KR20220149736A - 생태학적으로 허용 가능한 용매 내 다당류의 직접적인 황산화 방법 - Google Patents

생태학적으로 허용 가능한 용매 내 다당류의 직접적인 황산화 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20220149736A
KR20220149736A KR1020227034358A KR20227034358A KR20220149736A KR 20220149736 A KR20220149736 A KR 20220149736A KR 1020227034358 A KR1020227034358 A KR 1020227034358A KR 20227034358 A KR20227034358 A KR 20227034358A KR 20220149736 A KR20220149736 A KR 20220149736A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
sulfate
salt
chondroitin sulfate
molecular weight
polysaccharide
Prior art date
Application number
KR1020227034358A
Other languages
English (en)
Inventor
파올라 바짜
다비데 비안키
아우로 로베르토 탈리아니
Original Assignee
르사프르 에 꽁빠니
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 르사프르 에 꽁빠니 filed Critical 르사프르 에 꽁빠니
Publication of KR20220149736A publication Critical patent/KR20220149736A/ko

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
    • C08B37/006—Heteroglycans, i.e. polysaccharides having more than one sugar residue in the main chain in either alternating or less regular sequence; Gellans; Succinoglycans; Arabinogalactans; Tragacanth or gum tragacanth or traganth from Astragalus; Gum Karaya from Sterculia urens; Gum Ghatti from Anogeissus latifolia; Derivatives thereof
    • C08B37/0063—Glycosaminoglycans or mucopolysaccharides, e.g. keratan sulfate; Derivatives thereof, e.g. fucoidan
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
    • C08B37/006—Heteroglycans, i.e. polysaccharides having more than one sugar residue in the main chain in either alternating or less regular sequence; Gellans; Succinoglycans; Arabinogalactans; Tragacanth or gum tragacanth or traganth from Astragalus; Gum Karaya from Sterculia urens; Gum Ghatti from Anogeissus latifolia; Derivatives thereof
    • C08B37/0063—Glycosaminoglycans or mucopolysaccharides, e.g. keratan sulfate; Derivatives thereof, e.g. fucoidan
    • C08B37/0069—Chondroitin-4-sulfate, i.e. chondroitin sulfate A; Dermatan sulfate, i.e. chondroitin sulfate B or beta-heparin; Chondroitin-6-sulfate, i.e. chondroitin sulfate C; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
    • C08B37/006—Heteroglycans, i.e. polysaccharides having more than one sugar residue in the main chain in either alternating or less regular sequence; Gellans; Succinoglycans; Arabinogalactans; Tragacanth or gum tragacanth or traganth from Astragalus; Gum Karaya from Sterculia urens; Gum Ghatti from Anogeissus latifolia; Derivatives thereof
    • C08B37/0063—Glycosaminoglycans or mucopolysaccharides, e.g. keratan sulfate; Derivatives thereof, e.g. fucoidan
    • C08B37/0075—Heparin; Heparan sulfate; Derivatives thereof, e.g. heparosan; Purification or extraction methods thereof

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

본 발명은 생태학적으로 허용 가능한 용매를 사용하여 비보호 당(unprotected sugars), 특히 다당류의 직접적인 황산화를 수득하기 위한 신규한 방법에 관한 것이다.

