BR0007985B1 - processo para a preparação de derivados multiplamente reticulados do ácido hialurÈnico (ha), ha multiplamente reticulado, ha reticulado em um ou mais polìmeros diferentes de ha, ha reticulado em um segundo polìmero, produto, e, uso de um derivado de ha multiplamente reticulado. - Google Patents

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"PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE DERIVADOS MULTIPLAMENTE RETICULADOS DO ÁCIDO HIALURÔNICO (HA), ÁCIDO HIALURÔNICO MULTIPLAMENTE RETICULADO, ÁCIDO HIALURÔNICO RETICULADO EM UM OU MAIS POLÍMEROS DIFERENTES DE ÁCIDO HIALURÔNICO, ÁCIDO HIALURÔNICO RETICULADO EM UM SEGUNDO POLÍMERO, ÁCIDO HIALURÔNICO RETICULADO EM UM POLÍMERO DIFERENTE DE ÁCIDO HIALURÔNICO, PRODUTO, E, USO DE UM DERIVADO DE ÁCIDO HIALURÔNICO MULTIPLAMENTE RETICUL ADO"

A presente invenção se refere a um processo para a produção de derivados do ácido hialurônico (HA), especialmente derivados duplamente reticulados do ácido hialurônico, e a novos derivados reticulados assim obtidos, a produtos contendo os mesmos e seus usos em aplicações cosméticas, médicas e farmacêuticas.

O ácido hialurônico (HA) é um membro de uma classe de polímeros conhecida como gücosaminoglicanos. O HA é um polissacarídeo de cadeia linear longa e é usado atualmente como o sal de sódio que tem uma fórmula molecular (Ci4H2ONNaOi iX, onde η pode variar de acordo com a fonte, procedimento de isolamento e método de determinação. No entanto, pesos moleculares até 14x106 foram registrados.

O HA e seus sais podem ser isolados de muitas fontes incluindo o cordão umbilical humano, cristas de galo e quase todas as matrizes conectivas de organismos vertebrados.

O HA é também um componente capsular de bactérias, tais como Streptococci, conforme foi demonstrado por Kendall et al., (1987), Biochem. Biophvs. Acta, 279,401-405; ele, no entanto, poderá ser também obtido por métodos de fermentação. Por exemplo, a patente norte-americana US 5.411.874 dos presentes inventores descreve um método para a produção de ácido hialurônico pela fermentação contínua de Streptococcus equi.

O HA é não-imunogênico e portanto tem grande potencial em medicina. Por causa das suas propriedades visco-elásticas, verificou-se que o HA tendo um peso molecular elevado (acima de um milhão) é especialmente útil em uma variedade de campos clínicos, incluindo o tratamento de ferimentos, cirurgias oftalmológicas e ortopédicas. HA é também potencialmente útil em uma variedade de campos não médicos, tais como em aplicações cosméticas.

No entanto, o uso de HA em algumas destas aplicações é limitado pelo fato de que após a administração em seres humanos o HA é rapidamente degradado por enzimas como as hialuronidases e radicais livres. Além disso, o HA é solúvel em água na temperatura ambiente, o que pode torná-lo menos adequado para certas aplicações.

Várias tentativas portanto foram feitas para se preparar formas mais estáveis de HA, especialmente pela reticulação das moléculas de HA.

Assim sendo, a USP 4.582.865 (Biomatrix Inc.) descreve a preparação de géis reticulados de ácido hialurônico os quais são formados pela reticulação de HA ele próprio ou misturado com outros polímeros hidrófilos utilizando-se divinil sulfona como o agente de reticulação. Parece que neste caso a reticulação ocorre através dos grupos hidroxila do HA.

A USP 5.550.187 (Collagen Corporation) descreve um método para a preparação de composições de biomaterial reticulado que envolve a mistura de um polímero biocompatível, o qual é de preferência colágeno mas pode ser escolhido de outros polímeros incluindo ácido hialurônico, com um agente de reticulação seco e estéril como um polímero hidrófilo sintético.

