CN110114373A - 交联透明质酸凝胶纯化方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种以化学交联的交联透明质酸凝胶的纯化方法，详细地，涉及一种不降低交联透明质酸凝胶所含的透明质酸的含量的情况下，选择性地仅去除残留在交联透明质酸凝胶的交联剂来纯化的方法。通过本发明的方法制备的凝胶的特征在于，能够获取高纯度的交联透明质酸而无需复杂的工艺。

Description

交联透明质酸凝胶纯化方法

技术领域

本发明涉及一种交联透明质酸凝胶的制备方法。具体地，涉及一种获取交联透明质酸凝胶之后，有效纯化未反应交联剂的方法。

背景技术

透明质酸正在被用作填充剂、关节腔注射剂、抗粘连剂、眼科药品或化妆品的原料。但，由于透明质酸本身被酶和活性氧快速分解并从体内释放，则存在注射到体内后其效果的持续时间不能令人满意的限制，因此，摸索出可延长体内分解时间的方案，并已经开始试图化学交联透明质酸。

为了提高透明质酸的化学结构稳定性来延长体内的物性维持时间，开发了一种通过添加交联剂来稳定透明质酸的技术，现有的透明质酸交联体及透明质酸衍生物交联物的体内最大持续时间为约6个月至24个月。

然而，应注意，透明质酸交联体的交联剂组分在体内被认为是体外异物而可引起炎症反应。因此，透明质酸交联体的制备工艺必须伴随未反应交联剂组分的纯化工艺。

例如，在韩国公开专利公报第10-2015-0029578号中公开了一种如下工艺，即，将10w/w％以上的高浓度的透明质酸溶解于碱性水溶液以形成长链，然后向线性化的透明质酸中加入0.5w/w％至1.0w/w％的少量交联剂，使线性化的透明质酸交联为高密度网状结构后，将形成高密度网状结构的水凝胶切割为1mm*1mm至20mm*20mm的尺寸，将已切割的水凝胶通过在pH为6.8以下的缓冲溶液中去除残留的交联剂来进行溶胀(swelling)的工艺。

发明内容

技术问题

正在进行各种工艺研究以减少残留在交联透明质酸凝胶的交联剂。

但是，如韩国公开专利公报第10-2015-0029578号，若经单纯通过溶胀来去除未反应交联剂的纯化工艺，则所获取的交联透明质酸吸收作为洗涤溶液的缓冲溶液等而溶胀，进而失去坚固性，从而无法表现出作为透明质酸的所需物性。韩国公开专利公报第10-2016-0125332号中的洗涤装置也是如此。

并且，韩国公开专利公报第10-2013-0010973中公开了一种通过加入少量的交联剂来交联透明质酸的方法。但是，这种方法只是使用了少量的交联剂，并不是一种能完全去除残留交联剂的方法，因此无法证明残留交联剂的量减少。

在国际公开公报WO2014/206701号中公开了一种通过使用析出溶剂来析出透明质酸凝胶的残留交联剂去除方法。但是，这种方法不适合大规模生产，并且存在局限性，即为了精密析出需要昂贵的设备。

在国际公开公报WO2010/015901号中公开了一种通过利用透析膜来洗涤凝胶的过程，但该方法也存在局限性，即在透析膜填充凝胶并洗涤的过程复杂且很难适用于大规模生产。

上述的韩国公开专利公报第10-2016-0125332号中公开了一种洗涤交联透明质酸凝胶的洗涤装置，但没有与如下方法有关的提示，即残留交联剂是否被有效洗涤以及控制交联透明质酸凝胶所含的透明质酸的含量的方法。

据此，本发明人试图开发一种能够有效地从不损害交联透明质酸的粘弹性的情况下除去未反应交联剂的纯化方法，从而完成了本发明。

解决问题的方案

本发明通过以下方案解决了上述问题。

1.一种洗涤容器，是一种使交联剂与透明质酸进行交联反应之后纯化未反应交联剂的洗涤容器，其形成有能够使洗涤液出入的细孔，并且具有能够物理性抑制交联透明质酸的溶胀的尺寸。

2.根据1所述的洗涤容器，其特征在于，由本体和盖帽形成，在本体和盖帽上都形成有细孔。

3.一种交联透明质酸的未反应交联剂纯化方法，包括：使交联剂与透明质酸进行交联反应的步骤；对获取的交联透明质酸进行切割的步骤；将切割的交联透明质酸填充在1或2所述的洗涤容器的步骤；用洗涤液洗涤填充有交联透明质酸的洗涤容器的步骤。

