KR101922711B1 - 가교된 히알루론산겔의 정제 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 화학적으로 가교된 가교 히알루론산 겔의 정제 방법으로서, 상세하게는 가교 히알루론산 겔에 잔류하고 있는 가교제를 가교 히알루론산 겔이 함유하는 히알루론산의 함량 저하 없이 가교제만을 선택적으로 제거하여 정제하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법으로 제조된 겔은 복잡한 공정 없이 단순하게 고순도로 가교 히알루론산의 수득이 가능한 것이 특징이다.

Description

가교된 히알루론산겔의 정제 방법 {A METHOD FOR PURIFICATION OF CROSS-LINKED HYALURONIC ACID GEL}

본 발명은 가교 히알루론산 겔의 제조 방법에 관한 것이다. 구체적으로 본 발명은 가교 히알루론산 겔을 수득한 후 미반응 가교제를 효율적으로 정제하는 방법에 관한 것이다.

히알루론산은 필러, 관절강 주사제, 유착방지제, 안과용 의약품 또는 화장품의 원료로서 사용되고 있다. 단 히알루론산 그 자체는 효소와 활성산소 등에 의해 빠르게 분해되어 체내에서 배출됨으로써 체내 주입 후 목적효과의 지속시간이 만족스럽지 못하다는 한계가 있어, 체내에서의 분해시간을 연장시킬 수 있는 방안이 모색되었고, 히알루론산을 화학적으로 가교하려는 시도가 태동되었다.

히알루론산의 화학구조적 안정성을 높여 생체 내에서의 물성유지 기간을 연장시키고자, 가교제를 첨가하여 히알루론산을 안정화시키는 기술이 개발되어 왔으며, 현존하는 히알루론산 가교체 및 히알루론산 유도체 가교물의 생체 내 최대 유지기간은 약 6 내지 24개월인 것까지 회자되고 있다.

다만 히알루론산 가교체의 가교제 성분은 생체내에서 체외 이물질로 인식되어 염증 반응을 야기할 수 있어 주의할 필요가 있다. 이에 히알루론산 가교체 제조 공정은 필수적으로 미반응 가교제 성분의 정제 공정을 수반한다.

예컨대 대한민국 공개특허공보 제 10-2015-0029578호는 10 w/w% 이상의 고농도의 히알루론산을 알칼리 수용액에 용해시켜 긴 체인이 형성되도록 한 다음, 선형화된 히알루론산에 0.5 내지 1.0 w/w% 의 소량의 가교제를 첨가하여 선형화된 히알루론산을 고밀도 망상구조로 가교시킨 후, 고밀도 망상구조로 형성된 하이드로겔을 1mm*1mm 내지 20mm*20mm 의 크기로 커팅하고, 커팅된 하이드로겔을 pH 6.8 이하의 완충액에서 잔류 가교제를 제거하며 팽윤시키는 공정을 개시한다.

대한민국 공개특허공보 제 10-2015-0029578호

가교 히알루론산 겔에 잔류하고 있는 가교제를 줄이기 위한 다양한 공정 연구가 이루어지고 있다.

그러나 대한민국 공개특허공보 제 10-2015-0029578호와 같이 단순 팽윤을 통해 미반응 가교제를 제거하는 방식의 정제공정을 거치면, 수득된 가교 히알루론산이 세척용액인 완충액 등을 흡수하여 팽윤됨으로써 견고함을 잃게 되어, 히알루론산으로서 요망되는 물성을 나타내지 못하게 될 수 있다. 대한민국 공개특허공보 제 10-2016-0125332호의 세척 장치 역시 마찬가지이다.

또한 대한민국 공개특허공보 제 10-2013-0010973호에서는 적은 양의 가교제를 첨가하여 히알루론산을 가교하는 방법이 제시되어 있다. 하지만 이러한 방법은 단지 사용하는 가교제의 양이 적을 뿐, 잔류 가교제를 완벽하게 제거할 수 있는 방법이 아니며, 잔류 가교제의 양이 감소되었음을 입증하지 못하였다.

국제공개공보 WO 2014/206701호에는 히알루론산 겔을 석출 용매를 사용하여 석출하는 잔류 가교제 제거 방법이 제시되어있다. 하지만 이러한 방법은 대규모 생산에 적합하지 않으며, 정밀한 석출을 위해 고가의 장비를 요구한다는 점에서 한계가 있다.

