KR101250846B1 - 히알루론산 가교물의 제조방법 - Google Patents

히알루론산 가교물의 제조방법 Download PDF

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    • C08J3/24—Crosslinking, e.g. vulcanising, of macromolecules

Abstract

본 발명은 에폭시 반응기를 둘 또는 그 이상 가지고 있는 가교제와 히알루론산의 혼합물을 유기용매 중에서 고체상으로 가교제에 의한 히알루론산의 가교반응을 유도하여 히알루론산 가교물을 제조하는 과정을 포함하는 히알루론산 가교물의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 제조방법에 따르면, 소망하는 고체상의 형태에서 반응을 진행시킬 수 있고, 높은 반응율과 그로 인한 불순물의 최소화, 고순도 물질의 제조, 용이한 정제과정 등 종래기술의 대부분의 문제점들을 해소할 수 있다. 또한, 그와 같이 얻어진 히알루론산 가교물은 마이크로비드, 실, 하이드로겔, 필름 및 스폰지와 같은 다양한 형태로 제조될 수 있으며, 생체적합성, 물리적 특성 및 열과 분해효소에 대한 안정성 등이 우수하다.

Description

히알루론산 가교물의 제조방법 {Process for Preparing Crosslinked Hyaluronic Acid}
도 1은 본 발명의 실시예 4에서 제조된 실 형태의 히알루론산 가교물의 사진이다;
도 2는 본 발명의 실시예 4에서 제조된 마이크로비드 형태의 히알루론산 가교물의 사진이다.
본 발명은 히알루론산 가교물의 신규한 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는, 에폭시 반응기를 둘 또는 그 이상 가지고 있는 가교제와 히알루론산의 혼합물을 유기용매 중에서 고상(solid phase)으로 가교반응을 유도하여 히알루론산 가교물을 제조하는 방법에 관한 것이다.
히알루론산은 N-아세틸-D-글루코사민과 D-글루쿠론산으로 구성되어 있고 상기 반복단위가 선형으로 연결되어 있는 생체고분자 물질로서, 안구의 유리액, 관절 의 활액 및 닭벼슬 등에 많이 존재한다. 히알루론산은 우수한 생체적합성과 점탄성으로 인해 안과용 수술 보조제, 관절기능 개선제, 약물전달 물질 및 점안제 등의 의료 및 의료 용구나, 화장품 용도 등으로 널리 사용되고 있다. 그러나, 그 자체만으로는 생체내(in vivo) 또는 산, 알칼리 등의 조건에서 쉽게 분해되어 사용이 제한적이다. 따라서, 구조적으로 안정한 히알루론산 유도체를 개발하기 위한 노력이 널리 진행되고 있다(Laurent, T.C. "The chemistry, biology and medical applications of hyaluronan and its derivatives" Portland Press Ltd., London, 1998).
히알루론산 유도체는 수술 후의 유착 방지제, 주름살 개선제, 성형 보조물, 관절기능 개선제, 약물 전달체 및 세포배양 지지체(Scaffold) 등 다양한 용도로 개발되고 있으며, 특히 주름살 개선제와 성형 보조제 등은 상업적 용도로 활발한 연구가 행해지고 있다(F. Manna, M. Dentini, P. Desider, O. De Pita, E. Mortilla, B. Maras, Journal of European Academy of Dermatology and Venereology, 13(1999) 183-192).
히알루론산 유도체의 하나로서, 가교제를 사용하여 히알루론산들을 상호 공유결합시킨 히알루론산 가교물은 우수한 생체적합성, 물리적 안정성 및 생분해성을 가지고 있으며, 미국특허 제4,716,224호, 제4,963,666호, 제5,017,229호, 제5,356,883호 등에는 그것의 제조방법들이 개시되어 있다.
