BR112020012517A2 - método para produzir um produto de gel injetável, produto de gel injetável, composição aquosa, e, seringa pré-carregada. - Google Patents

Abstract

A presente invenção provê um método de produção de um produto de gel injetável, compreendendo as etapas de a) reticulação de um primeiro glicosaminoglicano (GAG) com um primeiro agente de reticulação para produzir um gel, em que a taxa de carregamento do agente de reticulação para a unidade de dissacarídeo está abaixo de 0,15; b) preparação de partículas do gel da etapa a); c) mistura das partículas de gel de glicosaminoglicano (GAG) da etapa b) com um segundo glicosaminoglicano (GAG) para prover uma mistura; d) reticulação da mistura da etapa c) com um segundo agente de reticulação para obter reticulação entre os glicosaminoglicanos (GAGs) da segunda fase externa, provendo assim um gel com uma primeira fase interna das partículas de gel de glicosaminoglicano reticulado (GAG), incorporadas em um gel da segunda fase externa, compreendendo o segundo glicosaminoglicano (GAG), e e) preparação de partículas injetáveis do gel da etapa d), cada uma dessas partículas contendo uma pluralidade de partículas de gel de GAG reticulado da primeira fase interna. A presente invenção provê adicionalmente ainda um produto de gel injetável, uma composição aquosa e uma seringa pré-carregada.

Description

1 / 37 MÉTODO PARA PRODUZIR UM PRODUTO DE GEL INJETÁVEL, PRODUTO DE GEL INJETÁVEL, COMPOSIÇÃO AQUOSA, E, SERINGA PRÉ-CARREGADA Campo técnico da invenção

[001] A presente invenção refere-se ao campo de géis de polissacarídeo. Mais especificamente, a presente invenção refere-se a produtos de gel injetável para uso em cirurgia cosmética. Fundamentos da invenção

[002] Um dos polímeros biocompatíveis mais amplamente usados para uso médico é o ácido hialurônico. É um polissacarídeo de ocorrência natural pertencente ao grupo de glicosaminoglicanos (GAGs). O ácido hialurônico (HA) e os outros GAGs são cadeias de heteropolissacarídeos com carga negativa que têm capacidade para absorver grandes quantidades de água. O ácido hialurônico e os produtos derivados do ácido hialurônico são amplamente usados nos campos biomédico e cosmético, por exemplo, durante a viscocirurgia e como preenchimento dérmico.

[003] Quando usados como preenchimento injetável, materiais firmes e reticulados densamente são frequentemente considerados como tendo um efeito clínico mais forte, denominado “capacidade de levantamento”. Também é sugerido que esses materiais possam ter uma melhor longevidade no tecido. Ao mesmo tempo, suspeita-se que materiais muito firmes originem reações indesejadas nos tecidos, como rejeições de corpos estranhos, enquanto materiais mais macios são considerados menos problemáticos nesse sentido.

[004] O documento EP 466 300 A2 descreve uma pasta fluida de gel bifásica na qual a primeira fase compreende partículas de gel polimérico intumescidas dispersas em uma segunda fase de uma solução viscoelástica de um polímero.

[005] O documento US 2007/0196426 A1 descreve um gel

2 / 37 reticulado compreendendo um número de cubos fortemente reticulados interconectados por um gel que é cada vez menos reticulado, isto é, um gel no qual a quantidade de reticulação diminui progressivamente.

[006] A US 2016/0143943 A1 descreve partículas de gel de HA de núcleo com casca, aumentando gradualmente a capacidade de intumescimento do centro para a superfície.

[007] O documento EP 02011816 A1 descreve um gel injetável correticulado com partículas de gel altamente reticuladas ligadas a um gel levemente reticulado. O objetivo é prover uma ação dupla após a injeção; um primeiro preenchimento imediato e, em um segundo estágio, quando o gel levemente reticulado é biodegradado nos tecidos, um fenômeno de reativação fibroblástica após uma reação leve do corpo estranho às partículas altamente reticuladas. Sumário da invenção

[008] Os materiais de preenchimento de glicosaminoglicanos, como o ácido hialurônico, são compostos de pequenas partículas para permitir a injeção através de uma agulha fina. Os inventores verificaram que a simples mistura de um material de preenchimento firme e macio para injeção não proverá uma funcionalidade dupla in vivo, uma vez que as partículas se distribuirão e se separarão uma da outra até certo ponto após a injeção no tecido. Assim, ao usar um material injetável composto por uma mistura de partículas firmes e macias, o tecido pode ser imediatamente submetido às partículas firmes após a injeção, uma vez que as partículas macias e duras se separam e terminam em locais diferentes.

[009] É um objetivo da presente invenção melhorar a capacidade de levantamento de um material de preenchimento. Para este e outros objetivos que ficarão evidentes para uma pessoa versada na técnica da seguinte descrição, a presente invenção provê de acordo com um primeiro aspecto um produto de gel injetável compreendendo uma primeira fase interna de uma

3 / 37 pluralidade de partículas de gel de glicosaminoglicano reticulado (GAG) incorporadas em uma segunda fase externa de um gel de glicosaminoglicano (GAG) reticulado; em que a segunda fase externa está na forma de partículas; em que o grau de modificação (MoD) do gel da primeira fase interna é 0,15 ou menor, e em que o MoD do gel da segunda fase externa é menor que o MoD do gel da primeira fase interna e em que o MoD é a quantidade molar de agente(s) de reticulação ligado(s) em relação à quantidade molar total de unidades de dissacarídeos de GAG de repetição.

[0010] O primeiro aspecto da invenção baseia-se no entendimento de que, no produto de gel injetável, cada partícula se apresentará como um material macio para o tecido, independentemente da distribuição de partículas no tecido, causando assim menos reações teciduais. À medida que a fase externa mais macia se degrada com o tempo, a fase interna se deteriora em menor grau. Com o tempo, a fase externa é degradada a tal ponto que é dissolvida e transportada para fora do local da injeção por fluidos teciduais. Como o material da fase inicialmente interna e mais firme terá se degradado em um material mais macio durante esse tempo, o material deixado no local da injeção será mais macio do que o material da fase interna era inicialmente. Isso permite que o material incorporado forneça um segundo período de funcionamento no tecido, agora com uma firmeza reduzida para menos reação do tecido. Em outras palavras, ao selecionar a firmeza do gel interno e do gel externo para que o gel externo seja mais macio, o tecido pode primeiro ser submetido ao gel externo mais macio, mas, como esse gel é degradado lentamente, o tecido é eventualmente submetido ao gel interno inicialmente mais firme que se tornou mais macio durante a degradação do gel externo, ou seja, deixou-se o gel interno intumescer in vivo antes que o tecido estivesse

4 / 37 em contato direto com o gel interno.

[0011] Além disso, o produto de gel injetável pode ser preparado de modo que o tecido seja submetido a um gel com propriedades similares, por exemplo, em termos de intumescimento ou firmeza, por períodos mais longos. Assim, pode ser desejável em certas aplicações que o gel interno exposto, após degradação do gel externo, seja tão macio quanto o gel externo inicial. No entanto, em outras aplicações, o gel interno exposto não precisa ser tão macio quanto o gel externo inicial. Como a exposição do gel interno será bastante atrasada e ocorrerá por um longo tempo, a reação do tecido pode ser muito mais fraca do que seria ao injetar diretamente um gel firme.

[0012] A presente invenção provê adicionalmente, de acordo com um segundo aspecto, um método para produzir um produto de gel injetável, compreendendo as etapas de: a) reticulação de um primeiro glicosaminoglicano (GAG) com um primeiro agente de reticulação para produzir um gel, em que a taxa de carregamento do agente de reticulação para a unidade de dissacarídeo está abaixo de 0,15; b) preparação de partículas do gel da etapa a); c) mistura das partículas de gel de glicosaminoglicano (GAG) da etapa b) com um segundo glicosaminoglicano (GAG) para prover uma mistura; d) reticulação da mistura da etapa c) com um segundo agente de reticulação para obter reticulação entre os glicosaminoglicanos (GAGs) da segunda fase externa, provendo assim um gel com uma primeira fase interna das partículas de gel de glicosaminoglicano reticulado (GAG), incorporadas em um gel da segunda fase externa, compreendendo o segundo glicosaminoglicano (GAG); e e) preparação de partículas injetáveis do gel da etapa d), cada uma dessas partículas contendo uma pluralidade de partículas de gel de GAG

5 / 37 reticulado da primeira fase interna.

[0013] Como um terceiro aspecto da invenção, é provida uma composição aquosa compreendendo um produto de gel injetável de acordo com o primeiro aspecto da invenção acima e, opcionalmente, um agente tamponante.

[0014] Além disso, como um quarto aspecto da invenção, é provida uma seringa pré-carregada, que é pré-carregada com um produto de gel injetável de acordo com o primeiro aspecto da invenção acima e depois esterilizada, ou pré-carregada com uma solução composição aquosa esterilizada de acordo com o terceiro aspecto da invenção. Descrição detalhada da invenção

[0015] Como um primeiro aspecto da invenção, é provido um produto de gel injetável compreendendo uma primeira fase interna de uma pluralidade de partículas de gel de glicosaminoglicano reticulado (GAG) incorporadas em uma segunda fase externa de um gel de glicosaminoglicano (GAG) reticulado; em que a segunda fase externa está na forma de partículas; em que o grau de modificação (MoD) do gel da primeira fase interna é 0,15 ou menor, e em que o MoD do gel da segunda fase externa é menor que o MoD do gel da primeira fase interna e em que o MoD é a quantidade molar de agente(s) de reticulação ligado(s) em relação à quantidade molar total de unidades de dissacarídeos de GAG de repetição.

