CN111670204B - 低分子量肝素的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种改进的依诺肝素钠的制备方法。该方法简单，商业可行并且有工业化优势。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求于2017年12月11日提交的印度临时专利申请号201741044415的优先权，其全部内容通过引用并入本文中。
技术领域
本发明涉及一种低分子量肝素的制备方法。更具体地，本发明涉及一种改进的依诺肝素钠的制备方法。
背景技术
肝素是生物活性剂，是从自然资源中提取的，具有重要的抗凝和抗血栓形成的特性。特别地，它们可用于治疗术后静脉血栓形成。
低分子量肝素通过肝素的化学或酶促解聚制备。在不同国家/地区获得批准和销售的低分子量(LMW)肝素包括依诺肝素(Enoxaparin)、达肝素(Dalteparin)、那屈肝素(Nadroparin)、帕肝素(Parnaparin)、亭扎肝素(Tinzaparin)、贝米肝素(Bemiparin)和舍托肝素(Certoparin)。
依诺肝素钠由赛诺菲-安万特(Sanofi-Aventis)生产，并以注射剂的形式在美国和欧洲出售，商标名称分别为
依诺肝素钠是由猪肠粘膜衍生的肝素钠为原料，经碱解聚肝素苄酯盐来制备。多种报道/专利/专利出版物公开了依诺肝素钠的制备方法。例如，EP0040144、EP0337327、US5849721和USRE38743公开了一种依诺肝素钠的制备方法，其主要包括以下步骤：制备肝素苄索铵盐(benzethonium heparinate)，制备肝素苄酯钠盐和碱性解聚肝素苄酯钠盐。
此外，以下专利/专利公开文本中公开了为满足药典要求，对依诺肝素钠制备方法的各种改进，例如在过滤材料或助滤剂的惰性吸附固体基质上制备肝素苄索铵盐，使用硼氢化钠对依诺肝素钠进行纯化，从而减少杂质(EP1510528)；通过尽量减少苄基氯物质的使用生产肝素酯(US20030236221)；使用二氯甲烷溶剂进行酯化(CN100582123C、CN104086674B和CN104558252B)；乙醇沉淀肝素苄酯(CN101974107B)；乙醇沉淀肝素苄酯并在pH 10-11下用过氧化氢脱色(CN102050888B)；使用特定浓度的氢氧化钠进行解聚(CN106432547A)；纯化方法(CN100436483C、CN102040673B、CN102603925B、CN102924629B、CN103342761B和CN103804523B)；肝素钠预处理(CN106977627A)；在50-60℃下成盐，在DMF和DMSO中酯化，乙醇沉淀肝素苄酯(RU2512768C1)；用超声洗涤肝素苄索铵盐产品，用甲醇沉淀肝素苄酯，并用饱和乙酸钠甲醇溶液除去苄索铵对磺基的保护(RU2670767C1)。
现有技术中描述的方法公开了酯化和解聚的程度对于获得具有所需分子量的依诺肝素钠至关重要，并且在制备的每个阶段都有收率损失，并且还涉及使用大量溶剂。在现有技术的方法中，在酯化阶段，通过加入乙酸钠的甲醇溶液来淬灭反应，得到呈粘稠硬质团块的肝素苄酯，其粘在反应器和搅拌器叶片的壁上，从而在分离肝素苄酯钠盐中造成困难，因此在商业规模上存在操作困难。
因此，需要开发一种改进的方法，该方法在每个阶段都应格外小心，以通过减少杂质含量和使用最小量的试剂和溶剂来提高依诺肝素钠的收率，从而减少总体生产成本。
发明内容
发明人发现，向含有肝素苄酯的反应混合物中加入水会使肝素苄酯团块沉淀，该沉淀物易于加工用于进一步反应而没有任何困难，并且将粗制的依诺肝素钠在约9-10的pH下用过氧化氢脱色，得到的产品符合颜色标准要求。该方法简单，商业可行并且有工业化优势。因此，本发明提供了一种改进的制备依诺肝素钠的方法，包括以下步骤：
a)用苄索氯铵使肝素钠成盐以形成肝素苄索铵盐，
b)将步骤(a)中得到的肝素苄索铵盐与苄基氯在惰性溶剂中反应以形成粗制肝素苄酯，
c)在0℃至室温的温度下向步骤(b)中得到的含有粗制肝素苄酯的反应混合物中加入水，以得到肝素苄酯沉淀物，