국제공개공보 WO 2010/015901호에는 투석 멤브레인을 이용하여 겔을 세척하는 과정이 제시되어 있으나, 이 방법도 투석 멤브레인에 겔을 충전하고 세척하는 과정이 매우 까다로우며 대규모 생산에 적용하기 힘들다는 한계가 있다.

전술한 대한민국 공개특허공보 제 10-2016-0125332호에서는 가교 히알루론산 겔을 세척하는 세척 장치를 제시하고 있으나, 잔류 가교제가 효과적으로 세척되는지 여부 및 가교 히알루론산 겔이 함유하는 히알루론산의 함량을 제어하는 방법에 대한 제시가 없다.

이에 본 발명자는 가교 히알루론산의 점탄성이 훼손되지 않는 선에서 미반응 가교제의 효과적인 제거가 가능한 정제 공정의 개발을 목적하게 되었고, 이로써 본 발명의 완성에 이르게 되었다.

본 발명은 다음의 수단을 통해 전술한 과제를 해결하였다.

1. 가교제와 히알루론산의 가교 반응한 후 미반응 가교제를 정제하는 세척 용기로서, 세척용 용액이 출입할 수 있는 세공이 형성되어 있고, 가교 히알루론산의 팽윤을 물리적으로 억제할 수 있는 크기로 구성된 세척 용기.

2. 상기 1 에 있어서, 세척 용기가 본체와 뚜껑으로 이루어져 있고, 본체와 뚜껑 모두에 세공이 형성되어 있는 것을 특징으로 하는 세척 용기.

3. 가교제와 히알루론산의 가교반응을 진행하는 단계; 수득된 가교 히알루론산을 절단하는 단계; 절단된 가교 히알루론산을 상기 1 또는 2 에 따른 세척 용기에 충전하는 단계; 가교 히알루론산이 충전된 세척 용기를 세척용 용액으로 세척하는 단계를 포함하는 가교 히알루론산의 미반응 가교제 정제 방법.

4. 상기 3 에 있어서, 세척용 용액이 확산을 통해 가교제가 정제될 수 있도록 예컨대 PBS 완충 용액과 같은 등장성 용액인 것을 특징으로 하는 정제 방법.

5. 상기 3 또는 4 에 있어서, 세척용 용액이 담긴 용기에 가교 히알루론산을 충전한 세척 용기를 담지하여 미반응 가교제를 세척하는 것을 특징으로 하는 정제 방법.

6. 상기 3 내지 5 중 어느 하나에 있어서, 세척하는 단계가 세척 용기를 세척용 용액에 담지한 후 10 시간 이상, 바람직하게는 20 시간 이상 진행되는 것을 특징으로 하는 정제 방법.

7. 상기 3 내지 6 중 어느 하나에 있어서, 가교 히알루론산의 팽윤을 물리적으로 억제하여 히알루론산의 함량 저하를 방지해 세척 후 가교 히알루론산의 히알루론산 함량이 10 내지 50 mg/mL 을 유지할 수 있도록 하는 것이 특징인 정제 방법.

8. 상기 3 내지 7 중 어느 하나에 따른 정제 방법으로 정제된 가교 히알루론산.

본 발명에 따르면 가교 반응에 따라 수득된 가교 히알루론산에 있어서 점탄성의 저하 없이 미반응 가교제의 정제가 가능하다. 구체적으로 본 발명에 따르면 종래의 단순 팽윤에 따른 정제 공정과 달리 정제 공정 중 겔의 팽윤을 억제함과 더불어 가교 히알루론산 내의 히알루론산의 함량 저하를 방지할 수 있다.

도 1 은 본 발명예 따른 세척 용기의 일 구현예의 평면을 나타낸 것이다.
도 2 는 본 발명에 따른 세척 용기의 일 구현예의 측면을 나타낸 것이다.
도 3 은 본 발명에 따른 세척 용기의 일 구현예의 실물을 나타낸 것이다.
도 4 는 가교 반응 종료 후 절단한 가교 히알루론산 겔을 나타낸 것이다.
도 5 는 가교 히알루론산 겔을 본 발명에 따른 세척 용기의 일 구현예에 충전한 상태를 예시한 것이다.
도 6 은 본 발명에 따른 세척 용기의 일 구현예를 사용하여 미반응 가교제를 정제하는 정제 공정을 예시한 것이다.
도 7 은 멸균 저항성 시험 결과를 나타낸 것이다.
도 8 은 실시예 3 의 잔류 2,2'-설포닐다이에탄올 크로마토그램을 나타낸 것이다.
도 9 는 실시예 4 의 잔류 2,2'-설포닐다이에탄올 크로마토그램을 나타낸 것이다.
도 10 은 비교예 1 의 잔류 2,2'-설포닐다이에탄올 크로마토그램을 나타낸 것이다.

