PROCESSO PER LA PREPARAZIONE DI CONDROITINE SOLFATATE IN POSIZIONE 3 SULL’ACIDO GLUCURONICO
*;Campo dell’invenzione ;La presente invenzione si riferisce al campo dei processi per la modificazione strutturale di polisaccaridi. ;Stato dell’arte ;La condroitina solfato (CS) appartiene alla più ampia famiglia dei glicosamminoglicani, detti GAGs. Questi polisaccaridi, spesso legati covalentemente a proteine (proteoglicani), sono componenti ubiquitari della matrice extracellulare e delle superfici cellulari di vertebrati e invertebrati, in cui assolvono ruoli biologici differenziati. ;La CS à ̈ un polisaccaride naturale lineare formato dall’alternanza di residui di N-acetil-D-galattosammina 1→4 (GalNAc) e acido D-glucuronico β-1→3 (GlcA). Nei vertebrati la condroitina à ̈ presente in forma variamente solfatata, i residui coinvolti nella solfatazione sono gli ossidrili 4 e 6 della GalNAc e solo in alcuni casi anche quelli 2 e 3 del GlcA. ;Il peso molecolare della condroitina e l’entità e i siti della solfatazione dipendono dalla specie, dall'età e dalla tipologia del tessuto. Qui di seguito sono riportati i più comuni pattern di solfatazione della CS naturale: ;;HOOC ;NHAc ;;CS-0: GlcA-GalNAc CS-E: GlcA-GalNAc(4,6S) ;CS-A: GlcA-GalNAc(4S) CS-K: GlcA(3S)-GalNAc(4S) ;CS-C: GlcA-GalNAc(6S) CS-L: GlcA(3S)-GalNAc(6S) ;CS-D: GlcA(2S)-GalNAc(6S) CS-M: GlcA(3S)-GalNAc(4,6S) ;E’ noto che i glicosamminoglicani, in particolare la CS, sono in grado di codificare specifiche informazioni funzionali mediante il pattern di solfatazione dello scheletro polisaccaridico, che à ̈ finemente regolato in vivo ed à ̈ tessuto/età specifico. La relazione tra sequenze solfatate ed effetti funzionali non à ̈ attualmente sempre definita a livello molecolare per la difficoltà di reperire per via estrattiva prodotti con sequenze univocamente determinate. ;Attualmente la CS à ̈ utilizzata come farmaco condroprotettivo e antireumatico, con applicazioni nella terapia di osteoartriti tibiofibulari del ginocchio e nelle osteoartriti della cartilagine articolare. Per questa sua utilizzazione in campo farmaceutico la CS, con un pattern di solfatazione in cui sulla stessa catena polisaccaridica sono predominanti unità disaccaridiche di tipo GlcA-GalNAc(4S) e GlcA-GalNAc(6S), si ottiene con tecniche estrattive da varie fonti animali, come cartilagini di maiale, pinne di pescecane e cartilagini di teleostei. ;La scarsità della materia prima e la complessità del downstream di purificazione limitano a livello mondiale la disponibilità di questo principio attivo, il cui mercato à ̈ pertanto controllato dalla difficoltà di soddisfare una domanda in continua crescita. Esiste, infatti, un grande interesse a differenziare l'impiego della CS in campo farmaceutico, investendo altri settori terapeutici, in addizione a quello osteartritico, se in futuro si potrà disporre di CS con differenti pattern di solfatazione dello scheletro della condroitina. Esiste pertanto un crescente interesse allo sviluppo di strategie produttive alternative a quelle estrattive, di tipo biotecnologico e chimico sintetico, per ottenere CS con pattern di solfatazione differenziati, perché la loro estrazione da fonti naturali sarebbe estremamente costosa e perché le sempre più