A USP 5.510.121 (Rhee et al.) descreve conjugados formados pela ligação covalente de glicosaminoglicanos ou derivados dos mesmos em polímeros sintéticos hidrófilos, especialmente derivados ativados de PEG. O processo descrito parece envolver somente uma etapa de reticulação.

A USP 5.578.661 (Nepera Inc.) descreve um sistema de formação de gel para uso como uma proteção para ferimentos que é formada de três componentes principais, o primeiro sendo um polímero solúvel em água, o segundo sendo um polímero contendo o ácido e o terceiro sendo um polissacarídeo ou polímero contendo amina como o ácido hialurônico. Neste caso a reticulação parece ser através de ligação iônica.

A patente US 5.644.049 (Italian Ministry for Universities and Scientific and Technology Research) descreve um biomaterial compreendendo uma rede de polímeros interpenetrantes (IPN) onde um dos componentes poliméricos é um polissacarídeo acidulado como o ácido hialurônico e o segundo componente polimérico poderá ser um polímero sintético. Os dois componentes poderão ser (mas não necessariamente são) reticulados.

Tomihata e Ikada registraram a reticulação de HA utilizando uma carbodi-imida solúvel em água como o agente de reticulação. Eles consideraram que a reticulação acontecia através dos grupos éster. A reação de reticulação foi também executada na presença de L-Lisina-éster metílico, o que parece produzir uma reticulação adicional através de ligações amida para o éster de Lisina. (J. Biomed. Mater. Res., 37, 243 - 251, 1997).

A Patente US 5.800.541 descreve matrizes poliméricas sintéticas de colágeno, preparadas utilizando-se uma reação em múltiplas etapas. A primeira etapa envolve a reação de colágeno com um polímero sintético hidrófilo; a matriz resultante poderá ser depois modificada em uma segunda etapa da reação, a qual poderá envolver reticulação, ou conjugando a matriz com um polímero sintético, acoplando moléculas biologicamente ativas ou glicosaminoglicanos à matriz, reticulando a matriz utilizando agentes de reticulação convencionais químicos ou modificando o colágeno na matriz por intermédio de reação química, neste processo, a matriz polimérica sintética inicial de colágeno parece ser reticulada apenas através de um tipo de ligação, e as etapas adicionais de processo servem para introduzir outras substâncias químicas, as quais poderão formar tipos diferentes de ligações. No entanto, não parece que quaisquer das duas substâncias que formam o produto serão ligadas uma com a outra por mais de um tipo de ligação.

O pedido internacional de patente WO 97/04012 (Agerup) descreve composições de géis de polissacarídeos (as quais entre outras poderão ser o ácido hialurônico) que são preparadas pela formação de uma solução aquosa do polissacarídeo, iniciando-se a reticulação na presença de um agente de reticulação polifuncional, impedindo-se esterilmente que a reação de reticulação seja terminada antes que ocorra a gelatinização (por exemplo por diluição da solução) e então reintroduzindo-se esterilmente as condições liberadas (por exemplo pela evaporação da solução) para que a reticulação continue até um gel viscoso elástico. Nesta aplicação não se sugere que tipos diferentes de ligação são formadas nos dois estágios de reticulação.

Nenhum dos documentos anteriormente mencionados descreve produtos nos quais o HA é ligado a uma ou mais moléculas poliméricas (as quais poderão ser as mesmas ou diferentes) por intermédio de dois tipos diferentes de ligações reticuladas.

Os requerentes verificaram agora que o ácido hialurônico poderá ser reticulado com outros polímeros através de dois tipos diferentes de ligações de reticulação, para efetuar uma reticulação dupla. A formação de tipos diferentes de ligação é conseguida efetuando-se a reticulação através de grupos funcionais diferentes. As ligações assim formadas podem portanto ser descritas como ligações funcionais. Assim sendo, por exemplo um tipo de ligação poderá ser formado pela ligação através de grupos hidroxila e uma ligação funcional diferente formada por reticulação através de, por exemplo, grupos carboxila. Verificou-se que tais reticulações múltiplas resultam em um alto grau de reticulação com bioestabilidade melhorada de HA baseado no grau de reticulação e escolha do segundo polímero.