그러나, 이들 특허에서의 방법으로 제조된 히알루론산 가교물(히알루론산 유도체)은 히알루론산 분해효소 및 열에 대한 안정성이 상대적으로 낮으며 미반응 화 학물질의 제거가 어려워 고순도의 생체적합성 물질로 활용하기에는 한계가 있다. 특히, 가교제로 다관능성 에폭시계 가교제(polyfunctional epoxide-based crosslinking agent)를 사용하는 미국특허 제4,716,224호, 제4,963,666호 및 미국특허출원 공개 제US2003/0094719A1호의 방법으로 제조된 히알루론산 가교물은, 물리적 점탄성이 낮고, 첨가된 가교제의 농도가 높아 활성상태로 반응물에 남아 있을 수 있거나, 또는 반응 후 남아 있는 미반응물의 잔류량이 높아 반응효율이 낮고 정제공정이 어렵다는 문제점이 있다. 즉, 이들 방법은 알칼리 수용액에서 가교제와 히알루론산을 혼합하여 이를 용액상(liquid phase)에서 가교반응을 유도하고 있지만, 일반적으로 반응성이 매우 낮아 물성을 향상시키기 위해서는 반응농도를 증가시키거나 가교제를 많이 첨가해야 하는데, 이 경우 고농도로 제조하기 용이하지 않으며 다량으로 첨가된 가교제를 정제과정에서 완벽하게 제거하기 어렵다는 문제점을 가지고 있다.
따라서, 본 발명의 목적은 이러한 종래기술의 문제점을 해결할 수 있는 히알루론산 가교물의 제조방법을 제공하는 것이다.
즉, 본 발명의 목적은 생체적합성, 물리적 특성, 및 열과 분해효소에 대한 안정성을 향상시킴으로써 체내의 다양한 환경에서도 유용하게 사용될 수 있을 뿐만 아니라, 불순물을 최소화하고, 고효율의 결합반응을 유도하며, 정제가 용이한 히알루론산 가교물의 제조방법을 제공하는 것이다.
이러한 목적을 달성하기 위한 본 발명에 따른 히알루론산 가교물의 제조방법은, 에폭시 반응기를 둘 또는 그 이상 가지고 있는 가교제와 히알루론산의 혼합물을 유기용매 중에서 고체상(solid phase)으로 가교제에 의한 히알루론산의 가교반응을 유도하여 히알루론산 가교물을 제조하는 과정을 포함한다.
즉, 본 발명의 제조방법은 가교제에 의한 히알루론산의 가교반응을 액체상(liquid phase)이 아닌 유기용매 중에서 고체상(solid phase)으로 진행시킨다는 점에서 종래기술의 제조방법과 큰 차이가 있다.
액체상의 가교반응으로 진행되는 종래기술에서는 가교반응의 효율이 낮으므로, 히알루론산과 결합한 가교제의 여러 에폭시 작용기 중 미반응 에폭시 작용기가 히알루론산에 남아 있게 되며, 이는 생체내 물질과 반응할 위험이 있으므로 최소화하거나 가수 분해하여 비활성 작용기로 변환시켜야 한다. 따라서, 이를 위한 추가 반응 또는 공정이 필요하다. 또한, 과량의 가교제를 첨가하는 경우에는 미반응 가교제가 히알루론산 가교물 사이에 남아 있을 위험성이 매우 크다. 따라서, 이러한 가능성을 최소화하기 위하여 반응율에 규합되는 정확한 양의 가교제를 첨가하여 고효율의 반응을 유도하는 것이 공정의 효율 및 생체적합성의 관점에서 매우 중요하지만, 이러한 작업은 반응의 특성상 용이하지 않다.
반면에, 본 발명에서와 같이 유기용매 중에서 고체상으로 가교반응을 행하면, 소망하는 고상 형태에서 반응을 진행시킬 수 있다는 점 이외에도, 높은 반응율 과 그로 인한 불순물의 최소화, 고순도 물질의 제조, 용이한 정제과정 등 종래기술의 대부분의 문제점들을 해소할 수 있다. 또한, 최종적으로 얻어진 히알루론산 가교물(유도체)은 크게 향상된 생체적합성, 물리적 강도, 및 열과 효소에 대한 안전성 등 우수한 물성을 갖는 것으로 확인되었다.