severe normative in materia di sicurezza di farmaci di derivazione animale potrebbero in prospettiva escludere dal mercato farmaceutico la CS estrattiva. Recentemente la domanda di brevetto PCT/EP201 0/0571 29 ha descritto un metodo fermentativo per la produzione di condroitina in alte rese, che rende possibile lo sviluppo di strategie sintetiche di solfatazione regioselettiva per ottenere CS con specifici pattern di solfatazione sulla catena polisaccaridica. ;In US 6,777,398 à ̈ descritto un metodo di solfatazione della condroitina che permette di ottenere tre differenti tipi di CS, caratterizzati dalla presenza sulla catena polisaccaridica rispettivamente di unità di tipo GlcA-GalNAc(4S), GlcA-GalNAc(6S) o GlcA-GalNAc(4,6S), tutte CS di tipo non naturale, perché la CS di tipo estrattiva presenta invece sulla stessa catena polisaccaridica contemporaneamente unità disaccaridiche di tipo GlcA-GalNAc(4S) e GlcA-GalNAc(6S). ;La domanda di brevetto italiano MI2010A002092 descrive, invece, uno schema di solfatazione della condroitina che consente di avere sulla stessa catena polisaccaridica contemporaneamente unità disaccaridiche di tipo GlcA-GalNAc(4S) e GlcA-GalNAc(6S), mimando la condizione strutturale delle CS naturali. ;Le strategie sintetiche rivendicate in US 6,777,398 e in M12010A002092 hanno entrambe, come passaggio chiave per la protezione regioselettiva del 4,6-diolo dell’unità GalNAc, la formazione di un ciclo benzilidenico, la cui apertura nella fase di solfatazione regioselettiva à ̈ realizzata però in maniera differente in questi due brevetti. ;Rimane pertanto aperta e attuale la problematica di elaborare nuovi schemi sintetici in grado di consentire la solfatazione regiospecifica della condroitina, per ottenere CS con specifici pattern di solfatazione, in particolare per ottenere pattern di solfatazione che coinvolgono non solo GalNAc ma contemporaneamente anche GlcA. ;E’, infatti, di grande interesse la possibilità di sintetizzare CS con un pattern di solfatazione che preveda la presenza di unità disaccaridiche di tipo GlcA(3S)-GaINAc(4S) e GlcA(3S)-GalNAc(6S), perchà ̈ à ̈ noto che CS contenenti regioni con pattern di solfatazione in posizione 3 su GlcA sono in grado di promuovere la crescita degli assoni (Tadahisa, M. and Kazuyuki, S. Trends Glycosci. Glycotechnol. 2006, 18, 165-183) e di legarsi a "heparin-binding growth factors†(Deepa, S.S. et al. J. Biol. Chem. 2002, 277, 43707-43716). ;La disponibilità di CS con queste caratteristiche strutturali aprirebbe, pertanto, nuove, importanti opportunità per lo sviluppo di nuove strategie terapeutiche. ;Descrizione dettagliata dell’invenzione ;Il presente brevetto, consente di rispondere alle esigenze suddette con un’innovativa strategia sintetica che consente di ottenere, partendo da condroitina preparata per via biotecnologica e utilizzando approcci sintetici compatibili con lo scale up industriale, tre differenti tipologie di CS in cui la condroitina à ̈ solfatata in posizione 3 su GlcA: ;a) una CS in cui sono presenti unità disaccaridiche GlcA(3S)-GalNAc; ;b) una CS in cui sulla stessa catena polisaccaridica sono presenti contemporaneamente unità disaccaridiche GlcA(3S)-GalNAc(4S) e GlcA(3S)-GalNAc(6S); ;c) una CS in cui sulla stessa