Em um primeiro aspecto portanto, a invenção presente fornece um processo para a preparação de derivados multiplamente reticulados (por exemplo duplamente) do ácido hialurônico, cujo processo compreende a reticulação de HA até um ou mais polímeros diferentes de HA e opcionalmente até outra molécula de HA através de dois ou mais grupos funcionais diferentes.

A reticulação de cada tipo de grupo funcional poderá ser efetuada pelo contato do HA e pelo menos um outro polímero, com um ou mais agentes de reticulação, simultaneamente ou em seqüência, conforme descrito em mais detalhes aqui abaixo.

Neste relatório, o polímero no qual o HA poderá ser reticulado será referido de forma geral como "polímero", "segundo polímero" ou "polímero subseqüente". Um "segundo polímero" ou "polímero subseqüente" poderá ser composto de uma mistura de polímeros.

Neste relatório, "HA multiplamente reticulado" refere-se a um derivado do ácido hialurônico onde uma molécula de HA é reticulada até um segundo polímero e opcionalmente até um polímero posterior e / ou outra molécula de HA por intermédio de dois ou mais tipos diferentes de ligação funcional. Da mesma forma, "HA duplamente reticulado" refere-se a um derivado do ácido hialurônico onde uma molécula de HA é reticulada até um segundo polímero e opcionalmente até um polímero posterior e / ou outra molécula de HA por intermédio de dois tipos diferentes de ligação funcional e "HA de reticulação única" refere-se a um derivado do ácido hialurônico onde uma molécula de HA é reticulada somente até um segundo polímero, somente por um tipo de ligação funcional.

Polímeros aos quais o HA poderá ser reticulado de acordo com a invenção presente poderão incluir biopolímeros e polímeros sintéticos. Será visto é claro que o referido polímero deve ser não tóxico e biocompatível. De preferência, o segundo (ou subseqüente) polímero é um polímero solúvel em água. Também será visto que as propriedades do segundo (ou subseqüente) polímero influenciarão até certo ponto as propriedades do produto final reticulado. O segundo ou subsequente polímero deverá portanto ser escolhido levando-se em conta as propriedades desejadas do produto final, e deve ser compatível com e mesmo aumentar estas propriedades. Especialmente, o segundo (ou subseqüente) polímero deverá ter de preferência boa bioestabilidade.

Polímeros sintéticos que podem ser utilizados incluem o álcool polivinílico (PVA), óxido de polietileno (PEO), e óxido de polipropileno (PPO), assim como copolímeros de quaisquer dos polímeros anteriormente mencionados, ácido poliacrílico, poliacrilamida e outros polímeros sintéticos hidrófilos de hidroxila e carboxila.

Os biopolímeros que poderão ser utilizados de acordo com a invenção presente incluem polipeptídeos, celulose e seus derivados tais como hidroxietilcelulose e carboximetilcelulose, alginato, quitosano, lipídios, dextrano, amido, goma "gelano" e outros polissacarídeos.

Os polímeros anteriormente mencionados poderão ser não iônicos, aniônicos ou catiônicos. Polímeros não iônicos incluem PVA, PEO e copolímeros tais como PEO-PPO-PEO. Polímeros catiônicos incluem quitosano; polímeros contendo amina, colágeno e gelatina. Polímeros aniônicos incluem alginato, goma de "gelano", carboximetilcelulose (CMC), ácido poliacrílico e ácido poliaspártico.

Será visto que certos polímeros, por exemplo polipeptídeos, poderão existir na forma aniônica ou catiônica, dependendo de vários fatores, por exemplo do pH da mistura da reação. Geralmente é preferível utilizar-se tais polímeros em condições que os tornem aniônicos.

A reticulação de cada tipo de grupo funcional poderá ser efetuada simultaneamente ou em seqüência conforme descrito em mais detalhes aqui abaixo.