[0016] Um produto de gel injetável refere-se ao gel capaz de fluir e ser injetado através de uma seringa, tal como uma seringa com uma agulha de diâmetro fino, como geralmente requerido em cirurgia cosmética. A agulha pode ser do tipo calibre 27. Assim, o produto de gel injetável pode estar pronto para ser acondicionado em uma seringa.

[0017] O produto de gel injetável pode ser considerado bifásico, isto

6 / 37 é, compreendendo uma primeira fase interna compreendendo a pluralidade de partículas de gel incorporadas em uma segunda fase de gel externa. A fase interna pode ter uma maior concentração de GAGs, pode ser mais firme e/ou ter um maior grau de reticulação.

[0018] O produto de gel injetável também pode ser coesivo ou apresentar coesividade, por exemplo, como definido no documento WO 11086458 A1.

[0019] Um glicosaminoglicano (GAG) é uma cadeia de heteropolissacarídeos com carga negativa que tem capacidade para absorver grandes quantidades de água. O GAG pode, por exemplo, ser glicosaminoglicanos sulfatados ou não sulfatados, como hialuronano, sulfato de condroitina, sulfato de heparano, heparosano, heparina, sulfato de dermatano e sulfato de queratano. Em algumas modalidades, o GAG é ácido hialurônico, condroitina ou sulfato de condroitina.

[0020] O gel da fase interna e/ou da fase externa pode ser um hidrogel. Ou seja, eles podem ser considerados como sistemas reticulados de moléculas de GAG insolúveis em água, mas substancialmente diluídos, quando submetidos a um líquido, tipicamente um líquido aquoso.

[0021] O gel da primeira fase interna e o gel da segunda fase externa são reticulados. Os géis compreendem assim uma rede de forma contínua de moléculas de GAG que é mantida unida pelas reticulações covalentes, entrelaçamento físico das cadeias de GAG e várias interações, como ligação de hidrogênio, forças de van der Waals e interações eletrostáticas.

[0022] O grau de modificação (MoD) é uma medida do grau de reticulação. MoD é expresso como mol/mol, um número sem dimensão ou % em mol. MoD descreve a quantidade de agente(s) de reticulação que é/são ligado(s) ao GAG, isto é, quantidade molar de agente(s) de reticulação ligado(s) em relação à quantidade molar total de unidades de dissacarídeos de GAG de repetição. Assim, o MoD reflete em que grau o GAG foi

7 / 37 quimicamente modificado pelo(s) agente(s) de reticulação.

[0023] Outra quantidade para medir o grau de reticulação é a taxa de carregamento, isto é, a razão entre o número de agentes de reticulação adicionados ao vaso de reação e o número total de unidades de dissacarídeos adicionados ao vaso de reação ao realizar a reação de reticulação.

[0024] Como exemplo, o grau de reticulação do produto de gel pode ser tal que a taxa de carregamento seja menor que 0,1, preferivelmente menor que ou igual a 0,02, ao preparar os géis da primeira fase interna e da segunda fase externa.

[0025] O gel da primeira fase interna e o gel da segunda fase externa estão ainda na forma de partículas, isto é, na forma de fragmentos que podem ter qualquer tipo de forma, regular ou irregular. Os tamanhos podem ser não uniformes, isto é, o produto de gel pode compreender partículas de tamanhos diferentes. Além disso, as partículas de gel da fase externa compreendem uma pluralidade de partículas de gel internas. Em outras palavras, o tamanho de partícula do gel externo é maior que o tamanho de partícula do gel interno.

[0026] As partículas de gel da segunda fase externa podem ter um tamanho ≥ 0,1 mm.

[0027] O primeiro aspecto da invenção baseia-se na percepção de que a incorporação de um material densamente reticulado e, portanto, firme, em um material levemente reticulado e, portanto, macio, pode proporcionar maior capacidade de levantamento no tecido. No entanto, os inventores verificaram que ter um MoD menor que 0,15 no gel da fase interna e um MoD ainda mais baixo no gel da fase externa é vantajoso, pois torna o gel combinado ideal para injeção. O produto de gel da presente invenção é assim macio o suficiente para causar pequenas reações nos tecidos após a injeção.

[0028] Com o tempo, o material macio é degradado a tal ponto que é dissolvido e transportado para fora do local da injeção por fluidos teciduais. Devido ao MoD menor que 0,15, o material interno inicialmente mais firme

8 / 37 terá se degradado em um material mais macio durante esse período. Assim, o material deixado no local da injeção será mais macio do que o material firme era inicialmente. Isso permite que o material incorporado forneça um segundo período de funcionamento no tecido, agora com uma firmeza reduzida para menos reação do tecido. Em outras palavras, devido ao MoD menor que 0,15 no gel da fase interna e a um MoD ainda mais baixo no gel da fase externa, o tecido é exposto a um gel macio por um longo período de tempo.

[0029] Deve ser entendido que a primeira fase interna da pluralidade de partículas de gel de glicosaminoglicano reticulado (GAG) pode compreender fases adicionais, como partículas menores incorporadas na primeira fase interna da pluralidade de partículas de gel de glicosaminoglicano reticulado (GAG), e essas partículas menores podem ter partículas ainda menores incorporadas, e assim por diante.

[0030] Nas modalidades, o grau de modificação (MoD) do gel da primeira fase interna é 0,10 ou menor, tal como 0,05 ou menor, tal como 0,02 ou menor.

[0031] Nas modalidades, o grau de modificação (MoD) do gel da segunda fase externa é 0,10 ou menor. Géis com essa maciez podem ser adequados para contato com o tecido após a injeção.

[0032] No entanto, o MoD da segunda fase externa pode estar acima de 0,05, como acima de 0,05, mas menor que o MoD do gel da fase interna. Como um exemplo, o MoD do gel da segunda fase externa pode estar entre 0,08 e 0,095. Verificou-se que os géis que têm esse MoD são suficientemente firmes para se unirem como um gel coesivo, mas ainda assim são percebidos como macios após a injeção.

[0033] Uma propriedade física relevante de um produto de gel de GAG reticulado é o volume de líquido que o gel pode absorver e está relacionado à estabilidade estrutural do gel, geralmente chamada de força ou firmeza do gel. Expressões tradicionais para a absorção de líquidos são

9 / 37 intumescimento, capacidade de intumescimento, capacidade de retenção de líquidos, grau de intumescimento, fator de intumescimento, absorção máxima de líquido e intumescimento máximo. Ao longo deste texto, o termo fator de intumescimento (SWF) será usado.

[0034] Quando o gel é submetido a condições não precipitantes, é possível determinar seu fator de intumescimento ou inversamente sua concentração mínima (Cmin), isto é, a concentração de GAG quando o produto de gel está totalmente intumescido. A adição adicional de líquido não diluirá ainda mais o gel, isto é, o gel não pode ser diluído indefinidamente como uma solução de moléculas livres. Geralmente, espera-se que os géis mais firmes (com baixo intumescimento) tenham uma meia-vida mais longa in vivo do que os géis mais macios (com alto intumescimento).

[0035] Nas modalidades, o fator de intumescimento (SwF) do gel da segunda fase externa é acima de 3,0, tal como acima de 4,0. Esse gel pode ser percebido como macio para o tecido.

[0036] No entanto, o fator de intumescimento do gel da segunda fase externa ainda pode estar abaixo de 10,0, ou seja, entre 3,0 e 10,0, como entre 3,0 e 5,0. Um gel com esse fator de intumescimento pode ser macio o suficiente para ser percebido como macio, mas firme o suficiente para reter uma pluralidade de partículas de gel internas incorporadas no gel durante a fabricação, como após a redução do tamanho de partícula (PSR) do gel externo. A PSR é um processo no qual um gel é empurrado através de uma grade, quebrando assim o gel em partículas com um tamanho médio de partículas correspondente aos furos transpassantes da grade.

[0037] Nas modalidades, os géis da primeira fase interna e da segunda fase externa são reticulados um ao outro.

[0038] Assim, os géis podem ser reticulados entre si, de modo a formar um único gel coesivo, em contraste com as partículas de gel internas dispersas no gel externo. As reticulações entre os géis interno e externo

10 / 37 podem ser realizadas enquanto se reticula o gel externo. Isso pode ser vantajoso, pois pode impedir que as partículas de gel internas se separem do gel externo antes que o gel externo seja completamente dissolvido após a injeção.

[0039] Nas modalidades, o grau de modificação (MoD) é substancialmente homogêneo na segunda fase externa e substancialmente homogêneo na primeira fase interna.

[0040] Assim, o grau de reticulação pode ser substancialmente homogêneo em ambas as fases do gel, como constante quando visto em uma direção do centro do gel e para o exterior. Portanto, isso está em contraste com um gel no qual o grau de reticulação varia dentro do gel.

[0041] As partículas de gel externas podem compreender pelo menos cinco partículas de gel internas, como pelo menos dez partículas de gel internas, como pelo menos vinte partículas de gel internas.

[0042] Em modalidades, o tamanho de partícula de gel externa é pelo menos três vezes o tamanho de um tamanho de partícula interna.

[0043] Além disso, as partículas internas podem ter um tamanho médio menor que 0,200 mm.

[0044] Em modalidades, o teor em peso seco do glicosaminoglicano reticulado (GAG) da primeira fase interna é pelo menos 25% do teor em peso seco total de glicosaminoglicanos (GAGs) na fase interna e externa, como pelo menos 50% do teor em peso seco total de glicosaminoglicanos (GAGs) na fase interna e externa.