d)向步骤(c)中得到的含有肝素苄酯沉淀物的反应混合物中加入乙酸钠的醇溶液，以分离出肝素苄酯钠盐，
e)将步骤(d)中得到的肝素苄酯钠盐解聚，以产生粗制依诺肝素钠，
f)将步骤(e)中获得的粗制依诺肝素钠在约9-10的pH下脱色，以得到脱色的依诺肝素钠，和
g)纯化脱色的依诺肝素钠。
具体实施方式
在更详细地描述本公开的方法之前，应理解，该方法不限于所描述的特定实施例，其应当可以变化。还应理解，本文使用的术语仅是出于描述特定实施方案的目的，而不是旨在限制，因为本方法的范围将仅由所附权利要求书限制。
在提供数值范围的情况下，应理解为，除非上下文另有明确规定，否则本方法涵盖在所述范围的上限与下限之间的每个中间值(到下限单位的十分之一)和所述范围中的任何其他所述或中间值。这些较小范围的上限和下限可以独立地包括在较小范围内，并且也包括在方法的范围内，但要遵守所述范围内任何明确排除的限制。在规定的范围包括一个或两个限值的情况下，本方法中还应包括排除其中一个或两个限值的范围。
本文给出了某些范围，在数值之前加上术语“约”。术语“约”在本文中用于对其后的确切数字以及对接近或近似于该术语后面的数字的数字提供文字支持。在确定某一数字是否接近或近似于具体列举的数字时，接近或近似的未列举的数字可以是给出该数字的上下文中提供与具体列举的数字基本等值的数字。
在一个实施方案中，本发明提供了一种制备依诺肝素钠的方法，包括以下步骤：
a)用苄索氯铵使肝素钠成盐以形成肝素苄索铵盐，
b)将步骤(a)中得到的肝素苄索铵盐与苄基氯在惰性溶剂中反应以形成粗制肝素苄酯，
c)在0℃至室温的温度下向步骤(b)中得到的含有粗制肝素苄酯的反应混合物中加入水，以得到肝素苄酯沉淀物，
d)向步骤(c)中得到的含有肝素苄酯沉淀物的反应混合物中加入乙酸钠的醇溶液，以分离肝素苄酯钠盐，
e)将步骤(d)中得到的肝素苄酯钠盐解聚，以得到粗制依诺肝素钠，
f)将步骤(e)中得到的粗制依诺肝素钠在约9-10的pH下脱色，得到脱色的依诺肝素钠，和
g)纯化脱色的依诺肝素钠。
在某些实施方案中，肝素苄索铵盐可以通过在水性介质中，在20℃至40℃的温度下化学计量过量的苄索氯铵与肝素钠的相互作用来制备。
对于酯化(步骤b)，用于溶解肝素苄索铵盐的惰性溶剂选自N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、N,N-二甲基乙酰胺(DMA)、二氯甲烷(DCM)等。肝素苄索铵盐、惰性溶剂和苄基氯的比例可为1∶2∶1至1∶6∶1。肝素苄索铵盐与苄基氯的反应在室温至70℃的温度下进行1至20小时，优选在30至55℃下进行5至15小时。如本文所用，术语“室温”是指18℃至35℃。
反应完成后，按照现有技术方法获得的肝素苄酯是硬而粘的团块，难以从加工设备中提取，并且需要大量的乙酸钠的醇溶液，导致明显的产率损失。
根据本发明，令人惊讶地发现，向含有粗制肝素苄酯的反应混合物中加入少量水产生固体，该固体易于在工艺设备中进行处理，以进行进一步反应。加水克服了现有技术方法中分离的缺点，并避免了使用大量的乙酸钠的醇溶液。因此，使肝素苄酯产物易于沉淀，提高了产物的总产率和质量。例如，对于1gm的肝素苄索铵盐，使用2至6ml的纯化水沉淀出肝素苄酯。
在本发明的另一个实施方案中，向步骤(b)获得的含有粗制肝素苄酯的反应混合物中加入水的操作在0至25℃的温度下进行15分钟至4小时。在另一个实施方案中，对于1Kg的粗制肝素苄酯，使用7升的乙酸钠甲醇溶液。
在一个优选的实施方案中，向含有粗制肝素苄酯的反应混合物中加入水的操作在10至20℃的温度下进行。
在另一个实施方案中，钠盐形式的肝素苄酯通过加入乙酸钠的醇溶液来分离，其中醇选自甲醇、丙醇、异丙醇和其混合物。
然后，根据步骤(e)，通过用无机碱的水溶液处理肝素苄酯钠盐来进行解聚。在某些实施方案中，无机碱是碱性氢氧化物，例如氢氧化钠。无机碱与肝素苄酯钠盐的比例可以为0.05至0.2重量％，优选为0.08至0.15重量％。在某些实施方案中，解聚在50℃至70℃，优选55℃至65℃的温度下进行30分钟至3小时，优选1至2小时。在另一个实施方案中，解聚1重量份肝素苄酯钠盐通过将其与0.08至0.15重量份的氢氧化钠以及20至30重量份的水混合，然后将所得的混合物在55℃至65℃的温度下保持1至2小时，以得到粗制依诺肝素钠。