catena polisaccaridica sono presenti contemporaneamente unità disaccaridiche GlcA(2,3S)-GalNAc(4S) e GlcA(2,3S)-GalNAc(6S) ;Le tre tipologie sono schematicamente rappresentate rispettivamente dai prodotti 7, 5 e 3 nello Schema sintetico di seguito riportato. ;Elemento chiave alla base deH’innovatività e inventività della presente invenzione à ̈ la non prevedibile scoperta della scarsa reattività nei riguardi della reazione di acilazione deH’ossidrile in 3 del GlcA della condroitina quando gli ossidrili 4 e 6 del residuo vicinale di GalNAc sono protetti come ortoestere ciclico o come acetili. Questa scoperta, superando i problemi presenti nei processi noti dello stato della tecnica, rende possibile nuove strategie sintetiche di solfatazione della condroitina, che consentono di ottenere in forma pura mediante sintesi chimica le tre differenti tipologie di CS sopradescritte ;Come si vede dallo Schema il processo secondo l'invenzione prevede la formazione di un intermedio costituito dall’ortoestere ciclico (trimetilortoacetato o trimetil- ortobenzoato) sugli ossidrili 4 e 6 dei residui di GalNAc di condrotitina in forma acida. ;In particolare il prodotto CS 7 (formula 7) si ottiene partendo da condroitina ottenuta per fermentazione attraverso la seguente serie di reazioni: ;i) acetilazione per proteggere l'ossidrile 2 di GlcA con formazione dell’intermedio suddetto, ;ii) apertura idrolitica dell’ortoestere ciclico formato nel passaggio precedente; iii) acetilazione del prodotto ottenuto per proteggere l’ossidrile 4 o 6 di GalNAc; iv) solfatazione dell’ossidrile 3 di GlcA del prodotto del passaggio precedente ed eliminazione idrolitica dei gruppi protettori. ;Secondo una variante del processo secondo l’invenzione, operando sull'intermedio ottenuto dal passaggio (ii) (formula 4) à ̈ possibile ottenere il prodotto CS5 (formula 5) per solfatazione degli ossidrili 3 di GlcA e 4 o 6 di GalNAc (passaggio (vii) ed eliminazione idrolitica dei gruppi protettori. ;Secondo una ulteriore variante del processo à ̈ possibile ottenere il prodotto CS3 (formula 3) per: ;v) apertura idrolitica dell'intermedio estere ciclico ottenuto dal passaggio (i); vi) solfatazione degli ossidrili 2 e 3 di GlcA e 4 o 6 di GalNAc. ;Il processo secondo l’invenzione in tutte le varianti descritte prevede uno stadio di purificazione finale basato su processi di membrana facilmente scalabili industrialmente, che permettono di ottenere le rispettive CS con buone rese e a costi compatibili con lo scale up industriale. ;Come si vede dallo Schema la condroitina sale sodico, ottenuta per via fermentativa, viene trasformata in condroitina acido secondo procedure note. ;Ad esempio condroitina ottenuta per via fermentativa à ̈ sciolta in acqua MilliQ e tenuti in batch sotto agitazione per circa 2h a temperatura ambiente con 250g di resina a scambio cationico, precedentemente lavata e neutralizzata con acqua. Lo slurry successivamente à ̈ sversato in una colonna in vetro con setto poroso (porosità 3) eluendo con acqua MilliQ finché l’eluato risulta avere un pH <2 . Successivamente si lava ancora con acqua MilliQ fino alla neutralità dell’eluato eventualmente addizionando la soluzione di lavaggio al precedente eluato contenente la condroitina acida