4.根据3所述的纯化方法，其特征在于，洗涤液为如PBS缓冲溶液的等渗性溶液，使得交联剂通过洗涤液的扩散而被纯化。

5.根据3或4所述的纯化方法，其特征在于，在装有洗涤液的容器中，通过承载填充有交联透明质酸的洗涤容器来洗涤未反应交联剂。

6.根据3至5中任一项所述的纯化方法，其特征在于，洗涤步骤是将洗涤容器承载于洗涤液中后进行10小时以上，优选地，进行20小时以上。

7.根据3至6中任一项所述的纯化方法，其特征在于，通过物理性抑制交联透明质酸的溶胀来防止透明质酸的含量降低，使得洗涤后交联透明质酸的透明质酸含量能够维持10mg/mL至50mg/mL。

8.一种交联透明质酸，通过3至7中任一项所述的纯化方法纯化。

发明的效果

根据本发明，在根据交联反应获取的交联透明质酸中，可以在不降低粘弹性的情况下进行未反应交联剂的纯化。具体地，根据本发明，与现有的仅通过溶胀的纯化工艺不同，抑制纯化工艺中凝胶的溶胀的同时，可防止交联透明质酸中透明质酸的含量降低。

附图说明

图1示出根据本发明的洗涤容器的一实例的平面。

图2示出根据本发明的洗涤容器的一实例的侧面。

图3示出根据本发明的洗涤容器的一实例的实物。

图4示出交联反应结束后切割的交联透明质酸凝胶。

图5例示出将交联透明质酸凝胶填充在根据本发明的洗涤容器的一实例的状态。

图6例示出使用根据本发明的洗涤容器的一实例来纯化未反应交联剂的纯化工艺。

图7示出灭菌抵抗性试验结果。

图8示出实施例3的残留2,2’-磺酰基二乙醇色谱图。

图9示出实施例4的残留2,2’-磺酰基二乙醇色谱图。

图10示出比较例1的残留2,2’-磺酰基二乙醇色谱图。

具体实施方式

在本说明书中，透明质酸是指单独的公知透明质酸原料或其混合物，例如透明质酸、其盐或其前体等。

透明质酸是一种天然的高分子物质，因其优异的生物相容性而广泛用于美容或医疗等各个领域。自然状态的透明质酸主要存在于细胞外基质中，通过与纤维质和胶原混合形成基质液体起到稳定组织结构的作用。它是一种在所有脊椎动物的组织中被发现的物质，是一种没有免疫原性的理想性化学物质，非常适合用作组织修复的组成物。

交联的透明质酸是一种将多糖聚合物等以交联剂连接而形成基质的缠结形状的凝胶。交联的透明质酸的三维结构可以在注入体内时自由移动营养素、氧气及激素等，可发挥常规的组织功能，并且可通过进行交联来将透明质酸的组织滞留时间延长至约12个月。交联的透明质酸与非交联的透明质酸为主组分的产品相比，在体内的分解速度更慢，并且依然维持被吸收到体内的性质。具有这种性质的交联透明质酸凝胶可以皮下或皮内给药以表现改善皱纹的效果，或者可以注射到患有软骨缺陷性关节炎的患者的关节腔中，从而可具有通过缓冲作用来减轻关节疼痛的效果。

通常，制备交联的透明质酸凝胶的步骤如下。

在溶解有透明质酸的碱性溶液中加入交联剂进行凝胶化的步骤(反应工艺)；

将交联的透明质酸凝胶以适当的尺寸切割后，在水溶液上进行溶胀且纯化的步骤(纯化工艺)；

通过粉碎完成溶胀的交联透明质酸凝胶来形成所需尺寸的步骤(粉碎工艺)；

将粉碎的凝胶填充在适合用途的容器并进行灭菌的步骤(灭菌工艺)。

通过上述步骤制备的交联透明质酸凝胶应保持高生物相容性，以便在用于对身体给药时不会引起副作用。但是，由于化学反应的性质，反应工艺中使用的交联剂不参与与透明质酸的交联反应，并且以规定量残留在凝胶内部。由于残留的交联剂在体内给药时可能引起炎症反应等的副作用，因此交联透明质酸凝胶的制造商应该设计能够完全去除残留交联剂的制备工艺。