Description

생태학적으로 허용 가능한 용매 내 다당류의 직접적인 황산화 방법
본 발명은 생태학적으로 허용 가능한 용매를 사용한 신규한 황산화 방법, 특히 당의 황산화 방법에 관한 것이다; 그 방법은 다당류에도 적용 가능하며, 콘드로이틴 황산염과 같은 황산화된 글리코사미노글리칸의 제조를 가능하게 한다. 이러한 유형의 반응은 일반적으로 디메틸포름아미드, 디메틸아세트아미드 등과 같은 높은 환경적 영향을 갖는 독성 용매 내에서 수행된다. 생태학적으로 허용 가능한 용매인 아세트산 내에서 황산화 반응이 우수한 전환율, 우수한 황산화 정도의 제어 및 우수한 화학선택성(chemoselectivity)을 나타내며 수행될 수 있다는 것은 이전에 알려지지 않은 발견이다. 또한, 상기 방법은 히드록실기 보호/탈보호 단계가 필요 없으며, 비보호당(unprotected sugars)에 직접적으로 적용될 수 있다. 이는 또한 광범위한 분자량의 다당류에 적용 가능하다. 특히, 이는 글리코사미노글리칸에 적용될 수 있으며, 헤파린(heparin), 케라탄 황산염(keratan sulfate), 데르마탄 황산염(dermatan sulfate) 및 콘드로이틴 황산염(chondroitin sulfate)의 제조에 유용할 수 있다.
글리코사미노글리칸(GAGs, 또는 뮤코다당류)은 단순당과 아미노당이 번갈아 나오는 이당류의 직쇄형 사슬로 형성되는 다당류의 군이며; 하나 이상의 황산염기(sulfate group)가 이당류 상의 다양한 위치에 존재할 수 있다. 그들은 많은 동물 조직에 존재하며, 특히 일반적으로 피부, 연골, 및 연조직과 같은 결합 조직에 풍부하다. GAG는 헤파린 및 헤파란 황산염, 콘드로이틴 황산염, 데르마탄 황산염, 케라탄 황산염 및 히알루론산을 포함하며; 후자가 황산염기가 없는 유일한 것이다. 글리코사미노글리칸은 기원의 동물 종 및 기관 또는 조직에 따라 서로 다른 황산화 프로파일 및 서로 다른 분자량을 가질 수 있다.
콘드로이틴 황산염은 N-아세틸글루코사민 및 글루쿠론산으로 구성되는 글리코사미노글리칸이며, 그 이당류 상의 다양한 위치에 황산염기가 존재하고, 이는 일반적으로 다양한 동물 조직에 존재한다; 이는 사람 내 가장 풍부한 GAG이며, 특히 연골에서 발견된다. 이는 현재, 퇴행성 관절염(osteoarthritis) 및 기타 염증성 관절 질병, 특히 무릎 및 손의 관절 질병의 치료를 위한, 사람용 및 수의과용의 주사용 약물 및 기능성 식품(nutraceutical) 제품으로서 사용된다.
CS는 보통 식품 산업, 특히 소 및 돼지와 같은 사육 동물로부터 또는 어업, 특히 상어 유래 부산물로서 얻어진다. 기원의 조직 및 종에 따라, 콘드로이틴 황산염은 서로 다른 특성, 특히 서로 다른 황산화 프로파일 및 서로 다른 분자량을 가지며; 후자는 또한 사용된 제조 방법에 의해 영향받을 수 있다. CS는 이를 구성하는 이당류의 서열에 기초하여 분류될 수 있고; 황산염기는 이당류 상에서 그리고 두개의 당 모두에서 다른 위치에(주로 2, 4 및 6 위치에) 존재할 수 있으며; 콘드로이틴 A 및 C는 오직 하나의 황산염기를 갖는 반면, B, E 및 D는 두개의 황산염기를 갖는다. 비황산화 및 3황산화된 콘드로이틴 또한 존재할 수 있다.
시장에 나와 있는 동물 기원 CS 조성물은 기원의 종 및 조직에 따라 다르고; 분자량 또한 다르며, 일반적으로 해양 기원의 생성물에서 더 높고 육생 동물로부터 수득한 생성물에서 더 낮다. 또한, 동물 기원의 CS는 중합체의 분자량의 면에서 매우 다차원적인 혼합물로서 존재하며, 이는 짧은-사슬(수 kDa), 중간-사슬 및 긴-사슬(100 kDa 초과)의 다당류의 혼합물로 구성되기 때문이다. CS의 특성을 기술하기 위해, 평균 분자량 값과 함께 이의 다분산성(분자량의 평균 주변 분포) 또한 나타내었다. 생성물의 기원(product origin)에 의한 조성물에 관한 설명은 WO2012/159655, pp. 2-3, 표 1에서 찾을 수 있다.
CS(또는 다른 글리코사미노글리칸)의 평균 원래 분자량은 또한 다당류의 제어된 단편화로 인해 원하는 대로 감소될 수 있으며; 낮은 평균 분자량의 동물 기원 CS(LMW-CS)에서, 다당류 사슬이 산 및 라디칼 가수분해 모두에서 무작위적으로 단편화되기 때문에 다분산도가 일반적으로 더 높다.
생성물의 열악한 표준화 외에도, CS가 동물 기원이라는 사실은 기원 동물에서 사람 또는 애완 동물로 전염될 수 있는 질병과 관련된 것과 같은 다른 위험성을 분명히 수반한다.
동물 기원의 단점을 극복하기 위해, 반합성(semisynthesis)을 통해 수득되는 콘드로이틴 황산염의 생산이 최근 개발되었다; K4로 불리는 비황산화 전구체는 발효를 통해 생산되며, 이후 콘드로이틴 황산염으로 전환된다. K4는 콘드로이틴과 동일한 선형 구조를 갖지만, 과당 잔기를 가지며 황산염기가 없는 다당류이다; 이는 또한 WO2001/02597A1에 개시된 바와 같이, 예를 들어 대장균 O5:K4:H4유래의 발효를 통해 생산될 수 있다. K4는 화학적 가수분해에 의해 쉽게 탈과당화될 수 있으며, 이는 비황산화 콘드로이틴의 구조에 해당하는 K4d라고 불리는 선형 중합체를 생성하며, 이로부터 CS가 수득된다.
대안적으로, K4d 다당류는 WO2012/004063에 기재된 바와 같이 적합한 재조합 미생물 균주를 사용하여 발효에 의해 직접 생산될 수도 있다.