본 명세서에서 사용된 용어 "히알루론산"은 히알루론산 자체와 히알루론산 염을 모두 포함하는 의미로 사용되고 있다. 따라서, 이하에서 사용된 용어 "히알루론산 수용액"은 히알루론산의 수용액, 히알루론산 염의 수용액, 및 히알루론산 과 히알루론산 염의 혼합 수용액을 모두 포함하는 개념이다. 상기 히알루론산 염은 히알루론산 나트륨, 히알루론산 칼륨, 히알루론산 칼슘, 히알루론산 마그네슘, 히알루론산 아연, 히알루론산 코발트 등의 무기염과, 히알루론산 테트라부틸암모늄 등의 유기염이 모두 포함된다. 경우에 따라서는, 그들의 둘 또는 그 이상이 조합되어 사용될 수도 있다.
히알루론산의 분자량은 특별히 제한되는 것은 아니지만, 다양한 물성과 생체적합성을 구현하기 위해 100,000 내지 5,000,000 이 바람직하다.
상기 가교제는 둘 또는 그 이상의 에폭시 작용기를 포함하는 화합물로서 다양할 수 있으며, 바람직한 예로 부탄디올디글리시딜에테르(1,4-butandiol diglycidyl ether: BDDE), 에틸렌글리콜디글리시딜에테르(ethylene glycol diglycidyl ether: EGDGE), 헥산디올디글리시딜에테르(1,6-hexanediol diglycidyl ether), 프로필렌글리콜디글리시딜에테르(propylene glycol diglycidyl ether), 폴리프로필렌글리콜디글리시딜에테르(polypropylene glycol diglycidyl ether), 폴리 테트라메틸렌글리콜디글리시딜에테르(polytetramethylene glycol diglycidyl ether), 네오펜틸글리콜디글리시딜에테르(neopentyl glycol diglycidyl ether), 폴리글리세롤폴리글리시딜에테르(polyglycerol polyglycidyl ether), 디글리세롤폴리글리시딜에테르(diglycerol polyglycidyl ether), 글리세롤폴리글리시딜에테르(glycerol polyglycidyl ether), 트리메틸프로판폴리글리시딜에테르(tri-methylpropane polyglycidyl ether), 비스에폭시프로폭시에틸렌(1,2-(bis(2,3-epoxypropoxy)ethylene), 펜타에리쓰리톨폴리글리시딜에테르(pentaerythritol polyglycidyl ether) 및 소르비톨폴리글리시딜에테르(sorbitol polyglycidyl ether) 등을 들 수 있고, 그 중에서도 부탄디올글리시딜에테르가 특히 바람직하다.
본 발명에 따른 히알루론산 가교물은 상기 가교제의 에폭시 작용기가 히알루론산의 알코올기와 반응함으로써 형성된다. 상기 에폭시 작용기와 히알루론산 알코올기는 반응시 에테르 결합을 형성하는데, 에폭시 작용기는 고효율의 반응에 의해 거의 모두가 히알루론산에 붙어 있게 되므로 부산물이 발생하지 않는다.
본 발명에 따른 히알루론산 가교물은 생체적합성 소재로 주름살 개선제, 성형 보조제, 관절기능 개선제, 유착 방지제 등 체내에 도입된 상태에서 어떠한 부작용 없이 일정한 형태를 유지하는 용도로 사용할 수 있으며, 약물 전달계(drug delivery system)에서 특정한 약물을 전달하는 매개체(vehicle), 세포배양 지지체 등에 유용하게 사용할 수 있다. 또한 실, 마이크로비드, 필름, 하이드로겔 및 스폰지 등 용도에 맞게 다양한 형태로 제조될 수 있다.
본 발명의 하나의 바람직한 제조방법은,
(a) 히알루론산을 알칼리 수용액에 넣어 녹이고, 상기 히알루론산 알칼리 수용액에 가교제를 첨가하여 균질하게 혼합하는 단계;
(b) 상기 가교제가 포함된 히알루론산 알칼리 수용액을 유기용매에 떨어뜨려 고체상으로 히알루론산과 가교제의 반응을 유도하는 단계;
(c) 상기 가교반응을 통해 얻어진 히알루론산 가교물에서 수산화 이온 및 미반응 가교제를 제거하는 단계; 및
(d) 상기 히알루론산 가교물을 분리 및 건조하여 회수하는 단계;
를 포함한다.
