱来获得的平面间距离(d)与比例反射强度(I/Io)进行比较，以比较晶体结构的峰。

测量X射线衍射光谱的仪器和条件如下。

<粉末X射线衍射光谱测量方法>

-制造公司：PANalytical(Almelo，Netherlands)

-机型：X'pert pro MPD

-X线波长：CuKγ的

所述X线衍射分析结果示于图3至图5。

如图3至图5，根据实施例2的粉末状交联透明质酸和根据实施例6、实施例10的交联的透明质酸水凝胶都是无定形状态。

根据实施例2的粉末状交联透明质酸在2θ值为约22°至23°的位置显示出平缓的峰，根据实施例6、实施例10的交联的透明质酸水凝胶在2θ值为约28°的位置显示出平缓的峰。

实施例12

向1％的NaOH水溶液中添加相同量的乙醇，并向其中添加透明质酸钠(Na-HA，分子量：1.0至4.0MDa)后混合，以使混合物的浓度达到3％(w/v)。将BDDE添加至所述混合物中，以制备反应物。此时，BDDE和透明质酸钠(Na-HA)的比例为100μL(BDDE)/1g(HA)。

将所述反应物在30℃下以200rpm的速率搅拌，并使其交联反应5个小时。以小于或等于100mL/min的速率向其中添加乙醇，直至反应物和乙醇的体积比例达到1：5。透明质酸钠(Na-HA)以粉末状沉淀之后，以沉淀状态使其进一步反应16小时。所述交联反应之后，通过添加1.2M的HCl溶液来调节pH(pH小于或等于8)，从而终止反应，之后用乙醇洗涤数次。

洗涤之后进行干燥，使其干燥失重达到小于或等于10％，从而获得粉末形式的交联透明质酸。将所述交联透明质酸以达到10mg/mL的量添加至PBS中，从而获得水凝胶。用均质机将所述水凝胶以小于或等于7000rpm的速率进行均化。对于所述均化的凝胶，在121℃下灭菌20分钟或更短时间，从而获得交联的透明质酸水凝胶。

实施例13

将透明质酸钠(Na-HA)添加至1％的NaOH水溶液和乙醇的混合液中，直至混合物的浓度达到2％(w/v)，并向其中以125μl(BDDE)/1g(HA)透明质酸钠的比例添加BDDE，从而制备反应物，除此之外，通过与实施例12相同的方法，制备了粉末形式的交联透明质酸。

实验例6：交联的透明质酸水凝胶的保存稳定性评价，粘弹性测量(3)

将通过实施例12和13制备的交联的透明质酸水凝胶，分别在25℃、30℃、40℃以及60℃下保存8个月，并且每月定期测量粘弹性。在与实验例1相同的条件下，利用旋转型流变仪Kinexus Pro Rheometer(Malvern，Worchestershire，UK)测量了粘弹性。另外，将市售的交联透明质酸注射剂

(Sanofi公司)作为对比产品，在相同的条件下测量了粘弹性。在表5和表6中，用*表示因实验结束而未测量的值(空格＝Not measured)。

根据实施例12和13或对比产品的水凝胶弹性和粘性的测量结果示于表5至表7以及图6至图11。

【表5】

根据温度与保存期限的弹性结果

【表6】

根据温度与保存期限的粘性结果

【表7】

8个月后粘弹性减少率

表5中的弹性是指储能模量G'(Pa，在2.5Hz下)，表6中的粘性是指损耗模量G”(Pa，在2.5Hz下)。表7为将根据实施例12和13或对比产品的水凝胶分别在25℃、30℃、40℃以及60℃下保存8个月后测量的弹性减少率和粘性减少率。

如所述表5、表6与图6至图11所示，根据实施例12和13的水凝胶相比于对比产品

显示出至少同等的稳定性。另外，根据实施例12和13或对比产品的水凝胶，显示出粘弹性随着保存条件温度的增加而减少的倾向，并且弹性减少率相较于粘性减少率更高。

实施例14

实施例14-1

向1％的NaOH水溶液中以6：4的比例添加乙醇，并向其中添加透明质酸钠(Na-HA，分子量：1.0至4.0MDa)后混合，以使混合物的浓度达到2.5％(w/v)。将BDDE添加至所述混合物中，以制备反应物。此时，BDDE和透明质酸钠(Na-HA)的比例为100μL(BDDE)/1g(HA)。

将所述反应物在30℃下以170rpm的速率搅拌，并使其交联反应5个小时。以小于或等于100mL/min的速率向其中添加乙醇，直至反应物和乙醇的体积比例达到1：5。透明质酸钠(Na-HA)以粉末状沉淀之后，以沉淀状态使其进一步反应16小时。所述交联反应之后，通过添加1.2M的HCl溶液来调节pH(pH小于或等于8)，从而终止反应，之后用乙醇洗涤数次。