이후 K4d 다당류의 황산화는, 황산염기의 도입 위치, 일반적으로 4 위치 또는 6 위치에서의 황산화 정도(이당류 단위 당 황산염기의 수)를 조절하기 위해 제어된 조건 하에서 일어날 수 있다. 분자량은 또한 예를 들어 고분자량 중합체를 산 또는 라디칼 가수분해에 적용함으로써 조절될 수 있으며; 이는 황산화 전 또는 후 모두, 즉 K4d 다당류 및 콘드로이틴 황산염 모두에서 수행될 수 있다. 변형이 가능한 이 방법은 원하는 황산화 프로파일을 가지며 탁월한 신뢰도를 갖고 동물 기원 생성물의 단점 특성이 없는 콘드로이틴 황산염을 생성한다(US2019/231810).
K4d 중합체의 황산화 반응은 지금까지 다양한 황산화제로 수행되었지만 항상 무수 유기 용매, 특히 디메틸포름아미드(DMF)를 사용였으며; 이는 낮은 생태-독성 영향 방법이 아니다.
DMF는 가연성일 뿐만 아니라 사람 및 환경에도 위험하므로 특별한 주의가 필요한 용매이며; 이는 피부 및 눈, 호흡기계 및 생식기계에 유독하다. 이는 또한 피부에 닿거나 흡입하면 유해하므로 특히 위험하다. 독성 특성의 면에서, 환경적 비용 또한 매우 높으며; DMF를 함유하는 폐수의 재생(recovery) 및 처리는 비용이 많이 든다. 디메틸아세트아미드 또는 N-메틸 피롤리돈은 황산화반응에서 DMF의 대안으로서 사용될 수 있으나, 유사한 생태-독성 문제를 나타낸다.
DMF는 또한 황산화제를 위한 우수한 용매이다; 예를 들어, in Chopin et al., BioMed Research International 2015, Article ID508656에서, 글리코사미노글리칸은 이온성 액체를 반응 용매로서 사용하여 황산화되지만, 황산염기 공여체(다양한 유기 염기를 갖는 SO3 착물)를 용해시키기 위해 DMF가 여전히 사용된다. 더욱이, DMF는 SO3와 착물을 형성하며, 이는 가능한 황산화제를 구성한다.
DMF의 대안으로서, 아세토니트릴이 마이크로파 방사선으로 수행되는 반응에서 용매로 사용될 수 있으며; 예를 들어, de Paz Carrera et al., WO2012/035188를 참조바란다. 다당류 포함 유기 분자의 황산화 반응에 대한 일반적인 설명은 Desai et al., Tetrahedron 66, 2907-18 (2010)의 리뷰 논문에서 찾을 수 있다.
정의
K4: 하기 화학식 구조를 갖는, 과당화된 비황화 글리코사미노글리칸 다당류:
Figure pct00001
K4d: 하기 화학식 구조를 갖는, 과당 잔기가 없는 비황화 글리코사미노글리칸 다당류:
Figure pct00002
콘드로이틴 황산염: 하기 화학식 구조를 갖는, 황산화된 글리코사미노글리칸 다당류:
Figure pct00003
본 발명의 상세한 설명
본 발명의 황산화 방법은 생태학적으로 허용 가능한 용매인 아세트산 사용을 허용하는 동시에 그의 진행, 즉 황산화 정도 및 황산염기의 도입 위치, 즉 이의 선택성의 면에서 우수한 제어를 유지한다. 또한, 이 방법에는 보호 및 탈보호 단계가 필요하지 않아 원료를 절약하고 폐수 생산을 줄일 수 있다. 이 방법은 분자량(MW)의 증가를 수반하는데, 이는 새로운 황산염기의 도입과 전적으로 연관되지만 중합체 길이에 영향을 미치지 않거나 제어된 방식으로만 영향을 미치며, 특히 단편화를 생성하지 않는다; 따라서 LMW-CS가 필요한 경우, 최종 생성물의 MW는 합성 방법(황산화 전에, K4d 다당류의 제어된 단편화 또는 황산화 후에, 콘드로이틴 황산염에 대한 제어된 단편화) 및 분리 방법(침전 또는 한외여과에 의한 분리)을 결합하여 원하는 대로 조절될 수 있다. 따라서 상기 신규한 방법은 영양 및 제약 분야에서 사용하기에 적합한 원하는 황산화 프로파일, 분자량 및 다분산성을 갖는 CS를 생산한다.
본 발명의 방법은 무공해 용매의 사용 및 더 적은 폐수 생산으로 인해 더 낮은 생태학적 영향을 미친다. 상기 방법의 바람직한 구체예에서, 생성된 생성물은 저분자량 콘드로이틴 황산염의 나트륨 염이다.
가능한 일 구체예에서, K4d 중합체 염, 바람직하게는 테트라알킬암모늄 염, 보다 바람직하게는 피리디늄 염 또는 테트라메틸-, 테트라에틸- 또는 테트라부틸-암모늄 염이 황산화된다. 대안적인 구체예에서, 산 형태의 K4d 다당류가 사용된다.
일 구체예에서, 유기 염기와의 SO3 착물, 예를 들어 SO3Py 또는 SO3NEt3, DMF와의 SO3 착물 등이 황산화제로서 사용된다. 대안적인 구체예에서, 염화술폰산은 황산화제로서 사용된다.
일 구체예에서, 아세트산을 용매로서 사용하여 황산화 반응을 수행한다.
본 발명의 방법은 하기를 포함한다:
a) 글리코사미노글리칸 또는 이의 염과 같은 다당류를 아세트산에 용해 또는 현탁시키는 단계,
b) 황산화제를 부가하는 단계,
c) 제어된 온도 조건 하에서, 예를 들어, 반응 혼합물을 아세트산 또는 이의 황산화될 다당류와의 혼합물의 어는점 내지 70℃, 보다 바람직하게는 10 내지 50℃, 보다 더 바람직하게는 10 내지 20℃로 유지하며 반응을 수행하는 단계,
d) 예를 들어 직접 여과(direct filtration), 유기 용매 내 침전, 또는 크로마토그래피를 통해 반응 용매로부터 생성물을 분리하는 단계,
e) 선택적으로, 글리코사미노글리칸 황산염 용액으로부터 유기 또는 무기 염 및 기타 불순물을, 예를 들어 투석을 통해, 제거하는 단계,
f) 선택적으로, 원하는 생성물 분리 후에 수득 가능한 반응 용매를 재생(recover)하고, a)에 기술된 반응에 재사용하는 단계.
그렇게 함으로써 원하는 생성물의 용액이 영양 분야에서 사용하기에 충분히 순수한 형태로 수득되며; 고체 형태의 생성물을 수득하는 것을 원하는 경우, 그 용액을 동결-건조, 분무-건조 또는 기타 적합한 방법으로 건조시킬 수 있다.
주사용으로 적합한 품질의 반응 생성물을 수득하기 위해, 예를 들어 탄소를 이용한 발열원 제거 후 건조 전에 멸균 여과를 함으로써 상기 용액에서 발열원을 제거하는 것이 바람직하다.