残留交联剂的去除过程在纯化工艺中进行，并且通常的纯化工艺由将交联透明质酸凝胶承载于洗涤用水溶液的方式组成。通常，洗涤用水溶液使用生理盐水或缓冲溶液。由于投入到水溶液的交联透明质酸凝胶具有能够进行材料交换的基质结构，因此残留在凝胶内部的交联剂可通过简单的扩散逸出到凝胶外部。因此，将交联透明质酸凝胶承载于洗涤用水溶液充分的时间，进而可完全去除残留交联剂。但是，由于交联透明质酸凝胶具有强的吸水力，因此在投入到水溶液时具有吸收水分而溶胀的性质。凝胶随着溶胀含有越来越多的水，因此形成凝胶的透明质酸的含量逐渐被稀释而降低。然而，本发明人发现形成交联透明质酸凝胶的透明质酸含量是决定形成凝胶的基质的坚固性的重要因素。即，随着凝胶所含的透明质酸的含量降低，凝胶的弹性降低，并且注入体内时容易分解并消失，故认识到无法表现出令人满意的皱纹改善效果或关节内缓冲效果。对此，交联透明质酸凝胶制备人已确认，为了制备具有所需的透明质酸含量的凝胶，精确调整纯化时间，并且在纯化过程中需要随时检查凝胶的溶胀程度。根据本发明的一实例，交联透明质酸凝胶所含的透明质酸的含量在纯化过程以后，适当为10mg/mL至50mg/mL，优选为15mg/mL至25mg/mL。由于包含10mg/mL以上的透明质酸的交联透明质酸凝胶具有高浓度的透明质酸，因此仍然保持强的吸水力，如前所述的单纯溶胀方式的现有纯化过程，没有特殊装置地投入到水溶液时，由于快速溶胀而使得残留交联剂的洗涤在完全完成前，透明质酸的含量可能已经变得非常低。纯化后，透明质酸的含量降低的交联透明质酸在投入到体内时因未反应交联剂引起的炎症反应会减少，但事实上，通过注入透明质酸来发挥所需性能的作用微小。但是，在本发明的一实例中，令人惊讶的是，在纯化过程以后也能保存10mg/mL以上的透明质酸的含量。

基于上述观点的本发明洗涤容器的特征在于，使洗涤用水溶液可以自由通过并且具有以物理性抑制交联透明质酸凝胶的溶胀的尺寸。通过使用根据本发明的洗涤容器的纯化方法纯化的交联透明质酸凝胶不仅完全去除残留的交联剂，而且最终获取的交联透明质酸凝胶具有高纯度及生物相容性，透明质酸含量可保持在所需的范围内。即，若经根据本发明的洗涤容器的纯化过程，在纯化过程前后，交联透明质酸凝胶的粘弹性在物理性质上不会有太大变化。这与现有的纯化方法相比，是一种令人刮目相看的效果。

本发明所使用的洗涤容器应满足如下条件。

1.具有硬度及张力，以能够物理性抑制交联透明质酸凝胶的溶胀。

2.材质在水溶液中不会生锈或分解。

3.形成在洗涤容器的细孔的尺寸应为使得凝胶不会流出到洗涤容器外部的尺寸。

4.通过洗涤容器的细孔，洗涤用水溶液应能够以充分的面积与凝胶接触。

5.洗涤容器的内部体积不应大于交联透明质酸凝胶的溶胀目标体积。

满足上述条件的根据本发明的洗涤容器通过抑制交联透明质酸凝胶溶胀至所需体积或更大，来防止透明质酸的含量降低至目标含量或更低，即使交联透明质酸凝胶经历纯化过程，也可能不会降低如粘弹性等的基本物性。

据推测，交联透明质酸的溶胀过程可以通过以下四种力的作用来解释。

1.形成交联透明质酸凝胶的基质保持凝胶形态的力(A)

2.洗涤用水溶液的渗透压(B)

3.交联透明质酸凝胶所含的透明质酸的吸水力(C)

4.交联透明质酸凝胶的渗透压(D)