본 명세서에서 히알루론산이라 함은 히알루론산, 이의 염 또는 이의 전구체 등 공지의 히알루론산 원료 단독 또는 혼합물을 모두 일컫는다.

히알루론산은 생체적합성이 우수하여 미용 또는 의학적 목적 등 다양한 분야에서 널리 활용되는 천연 고분자 물질이다. 자연상태의 히알루론산은 주로 세포 외 기질에 존재하며, 섬유질 및 콜라겐과 혼합하여 기질액을 형성함으로써 조직구조를 안정화하는 역할을 한다. 이는 모든 척추동물의 조직에서 발견되는 물질로서, 면역원성이 없어 조직수복 목적의 구성물로 활용하기에 이상적인 화학물질이다.

가교된 히알루론산은 폴리사카라이드 중합체 등을 가교제로 연결하여 매트릭스가 형성된 얽힌 형태의 겔이다. 가교된 히알루론산의 3 차원 구조는 체내 주입되었을 때 영양분, 산소 및 호르몬 등을 자유롭게 이동 가능하게 하여 일반적인 조직의 기능을 발휘할 수 있으며, 가교를 함으로써 히알루론산의 조직 체류 시간을 약 12 개월까지 연장할 수 있다. 가교된 히알루론산은 가교되지 않은 히알루론산을 주성분으로 한 제품과 비교했을 때 훨씬 느린 속도로 체내에서 분해되며, 여전히 체내에 흡수되는 성질을 유지하고 있다. 이와 같은 성질을 지닌 가교 히알루론산 겔은 피하 혹은 피내에 투여되어 주름 개선 효과를 나타내거나, 혹은 연골이 손실된 관절염 환자의 관절강에 주입되어 완충작용을 통해 관절의 통증을 완화하는 효과를 나타낼 수 있다.

일반적으로 가교된 히알루론산 겔의 제조는 아래와 같은 단계로 진행된다.

히알루론산이 용해된 염기성 용액에 가교제를 첨가하여 겔화하는 단계 (반응 공정);

가교된 히알루론산 겔을 적절한 크기로 절단한 후, 수용액 상에서 팽윤하며 정제하는 단계 (정제 공정);

팽윤이 완료된 가교 히알루론산 겔을 분쇄하여 원하는 사이즈로 형성하는 단계 (분쇄 공정);

분쇄된 겔을 용도에 맞는 용기에 충전하여 멸균하는 단계 (멸균 공정).

위의 단계를 거쳐 제조된 가교 히알루론산 겔은, 체내에 투여하는 목적으로 사용될 경우 부작용을 초래하지 않도록 높은 생체적합성을 유지하여야 한다. 하지만 반응 공정에서 사용되는 가교제는 화학 반응의 특성 상, 히알루론산과의 가교 반응에 참여하지 않고 일정량만큼 겔 내부에 잔류하게 된다. 이렇게 잔류하는 가교제는 체내 투여 시 염증 반응 등의 부작용을 초래할 가능성이 있어, 가교 히알루론산 겔의 제조자는 잔류 가교제를 완벽하게 제거할 수 있는 제조 공정을 설계하여야 한다.