완전한 방법은 WO2001/02597A1에 개시된 바와 같이 야생형 대장균 균주 O5:K4:H4의 발효에 의해 수득된 캡슐 다당류 K4의 생산으로 시작된다. 바이오매스 분리 후, 제어된 조건 하 상청액을 가수분해하여 과당 잔기 제거하면; 비황산화 콘드로이틴에 해당하는 K4d 다당류의 수용액이 수득된다. 상기 생성물은 추가로 정제되어 나트륨 염 형태의 탈과당화된 고분자량 다당류의 수용액을 수득할 수 있다. 이 생성물은 이후 Cho et al. in Biol Pharm Bull 27, (1), 47-51에 기술된 방법과 유사하게, 산성 조건 내에서 제어된 단편화를 거친다. 대안적으로, IT 1224260에 개시된 바와 같이 과산화수소 및 황산철을 사용하거나 또는 US　4,977,250에 개시된 바와 같이 차아염소산나트륨을 사용하는 라디칼 단편화 방법을 이용할 수 있다. 반응은 일반적으로 생성물의 분자량을 제어하기 위해 HPLC-SEC에 의해 추적 관찰되며; 원하는 평균 MW, 예를 들어 5 내지 30 kDa에 도달하면, 수산화 나트륨, 탄산 나트륨 또는 다른 염기를 중성 pH에 도달할 때까지 부가함으로써 반응을 ??치(quench)하고, 혼합물을 실온까지 냉각시킨다.
저분자량 K4d 중합체의 수용액을 500 내지 5000 달톤의 컷오프를 갖는 폴리술폰 막으로 한외여과하며; 무기염(주로 염화 나트륨 및 황산 나트륨) 및 초저분자량을 갖는 당이 투과액(permeate)에서 제거된다. 이러한 방식으로 중합체의 분자량은 좁은 범위에서 선택되며; 분자량의 분포를 더욱 좁히기 위해(낮은 다분산성) 높은 컷오프와 낮은 컷오프를 갖는 두개의 한외여과를 결합하는 것 또한 가능하다.
막에 의해 갇힌 고분자량 중합체의 분획은 다음 배치(batch)에서 재활용될 수 있다.
K4d 다당류를 나트륨 염으로서 수득하기 위해, 용액은 한외여과 또는 박막증발을 통해 농축될 수 있고, 이후 분무-건조될 수 있으며; 대안적으로, 생성물은 동결-건조를 통해 분리될 수 있다. 원하는 분자량을 갖는 실질적으로 순수한 K4d 다당류(비황화 콘드로이틴)가 수득되며; 잔류 수분 함량은 5% 미만, 일반적으로 2% 미만이다 (Karl-Fischer 적정).
상기 기술한 바와 매우 유사한 공정을 사용하여, 투석 또는 수지에서의 용리를 위한 적절한 용액을 사용함으로써 (예를 들어, NaCl 대신 KCl 용액을 사용함으로써) 칼륨, 암모늄 또는 기타 염이 수득될 수 있다.
산 형태 또는 4차 암모늄 염의 K4d 중합체를 수득하기 위해 상기 기술한 바와 같이 수행하는 것이 가능하지만, 비용을 절감하기 위해 양이온-교환 수지, 바람직하게는 강산 수지 및 바람직하게는 술폰산 수지를 사용하는 것이 바람직하다. 수지는 아가로스와 같은 천연 중합체, 또는 폴리아크릴레이트 또는 폴리스티렌과 같은 합성 중합체를 기반으로 할 수 있으며; 이는 단단하거나 겔 형태일 수 있고; 이는 술폰산기 또는 인산기와 같은 강산기로 작용화되어야 한다. 상기 방법은 칼럼 또는 배치 모드로 수행될 수 있으며, 사용되는 수지의 양은 작용화 정도(수지 1리터당 작용기의 수)에 따라 다르다.
K4d 중합체의 수용액은 용액의 pH가 2 미만이 될 때까지 수지(산 형태)를 연속적인 비율로 부가함으로써 기계적 교반기가 장착된 반응기에서 처리되고; 이후 수지는 여과를 통해 분리된다. 해리되지 않은 산 형태의 K4d 다당류 용액이 수득되며, 중합체 단편화가 관찰되지 않고; 생성물은 또한 용액을 동결 건조 또는 분무 건조하여 고체 형태로 수득될 수 있다.
생성물을 4차 암모늄 염의 형태로 수득하고자 할 경우, 적합한 염기 (피리딘, 수산화 테트라부틸암모늄 등)를 중성 pH에 도달하기 위해 필요한 양으로 상기 기술된 산 용액에 부가하며; 상기 기술한 바와 같이 분무- 건조, 또는 동결-건조를 통해 고체 생성물이 수득된다.
이러한 방식으로, 잔류 수분은 5% 미만이고 실질적으로 나트륨이 없는(0.1% 미만) 모두 백색 또는 옅은 노랑색 고체의 형태인 피리디늄, 테트라메틸암모늄, 테트라에틸암모늄 및 테트라부틸암모늄 염을 수득할 수 있다.
이후 산 또는 염화된 형태의 K4d 중합체를 하기에 기술된 황산화 반응에 사용하여 콘드로이틴 황산염을 수득하고; 투석 및 농축한 다음, 그 CS 용액을 분무-건조하여 CS 나트륨 염을 수득한다. 반응의 우수한 제어는 중합체의 위치 선택성 및 황산화 정도의 조절을 가능하게 한다. 이러한 방식으로, 동물 기원의 콘드로이틴 황산염과 유사한 특성, 예를 들어 상어 또는 다른 동물 종에서 수득되는 CS와 유사한 황산화 프로파일을 갖는 생성물을 제조하는 것이 가능하다.
또한, 상기 기술한 바와 같이 황산화 전에 K4d 중합체를 단편화하거나 황산화 후에 수득된 콘드로이틴 황산염을 단편화함으로써 최종 생성물의 평균 분자량 및 이의 평균값 주위의 분포를 선택하는 것이 가능하며; 두 경우 모두 단편화는 인용된 문헌에 기재된 바와 같이 산 또는 라디칼 메커니즘에 의해 수득될 수 있다.
하기 실시예는 본 발명을 보다 상세히 예시한다.
실시예 1: K4d 중합체 나트륨 염의 일반적인 제조 공정
K4d 다당류는 Manzoni et al., Biotechnol Lett 18, 383-6(1996)에 기재된 바와 같이 대장균의 발효에 의해 캡슐 다당류 K4를 생산함으로써 수득되며; 바이오매스 분리 후, 상청액을 과당 잔기 제거를 위해 제어된 조건 하에서 가수분해하고; 생성된 K4d 다당류 수용액을 Rodriguez et al., Eur J Biochem 177, 117-124 (1988)에 기술된 바와 같이 크로마토그래피에 의해 추가로 정제하여, 탈과당화된 고분자량 다당류의 수용액을 수득한다.