e la soluzione risultante à ̈ liofilizzata. Il liofilizzato, ridotto in polvere fine in un varing blendor à ̈ ulteriormente essiccato sotto vuoto overnight.. ;La condroitina acido à ̈ sospesa per agitazione e riscaldamento in un opportuno solvente (ad esempio solventi polari aprotici quali DMF, DMSO, HMPT) ]) e, dopo raffreddamento a temperatura ambiente la sospensione viene trattata con un agente ortoesterificante (quale ad esempio:trimetilortoacetato, trimetil ortobenzoato, trietil ortoacetato, trimetil ortoformiato ecc.) ed un acido solfonico (quale ad esempio: acido (+)-canfor-10-solfonico, acido para-toluensolfonico, acido para-stirensolfonico, ecc.) sotto agitazione per alcune ore. Alla soluzione sono poi aggiunti neH’ordine trimetilammina, acetonitrile, anidride acetica e 4-(dimetilammino)-piridina (DMAP). ;Dopo agitazione a temperatura ambiente per diverse ore, si raffredda la soluzione a 0°C e si aggiunge, sempre sotto agitazione, lentamente una soluzione acquosa di acido acetico (ad esempio 80% (p/v)). La soluzione ottenuta, diafiltrata su membrane con cut-off 10kDa, dopo liofilizzazione, dà il polisaccaride di formula 4, che si presenta come un solido amorfo di colore marrone chiaro. ;Detto intermedio viene sciolto in opportuno solvente (ad esempio acetonitrile) e alla soluzione sono aggiunti in sequenza trietilammina, anidride acetica e DMAP lasciando sotto agitazione a temperatura ambiente per alcune ore. Alla soluzione così ottenuta si aggiunge acqua deionizzata quindi si diafìltra su membrane con cut-off 10KDa e si liofilizza ottenendo il polisaccaride di formula 6, che si presenta come un solido di colore giallino. ;Questo viene a sua volta sciolto in DMF e trattato con un complesso piridinaanidride solforica lasciando sotto agitazione per alcune ore sotto blando riscaldamento (circa 50°C). La soluzione, raffreddata a temperature ambiente, à ̈ portata a pH 13 con una soluzione alcalina e, dopo alcune ore di agitazione a temperatura ambiente, à ̈ neutralizzata con una soluzione acida, diafiltrata su membrane con cut-off 10KDa e liofilizzata dando una condroitina il cui pattern di solfatazione à ̈ come riportato nello Schema (formula 7), che si presenta come un solido bianco di consistenza ovattosa. La modulazione delle condizioni di reazione permette di variare il rapporto fra le due subunità costituenti il polisaccaride indicate. ;Secondo la prima alternativa prevista dal processo come sopra indicato il polisaccaride 4 ottenuto come sopra descritto viene sospeso in DMF e la soluzione à ̈ addizionata con un complesso piridina-anidride solforica in DMF o in complesso anidride solforica-trietilammina. Dopo agitazione per alcune ore sotto blando riscaldamento la soluzione, raffreddata a temperatura ambiente, à ̈ portata a pH 13 con una soluzione acquosa alacalina che dopo alcune ore di agitazione a temperatura ambiente, à ̈ neutralizzata con una soluzione acquosa acida, diafiltrata su membrane con cut-off 10KDa e liofilizzata dando il prodotto di formula 5, che si presenta come un solido bianco di consistenza ovattosa. La modulazione delle condizioni di reazione permette di variare i rapporti fra le subunità costituenti il polisaccaride. ;Infine secondo la seconda variante del processo