[0045] Esses géis podem ser macios o suficiente para prover uma maciez inicial in vivo, mas têm um teor de partículas internas alto o suficiente para prover uma segunda função uma vez que o gel externo se dissolva.

[0046] Como exemplo, o teor em peso seco do glicosaminoglicano (GAG) reticulado da primeira fase interna pode ser pelo menos 60% do teor em peso seco total de glicosaminoglicanos (GAGs) na fase interna e externa.

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[0047] Como um exemplo adicional, o teor em peso seco do glicosaminoglicano (GAG) reticulado da primeira fase interna pode ser entre 65% e 95% do teor em peso seco total de glicosaminoglicanos (GAGs) na fase interna e externa.

[0048] Nas modalidades, o glicosaminoglicano (GAG) é ácido hialurônico.

[0049] Salvo disposição em contrário, o termo “ácido hialurônico” abrange todas as variantes e combinações de variantes de ácido hialurônico, ou hialuronano, de vários comprimentos de cadeia e estados de carga, bem como com várias modificações químicas. Ou seja, o termo também abrange os vários sais de hialuronato de ácido hialurônico, como hialuronato de sódio. Várias modificações do ácido hialurônico também são englobadas pelo termo, como oxidação, por exemplo, oxidação de grupos CH2OH em COOH; oxidação com periodato de grupos hidroxila vicinais, opcionalmente seguida por redução ou formação de imina etc; redução, por exemplo, redução de COOH para CH2OH; sulfatação; desamidação, opcionalmente seguida de desaminação ou formação de amida com novos ácidos; esterificação; substituições com vários compostos, por exemplo, usando um agente de reticulação ou uma carbodi-imida; incluindo acoplamento de diferentes moléculas, como proteínas, peptídeos e componentes ativos de fármacos, ao ácido hialurônico; e desacetilação.

[0050] Como exemplo, o ácido hialurônico pode ser um ácido hialurônico quimicamente não modificado ou sal de hialuronato, preferivelmente hialuronato de sódio, com um peso molecular médio na faixa de 0,1 a 10 MDa, preferivelmente 0,8 a 5 MDa, mais preferivelmente 0,8 a 1,2 MDa. É preferido que o ácido hialurônico seja obtido de origem não animal, preferivelmente bactérias.

[0051] Em algumas modalidades, a reticulação do gel interno e/ou externo é realizada usando um ou mais agentes de reticulação polifuncionais

12 / 37 selecionados individualmente do grupo que consiste em divinil sulfona, multiepóxidos e diepóxidos. Em certas modalidades, o(s) agente(s) de reticulação polifuncional(is) é/são selecionado(s) individualmente do grupo que consiste em 1,4-butanodiol diglicidil éter (BDDE), 1,2-etanodiol diglicidil éter (EDDE) e diepoxioctano. Em modalidades específicas, o agente de reticulação polifuncional é o 1,4-butanodiol diglicidil éter (BDDE).

[0052] Assim, nas modalidades, a reticulação é ligações de éter.

[0053] Em modalidades, a reticulação do glicosaminoglicano é alcançada por acoplamento de amida de moléculas de glicosaminoglicano. O acoplamento de amida pode ser realizado usando um reticulador funcional di- ou multinucleofílico.

[0054] O acoplamento de amida usando um reticulador funcional di- ou multiamina em conjunto com um agente de acoplamento é uma via atraente para a preparação de moléculas de glicosaminoglicano reticulado úteis na presente invenção.

[0055] A reticulação pode ser conseguida usando um reticulador di- ou multinucleofílico que não é à base de carboidratos, por exemplo hexametilenodiamina (HMDA), ou um reticulador di- ou multinucleofílico à base de carboidratos, por exemplo diaminotrealose (DATH) juntamente com um glicosaminoglicano.

[0056] Assim, o reticulador compreendendo pelo menos dois grupos funcionais nucleofílicos pode, por exemplo, ser um reticulador di- ou multinucleofílico que não é à base de carboidratos ou um reticulador di- ou multinucleofílico à base de carboidratos.

[0057] Um grupo preferido de reticulador funcional di- ou multinucleofílico inclui aminas primárias homo- ou heterobifuncionais, hidrazinas, hidrazidas, carbazatos, semicarbazidas, tiossemicarbazidas, tiocarbazatos e aminóxi.

[0058] Os di-, tri-, tetra e oligossacarídeos funcionais di- ou

13 / 37 multinucleofílicos podem ser derivados de polissacarídeos funcionais nucleofílicos, como a quitobiose derivada da quitina. Os di-, tri-, tetra- e oligossacarídeos funcionais di ou multinucleofílicos também podem ser di-, tri-, tetra- e oligossacarídeos que foram modificados pela introdução de dois ou mais grupos funcionais nucleofílicos.

[0059] Reticuladores di- ou multinucleofílicos à base de carboidratos podem ser vantajosos, uma vez que proveem um produto de hidrogel baseado inteiramente em estruturas do tipo carboidrato ou seus derivados, o que minimiza a perturbação da reticulação nas propriedades nativas dos glicosaminoglicanos. O próprio reticulador também pode contribuir para manter ou aumentar as propriedades do hidrogel, por exemplo, quando reticulada com uma estrutura que se correlaciona com o ácido hialurônico ou quando reticulada com uma estrutura com altas propriedades de retenção de água.

[0060] Em modalidades, o reticulador di- ou multinucleofílico é um polissacarídeo pelo menos parcialmente desacetilado, isto é, um polissacarídeo acetilado que foi pelo menos parcialmente desacetilado para prover um polissacarídeo com grupos amina livres. Um glicosaminoglicano pelo menos parcialmente desacetilado pode ser reticulado sozinho ou em combinação com um segundo glicosaminoglicano, pelo qual o próprio glicosaminoglicano desacetilado atua como o reticulador di- ou multinucleofílico.

[0061] Nas modalidades do primeiro aspecto da invenção, as moléculas de glicosaminoglicano da primeira fase interna e/ou as moléculas de glicosaminoglicano da segunda fase externa são reticuladas covalentemente por meio de reticulações que compreendem um grupo espaçador selecionado do grupo que consiste em di-, tri- e , tetra- e oligossacarídeos.

[0062] A reticulação consiste tipicamente i) no grupo espaçador e ii)

14 / 37 nos grupos de ligação formados após a reação dos grupos funcionais do reticulador com os grupos de ácido carboxílico no GAG. O grupo espaçador pode, por exemplo, compreender um resíduo de tetrassacarídeo do ácido hialurônico, hexassacarídeo do ácido hialurônico, trealose, lactose, maltose, sacarose, celobiose ou rafinose.

[0063] A reticulação por meio de reticuladores compreendendo um grupo espaçador selecionado do grupo que consiste em di-, tri-, tetra- e oligossacarídeos provê um produto de hidrogel baseado inteiramente em estruturas do tipo carboidrato ou seus derivados, o que minimiza a perturbação da reticulação nas propriedades nativas dos glicosaminoglicanos. O di-, tri-, tetra- ou oligossacarídeo é preferivelmente bem definido em termos de estrutura e peso molecular. Preferivelmente, o espaçador é selecionado a partir de uma estrutura específica de di-, tri-, tetra- ou oligossacarídeo. Preferivelmente, o di-, tri-, tetra- ou oligossacarídeo é monodisperso ou tem uma distribuição de peso molecular estreita. O uso de reticuladores à base de di-, tri-, tetra- ou oligossacarídeos bem definidos, juntamente com uma reação de condensação altamente eficiente, permite que o produto seja montado de maneira controlada. O próprio reticulador também pode contribuir para manter ou aumentar as propriedades do hidrogel, por exemplo, quando reticulado com uma estrutura que se correlaciona com o ácido hialurônico (por exemplo, tetrassacarídeo do ácido diamino hialurônico) ou quando reticulado com uma estrutura com propriedades de alta retenção de água (por exemplo, trealose).

[0064] Como exemplo, pelo menos 75% das reticulações podem compreender um grupo espaçador selecionado do grupo que consiste em di-, tri-, tetra- e oligossacarídeos.

[0065] Adicionalmente, o grupo espaçador pode ser um resíduo de tetrassacarídeo do ácido hialurônico, hexassacarídeo do ácido hialurônico, trealose, lactose, maltose, sacarose, celobiose ou rafinose.

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[0066] Além disso, o grupo espaçador pode ser selecionado do grupo que consiste em di-, tri- e tetrassacarídeos.

[0067] Em modalidades do primeiro aspecto da invenção, pelo menos 90% das ligações entre moléculas de glicosaminoglicano e reticulações são ligações de amida.

[0068] Além disso, menos de 5% das ligações entre moléculas de glicosaminoglicano e reticulações podem ser ligações de éster.

[0069] O primeiro e/ou o segundo glicosaminoglicano podem ser adicionalmente reticulados usando um reagente de acoplamento peptídico. A reticulação usando um agente de acoplamento peptídico é vantajosa em relação a muitos outros métodos comuns de reticulação (por exemplo, reticulação BDDE), pois permite que a reticulação seja realizada em pH neutro com degradação mínima das moléculas de glicosaminoglicano.

[0070] De acordo com algumas modalidades, o reagente de acoplamento peptídico é selecionado do grupo que consiste em reagentes de acoplamento à base de triazina, reagentes de acoplamento de carbodi-imida, reagentes de acoplamento derivados de imidazólio, Oxyma e COMU.

[0071] De acordo com algumas modalidades, o reagente de acoplamento peptídico é um reagente de acoplamento à base de triazina. De acordo com algumas modalidades, o reagente de acoplamento à base de triazina é selecionado do grupo que consiste em cloreto de 4-(4,6-dimetoxi- 1,3,5-triazin-2-il)-4-metilmorfolínio (DMTMM) e 2-cloro-4,6-dimetoxi-1,3,5- triazina (CDMT). De acordo com algumas modalidades, o reagente de acoplamento à base de triazina é DMTMM.