이후 제어된 조건에서 산 해중합을 수행하며, HCl을 부가하여 상기 용액을 pH 1 내지 4 범위로 조정하고, 60-80℃로 가열한다. 반응은 일반적으로 생성물의 분자량을 확인하기 위해 HPLC-SEC에 의해 추적 관찰하며; 5 내지 30 kDa의 원하는 평균 분자량에 도달하면, 수산화 나트륨을 pH 7에 도달할 때까지 부가함으로써 반응을 ??치하고, 20-25℃로 냉각시킨다.
저분자량 K4d 중합체의 수용액을 2.5 kDa의 컷오프를 갖는 폴리술폰 막으로 한외여과하고, 물로 투석하고, 농축시킨다. 산업적 규모에서 생성물은 분무-건조를 통해 분리되는 반면, 실험실 규모에서는 동결-건조를 통해 수득된다. K4d 다당류 (비황화 콘드로이틴) 나트륨 염은 고운 흰색 분말로서 수득되며; 잔류 수분 함량은 2% 미만 (Karl-Fischer 적정)이다.
실시예 2: K4d 중합체 4차 암모늄 염의 일반적인 제조 공정
K4d 다당류는 생성물을 고체 형태로 분리할 필요 없이 원하는 분자량의 순수한 나트륨 염의 수용액이 수득될 때까지 실시예 1에 기재된 바와 같이 수행함으로써 수득된다.
상기 용액을 기계적 교반기가 장착된 반응기에 위치시키고, pH가 2 미만에 도달할 때까지 Amberlite IRA1200H 수지(산 형태)를 연속적인 비율로 부가하며; 이후 수지는 여과를 통해 분리된다. 해리되지 않은 산 형태의 K4d 다당류 용액이 수득되고 중합체의 단편화가 관찰되지 않으며; 생성물은 또한 용액을 동결-건조 또는 분무-건조하여 고체 형태로 수득될 수 있다.
Amberlite IRA1200H 대신 폴리아크릴 또는 폴리비닐 구조의 강한 양이온 수지와 같은 유사한 수지를 사용할 수 있으며, 유사한 결과가 수득될 것이다.
염기(피리딘 또는 수산화 테트라부틸-, 테트라메틸- 또는 테트라에틸- 암모늄)를 7 초과의 pH 값에 도달하는데 필요한 양으로 상기 산 용액에 부가한다. 고체 생성물이 분무-건조 또는 동결-건조를 통해 수득된다.
이러한 방식으로, 잔류 습도는 5% 미만이고 실질적으로 나트륨이 없는(0.1% 미만) 모두 백색 또는 옅은 노랑색 고체의 형태인 피리디늄, 테트라메틸암모늄, 테트라에틸암모늄 또는 테트라부틸암모늄 염이 수득된다.
실시예 3 : K4d 중합체의 대안적 제조 공정
실시예 1에 기재된 방법에 대한 대안으로서, 탈과당화된 다당류를 생성하는 균주 DSM23644를 사용하여 발효에 의해 K4d 다당류가 직접 수득될 수 있다. 생성물은 WO2012/004063에 기술된 바와 같이 정제되고, 원하는 분자량을 수득하기 위해 Cho et al. 에 기술된 바와 같이 산 또는 라디칼 해중합을 수행한다.
생성된 생성물은 실시예 1에 따라 수득된 것과 동일하며; 4차 암모늄 염은 실시예 2에 기재된 바와 같이 수행함으로써 수득될 수 있다.
실시예 4 (비교군): DMF 용매 중의 콘드로이틴 황산염의 제조
반응은 사용된 K4d 다당류가 10 kDa 미만의 저분자량을 갖는다는 점만이 다르고, WO2012/159655, 실시예 4에 기재된 바와 같이 수행한다.
반응기에 무수 디메틸포름아미드 72 ml 및 실시예 2에 기재된 바와 같이 수득된 K4d 다당류 테트라부틸암모늄 염 1.20 g을 채우고, 3당량의 SO3 DMF 착물을 부가하고 온도를 약 +10℃로 제어된 상태로 유지한다. 반응 완료 후, 반응을 중탄산나트륨으로 ??치하고 투석하며, 동결-건조하여 생성물을 분리하여; 분자량이 10 kDa 미만이며 WO2012/159655, p.16, 표 2에 보고된 황산화 프로파일을 갖는 콘드로이틴 황산염 나트륨이 수득된다.
실시예 5: 아세트산 중의 황산화 혼합물의 제조
유리 반응기를 질소 흐름 하에 무수 DMF 134ml로 채우고 5±5℃로 냉각시키고; 30℃ 미만의 온도를 유지하면서 67g의 염화술폰산을 적가한다. 부가하는 동안 흰색 침전물이 형성되며; 그 혼합물을 온도를 5±5℃로 조정하면서 추가로 20분 동안 교반 하에 유지한다. 고체를 질소 하에 소결 유리 B
Figure pct00004
chner 깔때기를 통해 여과시키고 DMF를 제거한다. 고체 시약을 자기 교반 하에 아세트산 (73.46g)에 용해시킨다. 생성된 황산화 용액을 사용할 때까지 습기로부터 보호된 4℃에서 질소 하에 유지한다.
실시예 6 : 아세트산 용매 중의 저분자량 콘드로이틴 황산염의 제조
유리 반응기에 200 ml의 무수 아세트산 및 실시예 2에 기재된 바와 같이 수득된 20 g의 K4d 다당류 테트라부틸암모늄 염을 질소 흐름 하에 채운다. 생성된 현탁액을 교반 하에 약 13℃로 냉각시키고, 실시예 5에 따라 제조된 황산화 용액(40.22g)으로 처리하고, 동일한 온도에서 24시간 동안 교반 하에 유지한다. 반응을 온도를 <30℃로 유지하며 30% NaOH(382 ml) 및 얼음으로 ??치하고; 현탁액을 HCl을 사용하여 pH 7.9로 조정하고 B
Figure pct00005
chner 깔때기를 통해 여과시키며 고체(아세트산 나트륨)를 버린다. 모액을 한외여과막(컷오프 2.5KDa)을 통해 한외여과하고, 물로 투석한다. 잔류물(retentate)을 진공 증발을 통해 농축시키고, 탈색 목탄으로 탈색하고 동결-건조하여 콘드로이틴 황산염 10.5g을 수득한다.
실시예 7: 아세트산 용매 중의 저분자량 콘드로이틴 황산염의 제조
유리 반응기에 200 ml의 무수 아세트산 및 실시예 2에 기재된 바와 같이 수득한 20 g의 K4d 다당류 테트라부틸암모늄 염을 질소 흐름 하에 채우고; 현탁액을 약 13℃로 냉각시키고 실시예 5에 기재된 황산화 용액(40.0g)을 부가한다. 24시간 후, 온도를 <30℃로 유지하며 반응을 물 및 얼음으로 ??치하고; 이후 한외여과하고 및 물로 투석하여 잔류물의 pH를 5.5 내지 7.5 사이로 조정한다. 잔류물을 농축시키고 목탄으로 탈색시키고 동결-건조하여; 콘드로이틴 황산염 11.5g이 수득된다.