come sopra descritta la condroitina acido à ̈ sospesa in un solvente polare aprotico come sopra indicato scaldando sotto vigorosa agitazione per alcune ore. La sospensione, raffreddata a temperature ambiente, à ̈ trattata con trimetilortoacetato o trimetilortobenzoato e acido (+)-canfor-1 0-solfonico agitando a temperatura ambiente, e quindi si addiziona una soluzione acquosa di acido acetico. Dopo agitazione a temperatura ambiente, si diafiltra su membrane con cut-off 10kDa e si liofilizza ottenendo rispettivamente (a seconda del reagente utilizzato) il polisaccaride 1 o il polisaccaride 2. Il polisaccaride 1 si presenta come un solido amorfo di colore giallino, costituito da 4-O-Ac-GalNAc e 6-O-Ac-GalNAc mentre il polisaccaride 2 si presenta come un solido amorfo di colore giallino, costituito da 4-O-Bz-GalNAc e 6-O-Bz-GalNAc, il rapporto fra le subunità costituenti il polisaccaride potendo variare modulando opportunamente le condizioni di reazione. ;Il polisaccaride 1 come sopra ottenuto à ̈ poi sospeso in DMF e trattato con un complesso piridina-anidride solforica sciolto in DMF sotto agitazione e blando riscaldamento fino a che si ha una chiarificazione della sospensione seguita dal formarsi dì un consistente precipitato gommoso che, raccolto mediante centrifugazione à ̈ solubilizzato in acqua deionizzata. ;La soluzione così ottenuta à ̈ portata a pH 13 con una soluzione alcalina lasciando ad agitare a temperatura ambiente per alcune ore. La soluzione basica, dopo neutralizzazione con acido e agitazione a temperatura ambiente viene diafiltrata su membrane con cut-off 10kDa e liofilizzata dando il prodotto 3 che si presenta come un solido bianco di consistenza ovattosa, in cui i rapporti fra le subunità costituenti il polisaccaride variano modulando le condizioni di reazione. ;L’invenzione viene ora più precisamente illustrata dagli esempi riportati che descrivono la produzione delle condroitine solfatate a livello dell’ossidrile 3 di GlcA (prodotti 7, 5 e 3 dello Schema) a questo proposito si precisa che i rapporti fra le subunità costituenti i polisaccaridi riportati nello Schema sono quelli derivanti dagli esempi come qui di seguito descritti. ;ESEMPIO 1 - Preparazione della condroitina acido. ;67g di condroitina sale sodico, ottenuta per via fermentativa, come descritto nella PCT/EP201 0/0571 29, avente un peso molecolare di 38 kDa e purezza > 90% sono sciolti in 1 ,5L di acqua MilliQ e tenuti sotto agitazione per circa 2h a temperatura ambiente con 250g di resina FLUKA Dowex 50 WX8 H+ form 50-100 mesh a scambio cationico, precedentemente lavata e neutralizzata con acqua. La sospensione, successivamente, à ̈ lavata su un bukner con setto poroso (porosità 3) con acqua MilliQ, finché il filtrato risulta avere un pH neutro e la soluzione risultante à ̈ liofilizzata. Il liofilizzato, ridotto in polvere fine in un varing blendor, à ̈ ulteriormente essiccato sotto vuoto per 12h. La condroitina acido à ̈ ottenuta con una resa molare superiore al 95%. ;ESEMPIO 2 - Sintesi del polisaccaride 1 (formula 1) ;60g di condroitina acido sono sospesi in 2,7L di A/,/V-dimetilformammide (DMF) sotto vigorosa agitazione a 70°C per 12h. La sospensione, raffreddata a temperature ambiente, à ̈ trattata con 397mL (3,16 moli) di trimetilortoacetato e 9,2g (39,5 mmoli) di acido (+)-canfor-10-so!fonico. Dopo 5h di agitazione a temperatura ambiente, si addizionano lentamente 20L di una soluzione acquosa di acido acetico 80% (p/v). Successivamente, dopo 1 ,5h di agitazione a temperatura ambiente, si diafiltra su membrane con cut-off 10kDa e si liofilizza. Si ottengono 64g del polisaccaride 1 di figura 2, che si presenta come un solido amorfo di colore giallino, in cui il rapporto 4-0-Ac-GalNAc/6-0-Ac-GalNAc à ̈ 10:7. La modulazione delle condizioni di reazione permette di variare questo rapporto. ;ESEMPIO 3 - Sintesi di CS2 (formula 2). ;60g di condroitina acido sono sospesi in 2,7L di dimetilformammide (DMF) sotto vigorosa agitazione a 70°C per 12h. La sospensione, raffreddata a temperature ambiente, à ̈ trattata con 543mL (3,16 moli) di trimetilortobenzoato e 9,2g (39,5 mmoli) di acido (+)-canfor-10-solfonico. Dopo 5h di agitazione a temperatura ambiente si addizionano lentamente 20L di una soluzione acquosa di acido acetico 80% (p/v). Successivamente, dopo 1 ,5h di agitazione a temperature ambiente, si diafiltra la soluzione su membrane con cut-off 10KDa e si liofilizza. Si ottengono 72g del polisaccaride 2 di figura 2, che si presenta come un solido amorfo di colore giailino, in cui il rapporto 4-0-Bz-GalNAc/6-0-Bz-GalNAc à ̈ 10:9. La modulazione delle condizioni di reazione permette di variare questo rapporto. ;ESEMPIO 4 - Sintesi del CS3 (formula 3), pattern di solfatazione della condroitina GlcA(2,3S)-GalNAc(4 o 6S) ;43,5g del polisaccaride 1 secondo l’esempio 2 sono sospesi in 1 ,8L di DMF e trattati con 572g (3,60mol) di complesso piridina-anidride solforica sciolto in 3,3L di DMF. Dopo 1 h di agitazione a 50°C la sospensione si chiarifica, ma dopo 12h si forma un consistente precipitato gommoso che, raccolto mediante centrifugazione (4°C; 3.000 rpm; 10min), à ̈ solubilizzato in 3L di acqua deionizzata. Successivamente, la soluzione, à ̈ portata a pH 13 con NaOH 15% (p/v), lasciando ad agitare a temperatura ambiente per 6h. La soluzione basica, dopo neutralizzazione con HCI 4M, à ̈ agitata per 6h a temperatura ambiente e diafiltrata su membrane con cut-off 10kDa e liofilizzata. Si ottengono 51 , Og di CS il cui pattern di solfatazione à ̈ quello riportato in figura 2-struttura 3, che si presenta come un solido bianco di consistenza ovattosa, in cui il rapporto GalNAc(6S)/GalNAc(4S) à ̈ 1 ,4:1. La modulazione delle condizioni di reazione permette di variare questo rapporto. ;ESEMPIO 5 - Sintesi del polisaccaride 4 di figura 2 ;1 ,01 Kg di condroitina acido, preparati come descritto nell'esempio 1 , sono sospesi in 60L di DMF e lasciati ad agitare per 12h a 70°C. La sospensione, raffreddata a temperature ambiente, à ̈ trattata con 6,63L (52,8moli) di trimetilortoacetato e 153g (0,66moli) di acido (+)-canfor-10-solfonico. Dopo 5h di agitazione a temperature ambiente si aggiungono nell’ordine 40L di trimetilammina, 55L di acetonitrile, 91 L di anidride acetica e 133g (1 ,09moli) di 4-(dimetilammino)-piridina (DMAP). Dopo 12h di agitazione a temperatura ambiente, si raffredda a 0°C e si aggiungono lentamente 500L di una soluzione acquosa di acido acetico 80% (p/v), lasciando agitare per 1 ,5h. La