잔류 가교제의 제거는 정제 공정에서 이루어지며, 일반적인 정제 공정은 가교 히알루론산 겔을 세척용 수용액에 담지하는 방식으로 이루어진다. 일반적으로 세척용 수용액은 생리식염수 혹은 완충 용액을 사용한다. 수용액 상에 투입된 가교 히알루론산 겔은 물질 교환이 가능한 매트릭스의 구조를 가지고 있기 때문에, 겔 내부에 잔류하는 가교제가 단순 확산을 통해 겔 외부로 빠져나갈 수 있다. 따라서 충분한 시간 동안 가교 히알루론산 겔을 세척용 수용액에 담지함으로써 잔류 가교제는 완벽하게 제거될 수 있다. 하지만 가교 히알루론산 겔은 강한 흡수(水)력을 지니고 있기 때문에, 수용액 상에 투입되는 경우 물을 흡수하여 팽윤하는 성질이 있다. 겔은 팽윤하면서 점점 많은 양의 물을 머금게 되고, 이에 따라 겔을 이루고 있는 히알루론산의 함량은 점점 희석되어 감소하게 된다. 그런데 본 발명자는 가교 히알루론산 겔의 히알루론산 함량은 겔을 이루는 매트릭스의 견고함을 결정하는 중요한 요소임을 발견하게 되었다. 즉 겔이 함유하는 히알루론산의 함량이 낮아짐에 따라 겔의 탄성은 떨어지며, 체내 주입 시 쉽게 분해되어 사라지기 때문에 만족스러운 주름 개선 효과 혹은 관절 내 완충 효과를 나타낼 수 없게 됨을 인지하게 된 것이다. 이에 가교 히알루론산 겔의 제조자는 원하는 히알루론산 함량을 지닌 겔을 제조하기 위해 정제 시간을 정밀하게 조절하며, 겔이 팽윤하는 정도를 정제 과정 동안 수시로 확인할 필요가 있음을 밝혔다. 본 발명의 일 구현예에 의하면 가교 히알루론산 겔이 함유하는 히알루론산의 함량은 정제 과정 이후 10 내지 50 mg/mL, 바람직하게는 15 내지 25 mg/mL 이 적당하다. 10 mg/mL 이상의 히알루론산을 포함하는 가교 히알루론산 겔은 높은 히알루론산의 농도로 인해 여전히 강한 흡수력을 유지하고 있으며, 앞서 살펴본 단순 팽윤 방식의 종래의 정제 과정과 같이 특별한 장치 없이 수용액 상에 투입되는 경우 빠른 속도로 팽윤되어 잔류 가교제의 세척이 완벽하게 이루어지기 전에 히알루론산의 함량이 이미 매우 낮아질 수 있다. 정제 후 히알루론산의 함량이 낮아진 가교 히알루론산은 체내에 투여하였을 때 미반응 가교제로 인한 염증 반응은 덜할 수 있겠지만, 정작 히알루론산의 주입을 통해 목적하고자 한 성능의 발휘가 미흡할 수 없다. 하지만 본 발명의 일 구현예는 놀랍게도 정제 과정 이후에도 10 mg/mL 이상의 히알루론산의 함량이 보존될 수 있었다.

위 견지를 기조로 한 본 발명의 세척 용기는 세척용 수용액이 자유롭게 통과하며 가교 히알루론산 겔의 팽윤을 물리적으로 억제할 수 있는 크기로 구현된 것이 특징이다. 본 발명에 따른 세척 용기를 이용한 정제 방법으로 정제된 가교 히알루론산 겔은 잔류 가교제가 완벽히 제거됨은 물론, 최종적으로 수득된 가교 히알루론산 겔이 높은 순도 및 생체적합성을 갖게 되며, 히알루론산 함량이 원하는 범위로 유지될 수 있다. 즉 본 발명에 따른 세척 용기를 이용한 정제 과정을 거치면, 정제 과정 전후로 가교 히알루론산 겔의 점탄성 등의 물리적 성질에 있어서 큰 변화가 없다. 이는 종래 정제 방법에 견주면 괄목할 만한 효과이다.

본 발명에 사용되는 세척 용기는 아래와 같은 조건을 만족하여야 한다.

1. 가교 히알루론산 겔의 팽윤을 물리적으로 억제할 수 있는 경도 및 장력을 지님.

2. 재질이 수용액 상에서 녹이 슬거나 분해되지 않음.

3. 세척 용기에 형성된 세공의 크기가 겔이 세척용기 외부로 유출되지 않을 정도의 크기이어야 함.

4. 세척 용기의 세공을 통하여 세척용 수용액이 겔과 충분한 면적으로 접촉할 수 있어야 함.

5. 세척 용기의 내부 부피는 가교 히알루론산 겔의 팽윤 목표 부피보다 크지 않아야 함.

위와 같은 조건을 만족하는 본 발명에 따른 세척 용기는 가교 히알루론산 겔이 원하는 부피 이상으로 팽윤되는 것을 억제하여, 히알루론산의 함량이 목표 함량 이하로 낮아지는 것을 막을 수 있고, 가교 히알루론산 겔이 정제 과정을 거치더라도 점탄성 등의 기본적인 물성의 저하가 나타나지 않을 수 있다.

추측하건대 가교 히알루론산의 팽윤 과정은 아래와 같은 네 가지 힘의 작용으로 설명될 수 있을 것으로 보인다.