실시예 8 : 아세트산 용매 중의 저분자량 콘드로이틴 황산염의 제조
유리 반응기에 800 ml의 무수 아세트산 및 실시예 2에 기재된 바와 같이 수득된 80 g의 K4d 다당류 테트라부틸암모늄 염을 질소 흐름 하에 채운다. 생성된 현탁액을 교반 하에 약 50℃로 가열시키고, 실시예 5에 따라 제조된 황산화 용액(161.32g)으로 처리하고, 동일한 온도에서 1시간 동안 교반 하에 유지한다. 현탁액의 일부(~200ml)를 온도를 30℃ 미만으로 유지하며 물과 얼음(2.5kg)에 부어 ??치시키고; 생성된 용액을 한외여과막(컷오프 2.5KDa)을 통해 한외여과하고, 투과액 내 전도도가 500μS 미만이 되도록 물로 투석하고, 잔류물의 pH를 5.5 내지 7.5 사이로 조정한다. 잔류물을 증발을 통해 농축시키고, 얼리고 동결-건조하여 콘드로이틴 황산염 8.6g을 수득한다.
실시예 9 : 염화술폰산을 사용한 아세트산 용매 중의 저분자량 콘드로이틴 황산염의 제조
유리 반응기에 200 ml의 무수 아세트산 및 실시예 2에 기재된 바와 같이 수득된 20 g의 K4d 다당류 테트라부틸암모늄 염을 질소 흐름 하에 채우고; 현탁액을 약 13℃로 냉각시키고 염화술폰산(8.95g)을 부가하고 그 온도를 24시간 동안 유지한다. 이후 실시예 7에 기재된 바와 같이 현탁액을 물 및 얼음에 붓고, 한외여과하고 투석한다. 12.7g의 콘드로이틴 황산염이 동결-건조를 통해 수득된다.
실시예 10: 염화술폰산을 사용한 아세트산 용매 중의 저분자량 콘드로이틴 황산염의 제조
기계적 교반기, 온도계 및 점적기(dropper)가 장착된 유리 반응기를 600 ml의 무수 아세트산 및 실시예 2에 기재된 바와 같이 수득된 60 g의 K4d 다당류 테트라부틸암모늄 염으로 질소 흐름 하에 채웠다. 생성된 현탁액을 교반 하에 약 50℃로 가열시키고 염화술폰산(28.8g)으로 처리하고, 동일한 온도에서 10분 동안 교반 하에 유지한다. 현탁액의 일부(~200ml)를 온도를 30℃ 미만으로 유지하며 물과 얼음(2.5kg)에 부어 ??치시키고; 생성된 용액을 한외여과막을 통해 한외여과하고, 투과액 내 전도도가 500 μS 미만이 되도록 물로 투석하고 잔류물의 pH를 5.5 내지 7.5 사이로 조정한다. 잔류물을 증발을 통해 농축시키고, 얼리고 동결-건조하여 콘드로이틴 황산염 8.64g을 수득한다.
실시예 1 1 : 염화술폰산을 사용한 아세트산 용매 중의 저분자량 콘드로이틴 황산염의 제조
200ml의 무수 아세트산, 20g의 K4d 다당류 염 TBA, 및 10.54g의 염화술폰산을 사용하여 10-15℃에서 24시간 동안 반응을 수행하여 이전 실시예와 같은 방법을 수행한다. 반응 완료 후 현탁액을 B
Figure pct00006
chner 깔때기를 통해 여과하고 케이크를 아세트산으로 세척하고 Na2CO3(적량(q.s.))로 pH 7.3의 물에 용해시킨다. 생성된 용액을 상기와 같이 한외여과하고 투석하며, 잔류물을 동결-건조하여 콘드로이틴 황산염 8.58g을 수득한다.
실시예 1 2 : 에탄올 및 물에서의 침전에 의한 아세트산 중의 저분자량 콘드로이틴 황산염의 정제
실시예 6에 기재된 바와 같이 합성을 수행하고, 반응 종료 시 여과를 통해 아세트산나트륨을 제거한다. 그 용액을 격렬한 교반 하에 무수 에탄올(absolute ethanol)에 떨어뜨리며; 그 결과는 현탁액이며, 이는 B
Figure pct00007
chner 깔때기를 통해 여과되어 27.1g의 유리질 고체 형태의 조 (crude) 콘드로이틴 황산염이 수득된다. 생성된 고체(2.5g)의 분액(aliquot)를 0.2M NaCl(7.5ml)에 용해시키고, 그 용액을 격렬한 교반 하에 EtOH(50ml)에 적가하면; 순수한 콘드로이틴 황산염이 무정형 고체(2.16g)의 형태로 침전된다.
실시예 1 3 : 아세트산 중의 고분자량 콘드로이틴 황산염의 합성 및 정제
실시예 1에 기재된 바와 같이 반응을 수행하여 수용액 중의 고분자량(탈과당화) K4d 다당류를 수득하지만; 해중합은 수행하지 않는다. 상응하는 테트라부틸암모늄 염을, 실시예 2에 기재된 바와 같이 이온 교환 수지를 사용하여 수득한다.
유리 반응기를 질소 흐름 하에 무수 아세트산 91ml 및 고분자량 K4d 다당류 TBA 염 9.1g으로 채웠다. 생성된 현탁액을 교반 하에 10-15℃ 로 냉각시키고 염화술폰산(5.3g)으로 처리하고, 동일한 온도에서 2.5시간 동안 교반 하에 유지한다. 그 현탁액을 B
Figure pct00008
chner 깔때기를 통해 여과하고 생성된 케이크를 10% NaHCO3 수용액에 용해시키며; 생성된 용액을 한외여과 막을 통해 한외여과하고 투석한다. 동결-건조를 통해 5.21g의 콘드로이틴 황산염이 수득된다.
실시예 1 4 : 아세트산 중의 저분자량 콘드로이틴 황산염의 (DMFSO 3 분말을 사용하는) 합성 및 정제
유리 반응기에 200 ml의 무수 아세트산 및 실시예 2에 기재된 바와 같이 수득한 20 g의 K4d 다당류 TBA 염을 질소 흐름 하에 채운다. 생성된 현탁액을 교반 하에 약 50℃로 가열시키고 DMF-SO3 착물(Aldrich, 10.95 g)로 처리하고, 동일한 온도에서 1시간 동안 교반 하에 유지하며; 이후 반응을 얼음에서 ??치하고, 이후 한외여과 및 투석하며, 잔류물의 pH를 5.5와 7.5 사이로 유지한다. 생성물을 탈색 목탄으로 탈색시키고 동결-건조하여 콘드로이틴 황산염 8.73g을 수득한다.