Os grupos funcionais que são responsáveis principalmente pela reticulação de moléculas de HA no segundo polímero são os grupos hidroxila e carboxila. Os grupos hidroxila poderão ser reticulados através de uma ligação de éter e os grupos carboxila através de uma ligação de éster. Se desejado o HA poderá ser modificado quimicamente antes da reticulação para formar outros grupos reativos quimicamente. Assim sendo, por exemplo o HA poderá ser tratado com ácido ou base de tal forma que ele sofrerá pelo menos uma desacetilação parcial, resultando na presença de grupos amina livres. Os referidos grupos amina poderão ser reticulados através de uma amida (-C(O)-NH-); imino (-N=CH-) ou ligação de amina secundária (-NH- CH-). Uma ligação de imino é um precursor de uma ligação de amina e uma ligação de imino pode ser convertida em uma ligação de amina na presença de uma agentes redutor.

Agentes de reticulação que poderão ser usados no processo da invenção presente incluem aqueles bem conhecidos na arte, por exemplo formaldeído, glutaraldeído, divinil sulfona, um polianidrido, um polialdeído, um álcool poli-hídrico, carbodiimida, epicloridrina, etileno glicol diglicidiléter, butanodiol diglicidiléter, poliglicerol poliglicidiléter, polietileno glicol diglicidiléter, polipropileno glicol diglicidiléter, ou um bis- ou poli- epóxi reticulador como 1, 2, 3, 4-diepoxibutano ou 1, 2, 7, 8- diepoxioctano.

Para formar uma ligação de éter o agente de reticulação é de preferência escolhido entre formaldeído, gluteraldeído, divinil sulfona e, em condições alcalinas, di e poli epóxidos. De preferência o reticulador contém um segmento de hidrocarboneto hidrófobo, por exemplo 1, 2, 3, 4- diepoxibutano, ou mais de preferência 1,2, 7, 8- diepoxioctano.

Para formar uma ligação éster o agente de reticulação é de preferência escolhido de álcoois poli-hídricos, carbodiimidas, polianidridos, cloretos do ácido carboxílico e, em condições ácidas, di e poli epóxidos. De preferência o reticulador contém um segmento de hidrocarbonetos hidrófobo, por exemplo 1, 2, 3, 4,- diepoxibutano, ou mais de preferência 1, 2, 7, 8- diepoxioctano.

Uma ligação amida é de preferência formada utilizando-se um agente de reticulação escolhido de carbodiimidas na presença de aminas, anidridos do ácido carboxílico e cloretos (HA desacetilado), e diisocianatos.

Uma ligação amina é de preferência formada utilizando-se um agente de reticulação escolhido de um epóxido, ou glutaraldeído com um agente de redução, na presença de grupos amino em HA desacetilado.

Uma ligação imino (ligação de base schiff) poderá ser formada utilizando-se glutaraldeído na presença de grupos amino em HA desacetilado.

Uma ligação sulfona é de preferência formada utilizando-se um cloreto de sulfonila.

Em uma realização da invenção presente, as ligações funcionais diferentes poderão ser formadas em seqüência, em um processo de etapas múltiplas, o qual poderá ser feito utilizando-se um agente de reticulação diferente para cada estágio ou utilizando-se o mesmo agente de reticulação em cada estágio e ajustando-se as condições de reação para controlar a reação específica de reticulação requerida.

Assim sendo, para se conseguir uma reticulação múltipla, por exemplo dupla, da forma em etapas de acordo com a invenção presente, uma primeira reação de reticulação é executada, por exemplo utilizando-se um dos métodos descritos abaixo. Quando esta é completada, ou já foi efetuada até o ponto requerido, um segundo agente de reticulação é adicionado na mistura da reação para efetuar a segunda reticulação. O agente de reticulação adicional poderá ser o mesmo ou diferente do primeiro. Quando um agente de reticulação diferente é utilizado ele geralmente será escolhido de tal forma que sem modificar-se as condições da reação, ele formará um tipo diferente de ligação funcional. No entanto, quando o mesmo agente de reticulação é utilizado para formar ambas as reticulações, as condições de reação devem ser ajustadas de forma apropriada para se formar um tipo diferente de ligação. Aqueles adestrados na arte ficarão rapidamente aptos a escolher um agente de reticulação apropriado e condições de reação apropriadas para se formar a ligação desejada.