洗涤之后进行干燥，使其干燥失重达到小于或等于10％，从而获得粉末形式的交联透明质酸。将所述交联透明质酸以达到10mg/mL的量添加至PBS中，从而获得水凝胶。用均质机将所述水凝胶以小于或等于7000rpm的速率进行均化。对于所述均化的凝胶，在121℃下灭菌21分钟或更短时间，从而获得了交联的透明质酸水凝胶。

实施例14-2

以120μl(BDDE)/1g(HA)透明质酸钠(Na-HA)的比例添加BDDE，从而制备反应物，除此之外，通过与实施例14-1相同的方法，制备了粉末形式的交联透明质酸。

实施例14-2

以140μl(BDDE)/1g(HA)透明质酸钠(Na-HA)的比例添加BDDE，从而制备反应物，除此之外，通过与实施例14-1相同的方法，制备了粉末形式的交联透明质酸。

实施例15

实施例15-1

向1％的NaOH水溶液中以6：4的比例添加乙醇，并向其中添加透明质酸钠(Na-HA，分子量：1.0至4.0MDa)后混合，以使混合物的浓度达到2.5％(w/v)。将BDDE添加至所述混合物中，以制备反应物。此时，BDDE和透明质酸钠(Na-HA)的比例为120μl(BDDE)/1g(HA)。

将所述反应物在25℃下以170rpm的速率搅拌，并使其交联反应5个小时。以小于或等于100mL/min的速率向其中添加乙醇，直至反应物和乙醇的体积比例达到1：5。透明质酸钠(Na-HA)以粉末状沉淀之后，以沉淀状态使其进一步反应16小时。所述交联反应之后，通过添加1.2M的HCl溶液来调节pH(pH小于或等于8)，从而终止反应，之后用乙醇洗涤数次。

洗涤之后进行干燥，使其干燥失重达到小于或等于10％，从而获得粉末形式的交联透明质酸。将所述交联透明质酸以达到10mg/mL的量添加至PBS中，从而获得水凝胶。用均质机将所述水凝胶以小于或等于7000rpm的速率进行均化。对于所述均化的凝胶，在121℃下灭菌21分钟或更短时间，从而获得了交联的透明质酸水凝胶。

实施例15-2

设置30℃的反应温度，使反应物进行交联反应，除此之外，通过与实施例15-1相同的方法，制备了粉末形式的交联透明质酸。

实施例15-3

设置35℃的反应温度，使反应物进行交联反应，除此之外，通过与实施例15-1相同的方法，制备了粉末形式的交联透明质酸。

实施例16

实施例16-1

向1％的NaOH水溶液中以6：4的比例添加乙醇，并向其中添加透明质酸钠(Na-HA，分子量：1.0至4.0MDa)后混合，以使混合物的浓度达到2.5％(w/v)。将BDDE添加至所述混合物中，以制备反应物。此时，BDDE和透明质酸钠(Na-HA)的比例为120μl(BDDE)/1g(HA)。

将所述反应物在30℃下以50rpm的速率搅拌，并使其交联反应5个小时。以小于或等于100mL/min的速率向其中添加乙醇，直至反应物和乙醇的体积比例达到1：5。透明质酸钠(Na-HA)以粉末状沉淀之后，以沉淀状态使其进一步反应16小时。所述交联反应之后，通过添加1.2M的HCl溶液来调节pH(pH小于或等于8)，从而终止反应，之后用乙醇洗涤数次。

洗涤之后进行干燥，使其干燥失重达到小于或等于10％，从而获得粉末形式的交联透明质酸。将所述交联透明质酸以达到10mg/mL的量添加至PBS中，从而获得水凝胶。用均质机将所述水凝胶以小于或等于7000rpm的速率进行均化。对于所述均化的凝胶，在121℃下灭菌21分钟或更短时间，从而获得了交联的透明质酸水凝胶。

实施例16-2

将反应物的搅拌速率设为130rpm，除此之外，通过与实施例16-1相同的方法，制备了粉末形式的交联透明质酸。

实施例16-3

将反应物的搅拌速率设为200rpm，除此之外，通过与实施例16-1相同的方法，制备了粉末形式的交联透明质酸。

实验例7：交联透明质酸的交联度分析

透明质酸(HA)是葡萄糖醛酸和N-乙酰-D-氨基葡萄糖重复连接的多糖类，已知透明质酸经链霉菌透明质酸酶(Streptomyces hyaluronidase)处理会分解成还原末端(non-reducing end)带有4，5-不饱和葡糖醛酸糖基残基的低聚糖。完全分解的未修饰的HA会成为四糖(四聚体)和六塘(六聚体)这两种产物，并且八糖(八聚体)是酶分解的最小尺寸底物。随着酶分解的进行，HA分解成小单位的低聚糖，而经BDDE等交联剂修饰的HA，即使被酶分解也会生成交联剂结合的低聚糖(HA-BDDE-HA,HA-BDDE)形式，因此进行HPLC分析时，在保留时间方面与未修饰的HA存在差异。