상기 단계(a)에서, 히알루론산의 농도는 히알루론산 알칼리 수용액에서의 고체 성분의 중량을 기준으로 1% 내지 50%이며, 바람직하게는 5% 내지 15%이다.
알칼리 수용액에 사용되는 알칼리 시약은 특별히 제한되는 것은 아니지만, 수산화나트륨, 수산화칼륨, 암모니아수 등과 같은 염기성 화합물이 바람직하며, 그 중에서 수산화나트륨이 특히 바람직하다. 알칼리 수용액의 농도는 0.1M 내지 10M인 것이 히알루론산의 용해 및 가교반응에 바람직하다.
추후 단계(b)에서 유기용매에 대한 히알루론산의 용해성을 떨어뜨려 고체상으로의 변환을 더욱 용이하게 하기 위하여, 히알루론산 알칼리 수용액에 염화나트륨 등의 염을 더 첨가할 수 있으며, 이 경우에 염의 바람직한 농도는 1 내지 1000 mg/ml이다. 상기 염화나트륨은 단계(b)에서 혼합용액이 유기용매에 떨어질 때 순간적으로 고체상태로 변환되는 것을 원활하게 해준다.
가교제의 첨가량은 히알루론산 반복 단위(repeating unit)당 0.01 당량% 내 지 50 당량%가 바람직하며, 0.1 당량% 내지 10 당량%가 더욱 바람직하다.
상기 단계(b)에서, 가교제가 포함된 히알루론산 알칼리 수용액을 유기용매에 떨어뜨려 고체상으로 만들 때 소망하는 형태에 따라 구형의 입자, 실 등으로 고화시킬 수 있다. 가교반응은 이러한 고체상에서 진행되며, 고체상에서의 반응농도는 액체상에서의 반응농도와 비교하여 상당히 높아지기 때문에 반응의 효율성을 극대화시킬 수 있어 우수한 물성을 지닌 히알루론산 유도체를 제조할 수 있다.
상기 유기용매로는 아세톤, 아세톤 수용액, 에탄올 등의 C2 내지 C6 알코올 또는 알코올 수용액 등을 사용할 수 있다.
가교반응의 온도는 15℃ 내지 60℃가 바람직하고, 25℃ 내지 50℃가 더욱 바람직하다. 이때, 가교반응의 시간은 특별히 제한되지 않으나, 반응 시간이 길어질수록 히알루론산이 분해되어 물리적 점탄성이 낮아지는 문제점이 있으므로 1 시간 내지 48 시간이 바람직하다.
상기 단계(c)에서, 히알루론산 가교물을 증류수나 산성용액 또는 염이 첨가된 수용액으로 수회 세척하여 미반응 가교제 및 수산화 이온을 제거할 수 있다. 상기 산성용액으로는 염산, 황산, 질산, 인산, 아세트산 등의 수용액을 사용할 수 있고, 상기 염이 첨가된 수용액으로는 염화나트륨 수용액, 인산 수용액, 인산염이 포함된 염화 나트륨 수용액 등을 사용할 수 있다. 그 중에서도, 세척효율이 뛰어난 염이 첨가된 수용액을 사용하는 것이 특히 바람직하다.
상기 단계(d)에서, 정제된 히알루론산 가교물을 유기용매 또는 유기용매 수 용액에 침전시켜 회수하거나 세척 용매상에서 회수할 수 있다. 또는, 상기 히알루론산 가교물을 증류수 또는 염이 첨가된 수용액에서 분쇄기를 이용하여 미세한 입자로 만든 다음 유기용매 또는 유기용매 수용액에 침전시켜 회수하거나 증류수상에서 회수할 수 있다. 상기 유기용매는 가교제가 포함된 히알루론산 알칼리 수용액을 고체상으로 만들 때 사용했던 유기용매와 그 종류가 동일할 수 있다.
회수된 히알루론산 가교물은 열, 질소, 공기 감압, 동결건조 등을 이용하여 건조하고, 적용목적에 따라 형태나 크기에 따라 분리 회수할 수 있다.