(A)与(B)是抑制交联透明质酸凝胶进行溶胀的力，(C)与(D)是促进交联透明质酸的溶胀的力。在(A+B)>(C+D)的情况下，凝胶的水分流失到水溶液上，则凝胶的体积会收缩，在(A+B)<(C+D)的情况下，水溶液上的水分将被吸收到凝胶中，则凝胶的体积会膨胀。然而，当溶胀持续而四种力达到平衡(A+B)＝(C+D)时，凝胶将达到溶胀平衡并且将不再溶胀。本发明所使用的洗涤容器显示出能够物理性抑制凝胶溶胀的张力(E)作用在凝胶上的效果，因此即使在如(A+B)<(C+D)的力不平衡的状态下，也可通过(A+B+E)＝(C+D)来保持凝胶的体积。之后，本发明的发明人证实，通过实验从上述假设出现的根据本发明的洗涤容器可以无如上所述的粘弹性等物理性状的降低地，有效地纯化未反应交联剂。

另一方面，在本发明中，交联透明质酸凝胶的残留交联剂的洗涤过程与凝胶的基质、渗透压以及透明质酸的吸收力无关地进行。残留交联剂根据洗涤用水溶液和交联透明质酸凝胶之间的自由交联剂的浓度梯度的扩散，通过基质从凝胶内部向外流出而进行洗涤。

用于洗涤根据本发明的交联透明质酸凝胶的洗涤容器的细孔的形状和尺寸不受限制，但是应小于凝胶的尺寸，使得交联透明质酸凝胶在纯化过程中不会从洗涤容器中脱离。在交联透明质酸凝胶的制备工艺中，优选地将凝胶切割成规定尺寸，以便在交联反应工艺完成而获取具有弹性的凝胶之后提高净化效率，并且切割的交联透明质酸凝胶保持其果冻形态。此时，粉碎的每个凝胶的尺寸优选为10mm至50mm，洗涤容器的细孔的尺寸的长度或直径应小于上述凝胶尺寸，1mm至10mm是适合的。非细孔的具有相同内径的筛网结构也适用于实现本发明。

洗涤容器材质应可提供能够物理性抑制交联透明质酸溶胀的张力，塑料或金属材质是适合的。更详细地，作为塑料材质化学稳定且强度高的聚丙烯、聚乙烯、聚四氟乙基或与其等同以上的材质是适合的，作为金属材质，化学上稳定且强度高的SUS 301、SUS 302、SUS 303、SUS 30 3SE、SUS 304、SUS 304L、SUS 316、SUS 316H、SUS 316L、SUS 316N、SUS316Ti或与其等同以上的材质是适合的。

通过使用根据本发明的洗涤容器来获取交联透明质酸凝胶的工艺如下。

首先进行交联剂与透明质酸的交联反应。此时，交联剂可以不受限制地采用已知交联剂，例如，可选自由1，3-二环氧丁烷、1，2，7，8-双环氧辛烷、1，5-己二烯二环氧化物、乙二醇二缩水甘油醚、双酚A二缩水甘油醚、二乙烯砜、环氧氯丙烷、1，4-丁二醇二缩水甘油醚(BDDE)、1，4-双(2，3-环氧丙氧基)丁烷、1，4-二缩水甘油氧基丁烷、1，2-双(2，3-环氧丙氧基)乙烯以及1-(2，3-环氧丙基)-2，3-环氧环己烷组成的组中。透明质酸的分子量和交联结合度可以根据所需产品的性质来适宜决定。

随后，切割所获取的交联透明质酸，并将切割的交联透明质酸填充到根据本发明的洗涤容器中，并用洗涤液进行洗涤。洗涤液可选择公知的缓冲溶液，并且根据需要加入NaOH、KOA、NaHCO 3或LiOH等盐，使得pH为约6.5至8.0。例如，可将磷酸盐缓冲溶液(PBS)等等渗性溶液用作洗涤液。

优选地，在洗涤期间，还可确认交联透明质酸凝胶的溶胀程度。例如，可以通过以1～4小时为单位测量洗涤的交联透明质酸凝胶的体积来确认溶胀程度。

由于未反应交联剂通过扩散而去除，优选地，洗涤应用充分时间进行。例如，虽然没有特别的限制，但可以进行10～48小时。不足10小时的洗涤随情况不同而有所不同，但不足以完全纯化未反应交联剂。

以上，说明了交联透明质酸的制备方法，但本发明着眼于纯化工艺的改善，即使在本说明书中未公开技术的情况下，有关除了纯化装置及工艺以外的透明质酸交联制备方法，在原料、含量及方法等所有方面，都可以不受限制地使用已知内容。