然后将粗制依诺肝素钠进行脱色(步骤(f))以得到脱色的依诺肝素钠。在某些实施方案中，通过在约9-10的pH下使用30％的过氧化氢来改善依诺肝素钠的颜色。所得产物为无色或白色。在某些实施方案中，通过以下操作进行脱色步骤：将pH调节至约9-10，加入30％的过氧化氢溶液，在保持pH恒定为约9-10下将混合物搅拌约45分钟至90分钟，将pH再调节至6-7，加入终浓度为5-15％(w/v)的量的氯化钠，然后用醇(例如甲醇和乙醇)沉淀。在进一步的实施方案中，通过以下操作进行脱色步骤：将pH调节至约9.7±1，加入30％的过氧化氢溶液，在保持pH恒定为约9.7±1下将混合物搅拌约60分钟，将pH再调节至6.0±0.1，加入终浓度为约10％(w/v)的量的氯化钠，然后用甲醇(3.6倍体积)沉淀。然后将沉淀的产物过滤并在55℃下真空干燥9小时以获得脱色的依诺肝素钠。
脱色步骤后获得的脱色产物通过下列操作进行纯化：将其溶解在水中，加入氯化钠，用甲醇沉淀并过滤，得到纯的依诺肝素钠。
在某些实施方案中，通过溶解在水和醇的混合物中来冻干纯化的依诺肝素钠以获得粉末形式的依诺肝素钠。在某些实施方案中，所述醇选自甲醇、乙醇、异丙醇和其混合物。在进一步的实施方案中，溶剂是水和乙醇的混合物。在某些实施方案中，通过将纯的依诺肝素钠溶解在含有浓度为85至95％(v/v)的水和浓度为5至15％(v/v)的醇的溶剂混合物中来进行冻干。如果如现有技术中所述仅使用水，则需要更长的冻干时间并且产生的依诺肝素钠为具有残留水分的饼状物。
在某些实施方案中，本发明提供了一种制备依诺肝素钠的方法，其包括以下步骤：
a)用苄索氯铵使肝素钠成盐以形成肝素苄索铵盐，
b)将步骤(a)中获得的肝素苄索铵盐与苄基氯在N,N-二甲基甲酰胺中在室温至70℃的温度下反应1至20小时以获得粗制肝素苄酯，其中肝素苄索铵盐、N,N-二甲基甲酰胺和苄基氯的比例为1∶2∶1至1∶6∶1，
c)在10至25℃的温度下向步骤(b)中获得的含有粗制肝素苄酯的反应混合物中加入水，搅拌15分钟至4小时，以沉淀出肝素苄酯，
d)向步骤(c)中获得的含有沉淀物的反应混合物中加入乙酸钠的醇溶液以分离肝素苄酯钠盐，
e)将步骤(d)中获得的肝素苄酯钠盐解聚以产生粗制依诺肝素钠，
f)用30％的过氧化氢在约9-10的pH下将步骤(e)中获得的粗制依诺肝素钠脱色，以得到脱色的依诺肝素钠，和
g)纯化步骤(f)中获得的脱色产物，然后冻干以获得粉末形式的依诺肝素钠。
在某些实施方案中，本发明的方法可用于生产平均分子量在4000至5500道尔顿之间，且具有12％至20％分子量小于2000道尔顿的级分和68％和88％分子量为2000至8000道尔顿的级分的依诺肝素钠。此外，本发明制备的依诺肝素钠符合美国药典要求，并且在理化性质的等效性，解聚方式，以及二糖结构单元、片段图和低聚糖种类序列的等效性方面符合同一性标准。
参考以下实施例进一步描述本公开，提供这些实施例以举例说明本发明，并且仅出于说明目的，不应解释为限制本发明的范围。
实施例
实施例1-4代表根据本发明的肝素苄酯或其盐的制备。
实施例1
步骤a：将1718g水和275g苄索氯铵加入到圆底烧瓶中，并在室温下搅拌直至溶解。将1000g水和100g肝素钠加入另一个圆底烧瓶中，并搅拌使其溶解。将苄索氯铵的水溶液缓慢加入肝素钠溶液中并保持2.5小时。然后，过滤反应物料，并将所得滤饼用水反复洗涤。将湿滤饼在50℃下真空干燥9小时，获得291.6g肝素苄索铵盐。通过HPLC测量，苄索铵根含量为71.4％。
步骤b：将50g肝素苄索铵盐(在步骤(a)中获得)和189.6g DMF进料到合适的反应器中并在室温下搅拌以溶解，然后添加22.0g苄基氯并搅拌反应物料10小时。通过在15至20℃下添加220.0g的水来淬灭反应混合物，从而沉淀出肝素苄酯，将反应混合物静置并倾析出上清液以将肝素苄酯湿固体保留在反应器中。湿固体用10％乙酸钠的甲醇溶液洗涤，然后用甲醇洗涤，过滤并干燥，得到14.8g肝素苄酯钠盐。通过HPLC测量，获得的酯的苄醇含量为10.7％。