본 발명에 따른 제조 방법들의 각 반응단계에서의 생성물은 당업계에 공지된 통상의 방법에 의하여 반응계로부터 분리 및/또는 정제될 수 있다. 분리 및 정제방법의 예로는, 증류(대기압 하에서의 증류 및 감압증류를 포함), 재결정, 칼럼 크로마토그래피, 이온교환 크로마토그래피, 겔 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 박층 크로마토그래피, 상 분리, 용매 추출, 투석, 세척 등을 들 수 있다. 정제는 각 반응단계마다 또는 일련의 반응 단계들 이후에 수행할 수 있다.
상기에서 제조된 히알루론산 가교물은 건조방법, 성형방법 등에 의해 마이크로비드, 실, 하이드로겔, 필름, 스폰지 등 다양한 형상으로 제조될 수 있다.
본 발명의 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서, 공정의 효율성 및 수율의 향상을 위하여, 상기 공정들의 일부가 변형되거나 기타 제조 공정들이 포함될 수 있으며, 이들은 모두 본 발명에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
본 발명에 따른 히알루론산 가교물의 합성에 필요한 원료물질 및 시약은 문헌의 방법에 의해 또는 전술한 방법에 의해 용이하게 제조 가능하거나, 상업적으로 구입 가능하다. 참고로, 별도의 설명이 없는 한, 본 발명에서 정의하는 각종 범위, 예를 들어, 농도 범위, 온도 범위, 시간 범위 등은 본 발명을 보다 효율적으로 실행하기 위한 조건들로서 이해한다.
이하, 실시예를 참조하여 본 발명의 내용을 상세히 설명하지만, 본 발명의 범주가 그것에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 고체상 반응으로 히알루론산 가교물의 마이크로비드 제조
50 mg/ml의 농도로 히알루론산 나트륨(분자량: 3,000,000, 제조사: LG Life Sciences Ltd.)을 5N NaOH 용액에 녹여 2 ml 제조한 다음, 상기 히알루론산 나트륨 용액에 BDDE를 2.4 ㎕ 첨가하였다(히알루론산 반복단위에 대한 BDDE의 당량비: 5%). 상기 용액을 에탄올에 구형의 입자 형태로 떨어뜨려, 실온에서 24 시간 동안 반응을 행한 후, 증류수로 여러 번 세척하였다. 세척된 비드는 에탄올에 침전하여 회수한 뒤, 질소가스로 건조시켰다.
실시예 2: 고체상 반응으로 히알루론산 가교물의 마이크로비드 제조
50 mg/ml의 농도로 히알루론산 나트륨(분자량: 3,000,000, 제조사: LG Life Sciences Ltd.)을 NaCl이 200 mg/ml이 되도록 첨가된 1N NaOH 용액에 녹여 2 ml 제조한 다음, 상기 히알루론산 나트륨 용액에 BDDE를 2.4 ㎕ 첨가하였다(히알루론산 반복단위에 대한 BDDE의 당량비: 5%). 상기 용액을 에탄올에 구형의 입자 형태로 떨어뜨려, 실온에서 24 시간 동안 반응을 행한 후, 증류수로 여러 번 세척하였다. 세척된 비드는 에탄올에 침전하여 회수한 뒤, 질소가스로 건조시켰다.
실시예 3: 고체상 반응으로 히알루론산 가교물의 실 제조
150 mg/ml의 농도로 히알루론산 나트륨(분자량: 3,000,000, 제조사: LG Life Sciences Ltd.)을 1 N NaOH 용액에 녹여 1.33 ml 제조한 다음, 상기 히알루론산 나트륨 용액에 BDDE를 0.096 ㎕ 첨가하였다(히알루론산 반복단위에 대한 BDDE의 당량비: 0.1%). 상기 용액을 에탄올에 일정한 속도로 분사하여 실의 형태로 떨어뜨려, 실온에서 24 시간 동안 반응을 행한 후, 증류수로 여러 번 세척하였다. 세척된 실은 에탄올에 침전하여 회수한 뒤, 질소가스로 건조시켰다.