soluzione, diafiltrata su membrane con cut-off 10kDa, dopo liofilizzazione, dà 1 ,05g del polisaccaride 4 di figura 2, che si presenta come un solido amorfo di colore marrone chiaro. ;ESEMPIO 6 - Sintesi del CS5 di figura 2, pattern di solfatazione della condroitina GlcA(3S)-GalNAc(4 o 6S) e GlcA-GalNAc(4 o 6S) ;71, Og del polisaccaride 4 di figura 2, sospesi in 1 ,4L di DMF, sono trattati con 235g (1,48moli) del complesso piridina-anidride solforica in 1,4L di DMF. Dopo 12h di agitazione a 50°C, la soluzione, raffreddata a temperatura ambiente, à ̈ portata a pH 13 con una soluzione acquosa di NaOFI 15% p/v. La soluzione basica, dopo 6h di agitazione a temperatura ambiente, à ̈ in sequenza neutralizzata con 4M HCI, diafiltrata su membrane con cut-off 10KDa e liofilizzata. Si ottengono 56, 9g di CS il cui pattern di solfatazione à ̈ quello riportato in figura 2-struttura 5, che si presenta come un solido bianco di consistenza ovattosa, in cui il rapporto 6-S03-Na+ / 4-S03-Na+ / 3,6-di-S03-Na+ / 3,4-di-S03-Na+ = 2,3 : 2,1 : 1 ,2 : 1. La modulazione delle condizioni di reazione permette di variare questo rapporto. ;ESEMPIO 7 - Sintesi del polisaccaride 6 di figura 2. ;46, 7g del polisaccaride 4 sono sciolti in 1 ,1 L di acetonitrile e in sequenza si aggiungono 1,2L di trietilammina, 550mL di anidride acetica e 6,4g (52,4mmoli) di DMAP. Dopo 12h di agitazione a temperatura ambiente, alla soluzione si aggiungono 2,5L di acqua deionizzata e nell’ordine si diafiltra su membrane con cut-off 10KDa e si liofilizza. Si ottengono 49, 6g del polisaccaride 6 di figura 2, che si presenta come un solido di colore giallino. ;ESEMPIO 8 - Sintesi del CS7 di figura 2, pattern di solfatazione della condroitina GlcA(3S)-GalNAc e GlcA-GalNAc ;41,2g del polisaccaride 6 di figura 2, sciolti in 800mL di DMF, sono trattati con 235g (1,48moli) del complesso piridina-anidride solforica in 1,4L di DMF. Dopo 12h di agitazione a 50°C, la soluzione, raffreddata a temperature ambiente, à ̈ portata a pH 13 con NaOH 15% (p/v). La soluzione basica, dopo 6h di agitazione a temperatura ambiente, à ̈ in sequenza neutralizzata con 4M HCI, diafiltrata su membrane con cut-off 10KDa e liofilizzata. Si ottengono 24, 7g di CS il cui pattern di solfatazione à ̈ quello riportato in figura 2-struttura 7, che si presenta come un solido bianco di consistenza cerosa, in cui il rapporto GlcA(3S)/GlcA à ̈ 1:1 ,8. La modulazione delle condizioni di reazione permette di variare questo rapporto. ;ESEMPIO 9 - Determinazione strutturale dei composti di figura 2 (formule 1-7) mediante spettroscopia NMR. ;Gli spettri risonanza magnetica nucleare (NMR) sono registrati utilizzando uno spettrometro Bruker DRX-600 (<1>H: 600 MHz,<13>C: 150 MHz) equipaggiato con cryoprobe. Come solvente si utilizza D2O e come riferimento interno acetone,<1>H: (CH3)2CO a Î ́ 2.22;<13>C: (CH3)2CO a Î ́ 31.0 0 in alternativa DMSO-d6e come riferimento interno CHD2SOCD3,<1>H: CHD2SOCD3a Î ́ 2.49;<13>C: CD3SOCD3a Î ́ 39.5. Gli esperimenti bidimensionali omonucleari (COSY e TOCSY phase-sensitive con filtro quantico doppio) sono stati effettuati utilizzando un’ampiezza spettrale di 3.600 in entrambe le dimensioni e una matrice di dati di 4096 x 256 punti. Gli spettri bidimensionali sono stati