1. 가교 히알루론산 겔을 이루는 매트릭스가 겔의 형태를 유지하는 힘 (A)

2. 세척용 수용액의 삼투압 (B)

3. 가교 히알루론산 겔이 함유하는 히알루론산의 흡수력 (C)

4. 가교 히알루론산 겔의 삼투압 (D)

(A) 와 (B) 는 가교 히알루론산 겔이 팽윤하는 것을 억제하는 힘이며, (C) 와 (D) 는 가교 히알루론산의 팽윤을 촉진하는 힘이다. (A+B) > (C+D)의 경우 겔의 수분이 수용액 상으로 이탈하여 겔의 부피는 수축하게 되며, (A+B) < (C+D)의 경우 수용액 상의 수분이 겔으로 흡수되어 겔의 부피는 팽창하게 될 것이다. 그러나 팽윤이 지속되어 네 가지의 힘이 평형을 이루어 (A+B) = (C+D)가 될 때는, 겔이 팽윤 평형에 도달하여 더 이상 팽윤 되지 않게 될 것이다. 본 발명에 사용되는 세척 용기는 겔이 팽윤하는 것을 물리적으로 억제할 수 있는 장력 (E)이 겔에 작용하는 효과를 나타내어, (A+B) < (C+D)와 같은 힘의 불균형 상태에서도 (A+B+E) = (C+D) 을 통해 겔의 부피를 유지할 수 있게 할 것으로 생각했다. 이후 본 발명자는 실험을 통해 위 가설로부터 태동한 본 발명에 따른 세척 용기는 전술한 바와 같이 점탄성 등의 물리적 성상의 저하 없이 미반응 가교제의 효과적인 정제가 가능함을 확인했다.

한편 본 발명에서 가교 히알루론산 겔의 잔류 가교제의 세척 과정은 겔의 매트릭스, 삼투압, 그리고 히알루론산의 흡수력과는 무관하게 진행된다. 잔류 가교제는 세척용 수용액과 가교 히알루론산 겔 사이의 자유 가교제의 농도 구배에 따른 확산으로 매트릭스를 통과하여 겔 내부에서 외부로 유출되며 세척이 이루어진다.

본 발명에 따른 가교 히알루론산 겔을 세척하기 위한 세척 용기의 세공의 형태나 크기는 제한되지 않으나, 가교 히알루론산 겔이 정제 과정에서 세척 용기 밖으로 이탈하지 않도록 겔의 크기보다 작은 크기를 가져야 한다. 가교 히알루론산 겔의 제조 공정에서는 가교 반응 공정이 종료되어 탄성을 갖게 된 겔을 수득한 후, 정제 효율을 높이기 위해 겔을 일정한 크기로 절단하는 것이 바람직하며, 절단된 가교 히알루론산 겔은 젤리의 형태를 유지한다. 이 때 분쇄된 각각의 겔의 크기는 10 내지 50 mm 가 적절하며, 세척 용기의 세공의 크기는 길이, 혹은 직경이 위 겔의 크기보다 작은 1 내지 10 mm 가 적절하다. 세공이 아닌 동일한 내경을 지닌 체망 형태의 구조 역시 본 발명을 실현하기에 적합하다.

세척 용기의 재질은 가교 히알루론산의 팽윤을 물리적으로 억제할 수 있을만한 장력을 제공할 수 있어야 하며, 이는 플라스틱 혹은 메탈 재질이 적절하다. 더욱 상세하게는 플라스틱으로서 화학적으로 안정하고 강도가 높은 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 폴리테트라플루오로에틸 혹은 이와 동등 이상의 재질이 적절하며, 메탈으로서 화학적으로 안정하며 강도가 높은 SUS 301, SUS 302, SUS 303, SUS 30 3SE, SUS 304, SUS 304L, SUS 316, SUS 316H, SUS 316 L, SUS 316N, SUS 316Ti 혹은 이와 동등 이상의 재질이 적절하다.

본 발명에 따른 세척 용기를 이용하여 가교 히알루론산 겔을 수득하는 공정은 다음과 같다.

먼저 가교제와 히알루론산의 가교반응을 진행한다. 이때 가교제는 제한 없이 공지의 것의 채택이 가능하며, 예컨대 1,3-부타디엔디에폭시드, 1,2,7,8-디에폭시옥탄, 1,5-헥사디엔디에폭시드, 에틸렌글리콜다이글리시딜에테르, 비스페놀 A 다이글리시딜에테르, 디비닐설폰, 에피클로르히드린, 1,4-부탄다이올 다이글리시딜 에테르(BDDE), 1,4-비스(2,3-에폭시프로폭시)부탄, 1,4-비스글리시딜옥시부탄, 1,2-비스(2,3-에폭시프로폭시)에틸렌 및 1-(2,3-에폭시프로필)-2,3-에폭시사이클로헥산으로 이루어진 군으로부터 선택할 수 있다. 히알루론산의 분자량, 가교결합도 등은 목적하는 제품의 성질에 따라 적의 결정할 수 있다.