실시예 4: 고체상 반응으로 히알루론산 가교물의 실과 마이크로비드 제조
150 mg/ml의 농도로 히알루론산 나트륨(분자량: 3,000,000, 제조사: LG Life Sciences Ltd.)을 1 N NaOH 용액에 녹여 2.67 ml 제조한 다음, 상기 히알루론산 나트륨 용액에 BDDE를 9.6 ㎕ 첨가하였다(히알루론산 반복단위에 대한 BDDE의 당량비: 5%). 상기 용액을 에탄올에 일정한 속도로 분사하여 실의 형태로 떨어뜨려, 실온에서 24 시간 동안 반응을 행한 후, 증류수로 여러 번 세척하였다. 세척된 실은 에탄올에 침전하여 회수한 뒤, 질소가스로 건조하여 실의 형태로 제조하였다.
일부의 세척된 실은 분쇄기를 이용하여 증류수 상에서 분쇄한 다음, 에탄올 에 침전하여 회수한 뒤, 질소가스로 건조시켜 마이크로 크기의 입자 형태로 제조하였다.
실험예 1: 실시예 4에서 제조된 히알루론산 가교물의 실과 마이크로비드의 형태와 물성 비교
실시예 4에서 제조된 히알루론산 가교물 실을 생리 식염수를 사용하여 76.6 mg/ml 농도로 만들었고, 형태를 확인하기 위해 촬영한 사진이 도 1에 개시되어 있다. 또한, 유변학적 특성을 확인하기 위하여 레오미터(rheometer)를 사용하여 0.02 내지 1 Hz의 진동수에서 멸균 후 복합점도(complex viscosity)를 측정하였다. 제조된 시료의 0.02 Hz의 진동수에서 측정한 복합점도는 71,661,079 cP를 나타내었다.
실시예 4에서 제조된 히알루론산 가교물 마이크로비드를 생리 식염수를 사용하여 70 mg/ml 농도로 만들었고, 형태를 확인하기 위해 촬영한 사진이 도 2에 개시되어 있다. 또한, 유변학적 특성을 확인하기 위하여 레오미터(rheometer)를 사용하여 0.02 내지 1 Hz의 진동수에서 멸균 후 복합점도(complex viscosity)를 측정하였다. 제조된 시료의 0.02 Hz의 진동수에서 측정한 복합점도는 9,590,261 cP를 나타내었다.
비교예 1: 액체상 반응으로 히알루론산 가교물의 마이크로비드 제조
150 mg/ml의 농도로 히알루론산 나트륨(분자량: 3,000,000, 제조사: LG Life Sciences Ltd.)을 1N NaOH 용액에 녹여 2.67 ml를 제조한 다음, 상기 히알루론산 나트륨 용액에 BDDE를 1.92 ㎕ 첨가하였다(히알루론산 반복단위에 대한 BDDE의 당량비: 1%). 상기 용액을 둘로 나눠 그 중 한 용액은 액체상으로 실온에서 24 시간 동안 반응을 행한 후, 증류수에서 분쇄 및 세척을 하여 에탄올에 침전한 뒤 회수하였다.
실시예 5: 고체상 반응으로 히알루론산 가교물의 마이크로비드 제조
비교예 1에서 나머지 다른 용액은 에탄올에 일정한 속도로 분사하여 실의 형태로 떨어뜨려, 실온에서 24 시간 동안 고체상으로 반응을 행한 후, 증류수로 여러 번 세척한 다음, 상기 증류수 상에서 분쇄기를 이용하여 분쇄한 뒤 에탄올에 침전하여 회수하고 질소가스로 건조시켜 마이크로 크기의 입자형태로 제조하였다.
비교예 2: 액체상 반응으로 히알루론산 가교물의 마이크로비드 제조
300 mg/ml의 농도로 히알루론산 나트륨(분자량: 3,000,000, 제조사: LG Life Sciences Ltd.)을 0.75N NaOH 용액에 녹여 1 ml를 제조한 다음, 상기 히알루론산 나트륨 용액에 BDDE를 1.44 ㎕ 첨가하였다(히알루론산 반복단위에 대한 BDDE의 당량비: 1%). 상기 용액은 액체상으로 실온에서 24 시간 동안 반응을 행한 후, 증류수에서 분쇄 및 세척한 다음, 에탄올에 침전하여 회수하였다.