processati applicando una funzione Osine a entrambe le dimensioni e la matrice dei dati, prima di effettuare la trasformata di Fourier, à ̈ stata sottoposta a zero-filling di un fattore 2. Negli esperimenti TOCSY il mixing time à ̈ stato posto pari a 120millisecondi. Gli esperimenti HSQC-DEPT sono stati misurati sul canale protonico via coerenza eteronucleare a singolo quanto, con disaccoppiamento protonico nel dominio di<13>C, utilizzando una matrice di dati di 2048 x 256 punti, poi estrapolata a 2048 x 1024 punti attraverso predizione lineare. In tabella 1 sono riassunti i dati spettroscopici dei composti di cui agli esempi 2-8. ;;GalNAc GlcA NAc altri 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 segnali {OAc} 4.50 3.94 3.73 5.28 3.74 3.44, 3.56 4.45 3.26 3.66 1.90 2.04 101.2 51.3 73.8 69.0 73.9 60.3 104.2 71.9 80.3 22.2 20.1 4-Ac) (4-Ac) (4-Ac) (4-Ac) (4-Ac) (4-Ac) (4-Ac) (4-Ac) (4-Ac) (4-Ac) (4-Ac) ;3.53 3.84 ;73.6 73.7 {OAc} 4.41 3.89 3.93 4.04 3.82 4.18 4.46 3.18 3.72 1.89 2.01 101.4 50.8 77.9 67.5 72.0 63.5 103.2 71.9 79.9 22.2 20.1 6-Ac) (6-Ac) (6-Ac) (6-Ac) (6-Ac) (6-Ac) (6-Ac) (6-Ac) (6-Ac) (6-Ac) (6-Ac) ;;4.56 4.15 4.02 5.54 3.83 3.49, 3.62 {Bz} 101.1 51.8 77.2 70.3 73.9 60.5 7.46-8.01 (4-Bz) (4-Bz) (4-Bz) (4-Bz) (4-Bz) (4-Bz) 128.6 ;4.36 3.24 3.46 3.56 3.87 1.91 129.4 103.9 72.2 73.7 76.5 74.2 22.2 130.1 4.36 3.88 3.68 3.99 3.96 4.44 133.8 100.7 50.7 80.0 67.8 72.4 63.9 ;(6-Bz) (6-Bz) (6-Bz) (6-Bz) (6-Bz) (6-Bz) ;4.62 3.97 3.94 4.93 3.73 3.66, 3.80 ;102.8 51.1 77.4 76.1 74.7 61.2 ;(4-S) (4-S) (4-S) (4-S) (4-S) (4-S) ;4.86 4.44 4.84 4.38 4.15 1.99 — 101.0 78.3 78.3 77.1 77.4 22.6 ;4.59 3.94 3.76 4.15 3.85 4.15 ;102.3 50.6 80.7 66.1 71.6 65.4 ;(6-S) (6-S) (6-S) (6-S) (6-S) (6-S) ;;4.44 3.33 3.69 ;103.4 72.2 81.2 ;;4.00 3.98 4.72 3.79 3.70, 3.78 (4-S) (4-S) 3.55 (4-S) 3.67 ;;51.5 75.7 76.1 74.4 61.0 73.5 76.3 ;;(4-S, (4-S, (4-S, (4-S, (4-S, (4-S, (4-S, ;4,3’-S) 4,3 ’-S) 4,3 ’-S) 4,3 ’-S) 4,3 ’-S) 4.56 3.60 6-S) 4.00 6-S) ;103.4 71.8 77.8 ;(4,3 ’-S) (4,3 ’-S) (4,3’-S) ;4.48- 1.99- — -4.55 -2.07 100.8 3.94 4.19 4.47 3.33 3.73 22.3 ;;72.5 67.4 104.0 72.2 79.8 ;;3.98 3.75 4.15 (6-S) (6-S) (6-S) (6-S) 4.34 (6-S) 3.66 ;;50.7 80.2 67.3 81.1 74.8 ;;(6-S, (6-S, (6-S, (4,3 ’-S, (4,3 ’-S, ;;6,3 ’-S) 6,3 ’-S) 6,3’-S) 3.84 4.15, 4.19 4.52 3.55 6,3’-S) 3.93 6,3 ’-S) ;;72.0 66.2 103.4 71.8 77.2 ;;(6,3’-S) (6,3 ’-S) (6,3’-S) (6,3 ’-S) (6,3 ’-S) ;;4.52 3.80 3.96 5.07 4.56 4.55 4.79 3.72 {OAc} 101.5 52.7 72.8 6S.9 99.3 70.5 71.7 79.5 1.93-2.05 HAc) (NHAc) (NHAc) (NHAc) (3-Ac) (3 -Ac) (3 -Ac) (3-Ac) 19.6 ;4.12 3.87, 3.99 3.42 1.85 ;71.2 61.7 77.0 20.9 {<+>NHEt3} 5.49 4.04 3.81 5.15 4.58 4.44 3.29 3.53 0.91, 2.42 92.5 49.9 70.4 68.8 99.5 72.7 71.6 81.1 10.5, 44.7 NAC2) (NAC2) (NAC2) (NAc2) (3-OH) (3-OH) (3-OH) (3-OH) ;;;4.00 3.57 3.63, 3.66 4.46 3.47 4.25 3.85 3.65 ;;68.0 75.1 61.3 104.2 72.3 81.9 77.9 76.9 ;;(3-S) (3-S) (3-S) (3-S) (3-S) (3-S) (3-S) (3-S) ;4.40 3.87 3.67 1.90 ... ;101.3 51.1 80.9 22.7 ;;3.97 3.51 3.57, 3.72 4.36 3.23 3.46 3.62 3.56 ;;68.0 75.0 61.2 104.7 72.7 74.0 80.0 76.5 ;;(3-OH) (3-OH) (3-OH) (3-OH) (3-OH) (3-OH) (3-OH) (3-OH) ;;†̃Valori riferiti a spettri misurati in DMSO-d6 ;;Tabella 1 -<1>H e<13>C NMR Chemical shift dei composti descritti negli esempi 2-8 ;(600 MHz, 298 K). *