[0072] De acordo com algumas modalidades, o reagente de acoplamento peptídico é um reagente de acoplamento de carbodi-imida. De acordo com algumas modalidades, o reagente de acoplamento de carbodi- imida é N-(3-dimetilaminopropil)-N’-etilcarbodi-imida (EDC) combinado com N-hidroxissuccinimida (NHS).

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[0073] O produto de gel injetável também pode compreender uma porção de moléculas de GAG que não são reticuladas, isto é, não estão ligadas a uma rede de moléculas de GAG reticulada tridimensional. No entanto, é preferido que pelo menos 50% em peso, preferivelmente pelo menos 60% em peso, mais preferivelmente pelo menos 70% em peso e mais preferivelmente pelo menos 80% em peso, do produto de gel injetável de moléculas de GAG faça parte de uma rede de moléculas de GAG reticulada.

[0074] Como um segundo aspecto da invenção, é provido um método para produzir um produto de gel injetável, compreendendo as etapas de: a) reticulação de um primeiro glicosaminoglicano (GAG) com um primeiro agente de reticulação para produzir um gel, em que a taxa de carregamento do agente de reticulação para a unidade de dissacarídeo está abaixo de 0,15; b) preparação de partículas do gel da etapa a); c) mistura das partículas de gel de glicosaminoglicano (GAG) da etapa b) com um segundo glicosaminoglicano (GAG) para prover uma mistura; d) reticulação da mistura da etapa c) com um segundo agente de reticulação para obter reticulação entre os glicosaminoglicanos (GAGs) da segunda fase externa, provendo assim um gel com uma primeira fase interna das partículas de gel de glicosaminoglicano reticulado (GAG), incorporadas em um gel da segunda fase externa, compreendendo o segundo glicosaminoglicano (GAG), e e) preparação de partículas injetáveis do gel da etapa d), cada uma dessas partículas contendo uma pluralidade de partículas de gel de GAG reticulado da primeira fase interna.

[0075] Os termos e definições usados em relação ao segundo aspecto da invenção são como discutidos em relação ao primeiro aspecto acima.

[0076] Nas modalidades, as partículas injetáveis produzidas na etapa

17 / 37 e) são um produto de gel, conforme descrito em relação a qualquer modalidade do primeiro aspecto acima.

[0077] O método do segundo aspecto é vantajoso, pois é um processo conveniente para a produção de um gel combinado, isto é, para incorporar um material densamente reticulado e, portanto, firme, em um material levemente reticulado e, portanto, macio. Esse gel combinado pode dar uma capacidade de levantamento mais forte no tecido. Os inventores verificaram que ter uma taxa de carregamento na etapa a) abaixo de 0,15, ou seja, ao produzir as partículas de gel de GAG “internas” e uma taxa de carregamento ainda mais baixa na etapa d), ou seja, ao incorporar as partículas de gel de GAG internas na matriz externa, facilita a formação de um produto de gel que pode dar uma capacidade de levantamento mais forte no tecido.

[0078] Além disso, o método do segundo aspecto da invenção é vantajoso, pois permite um processo eficaz para a produção do produto de gel injetável, uma vez que podem ser usadas pequenas quantidades de agente de reticulação.

[0079] As etapas de incorporação de partículas já reticuladas dentro de um gel que é subsequentemente reticulado podem ser repetidas por qualquer número de vezes, como pelo menos duas vezes ou pelo menos três vezes. Assim, a etapa d) pode compreender adicionalmente a preparação de partículas do gel provido e essas partículas preparadas podem ser usadas em uma etapa repetida c) no qual são misturados, por exemplo, um terceiro glicosaminoglicano (GAG) para prover uma mistura, que é subsequentemente reticulada em uma etapa repetida d) para formar um gel. As partículas desse gel podem novamente ser misturadas com outros GAGs e assim por diante.

[0080] Assim, as etapas c) e d) podem ser repetidas qualquer número de vezes. O agente de reticulação usado nas etapas de reticulação pode ser como discutido no primeiro aspecto da invenção acima.

[0081] Como exemplo, a reticulação na etapa a) e/ou etapa b) pode

18 / 37 resultar em ligações de éter.

[0082] Como um exemplo adicional, a reticulação na etapa a) e/ou na etapa b) pode resultar em moléculas de GAG sendo reticuladas covalentemente por reticulações compreendendo um grupo espaçador selecionado a partir do grupo que consiste em di-, tri-, tetra- e oligossacarídeos.

[0083] A reticulação na etapa d) pode ser realizada usando as mesmas condições de reticulação que a reticulação na etapa a). A taxa de carregamento na etapa d) pode ser a mesma da etapa a) ou diferente.

[0084] Além disso, a reticulação na etapa d) pode ser realizada usando o mesmo agente de reticulação da etapa a) ou usando um agente de reticulação diferente do agente de reticulação usado na etapa a). Consequentemente, o primeiro e o segundo agentes de reticulação podem ser iguais ou diferentes.

[0085] Além disso, a reticulação das etapas a) e/ou d) pode ser realizada por uma adição inicial do agente de reticulação para aumentar a homogeneidade da reticulação no primeiro gel e/ou externo.

[0086] A taxa de carregamento da etapa a) pode ser menor que 0,10, tal como menor que 0,05.

[0087] Como exemplo, a taxa de carregamento da etapa a) pode estar entre 0,002 e 0,10, como entre 0,005 e 0,10, como entre 0,005 e 0,05, como entre 0,005 e 0,03, como entre 0,005 e 0,03, como entre 0,01 e 0,3.

[0088] Nas modalidades, a taxa de carregamento do agente de reticulação para a unidade de dissacarídeo na etapa d) é menor que 0,10, tal como menor que 0,05. Os inventores verificaram que uma taxa de carregamento tão baixa ao produzir a matriz de gel externa ainda pode prover um produto de gel com características degradantes adequadas in situ.

[0089] Nas modalidades, a taxa de carregamento do agente de reticulação para a unidade de dissacarídeo na etapa d) é menor que a taxa de

19 / 37 carregamento da etapa a).

[0090] Nas modalidades, a reticulação da etapa d) compreende adicionalmente obter reticulação entre os géis da primeira fase interna e da segunda fase externa. Assim, o segundo agente de reticulação usado na etapa d) pode auxiliar ainda mais na reticulação da matriz de gel externa para as partículas de gel incorporadas e, assim, pode auxiliar na retenção das partículas de gel incorporadas no gel ao preparar as partículas injetáveis na etapa e).

[0091] Nas modalidades, a etapa c) compreende misturar as partículas de gel de glicosaminoglicano (GAG) da etapa b) no estado seco com o segundo glicosaminoglicano (GAG) no estado seco. As partículas de gel no estado seco podem, por exemplo, estar na forma de pó ou na forma de cordões emaranhados secos. A mistura no estado seco pode ser vantajosa, pois provê uma boa mistura entre o primeiro e o segundo GAGs, isto é, provê uma distribuição uniforme das partículas de gel da primeira fase interna dentro da fase externa.

[0092] No entanto, a etapa c) pode compreender primeiro dissolver as partículas de gel de glicosaminoglicano (GAG) da etapa b) e misturar a solução com uma solução compreendendo o segundo glicosaminoglicano (GAG).

[0093] Nas modalidades, a etapa de preparação de partículas da etapa b) compreende adicionalmente precipitar e secar as ditas partículas preparadas do gel da etapa a).

[0094] A precipitação das partículas de gel internas é vantajosa, pois aumenta ainda mais as possibilidades de lavar as partículas de gel da primeira fase interna, por exemplo, para diminuir o número de subprodutos, como agentes de reticulação não reagidos. A precipitação por si só pode atuar como uma etapa de limpeza; isto é, subprodutos indesejados podem ser separados das partículas de gel durante a precipitação real.

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[0095] Além disso, a precipitação das partículas de gel internas pode tornar as partículas de gel internas mais acessíveis para agentes de reticulação durante a segunda etapa da reticulação, isto é, durante a etapa d). Isso significa que podem ser usadas quantidades inferiores de agente de reticulação na segunda etapa de reticulação, isto é, a precipitação aumenta o uso eficaz dos agentes de reticulação e, assim, aumenta a eficácia de todo o método.

[0096] Além disso, um pó precipitado pode ser armazenado e, portanto, a segunda reticulação da etapa d) não precisa ser realizada imediatamente após a precipitação. Assim, a etapa c) pode ser realizada pelo menos 1 hora após a precipitação, como pelo menos 5 horas, como pelo menos 10 horas, como pelo menos 24 horas, como pelo menos 48 horas após a precipitação. Assim, uma etapa de precipitação e secagem das partículas preparadas do gel da etapa a) aumenta a flexibilidade do processo.

[0097] Consequentemente, uma etapa de precipitação é vantajosa, pois permite a limpeza das partículas de gel, o processo se torna mais flexível, pois as duas etapas de reticulação podem ser divididas em etapas de reticulação mais distintas e separadas e a eficácia geral do processo aumentou devido ao uso de quantidades mais baixas de agente de reticulação.

[0098] Nas modalidades do segundo aspecto, a mistura da etapa c) contém pelo menos 45% em peso seco das partículas de gel de GAG obtidas na etapa b), como pelo menos 50% em peso seco das partículas de gel de GAG obtidas na etapa b). Dessa forma, o teor em peso seco do glicosaminoglicano (GAG) reticulado da primeira fase interna pode ser pelo menos 50% do teor em peso seco total de glicosaminoglicanos (GAGs) na etapa c).