실험예 2: 실시예 5와 비교예 1 및 2에서 제조된 히알루론산 가교물의 마이크로비 드의 물성 비교
실시예 5에서 제조된 마이크로비드를 생리 식염수를 사용해 50 mg/ml 농도로 만든 후, 유변학적 특성을 확인하기 위하여 레오미터(rheometer)를 사용하여 0.02 내지 1 Hz의 진동수에서 멸균 후 복합점도(complex viscosity)를 측정하였다. 제조된 시료의 0.02 Hz의 진동수에서 측정한 복합점도는 6,466,432 cP를 나타내었다.
비교예 1에서 제조된 마이크로비드는 반응성이 매우 낮아 정제시 대부분 용해되어 회수가 되지 않았으며, 회수된 일부는 생리 식염수로 제조하였을 때 유변학적 특성을 확인할 수 없을 정도로 매우 낮은 점도를 보였다.
비교예 2에서 제조된 마이크로비드를 생리 식염수를 사용해 20 mg/ml 농도로 만든 후, 유변학적 특성을 확인하기 위하여 레오미터(rheometer)를 사용하여 0.02 내지 1 Hz의 진동수에서 멸균 후 복합점도(complex viscosity)를 측정하였다. 제조된 시료의 0.02 Hz의 진동수에서 측정한 복합점도는 6,138,680 cP를 나타내었다.
상기 결과에서 보는 바와 같이, 액체상의 가교반응으로 제조된 히알루론산 가교물(비교예 1)은, 고체상의 가교반응으로 제조된 히알루론산 가교물(실시예 5)과 동일한 농도의 히알루론산 및 동일한 가교제를 사용하여 제조하였음에도 불구하고, 실시예 5의 가교물에 비해 반응성이 매우 낮아 수율 및 물성이 많이 감소됨을 알 수 있다. 또한, 비교예 2의 가교물은 실시예 5의 가교물과 유사한 물성을 갖게 하기 위하여 두 배의 농도에서 반응시켜 제조하였지만, 이 경우에도 팽윤도가 약 2.5 배 높았기 때문에 가교도가 낮은 것으로 확인되었다.
따라서, 액체상의 가교반응에 비해 유기용매에서 고체상으로 가교반응을 하 는 경우가 반응의 효율성이 높아 상대적으로 낮은 반응농도와 가교제의 적은 양에서도 우수한 물성의 히알루론산 가교물이 제조될 수 있음을 알 수 있다.
상기에서 본 발명을 구체적인 예들을 중심으로 상세히 설명하였지만, 본 발명의 범주 및 기술사상 범위 내에서 다양한 변형 및 수정이 가능함은 당업자에게 있어서 명백할 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 특허청구범위에 속한다.
이상 설명한 바와 같이, 본 발명의 제조방법에 따르면, 소망하는 고체상의 형태에서 반응을 진행시킬 수 있고, 높은 반응율과 그로 인한 불순물의 최소화, 고순도 물질의 제조, 용이한 정제과정 등 종래기술의 대부분의 문제점들을 해소할 수 있다.
이러한 히알루론산 가교물은 마이크로비드, 실, 하이드로겔, 필름 및 스폰지와 같은 다양한 형태로 제조될 수 있으며, 우수한 생체적합성, 물리적 특성 및 열과 분해효소에 대한 안정성을 가지므로 체내의 다양한 환경에서도 주름살 개선제, 성형 보조물, 약물 전달체, 세포 지지체, 유착 방지제, 관절기능 개선제 등 다양한 용도로 사용될 수 있다.