实施例2
将50g肝素苄索铵盐(在实施例1的步骤(a)中获得)和189.6g DMF进料到合适的反应器中，并在室温下搅拌以溶解，然后加入22.0g苄基氯，搅拌反应物料15小时。通过在10至20℃下添加220.0g的水来淬灭反应混合物，从而沉淀出肝素苄酯，将反应混合物静置并倾析出上清液以将肝素苄酯湿固体保留在反应器中。湿固体用10％乙酸钠的甲醇溶液洗涤，然后用甲醇洗涤，过滤并干燥，得到15.2g肝素苄酯钠盐。通过HPLC测量，获得的酯的苄醇含量为11.5％。
实施例3
将10g肝素苄索铵盐(在实施例1的步骤(a)中获得)和37.92g DMF加入合适的反应器中并在室温下搅拌以溶解，然后加入4.4g苄基氯，搅拌反应物料6小时。通过在10至15℃下添加44.0g水淬灭反应混合物来沉淀出肝素苄酯，将反应混合物静置并倾析出上清液以将肝素苄酯湿固体保留在反应器中。湿固体用10％乙酸钠的甲醇溶液洗涤，然后用甲醇洗涤，过滤并干燥，得到3.19g肝素苄酯钠盐。通过HPLC测量，获得的酯的苄醇含量为6.6％。
实施例4
将70g肝素苄索铵盐(在实施例1中的步骤(a)中获得)和265.44g DMF加入合适的反应器中并在室温下搅拌以溶解，随后加入38.5g苄基氯，然后将反应物料搅拌15小时。通过在10至20℃下添加308.0g的水淬灭反应混合物来沉淀出肝素苄酯，将反应混合物静置并倾析出上清液以将肝素苄酯湿固体保留在反应器中。湿固体用10％乙酸钠的甲醇溶液洗涤，然后用甲醇洗涤，过滤并干燥得到21.4g肝素苄酯钠盐。通过HPLC测量，获得的酯的苄醇含量为11.1％。
实施例5：根据本发明的依诺肝素钠的制备：
步骤a：将1718g水和275g苄索氯铵加入到圆底烧瓶中，在室温下搅拌溶解。将1000克水和100克肝素加入另一个圆底烧瓶中，并搅拌使其溶解。将苄索氯铵的水溶液缓慢加入肝素溶液中并保持2.5小时。然后将物料过滤，并将获得的滤饼用水反复洗涤。将湿滤饼在50℃下真空干燥9小时，以获得291.6g肝素苄索铵盐。通过HPLC测量，苄索铵根含量为71.4％。
步骤b：将70g步骤(a)中获得的肝素苄索铵盐和265.44g N,N-二甲基甲酰胺加入到圆底烧瓶中并搅拌，随后缓慢加入21.17g苄基氯，将反应物料在室温下搅拌7小时。
步骤c：通过在10至20℃下添加308.0g水淬灭反应混合物，沉淀出肝素苄酯，将反应混合物静置并倾析出上清液以将肝素苄酯湿固体保留在反应器中。
步骤d：将步骤(c)中获得的湿固体用10％乙酸钠的甲醇溶液洗涤，然后用甲醇洗涤，过滤并干燥，得到21.2g肝素苄酯钠盐。通过HPLC测量，获得的酯的苄醇含量为7.4％。
步骤e：将在步骤(d)中获得的10.0g肝素苄酯钠盐悬浮在297ml的纯化水中，并在搅拌下加热到60°±1℃，然后添加33ml的1N氢氧化钠溶液。将混合物在60℃±1℃下搅拌60分钟。
步骤f：将步骤(e)中获得的溶液冷却至室温，并用1N盐酸将pH调节至9.7±1。加入4.0ml 30％过氧化氢溶液，将混合物搅拌60分钟，搅拌过程中通过加入1N氢氧化钠溶液将pH保持恒定在9.7±1。然后用1N盐酸将pH再调节至6.0±0.1，向反应混合物中加入足以达到10％(w/v)的量的氯化钠。加入3.6倍体积甲醇使产物沉淀，过滤并在55℃下真空干燥9小时，得到7.03gm粗制的依诺肝素钠。
步骤g：将在步骤(f)中获得的粗制依诺肝素钠(5gm)悬浮在50ml纯化水中并溶解。加入5克氯化钠并搅拌。加入150ml甲醇使产物沉淀，过滤并在55℃真空干燥9小时，得到4.39gm依诺肝素钠。
步骤h：将75mL的水装入100mL的三颈圆底烧瓶中，然后加入8.33mL的乙醇。向其中加入在步骤(g)中获得的依诺肝素钠，搅拌使其溶解，通过0.22μ过滤器过滤溶液，并将溶液装入冻干盘中并冷冻干燥，从而获得粉末形式的依诺肝素钠(4.2gm)。
通过尺寸排阻-高效液相色谱SEC-HPLC测定分子量分布和重均分子量：
| Mw | M<sub>2000</sub> | M<sub>8000</sub> | M<sub>2000-8000</sub> |
| 4283 | 18.5 | 10.5 | 71.1 |