[0099] Como um exemplo, a mistura da etapa c) pode conter pelo menos 60% em peso seco das partículas de gel de GAG obtidas na etapa b).

[00100] Como um exemplo adicional, a mistura da etapa c) pode conter

21 / 37 pelo menos entre 65% e 95% em peso seco das partículas de gel de GAG obtidas na etapa b). Dessa forma, o teor em peso seco do glicosaminoglicano (GAG) reticulado da primeira fase interna pode ser entre 65% e 95% do teor em peso seco total de glicosaminoglicanos (GAGs) na fase interna e externa.

[00101] Como um terceiro aspecto da invenção, é provida uma composição aquosa compreendendo um produto de gel injetável de acordo com qualquer modalidade do primeiro aspecto acima e, opcionalmente, um agente tamponante.

[00102] A composição aquosa pode ser adequada para injeção. A composição aquosa pode tipicamente conter um tampão de sal fisiológico. A composição pode compreender adicionalmente outros aditivos adequados, tais como anestésicos locais (por exemplo, cloridrato de lidocaína), fármacos anti- inflamatórios, antibióticos e outros medicamentos de suporte adequados, por exemplo fatores ou células de crescimento ósseo.

[00103] A administração do produto de gel injetável ou da composição aquosa pode ser realizada de qualquer maneira adequada, como por injeção de cânulas e agulhas padrão de tamanhos apropriados ou inserção cirúrgica, por exemplo no caso de administração de um filme. A administração é realizada onde o aumento de tecidos moles é desejado, como o queixo, bochechas ou em qualquer outro local da face ou do corpo.

[00104] Assim, como um quarto aspecto da invenção, é provida uma seringa pré-carregada, que é pré-carregada com um produto de gel injetável esterilizado de acordo com qualquer modalidade do primeiro aspecto acima ou com uma composição aquosa esterilizada de acordo com o terceiro aspecto acima.

[00105] O produto de gel pode ser mantido na forma precipitada na seringa e trazida para a sua forma não precipitada antes da injeção ou no corpo após a injeção.

[00106] O produto de gel pode ainda ser colocado em autoclave, uma

22 / 37 vez que esta é a maneira mais conveniente de esterilizar o produto final. Isso permite a preparação de um produto de gel esterilizado e injetável.

[00107] Em certas modalidades, o produto de gel injetável ou a composição aquosa de acordo com o primeiro e o terceiro aspectos acima são úteis como medicamento ou dispositivo médico em um método médico ou cirúrgico.

[00108] De acordo com um aspecto adicional, é provido o uso de um produto de gel injetável de acordo com o primeiro aspecto acima ou a composição aquosa de acordo com o terceiro aspecto acima em cirurgia cosmética ou médica. Em outras palavras, é provido um produto de gel injetável ou uma composição aquosa para uso em cirurgia cosmética ou médica.

[00109] Em algumas modalidades, o uso é em cirurgia cosmética selecionada a partir do preenchimento dérmico e contorno corporal. Em algumas outras modalidades, o uso é como um medicamento no tratamento e/ou em cirurgia médica selecionada de preenchimento dérmico, contorno corporal, prevenção de adesão tecidual, formação de canais, tratamento para incontinência e aplicações ortopédicas.

[00110] De acordo com um aspecto, é provido um método de tratamento de um indivíduo submetido a cirurgia cosmética ou médica, envolvendo a administração de um produto de gel injetável de acordo com o primeiro aspecto acima ou a composição aquosa de acordo com o terceiro aspecto acima a um indivíduo em necessidade.

[00111] Em certas modalidades, o indivíduo está passando por cirurgia cosmética selecionada de preenchimento dérmico e contorno corporal. Em certas outras modalidades, o indivíduo está passando por cirurgia médica, ou tratamento médico, para uma condição selecionada de preenchimento dérmico, contorno corporal, prevenção de adesão tecidual, formação de canais, tratamento para incontinência e aplicações ortopédicas.

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[00112] O glicosaminoglicano pode ele próprio atuar como um reticulador em um gel reticulado, por exemplo, quando um glicosaminoglicano desacetilado é usado. Nesses casos, o Grau de modificação (MoD), que é uma propriedade relevante ao usar agentes de reticulação que não o próprio glicosaminoglicano, pode corresponder ao grau de desacetilação do glicosaminoglicano. Assim, todas as modalidades e exemplos de MoD discutidos em relação aos aspectos anteriores acima também podem ser relevantes quando o próprio glicosaminoglicano atua como um reticulador, mas depois como grau de desacetilação do glicosaminoglicano.

[00113] Dessa forma, como um aspecto geral da presente invenção, é provido um produto de gel injetável compreendendo uma primeira fase interna de uma pluralidade de partículas de gel de glicosaminoglicano reticulado (GAG) incorporadas em uma segunda fase externa de um gel de glicosaminoglicano (GAG) reticulado; em que a segunda fase externa está na forma de partículas; em que a quantidade máxima de reticulações em relação à quantidade molar total de unidades de dissacarídeos de GAG de repetição do gel da primeira fase interna é 0,15 ou menor, e em que a quantidade máxima de reticulações em relação à quantidade molar total de unidades de dissacarídeo de GAG de repetição do gel da segunda fase externa é menor que a quantidade máxima de reticulações em relação à quantidade molar total de unidades de dissacarídeo de GAG de repetição do gel da primeira fase interna.

[00114] A quantidade máxima de reticulações em relação à quantidade molar total de unidades de dissacarídeo de GAG de repetição pode, por exemplo, ser o MoD se um agente de reticulação separado que não o próprio GAG for usado para reticulação ou o grau de desacetilação se o próprio GAG atuar como reticulador. Além disso, quando o próprio glicosaminoglicano

24 / 37 atua como reticulador no gel reticulado, os aspectos alternativos discutidos abaixo podem se tornar relevantes. Os termos e definições usados em relação a esses aspectos alternativos são como discutidos em relação aos aspectos anteriores acima.

[00115] Dessa forma, como um aspecto alternativo da presente invenção, é provido um produto de gel injetável compreendendo uma primeira fase interna de uma pluralidade de partículas de gel de glicosaminoglicano reticulado (GAG) incorporadas em uma segunda fase externa de um gel de glicosaminoglicano (GAG) reticulado; em que a segunda fase externa está na forma de partículas e em que o glicosaminoglicano (GAG) da primeira fase interna e/ou o glicosaminoglicano (GAG) da segunda fase externa compreende reticulações nas quais o próprio glicosaminoglicano atua como um reticulador di- ou multinucleofílicos.

[00116] Nas modalidades, o grau de desacetilação do gel da primeira fase interna é 0,15 ou menor, e em que o grau de desacetilação do gel da segunda fase externa é menor que o grau de desacetilação do gel da primeira fase interna.

[00117] Em uma modalidade, apenas o glicosaminoglicano (GAG) da primeira fase interna compreende reticulações nas quais o próprio glicosaminoglicano atua como um reticulador di- ou multinucleofílico.

[00118] Em uma modalidade, apenas o glicosaminoglicano (GAG) da segunda fase externa compreende reticulações nas quais o próprio glicosaminoglicano atua como um reticulador di- ou multinucleofílico.

[00119] Em uma modalidade, o glicosaminoglicano (GAG) da primeira fase interna e o glicosaminoglicano (GAG) da segunda fase externa compreendem reticulações nas quais o próprio glicosaminoglicano atua como um reticulador di- ou multinucleofílico.

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[00120] Como exemplo, um glicosaminoglicano desacetilado pode atuar como o reticulador di- ou multinucleofílico.

[00121] Dessa forma, o próprio glicosaminoglicano atuando como um reticulador di- ou multinucleofílico pode ser um glicosaminoglicano pelo menos parcialmente desacetilado, isto é, um glicosaminoglicano acetilado que foi pelo menos parcialmente desacetilado para prover um glicosaminoglicano com grupos amina livres. Um glicosaminoglicano pelo menos parcialmente desacetilado pode ser reticulado sozinho ou em combinação com um segundo glicosaminoglicano, pelo qual o próprio glicosaminoglicano desacetilado atua como o reticulador di- ou multinucleofílico.

[00122] Como um aspecto alternativo adicional da presente invenção, é provido um método para produzir um produto de gel injetável, compreendendo as etapas de: a) reticulação de um primeiro glicosaminoglicano (GAG) para produzir um gel, b) preparação de partículas do gel da etapa a); c) mistura das partículas de gel de glicosaminoglicano (GAG) da etapa b) com um segundo glicosaminoglicano (GAG) para prover uma mistura; d) reticulação da mistura da etapa c) para obter reticulação entre os glicosaminoglicanos (GAGs) da segunda fase externa, provendo assim um gel com uma primeira fase interna das partículas de gel de glicosaminoglicano reticulado (GAG), incorporadas em um gel da segunda fase externa, compreendendo o segundo glicosaminoglicano (GAG), e e) preparação de partículas injetáveis do gel da etapa d), cada uma dessas partículas contendo uma pluralidade de partículas de gel de GAG reticulado da primeira fase interna.

[00123] A reticulação da etapa a) e/ou etapa d) pode ser alcançada usando um glicosaminoglicano pelo menos parcialmente desacetilado,

26 / 37 sozinho ou em combinação com um segundo glicosaminoglicano, pelo qual o próprio glicosaminoglicano desacetilado atua como o reticulador di- ou multinucleofílico.

[00124] O grau de desacetilação do primeiro glicosaminoglicano na etapa a) pode estar abaixo de 0,15. O grau de desacetilação do segundo glicosaminoglicano na etapa d) pode ser menor que o grau de desacetilação do primeiro glicosaminoglicano.