本发明的实施方式

以下，通过实施例例示性说明本发明。注意的是，实施例仅用于表示本发明的一实例，本发明的保护范围并不限于此。

实施例

实施例1

分别如图1及图2所示，为了制备用于交联透明质酸凝胶的纯化工艺的洗涤容器，通过利用123D设计(Design)软件来制备对应于内径55mm、内部高度10mm及内部容积约24mL的洗涤容器的本体及盖帽的附图。利用附图而输出到3D打印机的洗涤容器及盖帽的实物如图3所示。

实施例2

为了制备交联透明质酸凝胶，将5g的透明质酸钠溶解于50mL的0.5M的氢氧化钠溶液中，然后向该溶液中加入0.3mL的二乙烯砜。在37℃的温度下发酵2小时后，如图4所示，将凝胶化的具有弹性的交联透明质酸凝胶切割成宽约10mm、长约10mm、高约10mm的尺寸。

实施例3

如图5所示，称取约4.8mL的实施例2的产物并装入实施例1的洗涤容器中。如图6所示，关闭洗涤容器的盖帽，并在500mL的pH 6.9的PBS缓冲溶液中投入填充有交联透明质酸凝胶的洗涤容器。24小时后，从缓冲溶液中取出洗涤容器来回收填充在洗涤容器中的凝胶。

实施例4

称取约4.8mL的实施例2的产物并装入实施例1的洗涤容器中。关闭洗涤容器的盖帽，并在500mL的pH 6.9的PBS缓冲溶液中投入填充有交联透明质酸凝胶的洗涤容器。48小时后，从缓冲溶液中取出洗涤容器来回收填充在洗涤容器中的凝胶。

实施例5

将实施例3的产物填充在玻璃注射器中，并在121℃的温度下灭菌20分钟。

实施例6

将实施例4的产物填充在玻璃注射器中，并在121℃的温度下灭菌20分钟。

比较例1

称取约4.8mL的实施例2的产物并投入到500mL的pH 6.9的PBS缓冲溶液中，每小时测量溶胀凝胶的体积，5小时后，当凝胶溶胀至24mL时，从缓冲溶液中回收凝胶。

比较例2

称取约4.8mL的实施例2的产物并投入到500mL的pH 6.9的PBS缓冲溶液中，48小时后，从缓冲溶液中回收凝胶。

比较例3

将实施例3的产物填充在玻璃注射器中，并在121℃的温度下灭菌20分钟。

比较例4

将实施例4的产物填充在玻璃注射器中，并在121℃的温度下灭菌20分钟。

实验例1

对与实施例3、实施例4、比较例1及比较例2相对应的交联透明质酸凝胶的透明质酸含量进行评价。将各个交联透明质酸凝胶的透明质酸的对应于3mg的量完全溶解于5mL的硼砂·硫酸溶液中的溶液用作测试液，并根据韩国药典的一般测试方法中的透明质酸眼用注射液的定量法来进行实验。分析结果如下表1。

表1

试样	透明质酸钠含量
		实施例3	20.1mg/mL
实施例4	19.9mg/mL
		比较例1	20.2mg/mL
比较例2	8.8mg/mL

通过上述结果可确认，如实施例3和实施例4所述，填充在洗涤容器的交联透明质酸凝胶分别承载于缓冲溶液24小时和48小时，尽管如此，与溶胀5个小时的比较例1的交联透明质酸凝胶相同，保持约为20mg/mL的透明质酸钠含量。可以确认，如比较例2所述，不使用洗涤容器的情况下，在缓冲溶液上被投入48小时的交联透明质酸凝胶过量溶胀，显示出非常低的透明质酸钠含量。

实验例2

对与实施例3、实施例4、比较例1及比较例2相对应的交联透明质酸凝胶的储存弹性进行评价。使用Rheometer MCR 302(AntonPaar)仪器评价储存弹性，并在1.0Hz上记录储存弹性。分析结果如下表2。