所获得的依诺肝素钠满足美国药典要求，并且在理化性质的等效性，解聚方式，以及二糖结构单元、片段图和低聚糖种类序列的等效性方面符合同一性标准。
比较例6：肝素苄酯钠盐的制备(不加水)：
将205g肝素苄索铵盐(在实施例1中的步骤(a)获得)和774g DMF加入合适的反应器中并在室温下搅拌以溶解，将温度升至60℃。缓慢添加62g的苄基氯，然后将反应物料搅拌15小时。将反应混合物在55℃下添加到乙酸钠在甲醇和水(分别为307g，l264g和451g)中的溶液中。形成了坚硬的固体，在55℃左右保持2小时，并用10％乙酸钠的甲醇溶液洗涤，然后用甲醇洗涤，干燥得到44.2g的肝素苄酯钠盐。通过HPLC测量，获得的酯的苄醇含量为11.06％。
因此，该比较例表明，向粗制肝素苄酯中加水可增加酯的收率，从而增加依诺肝素钠的收率。
Claims (14)
1.一种制备依诺肝素钠的方法，包括以下步骤：
a)用苄索氯铵使肝素钠成盐以形成肝素苄索铵盐，
b)将步骤(a)中得到的肝素苄索铵盐与苄基氯在惰性溶剂中反应以形成粗制肝素苄酯，
c)在0℃至室温的温度下向步骤(b)中得到的含有粗制肝素苄酯的反应混合物中加入水，以得到肝素苄酯沉淀物，
d)向步骤(c)中得到的含有肝素苄酯沉淀物的反应混合物中加入乙酸钠的醇溶液，以分离肝素苄酯钠盐，
e)将步骤(d)中得到的肝素苄酯钠盐解聚，以产生粗制的依诺肝素钠，
f)将步骤(e)中获得的粗制依诺肝素钠在9-10的pH下脱色，以得到脱色的依诺肝素钠，和
g)纯化脱色的依诺肝素钠。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的惰性溶剂选自N,N-二甲基甲酰胺DMF、N,N-二甲基乙酰胺DMA和二氯甲烷。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，苄索氯铵、惰性溶剂和苄基氯的比例为1∶2∶1至1∶6∶1。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，向步骤(b)中获得的含有粗制肝素苄酯的反应混合物中加入水的操作在10至25℃的温度下进行15分钟至4小时。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，解聚是通过将肝素苄酯钠盐用无机碱的水溶液在50℃至70℃的温度下处理30分钟至3小时来进行的。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的无机碱与肝素苄酯钠盐的重量比为0.05-0.2。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的无机碱是氢氧化钠。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，脱色使用30％过氧化氢进行。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，脱色的依诺肝素钠的纯化是通过将其溶解在水中，加入氯化钠并用醇沉淀来进行的。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，将纯化后的依诺肝素钠进行冻干以获得粉末形式的依诺肝素钠。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，冻干是通过将纯的依诺肝素钠溶解在水和醇的混合液中进行的。
12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述的醇选自甲醇、乙醇、异丙醇和其混合物。
13.如权利要求10所述的方法，其特征在于，冻干是在水和乙醇的混合物中进行的。
14.如权利要求11所述的方法，其特征在于，水和醇的浓度分别为85至95％v/v和5至15％v/v。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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