Claims (10)

  1. 글리코사미노글리칸 또는 그의 염을 황산화제와 반응시켜 글리코사미노글리칸 황산염을 제조하는 방법으로서, 상기 반응은 제어된 온도 조건 하에서, 아세트산 내에서 수행되는 것을 특징으로 하는 것인 방법.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 황산화제는 염화술폰산, 또는 유기 염기 또는 디메틸포름아미드와의 SO3 착물인 것인 방법.
  3. 청구항 2에 있어서, 상기 유기 염기는 피리딘 또는 트리에틸아민인 것인 방법.
  4. 청구항 1 내지 3 중 하나 이상의 항에 있어서, 상기 온도는 반응 혼합물의 어는점 내지 70℃, 바람직하게는 10 내지 50℃, 및 보다 바람직하게는 10 내지 20℃의 범위인 것인 방법.
  5. 청구항 1 내지 4 중 하나 이상의 항에 있어서, 상기 글리코사미노글리칸은 염의 형태인 것인 방법.
  6. 청구항 5에 있어서, 상기 염은 테트라알킬암모늄 또는 피리디늄 염인 것인 방법.
  7. 청구항 1 내지 6 중 하나 이상의 항에 있어서, 상기 글리코사미노글리칸은 콘드로이틴 황산염(chondroitin sulfate), 헤파린(heparin), 헤파란 황산염(heparan sulfate), 케라탄 황산염(keratan sulfate) 및 데르마탄 황산염(dermatan sulfate)으로부터 선택되는 것인 방법.
  8. 청구항 7에 있어서, 상기 글리코사미노글리칸은 콘드로이틴 황산염인 것인 방법.
  9. 청구항 1 내지 8 중 하나 이상의 항에 있어서, 저분자량 콘드로이틴 황산 나트륨 염(chondroitin sulfate sodium salt)을 제조하기 위한 것인 방법.
  10. 청구항 1 내지 9 중 하나 이상의 항에 있어서, 황산화 생성물은 선택적으로 투석을 통한 유기 또는 무기 염의 제거 후에, 여과, 유기 용매 내에서 침전 또는 크로마토그래피를 통해 분리되는 것인 방법.