이어서 수득된 가교 히알루론산을 절단하고, 절단된 가교 히알루론산을 본 발명에 따른 세척 용기에 충전하여, 세척용 용액으로 세척한다. 세척용 용액은 공지의 완충용액을 선택할 수 있으며, 필요에 따라 pH 를 약 6.5 내지 8.0 이 되도록 NaOH, KOA, NaHCO₃ 또는 LiOH 등의 염을 첨가할 수 있다. 예컨대 인산완충용액(PBS) 등의 등장성 용액이 세척용 용액으로 사용될 수 있다.

세척 동안에는 가교 히알루론산 겔의 팽윤 정도를 확인하는 것도 바람직할 수 있다. 예컨대 1-4 시간 단위로 세척 중인 가교 히알루론산 겔의 부피를 측정함으로써 팽윤 정도를 확인해 볼 수도 있다.

세척은 미반응 가교제가 확산을 통해 제거되기에 충분한 시간 동안 진행하는 것이 바람직하다. 예컨대 특별히 제한은 없겠지만 10-48 시간 정도로 진행해볼 수 있다. 10 시간 미만의 세척은 경우에 따라 다르겠지만 미반응 가교제의 충분한 정제에 미흡할 수 있다.

이상 가교 히알루론산 제조방법에 대해 설명했으나, 본 발명은 정제 공정의 개선에 주목한 것이므로, 본 명세서에서 게시하지 아니한 기술이라 할지라도 정제 장치 및 공정 이외의 히알루론산 가교 제조방법에 관한 것은 원료, 함량 및 방법 등 모든 측면에서 공지의 것을 제한 없이 이용할 수 있다.

이하 실시예를 통해 본 발명을 예시한다. 실시예는 본 발명의 일 구현예를 나타내는 것일 뿐, 본 발명의 보호범위가 이에 제한되는 것은 아님에 유의할 필요가 있다.

[실시예]

[실시예 1]

가교 히알루론산 겔의 정제 공정에 사용되는 세척 용기를 제작하기 위해, 123D Design 소프트웨어를 이용하여 내부 직경 55 mm, 내부 높이 10 mm, 내부 용적 약 24 mL에 해당하는 세척 용기의 본체 및 뚜껑의 도면을 각각 [도면 1] 및 [도면 2]와 같이 제작하였다. 도면을 이용해 3D 프린터로 출력된 세척 용기 및 뚜껑의 실물은 [도면 3]과 같다.

[실시예 2]

가교 히알루론산 겔을 제조하기 위해, 5 g의 히알루론산 나트륨을 50 mL의 0.5 M 수산화 나트륨 용액에 용해한 후, 디비닐설폰 0.3 mL를 용액에 투입하였다. 37 ℃에서 2 시간 동안 숙성한 후, 겔화되어 탄성을 지니는 가교 히알루론산 겔을 가로 약 10 mm, 세로 약 10 mm, 높이 약 10 mm의 크기로 [도면 4]와 같이 절단하였다.

[실시예 3]

실시예 2 의 결과물을 약 4.8 mL 만큼 칭량하여 [도면 5]와 같이 실시예 1의 세척 용기에 투입하였다. 세척 용기의 뚜껑을 닫고, 500 mL의 pH 6.9 PBS 완충 용액에 가교 히알루론산 겔이 충전된 세척 용기를 [도면 6]과 같이 투입하였다. 24 시간 후 완충 용액으로부터 세척 용기를 꺼내 세척 용기에 충전된 겔을 회수하였다.

[실시예 4]

실시예 2 의 결과물을 약 4.8 mL 만큼 칭량하여 실시예 1 의 세척 용기에 충전하였다. 세척 용기의 뚜껑을 닫고, 500 mL의 pH 6.9 PBS 완충 용액에 가교 히알루론산 겔이 충전된 세척 용기를 투입하였다. 48 시간 후 완충 용액으로부터 세척 용기를 꺼내 세척 용기에 충전된 겔을 회수하였다.