[00125] Pelo termo “pelo menos parcialmente desacetilado” como aqui usado em relação ao glicosaminoglicano, entende-se um glicosaminoglicano compreendendo grupos N-acetila nos quais pelo menos alguns dos grupos N- acetila foram clivados, resultando na formação de grupos amina livres no glicosaminoglicano. Por “pelo menos parcialmente desacetilado” como usado aqui, queremos dizer que uma porção significativa dos grupos N-acetila do glicosaminoglicano, particularmente pelo menos 1%, preferivelmente pelo menos 2%, pelo menos 3%, pelo menos 4%, pelo menos 5%, dos grupos N- acetila do glicosaminoglicano foram convertidos em grupos amina livres. Mais preferivelmente, pelo menos 3% dos grupos N-acetila do glicosaminoglicano foram convertidos em grupos amina livres.

[00126] De acordo com algumas modalidades, o glicosaminoglicano pelo menos parcialmente desacetilado pode ter um grau de acetilação menor que 99%, preferivelmente menor que 98%, menor que 97%, menor que 97%, menor que 96%, menor que 95%, menor que 94% ou menor que 93%.

[00127] A reticulação do glicosaminoglicano desacetilado pode ser realizada com a ajuda de um agente de acoplamento, tal como um reagente de acoplamento peptídico.

[00128] De acordo com algumas modalidades, o reagente de acoplamento peptídico é selecionado do grupo que consiste em reagentes de acoplamento à base de triazina, reagentes de acoplamento de carbodi-imida, reagentes de acoplamento derivados de imidazólio, Oxyma e COMU.

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[00129] De acordo com algumas modalidades, o reagente de acoplamento peptídico é um reagente de acoplamento à base de triazina. De acordo com algumas modalidades, o reagente de acoplamento à base de triazina é selecionado do grupo que consiste em cloreto de 4-(4,6-dimetoxi- 1,3,5-triazin-2-il)-4-metilmorfolínio (DMTMM) e 2-cloro-4,6-dimetoxi-1,3,5- triazina (CDMT). De acordo com algumas modalidades, o reagente de acoplamento à base de triazina é DMTMM.

[00130] De acordo com algumas modalidades, o reagente de acoplamento peptídico é um reagente de acoplamento de carbodi-imida. De acordo com algumas modalidades, o reagente de acoplamento de carbodi- imida é N-(3-dimetilaminopropil)-N’-etilcarbodi-imida (EDC) combinado com N-hidroxissuccinimida (NHS).

[00131] Consequentemente, a etapa a) pode compreender as subetapas: i) prover uma solução compreendendo um glicosaminoglicano pelo menos parcialmente desacetilado e opcionalmente um glicosaminoglicano adicional; ii) ativar grupos carboxila no glicosaminoglicano pelo menos parcialmente desacetilado e/ou no glicosaminoglicano adicional opcional com um agente de acoplamento, para formar glicosaminoglicanos ativados; iii) reticular os glicosaminoglicanos ativados através de seus grupos carboxila ativados usando grupos amino dos glicosaminoglicanos pelo menos parcialmente desacetilados para prover um gel de glicosaminoglicanos reticulados por ligações de amida.

[00132] Como um exemplo adicional, o segundo glicosaminoglicano pode ser glicosaminoglicano pelo menos parcialmente desacetilado e a etapa d) pode compreender as subetapas i) ativar grupos carboxila no segundo glicosaminoglicano pelo menos parcialmente desacetilado com um agente de acoplamento, para formar glicosaminoglicanos ativados;

28 / 37 ii) reticular os glicosaminoglicanos ativados através de seus grupos carboxila ativados usando grupos amino dos glicosaminoglicanos pelo menos parcialmente desacetilados para prover a segunda fase externa compreendendo o segundo glicosaminoglicano (GAG) reticulado por ligações de amida.

[00133] Em outras modalidades, o GAG reticulado na etapa a) e/ou a etapa d) é obtido por: 1) reticulação de GAG pelo menos parcialmente desacetilado a GAG parcialmente desacetilado na presença de um agente de acoplamento usando grupos amina livre e ácido carboxílico presentes nos GAGs pelo menos parcialmente desacetilados; ou 2) reticulação de GAG pelo menos parcialmente desacetilado a um GAG não desacetilado na presença de um agente de acoplamento usando grupos amina livre presentes no GAG pelo menos parcialmente desacetilado e nos grupos ácido carboxílico presentes no GAG.

[00134] Em modalidades, o glicosaminoglicano pelo menos parcialmente desacetilado tem um grau de acetilação de 99% ou menos, preferivelmente 98% ou menos, preferivelmente 97% ou menos, preferivelmente 96% ou menos, preferivelmente 96% ou menos, preferivelmente 95% ou menos, preferivelmente 94% ou menos, preferivelmente 93% ou menos, e um peso molecular médio ponderado de 0,1 MDa ou mais, preferivelmente 0,5 MDa ou mais.

[00135] De acordo com algumas modalidades, o glicosaminoglicano pelo menos parcialmente desacetilado é obtido por um método para desacetilação pelo menos parcial de um glicosaminoglicano, compreendendo: a1) prover um glicosaminoglicano compreendendo grupos acetila; a2) permitir que o glicosaminoglicano compreendendo grupos acetila reaja com hidroxilamina (NH2OH) ou um sal a uma temperatura de

29 / 37 100°C ou menos por 2 a 200 horas para formar um glicosaminoglicano pelo menos parcialmente desacetilado; e a3) recuperar o glicosaminoglicano pelo menos parcialmente desacetilado. Breve descrição dos desenhos

[00136] A Figura 1 mostra um esboço gráfico de uma modalidade do método da presente descrição. PSR = redução do tamanho de partícula

[00137] A Figura 2 mostra os resultados dos testes de degradação.

[00138] A Figura 3 mostra os resultados dos testes de degradação.

[00139] A Figura 4 mostra partículas de gel com partículas de gel incorporadas com uma ampliação de 10x.

[00140] A Figura 5 mostra uma imagem ao microscópio de partículas de gel obtidas no Exemplo 6 com uma ampliação de 10x.

[00141] A Figura 6 mostra uma imagem ao microscópio de partículas de gel obtidas no Exemplo 9. Exemplos experimentais

[00142] Os seguintes exemplos não limitativos ilustrarão adicionalmente a presente invenção. Nesses exemplos, o GAG usado é o ácido hialurônico, denominado HA e referente ao hialuronato de sódio. Métodos de teste analíticos Teor de gel (GelC)

[00143] O GelC descreve em % a proporção do HA total que está ligado na forma de gel. O teor de gel é definido como a quantidade de HA em uma amostra que não passa por um filtro de 0,22 μm. O GelC é calculado a partir da quantidade de HA que é coletada no filtrado e é fornecido em porcentagem da quantidade total de HA na amostra de gel. MoD (Grau de Modificação)

[00144] O MoD descreve a quantidade molar de agente(s) de reticulação ligado(s) em relação ao número total de unidades de dissacarídeos

30 / 37 de HA de repetição. Essa medida não distingue entre agentes de reticulação monoligados e realmente reticulados, isto é, todos os agentes de reticulação que estão ligados ao HA via pelo menos uma ligação covalente estão incluídos. Por exemplo, um MoD de 1% para um gel de HA reticulado com BDDE significa que existe uma molécula ligada (monoligada ou reticulada) de BDDE por 100 unidades de dissacarídeos no gel de HA.

[00145] O MoD pode ser determinado usando espectroscopia de RMN em produto de gel degradado enzimaticamente. HA solúvel, agente(s) de reticulação residual (não ligado(s)) e derivados dos mesmos são lavados antes da degradação do gel por filtração em um filtro de 0,22 µm. O produto de gel é degradado a 37°C por tratamento enzimático usando Condroitinase AC de Arthrobacter aurescens. O produto de gel degradado é submetido a espectroscopia de RMN registrando espectros unidimensionais de RMN de 1H em um espectrômetro de 400 MHz, equipado com uma sonda padrão de 5 mm.

[00146] Os espectros de RMN podem ser avaliados pela integração do sinal a δH 1,6 ppm, que se origina de quatro prótons na molécula de BDDE ligado, e os sinais a δH 2,0 ppm, que são dos três prótons nos grupos CH3 nos resíduos de N-acetilglucosamina dos dissacarídeos de HA. A razão entre as integrais desses dois sinais é proporcional à razão entre a quantidade molar de BDDE ligado e dissacarídeos após a correção do número de prótons responsáveis por cada sinal, fornecendo assim MoD. nagente de reticulação ligado nunidades de dissacarídeo Taxa de carregamento

[00147] Outra quantidade para medir o grau de reticulação é a taxa de carregamento, isto é, a razão entre o número de agentes de reticulação adicionados ao vaso de reação e o número total de unidades de dissacarídeos adicionados ao vaso de reação ao realizar a reação de reticulação. A taxa de

31 / 37 carregamento pode não ser a mesma do MoD, uma vez que a reação de reticulação pode estar incompleta, isto é, todos os reticuladores podem não ter reagido para formar reticulações. Fator de intumescimento (SwF)

[00148] A resistência ou densidade da rede de gel após reticulação pode ser estimada/determinada, por exemplo, permitindo que o gel absorva água ou solução salina até o equilíbrio. Como resultado das quebras de cadeia durante a degradação do gel, a rede se torna mais fraca e menos densa, o que pode ser detectado pelo aumento do fator de intumescimento (SwF). O SwF é medido de acordo com o seguinte protocolo: Cerca de 1 g de produto em gel é pesado em um copo medidor. É adicionada solução salina, o gel é completamente disperso e deixado absorver água até o equilíbrio. Após a sedimentação, o volume do gel saturado é lido. O volume final da razão em relação ao volume inicial é indicado como Fator de Intumescimento (SwF). Exemplo 1 - Descrição geral do processo para a produção de um gel combinado

[00149] Uma modalidade de um método para a produção de um produto de gel injetável reticulado com BDDE é apresentada graficamente na Fig. 1. No processo, o volume é precipitado e seco após a primeira etapa de redução de tamanho de partícula (PSR). O pó de gel seco reticulado é subsequentemente misturado com HA, BDDE e NaOH para uma segunda reticulação, onde as partículas de gel reticuladas anteriormente ficam incorporadas em um segundo material de gel. O segundo material é então submetido às mesmas etapas do processo que no processo normal. As partículas da primeira PSR são menores que as da segunda PSR, para permitir espaço para o gel interno no gel externo.