KR1020227034358A 2020-03-04 2021-03-02 생태학적으로 허용 가능한 용매 내 다당류의 직접적인 황산화 방법 KR20220149736A (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
IT102020000004564 2020-03-04
IT102020000004564A IT202000004564A1 (it) 2020-03-04 2020-03-04 Processo per la solfatazione diretta di polisaccaridi in solvente ecologicamente accettabile
PCT/IB2021/051714 WO2021176341A1 (en) 2020-03-04 2021-03-02 Process for direct sulfation of polysaccharides in an ecologically acceptable solvent

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20220149736A true KR20220149736A (ko) 2022-11-08

Family

ID=70804902

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020227034358A KR20220149736A (ko) 2020-03-04 2021-03-02 생태학적으로 허용 가능한 용매 내 다당류의 직접적인 황산화 방법

Country Status (12)

Country Link
US (1) US20230090768A1 (ko)
EP (1) EP4114869A1 (ko)
JP (1) JP2023516330A (ko)
KR (1) KR20220149736A (ko)
CN (1) CN115210266A (ko)
AU (1) AU2021229679A1 (ko)
BR (1) BR112022017636A2 (ko)
CA (1) CA3170461A1 (ko)
IT (1) IT202000004564A1 (ko)
MX (1) MX2022010895A (ko)
WO (1) WO2021176341A1 (ko)
ZA (1) ZA202210883B (ko)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112279936B (zh) * 2020-11-12 2023-06-30 上海辉文生物技术股份有限公司 一种类肝素的制备方法

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB773477A (en) * 1954-09-09 1957-04-24 Hoffmann La Roche Process for the manufacture of chitosan derivatives
AR243540A1 (es) 1986-08-05 1993-08-31 Ajorca Sa Procedimiento quimico para la depolimerizacion controlada de polianiones naturales y productos asi obtenidos, excluidos sus usos farmaceuticos.
AR243204A1 (es) 1986-11-21 1993-07-30 Ajorca Sa Un metodo para la depolimerizacion quimica de polisacaridos.
ITMI991465A1 (it) 1999-07-02 2001-01-02 Inalco Spa Processo per la preparazione dei polisaccaridi k4 e k5 da escherichiacoli
CN101230109B (zh) * 2007-12-24 2010-12-08 河北科技师范学院 磺化酰化6-羧基壳聚糖及其制备方法
WO2012004063A1 (en) 2010-07-09 2012-01-12 Gnosis S.P.A. Biotechnological production of chondroitin
ES2378676B1 (es) 2010-09-15 2013-02-28 Consejo Superior De Investigaciones Científicas (Csic) Procedimiento de sulfatación de oligosacáridos por calentamiento con microondas.
ITMI20110505A1 (it) * 2011-03-29 2012-09-30 Altergon Sa Processo per la preparazione di condroitine solfatate in posizione 3 sull'acido glucuronico
KR101788536B1 (ko) 2011-05-20 2017-10-20 그노시스 에스.피.에이. 상어­유사 콘드로이틴 설페이트 및 이의 제조방법
US10632144B2 (en) 2012-05-22 2020-04-28 Gnosis S.P.A. Low polydispersity, low molecular weight biotechnological chondroitin sulfate with anti-inflammatory and antiarthritis activity and use thereof in the prevention of osteoarthritis
CN104877042B (zh) * 2015-06-10 2017-08-29 浙江三门恒康制药有限公司 一种类肝素的制备方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN115210266A (zh) 2022-10-18
EP4114869A1 (en) 2023-01-11
BR112022017636A2 (pt) 2022-11-08
CA3170461A1 (en) 2021-09-10
MX2022010895A (es) 2022-09-27
ZA202210883B (en) 2024-02-28
US20230090768A1 (en) 2023-03-23
AU2021229679A1 (en) 2022-10-27
WO2021176341A1 (en) 2021-09-10
IT202000004564A1 (it) 2021-09-04
JP2023516330A (ja) 2023-04-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DK168297B1 (da) Fremgangsmåde til fremstilling af lavmolekylær heparin ud fra normal heparin
JPS59133201A (ja) 多糖類の解重合およびスルフエ−ト化法
KR101476381B1 (ko) 어류 정액 또는 알로부터 분리된 ｄｎａ 중합체 단편복합체를 포함하는 세포활성 강화용 조성물, 및 얼굴 또는 피부 충진제
US10870711B2 (en) Process for the preparation of polysaccharides
Chopin et al. A direct sulfation process of a marine polysaccharide in ionic liquid
KR20220149736A (ko) 생태학적으로 허용 가능한 용매 내 다당류의 직접적인 황산화 방법
US8513407B2 (en) Process for the preparation of N-acyl-(epi)K5-amine-O-sulfate-derivatives and products thus obtained
Balbinot-Alfaro et al. Properties, bioactive potential and extraction processes of glycosaminoglycans: An overview
KR101788536B1 (ko) 상어­유사 콘드로이틴 설페이트 및 이의 제조방법
CA2489862C (en) Epimerized derivatives of k5 polysaccharide with a very high degree of sulfation
AU2002327578B2 (en) Saccharide sulfation methods
EA046236B1 (ru) Способ прямого сульфатирования полисахаридов в экологически приемлемом растворителе
JP2023529428A (ja) 菌類からのヒアルロン酸の抽出方法、植物由来のヒアルロン酸およびその用途
DK2638074T3 (en) Process for Preparation of Chondroitin Sulfated at the 4- or 6-N-Acetyl-Galactosamine Residues
CN110698522B (zh) 一种软骨素奇数寡糖单体及其制备方法和应用
US20120253029A1 (en) Process for the preparation of highly o-sulfated epimerized derivatives of k5 polysaccharide and intermediates therein
Saravanan et al. Partial sequencing, structural characterization, and anticoagulant activity of heparan sulfate and sulfated chitosan from selected Indian marine mollusks
KR20220091513A (ko) 유기 용매에서 수행되는 히알루론산 나트륨 염의 정제 방법
dos Santos Queda Studies towards modified chitooligosaccharides: a new approach to NAG-NAM moiety
KR20050024339A (ko) 엔-아실-(에피)케이5-아민-오-황산염-유도체 생산방법 및그 생성물