[실시예 5]

실시예 3 의 결과물을 유리 주사기에 충전하여 121 ℃의 온도에서 20 분간 멸균하였다.

[실시예 6]

실시예 4 의 결과물을 유리 주사기에 충전하여 121 ℃의 온도에서 20 분간 멸균하였다.

[비교예 1]

실시예 2 의 결과물을 약 4.8 mL 만큼 칭량하여 500 mL의 pH 6.9 PBS 완충 용액에 투입하여 팽윤 된 겔의 부피를 1 시간 마다 측정하였으며, 5 시간 후 24 mL 만큼 겔이 팽윤되었을 때 완충 용액으로부터 겔을 회수하였다.

[비교예 2]

실시예 2 의 결과물을 약 4.8 mL 만큼 칭량하여 500 mL의 pH 6.9 PBS 완충 용액에 투입하고, 48 시간 후 완충 용액으로부터 겔을 회수하였다.

[비교예 3]

실시예 3 의 결과물을 유리 주사기에 충전하여 121 ℃의 온도에서 20 분간 멸균하였다.

[비교예 4]

실시예 4 의 결과물을 유리 주사기에 충전하여 121 ℃의 온도에서 20 분간 멸균하였다.

[시험예 1]

실시예 3, 실시예 4, 비교예 1 및 비교예 2 에 해당하는 가교 히알루론산 겔에 대한 히알루론산 함량 평가를 진행했다. 각각의 가교 히알루론산 겔의 히알루론산으로써 3 mg에 해당하는 양을 5 mL의 붕사·황산 용액에 완전히 용해시킨 액을 검액으로 사용하여, 대한민국 약전 일반시험법 중 히알루론산 안과용 주사액의 정량법에 따라 시험하였다. 분석 결과는 [표 1]과 같다.

시료	히알루론산 나트륨 함량
실시예 3	20.1 mg/mL
실시예 4	19.9 mg/mL
비교예 1	20.2 mg/mL
비교예 2	8.8 mg/mL

상기 결과를 통해, 실시예 3 과 실시예 4 와 같이 세척 용기에 충전되어 있던 가교 히알루론산 겔은 각각 24 시간, 48 시간 동안 완충 용액 상에 담지되어 있었음에도 불구하고, 5 시간 동안 팽윤되었던 비교예 1 의 가교 히알루론산 겔과 동등하게 약 20 mg/mL의 히알루론산 나트륨 함량을 유지하고 있음을 확인하였다. 비교예 2 와 같이 세척 용기를 사용하지 않고 48 시간 동안 완충 용액 상에 투입되어 있던 가교 히알루론산 겔은 과량으로 팽윤되어, 매우 낮은 히알루론산 나트륨의 함량을 나타냄을 확인할 수 있었다.

[시험예 2]

실시예 3, 실시예 4, 비교예 1 및 비교예 2에 해당하는 가교 히알루론산 겔에 대한 저장 탄성 평가를 진행했다. 저장 탄성의 평가는 Rheometer MCR 302 (Anton Paar) 기기를 통해 이루어 졌으며, 1.0 Hz에서 저장 탄성을 기록하였다. 분석 결과는 [표 2]와 같다.

시료	저장 탄성 (1 Hz)
실시예 3	710 Pa
실시예 4	689 Pa
비교예 1	718 Pa
비교예 2	385 Pa

상기 결과를 통해, 실시예 3 과 실시예 4 와 같이 세척 용기에 충전되어 있던 가교 히알루론산 겔은 각각 24 시간, 48 시간 동안 완충 용액 상에 투입되어 있었음에도 불구하고, 5 시간 동안 팽윤되었던 비교예 1 의 가교 히알루론산 겔과 비교하였을 때 약 700 Pa의 동등한 저장 탄성을 나타냄을 확인하였다. 이에 따라 통상적인 정제 방법으로 정제된 가교 히알루론산 겔과 본 발명의 세척 용기를 통해 물리적으로 팽윤이 장시간 억제되며 정제된 가교 히알루론산 겔은 동등한 물리적인 특성을 나타냄을 확인하였다. 하지만 세척 용기 없이 48 시간 동안 과도하게 팽윤된 비교예 2의 가교 히알루론산 겔은 저장 탄성이 약 2 배 이상 낮아 물리적인 성능이 저하되어 있음을 확인하였다.