[00150] A primeira e a segunda reticulação são tipicamente realizadas a uma temperatura de 10 a 75 graus centígrados, por exemplo, 10 a 40 graus centígrados, como 10 a 35 graus centígrados ou 10 a 30 graus centígrados,

32 / 37 mas é preferido que a etapa seja realizada a 15 a 35 graus centígrados, como 15 a 30 graus centígrados e, especialmente, à temperatura ambiente, por exemplo 20 a 25 graus centígrados. As faixas de temperatura preferidas são de 10 a 50 graus centígrados, como 18 a 40 graus centígrados.

[00151] O tempo de reação está adequadamente na faixa de 2 a 40h, como 4 a 36h. Um tempo de reação maior que 2h é útil para a reprodutibilidade, especialmente em maior escala. Um tempo de reação maior que 40h produz um gel com menor resistência de gel ou pode até romper o gel completamente. O tempo de reação está preferivelmente na faixa de 8 a 30h, como 12 a 24h, por exemplo, 16 a 24h.

[00152] Como um exemplo, a etapa de reticulação pode ser realizada a 15 a 35 graus centígrados por 2 a 40 h, como à temperatura ambiente por 16 a 24 h.

[00153] A Fig. 4 mostra uma imagem de microscópio com uma ampliação de 10x de partículas de gel obtidas pelo método da presente descrição, com partículas menores incorporadas nas partículas grandes. Exemplo 2 – Preparação de gel de um componente

[00154] Um gel de um componente foi preparado da seguinte forma: Misturou-se 100 g de HA (Mw 1MDa) e deixou-se reagir com 200 g de NaOH a 3% p/p e 1,8 g de BDDE - resultando em uma taxa de carregamento de 0,036. Após a reticulação, o gel foi neutralizado e tratado termicamente para inativar qualquer reticulador residual. A redução do tamanho de partícula (PSR) foi realizada usando uma malha de 80 µm. O gel foi precipitado em EtOH para obter um pó de gel, o qual foi lavado e seco. Exemplo 3 – Preparação de gel de um componente

[00155] Realizado como o exemplo 2, mas usando 30 g de HA, 73,5 g de NaOH a 2,5% p/p e 0,22 g de BDDE - resultando em uma taxa de carregamento de 0,015. Exemplo 4 – Preparação de gel de dois componentes

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[00156] Um gel de dois componentes foi preparado da seguinte forma: Misturou-se 5 g do pó de gel do exemplo 2 e deixou-se reagir com 5 g de HA (mw 1Mda), 45,5 g de NaOH a 1,33 % p/p e 90 mg de BDDE - resultando em uma taxa de carregamento de 0,036. A PSR do exemplo 2 foi repetida, mas usando uma malha de 315 µm. O pó de gel de dois componentes foi hidratado até uma concentração final de 20 mg/ml em tampão fosfato e autoclavado. O gel foi submetido a 90°C e o teor de gel foi medido em intervalos de 16h (ver Fig. 2). Assim, no Exemplo 4, a taxa de carregamento na primeira e na segunda reação de reticulação foi de 0,036. Exemplo 5 – Preparação de gel de dois componentes

[00157] Realizado como o exemplo 4, mas com 7 g do pó de gel do exemplo 2 e 3 g de HA, resultando em uma taxa de carregamento de 0,043. O gel foi submetido a 90°C e o teor de gel foi medido em intervalos de 16h (Fig. 2). Restylane Lyft (da Galderma) foi usado como referência. Assim, no Exemplo 5, a taxa de carregamento foi de 0,036 na primeira reação de reticulação e 0,043 na segunda reação de reticulação.

[00158] Os géis dos Exemplos 4 e 5 tinham as seguintes características iniciais: Teor em peso seco de gel Amostra interno GelC % [HA] (mg/ml) Exemplo 4 50% 83 20 Exemplo 5 70% 91 19 Restylane Lyft - 86 20

[00159] Como visto na Fig. 2, o gel combinado de 70% degrada até que o gel externo se esgote e depois se estabiliza em cerca de 70% de gel restante, que é degradado a uma taxa mais baixa. O mesmo tipo de comportamento foi observado com o gel combinado de 50%, mas esse gel se estabiliza em 50%. O gel de referência, contendo apenas um tipo de gel, é degradado a uma taxa mais constante. Esses resultados demonstram claramente o conceito de gel combinado, isto é, um gel combinado com um gel externo que se degrada primeiro antes que o gel interno comece a se degradar. O mesmo tipo de comportamento é esperado in vivo.

34 / 37 Exemplo 6 – Preparação de gel de dois componentes

[00160] Realizado como o exemplo 4, mas com 2,5 g do pó de gel do exemplo 3 e 2,5 g de HA (Mw 1MDa), 15 g de NAOH a 2% p/p e 35 mg de BDDE, resultando em uma taxa de carregamento de 0,022. O gel foi submetido a 90°C e o fator de intumescimento foi medido em intervalos de 16h (Fig. 3). Como referência, o pó de gel do exemplo 3 foi reticulado uma segunda vez para corresponder ao gel interno dos exemplos 6 e 7. A Fig. 5 mostra uma imagem ao microscópio de partículas de gel obtidas no Exemplo 6 com uma ampliação de 10x.

[00161] Assim, no Exemplo 6, a taxa de carregamento foi de 0,015 na primeira reação de reticulação e 0,022 na segunda reação de reticulação. Exemplo 7 – Preparação de gel de dois componentes

[00162] Realizado como o exemplo 6, mas com 3,5 g do pó de gel do exemplo 3 e 1,5 g de HA, resultando em uma taxa de carregamento de 0,025. O gel foi submetido a 90°C e o fator de intumescimento foi medido em intervalos de 16h (Fig. 3). Assim, no Exemplo 7, a taxa de carregamento foi de 0,015 na primeira reação de reticulação e 0,025 na segunda reação de reticulação.

[00163] Os géis dos Exemplos 6 e 7 tinham as seguintes características iniciais: Teor em peso seco de [HA] Amostra gel interno SwF (mg/ml) GelC % Exemplo 6 50% 4,0 20 93 Exemplo 7 70% 3,7 20 94 Ref - 3,1 20 96

[00164] O gel combinado de 50% aumenta seu intumescimento mais do que os outros géis, uma vez que esse gel compreende uma grande porção do gel externo mais macio, que contribui principalmente para o intumescimento. Após um certo período de tempo (cerca de 40 horas para o gel combinado de 50%), o gel externo desaparece e apenas o gel interno mais firme pode contribuir para o intumescimento. Isso causa uma queda no SwF medido, que depois aumenta lentamente novamente devido ao

35 / 37 intumescimento do gel interno. O gel combinado de 70% mostra um comportamento similar, mas menos distinto, pois contém uma quantidade menor do gel externo. O gel que tem apenas um gel interno (gel único) mostra um aumento mais constante no comportamento de intumescimento. Assim, após a degradação do gel externo, o gel interno apresentará um fator de intumescimento similar ao do gel combinado inicial.

[00165] A tabela abaixo resume as taxas de carregamento usadas para preparar os géis de dois componentes nos Exemplos experimentais 4 a 7 acima: Taxa de carregamento da 1ª reação de Taxa de carregamento da 2ª reação de Amostra reticulação reticulação Exemplo 4 0,036 0,036 Exemplo 5 0,036 0,043 Exemplo 6 0,015 0,022 Exemplo 7 0,015 0,025

[00166] Além disso, a realização das primeira e segunda reações de reticulação com as taxas de carregamento de acordo com a Tabela acima resultou no grau de modificação abaixo (MoD) para os géis interno e externo nos géis de dois componentes preparados nos Exemplos experimentais 4 a 7: MoD do gel interno no gel de dois MoD do gel externo no gel de dois Amostra componentes (%) componentes (%) Exemplo 4 3,9 1,1 Exemplo 5 3,9 1,1 Exemplo 6 2,2 1,0 Exemplo 7 2,2 1,0

[00167] Assim, o MoD dos géis internos em todos os Exemplos é maior que o MoD dos géis externos, o que é devido aos reticuladores que se difundem no gel interno durante a segunda reação de reticulação para reticular ainda mais esse gel, aumentando assim o MoD do gel interno durante a segunda etapa de reticulação. Exemplo 8 – Preparação de géis de um componente reticulados com ligações de amida

[00168] Os géis também foram preparados usando reticulação com ligações de amida, nas quais ácido hialurônico (HA), DATH (diaminotrealose) e DMTMM (cloreto de 4-(4,6-dimetoxi-1,3,5-triazin-2-il)-

36 / 37 4-metilmorfolínio) são misturados e deixados reagir. O DMTMM funciona como um agente de acoplamento, enquanto o DATH funciona como um reticulador.