Claims (13)

  1. 에폭시 반응기를 둘 또는 그 이상 가지고 있는 가교제와 히알루론산의 혼합물을 유기용매 중에서 고체상(solid phase)으로 가교반응시키는 과정을 포함하고, 상기 유기용매는 아세톤, 아세톤 수용액, 또는 C2 내지 C6 알코올 또는 알코올 수용액인 것을 특징으로 하는 히알루론산 가교물의 제조방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 히알루론산은 히알루론산, 히알루론산 염, 또는 히알루론산과 히알루론산 염의 혼합물인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  3. 제 2 항에 있어서, 상기 히알루론산 염은 히알루론산 나트륨, 히알루론산 칼륨, 히알루론산 칼슘, 히알루론산 마그네슘, 히알루론산 아연, 히알루론산 코발트 및 히알루론산 테트라부틸암모늄으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 또는 그 이상인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  4. 제 2 항 또는 제 3 항에 있어서, 상기 히알루론산 염의 분자량은 100,000 내지 5,000,000 인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 가교제는 부탄디올디글리시딜에테르(1,4-butandiol diglycidyl ether: BDDE), 에틸렌글리콜디글리시딜에테르(ethylene glycol diglycidyl ether: EGDGE), 헥산디올디글리시딜에테르(1,6-hexanediol diglycidyl ether), 프로필렌글리콜디글리시딜에테르(propylene glycol diglycidyl ether), 폴리프로필렌글리콜디글리시딜에테르(polypropylene glycol diglycidyl ether), 폴리테트라메틸렌글리콜디글리시딜에테르(polytetramethylene glycol diglycidyl ether), 네오펜틸글리콜디글리시딜에테르(neopentyl glycol diglycidyl ether), 폴리글리콜폴리글리시딜에테르(polyglycerol polyglycidyl ether), 디글리세롤폴리글리시딜에테르(diglycerol polyglycidyl ether), 글리세롤폴리글리시딜에테르(glycerol polyglycidyl ether), 트리메틸프로판폴리글리시딜에테르(tri-methylpropane polyglycidyl ether), 비스에폭시프로폭시에틸렌(1,2-(bis(2,3-epoxypropoxy)ethylene), 펜타에리쓰리톨폴리글리시딜에테르(pentaerythritol polyglycidyl ether) 및 소르비톨폴리글리시딜에테르(sorbitol polyglycidyl ether)로 이루어진 군에서 선택된 하나 또는 둘 이상인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  6. 제 5 항에 있어서, 상기 가교제는 부탄디올글리시딜에테르인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  7. (a) 히알루론산을 알칼리 수용액에 넣어 녹이고, 상기 히알루론산 알칼리 수용액에 가교제를 첨가하여 균질하게 혼합하는 단계;
    (b) 상기 가교제가 포함된 히알루론산 알칼리 수용액을 유기용매에 떨어뜨려 고체상으로 가교반응시키는 단계;
    (c) 상기 가교반응을 통해 얻어진 히알루론산 가교물에서 수산화 이온 및 미반응 가교제를 제거하는 단계; 및
    (d) 상기 히알루론산 가교물을 분리 및 건조하여 회수하는 단계를 포함하
    고, 상기 단계(b)에서 상기 유기용매는 아세톤, 아세톤 수용액, 또는 C2 내지 C6 알코올 또는 알코올 수용액인 것을 특징으로 하는 히알루론산 가교물의 제조방법.
  8. 제 7 항에 있어서, 상기 단계(a)에서 히알루론산의 농도는 히알루론산 알칼리 수용액에서의 고체 성분의 중량을 기준으로 1% 내지 50%인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  9. 제 7 항에 있어서, 상기 단계(a)에서 알칼리 수용액에 염화나트륨을 더 첨가하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  10. 제 7 항에 있어서, 상기 단계(a)에서 가교제의 첨가량은 히알루론산 반복 단위(repeating unit)당 0.01 당량% 내지 50 당량%인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  11. 제 7 항에 있어서, 상기 단계(b)에서 가교제가 포함된 히알루론산 알칼리 수용액을 상기 유기용매에 떨어뜨려 고화시킬 때 그 형태를 구형의 입자 또는 실의 형태로 만드는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  12. 삭제
  13. 제 7 항에 있어서, 상기 히알루론산 가교물은 마이크로비드, 실, 하이드로겔, 필름 또는 스폰지 형상을 가지는 것을 특징으로 하는 제조방법.
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