[시험예 3]

멸균이 안된 가교 히알루론산 겔로써 실시예 3, 실시예 4, 비교예 1 및 비교예 2 의 저장 탄성과, 유리주사기에 충전되어 멸균된 가교 히알루론산 겔로써 실시예 5, 실시예 6, 비교예 3 및 비교예 4 의 저장 탄성을 비교하여 정제 조건에 따른 멸균 저항성을 시험하였다. 저장 탄성의 평가는 Rheometer MCR 302 (Anton Paar) 기기를 통해 이루어졌으며, 분석 결과는 [표 3] 및 [도면 7]과 같다.

시료 (멸균 전)	저장 탄성 (1 Hz)	시료 (멸균 후)	저장 탄성 (1 Hz)	탄성 감소율 (%)
실시예 3	718 Pa	실시예 5	399 Pa	44.4 %
실시예 4	717 Pa	실시예 6	424 Pa	40.9 %
비교예 1	704 Pa	비교예 3	388 Pa	44.9 %
비교예 2	297 Pa	비교예 4	147 Pa	50.5 %

상기 결과를 통해, 세척 용기를 통해 정제된 실시예 3 및 실시예 4 의 가교 히알루론산 겔은 세척 용기를 사용하지 않고 정제된 비교예 1 및 비교예 2 의 가교 히알루론산 겔과 비교하였을 때 멸균 전 후로 동등한 탄성 감소율을 보여, 세척 용기의 사용은 가교 히알루론산 겔의 멸균 저항성에 영향을 주지 않는 것으로 나타났다.

[시험예 4]

실시예 3, 실시예 4, 비교예 1 에 해당하는 가교 히알루론산 겔에 대한 잔류 가교제의 평가를 진행했다. 각각의 결과물을 35 mesh 체망에 체과하고, 정제수에 100 배 희석하여 24 시간 동안 초음파 진탕하였다. 초음파 진탕이 종료된 후 액을 원심분리하였다. 원심분리된 상층액에 대해 디비닐설폰의 유도체인 2,2’-설포닐다이에탄올에 대한 농도 분석을 UHPLC 1290-Agilnet 6490 QQQ LC/MS (Agilent)기기를 이용하여 진행하였다. 실시예 3, 실시예 4, 비교예 1 및 비교예 2 에 대한 2,2’-설포닐다이에탄올에 대한 분석 결과는 [표 4]와 같다.

시료	잔류 2,2’-설포닐다이에탄올 농도	크로마토그램
실시예 3	0.7 ppm	도면 8
실시예 4	0 ppm (정량 한계 이하)	도면 9
비교예 1	20.7 ppm	도면 10

상기 결과를 통해, 세척 용기를 사용하여 24 시간 동안 정제된 실시예 3 의 가교 히알루론산 겔의 잔류 가교제의 유도체는 세척 용기를 사용하지 않은 비교예 1 의 경우와 비교 시 약 97 % 이상 감소한 것으로 나타났다. 세척 용기를 사용하여 24 시간 동안 정제된 실시예 4 의 경우 잔류 가교제의 유도체가 검출되지 않아 매우 높은 순도를 나타내는 것으로 확인하였다. 시험예 1 내지 시험예 4 의 결과를 종합하였을 때, 세척 용기의 사용은 가교 히알루론산 겔이 함유하는 히알루론산의 함량을 저하시키지 않고, 겔의 고유 물리적인 특성에 변화를 주지 않으면서 잔류 가교제 혹은 잔류 가교제의 유도체를 효과적으로 완전히 제거할 수 있음을 확인하였다.

Claims (7)

1. 가교제와 히알루론산의 가교반응을 진행하는 단계; 수득된 가교 히알루론산을 절단하는 단계; 절단된 가교 히알루론산을 세척 용기에 충전하는 단계; 가교 히알루론산이 충전된 세척 용기를 세척용 용액으로 세척하는 단계를 포함하는 가교 히알루론산의 미반응 가교제 정제 방법으로서, 세척 단계에서 세척 용기가 가교 히알루론산의 팽윤을 물리적으로 억제하는 것을 특징으로 하는 정제 방법.
2. 제 1 항에 있어서, 세척용 용액이 등장성 용액인 것을 특징으로 하는 정제 방법.
3. 제 1 항에 있어서, 세척용 용액이 담긴 용기에 가교 히알루론산을 충전한 세척 용기를 담지하여 미반응 가교제를 세척하는 것을 특징으로 하는 정제 방법.
4. 제 1 항에 있어서, 세척 후 가교 히알루론산의 히알루론산 함량이 10 내지 50 mg/mL 인 것을 특징으로 하는 정제 방법.
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