因此，将交联剂结合至透明质酸而修饰的程度定义为修饰度(MoD)，将透明质酸交联至交联剂两侧的(HA-BDDE-HA)定义为交联修饰度(Crosslink MoD)，并且将透明质酸交联至交联剂一侧的(HA-BDDE)定义为悬垂修饰度(pendant MoD)。

用于分解透明质酸(HA)的透明质酸酶(通过Streptomyces hyalurolyticus获得的透明质酸酶)使用的是Merck(Sigma Aldrich)公司的产品。用于HPLC分析的柱是DionexCarboPac PA100(Thermo Scientific公司)。

经交联剂修饰的HA在pH5.0和36℃的条件下，被透明质酸分解酶分解。分解的HA能够使用HPLC系统清晰地分离出四聚体、六聚体以及多元寡聚体。在232nm处通过UV吸光度来比较了每个分离的峰的大小。透明质酸被酶完全分解后变为四聚体和六聚体，并且交联的透明质酸分离为略大于四聚体和六聚体的糖单位，以及多元寡聚体等而显示于色谱图。可以通过每个色谱图的面积来求得修饰度(MoD)，八聚体及其以上低聚物的峰通过交联修饰度(crosslink MoD)(％)来区分，除四聚体和六聚体主峰外的小于八聚体的低聚物的峰通过悬垂修饰度(pendant MoD)(％)来区分，并且将二者之和用作总修饰度(total MoD)(％)。

对通过实施例12制备的交联透明质酸，用作对比产品的

(Sanofi公司)以及天然透明质酸(HA)的交联度进行分析，并将结果示于表8。另外，对通过实施例14-1至16-3制备的交联透明质酸的交联度进行分析，并将结果示于表9。

【表8】

【表9】

如表8，通过实施例12制备的交联透明质酸显示出与用作对比产品的

相似的粘弹性和至少同等的稳定性。在本发明的多个实施例中，所述交联透明质酸相比于天然透明质酸(HA)或

可以显示出悬垂修饰度(％)、交联修饰度(％)以及总修饰度(％)的增加。另外，通过实施例12制备的交联透明质酸显示出与

至少同等的悬垂修饰度(％)、交联修饰度(％)以及总修饰度(％)。

如表9，修饰度(MoD)(％)随着产生的交联反应的增加而增加。通常，交联反应随着交联剂(BDDE：HA摩尔比)的添加量增加而增加，并且修饰度(或变形度、交联度)(MoD)(％)随着交联反应的增加而增加。例如，对通过更改交联剂(例如，BDDE)浓度而制备的，即根据实施例14-1至14-3的交联透明质酸的交联度进行了分析，结果修饰度(％)随着交联浓度的增加而增加。

另外，如表9所示，对通过更改反应温度而制备的，即根据实施例15-1至15-3的交联透明质酸的交联度进行了分析，结果修饰度(％)随着反应温度的增加而增加。同时，对通过更改交联反应时的搅拌速率(添加BDDE后5小时或更短)而制备的，即根据实施例16-1至16-3的交联透明质酸的交联度进行了分析，结果修饰度(％)随搅拌速率的变化并不大。

通常，修饰度(％)越高，粘弹性即以储能模量G’(Pa，在2.5Hz下)表示的弹性以及以损耗模量G”(Pa，在2.5Hz下)表示的粘性就会越高，但是粘弹性的值会受制剂等其它因素的影响，因此并不总是恒定。

到目前为止，主要通过优选的多个实施例来描述了本发明。本发明所属领域的技术人员会理解，在不脱离本发明特性的范围内，本发明可以通过修改形式而实施。因此，以上公开的多个实施例应该从描述的观点作为参考，而不应从限制性观点来看待。因此，本发明的范围不是由本发明的详细描述限定，而是由所附权利要求限定，并且该范围内的所有差异将被解释为包括在本发明中。

Claims (28)

1.一种粉末状交联透明质酸的制备方法，其包括：

制备水溶液，所述水溶液包括透明质酸、其盐或它们的混合物；

将交联剂添加至所述水溶液中，从而使透明质酸进行交联反应；以及

将乙醇添加至所述水溶液中，从而使透明质酸固化成颗粒。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，将乙醇添加至所述水溶液中时，所述乙醇的添加速率为20mL/min至1000mL/min。