[00169] Um gel de um componente foi preparado da seguinte forma: O HA foi misturado e deixado reagir com quantidades adequadas de DATH e DMTMM dissolvidos em água. Após a reticulação, o gel foi diluído para 20 mg/g em solução salina e aquecido a 70°C durante cerca de 20 horas. A redução do tamanho de partícula (PSR) foi realizada usando malha de 125 µm. O gel foi precipitado em EtOH para obter um pó de gel, o qual foi lavado e seco. Exemplo 9 – Preparação de géis de dois componentes reticulados com ligações de amida

[00170] O pó de gel seco reticulado de HA reticulado com ligações de amida preparado como no Exemplo 8 foi subsequentemente misturado e deixado reagir com quantidades adequadas de HA, DATH e DMTMM dissolvidos em água para uma segunda reticulação, onde as partículas de gel reticuladas anteriormente foram incorporadas um segundo material de gel.

[00171] Após a segunda reticulação, o gel foi diluído para 20 mg/g em solução salina e aquecido a 70°C durante cerca de 20 horas. A redução do tamanho de partícula (PSR) foi realizada usando malha de 315 µm. O gel foi precipitado em EtOH para obter um pó de gel, o qual foi lavado e seco. O pó de gel de dois componentes foi hidratado até uma concentração final de 20 mg/ml em tampão fosfato e autoclavado.

[00172] Uma micrografia do gel de dois componentes preparado do Exemplo 9 é mostrada na Fig. 6.

[00173] As características de gel dos géis reticulados com ligações de amida são mostradas na tabela abaixo: Exemplo HA - conc GelC SwF G’ G’’ Tanδ (mg/g) (%) (ml/g) (Pa) (Pa) 8 20 96 2,9 1261 115 0,09 9 20 82 4,4 288 36 0,12

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[00174] O versado na técnica percebe que a presente invenção não se limita de modo algum às modalidades preferidas descritas acima. Pelo contrário, são possíveis muitas modificações e variações dentro do escopo das reivindicações anexas. Além disso, variações nas modalidades descritas podem ser entendidas e efetuadas pelo versado na prática da invenção reivindicada, a partir de um estudo dos desenhos, da descrição e das reivindicações anexas. Nas reivindicações, a palavra “compreendendo” não exclui outros elementos ou etapas, e o artigo indefinido “um” ou “uma” não exclui uma pluralidade. O simples fato de certas medidas serem recitadas em reivindicações dependentes mutuamente diferentes não indica que uma combinação dessas medidas não possa ser usada vantajosamente.

Claims (31)

REIVINDICAÇÕES

1. Método para produzir um produto de gel injetável, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: a) reticulação de um primeiro glicosaminoglicano (GAG) com um primeiro agente de reticulação para produzir um gel, em que a taxa de carregamento do agente de reticulação para a unidade de dissacarídeo está abaixo de 0,15; b) preparação de partículas do gel da etapa a); c) mistura das partículas de gel de glicosaminoglicano (GAG) da etapa b) com um segundo glicosaminoglicano (GAG) para prover uma mistura; d) reticulação da mistura da etapa c) com um segundo agente de reticulação para obter reticulação entre os glicosaminoglicanos (GAGs) da segunda fase externa, provendo assim um gel com uma primeira fase interna das partículas de gel de glicosaminoglicano reticulado (GAG), incorporadas em um gel da segunda fase externa, compreendendo o segundo glicosaminoglicano (GAG), e e) preparação de partículas injetáveis do gel da etapa d), cada uma dessas partículas contendo uma pluralidade de partículas de gel de GAG reticulado da primeira fase interna.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a taxa de carregamento do agente de reticulação para a unidade de dissacarídeo na etapa d) é menor que a taxa de carregamento da etapa a).

3. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a taxa de carregamento do agente de reticulação para a unidade de dissacarídeo na etapa d) é menor que 0,05.

4. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a reticulação da etapa d) compreende adicionalmente obter reticulação entre os géis da primeira fase interna e da segunda fase externa.

5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a etapa c) compreende misturar as partículas de gel de glicosaminoglicano (GAG) da etapa b) no estado seco com o segundo glicosaminoglicano (GAG) no estado seco.

6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a etapa de preparação de partículas da etapa b) compreende adicionalmente precipitar e secar as ditas partículas preparadas do gel da etapa a).

7. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a mistura provida na etapa c) contém pelo menos 50% em peso seco das partículas de gel de GAG obtidas na etapa b).

8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a reticulação na etapa a) e/ou etapa b) resulta em ligações de éter.

9. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que a reticulação na etapa a) e/ou na etapa b) resulta em moléculas de GAG sendo reticuladas covalentemente por reticulações compreendendo um grupo espaçador selecionado a partir do grupo que consiste em di-, tri-, tetra- e oligossacarídeos.

10. Método de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que pelo menos 75% das reticulações compreendem um grupo espaçador selecionado do grupo que consiste em di-, tri-, tetra- e oligossacarídeos.

11. Método de acordo com a reivindicação 9 ou 10, caracterizado pelo fato de que o grupo espaçador é um resíduo de tetrassacarídeo do ácido hialurônico, hexassacarídeo do ácido hialurônico, trealose, lactose, maltose, sacarose, celobiose ou rafinose.

12. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 11, caracterizado pelo fato de que o grupo espaçador é selecionado do grupo que consiste em di-, tri- e tetrassacarídeos.

13. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 12, caracterizado pelo fato de que pelo menos 90% das ligações entre moléculas de glicosaminoglicano e reticulações são ligações de amida.

14. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 13, caracterizado pelo fato de que menos de 5% das ligações entre moléculas de glicosaminoglicano e reticulações são ligações de éster.

15. Produto de gel injetável, caracterizado pelo fato de que compreende uma primeira fase interna de uma pluralidade de partículas de gel de glicosaminoglicano reticulado (GAG) incorporadas em uma segunda fase externa de um gel de glicosaminoglicano (GAG) reticulado; em que a segunda fase externa está na forma de partículas; em que o grau de modificação (MoD) do gel da primeira fase interna é 0,15 ou menor, e em que o MoD do gel da segunda fase externa é menor que o MoD do gel da primeira fase interna e em que o MoD é a quantidade molar de agente(s) de reticulação ligado(s) em relação à quantidade molar total de unidades de dissacarídeos de GAG de repetição.

16. Produto de gel injetável de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o grau de modificação (MoD) do gel da segunda fase externa é 0,10 ou menor.

17. Produto de gel injetável de acordo com a reivindicação 15 ou 16, caracterizado pelo fato de que o fator de intumescimento (SwF) do gel da segunda fase externa é acima de 3,0.

18. Produto de gel injetável de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 17, caracterizado pelo fato de que os géis da primeira fase interna e da segunda fase externa são reticulados um ao outro.

19. Produto de gel injetável de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 18, caracterizado pelo fato de que o grau de modificação (MoD) é substancialmente homogêneo na segunda fase externa e substancialmente homogêneo na primeira fase interna.

20. Produto de gel injetável de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 19, caracterizado pelo fato de que o tamanho de partícula de gel externa é pelo menos três vezes o tamanho de um tamanho de partícula interna.

21. Produto de gel injetável de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 20, caracterizado pelo fato de que o teor em peso seco do glicosaminoglicano (GAG) reticulado da primeira fase interna é pelo menos 50% do teor em peso seco total de glicosaminoglicanos (GAGs) na fase interna e externa.

22. Produto de gel injetável de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 21, caracterizado pelo fato de que o glicosaminoglicano (GAG) é ácido hialurônico.

23. Produto de gel injetável de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 22, caracterizado pelo fato de que a reticulação são ligações de éter.

24. Produto de gel injetável de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 22, caracterizado pelo fato de que as moléculas de glicosaminoglicano da primeira fase interna e/ou as moléculas de glicosaminoglicano da segunda fase externa são reticuladas covalentemente por reticulações compreendendo um grupo espaçador selecionado a partir do grupo que consiste em di-, tri-, tetra- e oligossacarídeos.

25. Produto de gel injetável de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que pelo menos 75% das reticulações compreendem um grupo espaçador selecionado do grupo que consiste em di-,

tri-, tetra- e oligossacarídeos.

26. Produto de gel injetável de acordo com a reivindicação 24 ou 25, caracterizado pelo fato de que o grupo espaçador é um resíduo de tetrassacarídeo do ácido hialurônico, hexassacarídeo do ácido hialurônico, trealose, lactose, maltose, sacarose, celobiose ou rafinose.

27. Produto de gel injetável de acordo com qualquer uma das reivindicações 24 a 26, caracterizado pelo fato de que o grupo espaçador é selecionado do grupo que consiste em di-, tri- e tetrassacarídeos.

28. Produto de gel injetável de acordo com qualquer uma das reivindicações 24 a 27, caracterizado pelo fato de que pelo menos 90% das ligações entre moléculas de glicosaminoglicano e reticulações são ligações de amida.

29. Produto de gel injetável de acordo com qualquer uma das reivindicações 24 a 28, caracterizado pelo fato de que menos de 5% das ligações entre moléculas de glicosaminoglicano e reticulações são ligações de éster.

30. Composição aquosa, caracterizada pelo fato de que compreende um produto de gel injetável como definido em qualquer uma das reivindicações 15 a 29 e opcionalmente um agente tamponante.

31. Seringa pré-carregada, caracterizada pelo fato de ser pré- carregada com um produto de gel injetável como definido em qualquer uma das reivindicações 15 a 29 e depois esterilizada, ou pré-carregada com uma composição aquosa esterilizada como definida na reivindicação 30.