表2

试样	储存弹性(1Hz)
		实施例3	710Pa
实施例4	689Pa
		比较例1	718Pa
比较例2	385Pa

通过上述结果可确认，如实施例3和实施例4所述，填充在洗涤容器的交联透明质酸凝胶分别承载于缓冲溶液24小时和48小时，尽管如此，与溶胀5个小时的比较例1的交联透明质酸凝胶相比，显示出约为700Pa的等同储存弹性。由此确认，通过以常规纯化方法纯化的交联透明质酸凝胶与通过本发明的洗涤容器而溶胀被长时间物理性抑制纯化的交联透明质酸凝胶具有等同的物理特性。但是，不使用洗涤容器的情况下，48小时过量溶胀的如比较例2的交联透明质酸凝胶的储存弹性约低2倍以上，则物理性能下降。

实验例3

将未经灭菌的实施例3、实施例4、比较例1及比较例2的交联透明质酸凝胶的储存弹性与填充到玻璃注射器并经灭菌的实施例5、实施例6、比较例3及比较例4的交联透明质酸凝胶的储存弹性进行比较，并测试根据纯化条件的灭菌抗性。使用Rheometer MCR 302(Anton Paar)仪器评价储存弹性，分析结果如下表3及图7。

表3

试样(灭菌前)	储存弹性(1Hz)	试样(灭菌后)	储存弹性(1Hz)	弹性减少率(％)
					实施例3	718Pa	实施例5	399Pa	44.4％
实施例4	717Pa	实施例6	424Pa	40.9％
					比较例1	704Pa	比较例3	388Pa	44.9％
比较例2	297Pa	比较例4	147Pa	50.5％

通过上述结果可确认，通过洗涤容器纯化的实施例3及实施例4的交联透明质酸凝胶与不使用洗涤容器纯化的比较例1及比较例2的交联透明质酸凝胶相比，在灭菌之前和之后显示出相同的弹性减少率，因此洗涤容器的使用不影响交联透明质酸凝胶的灭菌抗性。

实验例4

对与实施例3、实施例4、比较例1相对应的交联透明质酸凝胶的残留交联剂进行评价。将各个所得产物在35目筛中过筛，用纯净水稀释100倍，并超声波振荡24小时。超声波振荡完成后，对液体进行离心分离。使用UHPLC 1290-Agilnet 6490QQQ LC/MS(Agilent)仪器对离心分离的上清液进行作为二乙烯砜的2,2’-磺酰基二乙醇的浓度分析。对实施例3、

实施例4、比较例1及比较例2的2,2’-磺酰基二乙醇的分析结果如下表4。

表4

试样	残留2,2’-磺酰基二乙醇浓度	色谱图
			实施例3	0.7ppm	图8
实施例4	0ppm(定量限制以下)	图9
			比较例1	20.7ppm	图10

通过上述结果可确认，与不使用洗涤容器纯化的比较例1的情况相比，使用洗涤容器纯化24小时的实施例3的交联透明质酸凝胶的残留交联剂的衍生物减少了约97％以上。在使用洗涤容器纯化24小时的实施例4的情况下，未检测到残留交联剂的衍生物，因此证实纯度非常高。综合实验例1至实验例4的结果，使用洗涤容器不会降低交联透明质酸凝胶所含的透明质酸的含量，并且不会影响凝胶的固有物理性质，可有效地完全除去残留交联剂或残留交联剂的衍生物。

Claims (7)

1.一种纯化方法，作为交联透明质酸的未反应交联剂纯化方法，其包括：使交联剂与透明质酸进行交联反应的步骤；对获取的交联透明质酸进行切割的步骤；将切割的交联透明质酸填充在洗涤容器的步骤；以及用洗涤液洗涤填充有交联透明质酸的洗涤容器的步骤，其特征在于，

在洗涤步骤中物理性抑制交联透明质酸的溶胀。

2.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，洗涤液为等渗性溶液。

3.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，在装有洗涤液的容器中，通过承载填充有交联透明质酸的洗涤容器来洗涤未反应交联剂。

4.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，洗涤后，交联透明质酸的透明质酸含量为10mg/mL至50mg/mL。

5.一种洗涤容器，其用于在交联剂与透明质酸进行交联反应之后纯化未反应交联剂，其特征在于，形成有能够使洗涤液出入的细孔，并且具有能够物理性抑制交联透明质酸的溶胀的尺寸。

6.根据权利要求5所述的洗涤容器，其特征在于，由本体和盖帽形成，在本体和盖帽上都形成有细孔。

7.一种交联透明质酸，其特征在于，通过权利要求1所述的纯化方法纯化。