3.根据权利要求1所述的方法，其中，添加所述乙醇的过程中，相对于混合液总体积的乙醇的体积变化速率为0.5％(v/v)/min至35％(v/v)/min。

4.根据权利要求1所述的方法，其中，基于1g透明质酸、其盐或它们混合物，包括10μl至500μl的所述交联剂。

5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述水溶液和添加至所述水溶液的乙醇的体积比例为1∶1至10。

6.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括：使包括透明质酸颗粒的水溶液进行交联反应。

7.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括：

利用乙醇或包括乙醇的溶液来洗涤制备的交联透明质酸。

8.一种粉末状交联透明质酸，其通过根据权利要求1至7中任一项所述的方法制备。

9.根据权利要求8所述的粉末状交联透明质酸，其中，所述交联透明质酸显示出D90为小于或等于80μm的粒度分布。

10.根据权利要求8所述的粉末状交联透明质酸，其中，

所述交联透明质酸显示出D10为2.5μm至6μm，D50为8μm至20μm以及D90为25μm至80μm的粒度分布。

11.一种交联的透明质酸水凝胶的制备方法，其包括：

制备水溶液，所述水溶液包括透明质酸、其盐或它们的混合物；

将交联剂添加至所述水溶液中，从而使透明质酸进行交联反应；

将乙醇添加至所述水溶液中，从而使透明质酸固化成颗粒；

持续所述包括透明质酸颗粒的水溶液的交联反应，从而制备粉末状交联透明质酸；以及

将所述制备的粉末状交联透明质酸进行水合。

12.根据权利要求11所述的方法，其中，

所述进行水合为，将所述粉末状交联透明质酸添加至水或包括水的溶液中。

13.根据权利要求11所述的方法，其中，基于1mL的水或包括水的溶液，所述粉末状交联透明质酸以5mg至15mg的量添加。

14.根据权利要求11所述的方法，其进一步包括：利用过滤器来过滤所述交联的透明质酸水凝胶。

15.一种交联的透明质酸水凝胶，其通过根据权利要求11至14中任一项所述的方法来制备。

16.根据权利要求15所述的交联的透明质酸水凝胶，其中，所述交联的透明质酸水凝胶显示出D90为小于或等于240μm的粒度分布。

17.根据权利要求15所述的交联的透明质酸水凝胶，其中，

所述交联的透明质酸水凝胶显示出D10为25μm至40μm，D50为70μm至110μm，D90为190μm至240μm的粒度分布。

18.根据权利要求15所述的交联的透明质酸水凝胶，其中，所述交联的透明质酸水凝胶的弹性为30至200Pa，粘性为10至100Pa。

19.一种交联的透明质酸水凝胶，其通过包括以下步骤的方法来制备：

制备水溶液，所述水溶液包括透明质酸、其盐或它们的混合物；

将交联剂添加至所述水溶液中，从而使透明质酸进行交联反应；

将乙醇添加至所述水溶液中，从而使透明质酸固化成颗粒；

持续所述包括透明质酸颗粒的水溶液的交联反应，从而制备粉末状交联透明质酸；

将所述粉末状交联透明质酸进行水合，从而获得交联的透明质酸水凝胶；以及

过滤所述交联的透明质酸水凝胶。

20.根据权利要求19所述的交联的透明质酸水凝胶，其中，进行过滤之后获得的交联的透明质酸水凝胶显示出D90为小于或等于120μm的粒度分布。

21.根据权利要求19所述的交联的透明质酸水凝胶，其中，进行过滤之后获得的交联的透明质酸水凝胶显示出D10为10μm至30μm，D50为35μm至65μm，D90为80μm至120μm的粒度分布。

22.根据权利要求19所述的交联的透明质酸水凝胶，其中，进行过滤之后获得的交联的透明质酸水凝胶弹性为30至200Pa，粘性为10至100Pa。

23.根据权利要求19所述的交联的透明质酸水凝胶，其中，所述交联剂为丁二醇二缩水甘油醚(BDDE)、二乙烯基砜(DVS)或它们的混合物。

24.一种交联的透明质酸水凝胶，其为无定形的交联的透明质酸水凝胶，并且其X射线粉末衍射图谱(XRD)显示出图5中的图谱。

25.根据权利要求24所述的交联的透明质酸水凝胶，其中，所述交联的透明质酸水凝胶显示出D90为小于或等于120μm的粒度分布。

26.根据权利要求24所述的交联的透明质酸水凝胶，其中，所述交联的透明质酸水凝胶显示出D10为10μm至30μm，D50为35μm至65μm，D90为80μm至120μm的粒度分布。

27.根据权利要求24所述的交联的透明质酸水凝胶，其中，所述交联的透明质酸水凝胶的弹性为30至200Pa，粘性为10至100Pa。

28.根据权利要求24所述的交联的透明质酸水凝胶，其中，所述交联的透明质酸水凝胶的弹性为100至150Pa，粘性为10至60Pa。

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