Para se evitar dúvidas, deve-se notar que se o mesmo agente de reticulação é utilizado nas mesmas condições de reação em cada etapa, isto resultando em somente um tipo de ligação, i.e., produzirá um produto de reticulação simples, apesar de produzido em dois ou mais estágios.

Deve ser visto que quando as duas ou mais ligações funcionais de acordo com a invenção presente são formadas em seqüência, i.e. em uma reação de múltiplos estágios, a reticulação formada no primeiro estágio da reação deve ser suficientemente forte para suportar as condições de reação necessárias para se formar a segunda ou subseqüente reticulação(s). Assim sendo, a mais forte das duas (ou mais) ligações deve ser formada primeiramente. Isto ficará rapidamente aparente para o trabalhador adestrado e se necessário pode ser determinado por meio de experiências rotineiras.

Assim sendo, quando as reticulações são formadas através de grupos hidroxila e carboxila será visto que a reticulação do primeiro estágio deve ser feita através dos grupos hidroxila para produzir uma ligação éter e a reticulação do segundo estágio será então efetuada através dos grupos carboxila, para produzir uma ligação éster.

Uma ligação éter poderá ser formada utilizando-se um reticulador de epóxido em condições alcalinas, de preferência no pH 10 ou mais ou, desde que os polímeros a serem reticulados não contenham grupos amino, utilizando-se glutaraldeído como o agente de reticulação em condições ácidas por exemplo em pH 4 ou menos. Uma ligação éster poderá ser formada com um reticulador de epóxido em condições ácidas por exemplo em pH 4 ou menos.

Assim sendo, por exemplo, uma primeira reação de reticulação para formar uma ligação éter poderá ser executada utilizando-se um epóxido como o 1, 2, 7, 8-diepoxioctano em condições alcalinas, de preferência em um pH de 10 ou mais, por exemplo na faixa de pH de 10 a pH 12. Uma segunda reação de reticulação para formar uma ligação éster poderá posteriormente ser efetuada utilizando-se o mesmo agente de reticulação, e ajustando-se o pH do meio da reação para o pH 4 ou menos, por exemplo na faixa de pH 4 a pH 2. Alternativamente agentes diferentes de reticulação poderão ser utilizados em cada etapa, em cujo caso poderá não ser necessário ajustar-se as condições da reação. Assim sendo por exemplo uma primeira reação de reticulação poderá ser executada utilizando-se glutaraldeído em condições ácidas para formar uma ligação éter, seguido pela reação com um reticulador de epóxido também em condições ácidas para formar uma ligação éster.

A concentração de HA em relação ao total de polímeros utilizados (i.e. HA + segundo + polímero subseqüente, referido aqui como composto de HA / polímero) geralmente estará na faixa de 1 a 99%, por exemplo 5 a 95%. De preferência a concentração de HA no composto HA / polímero é de pelo menos 50%, e poderá ser até 99%, por exemplo 90% de HA.

A relação de agente de reticulação para polímeros totais (HA + segundo polímero) utilizada em cada estágio deste processo estará geralmente na faixa de 1:10 a 10:1 em peso.

As reações individuais de reticulação poderão ser executadas de acordo com os métodos conhecidos geralmente na arte.

Assim sendo, o HA e o segundo polímero utilizados como materiais iniciais poderão estar na forma de um filme ou em solução. Um filme de HA / segundo polímero poderá ser obtido misturando-se HA e o segundo polímero requerido em solução aquosa e secando-se a referida solução para formar um filme. Quando tal filme é utilizado, ele poderá ser colocado em suspensão em um solvente adequado juntamente com um agente de reticulação. O meio de reação de preferência é composto de um solvente orgânico como acetona, clorofórmio, ou um álcool como por exemplo etanol, ou i-propanol, misturados com uma solução acidulada ou alcalina. Uma solução acidulada de preferência tem um pH de 4 ou menos e uma solução alcalina de preferência tem um pH de 10 ou mais. A reação de reticulação acontece adequadamente em uma temperatura na faixa de 15 a 30 0 Cj por exemplo na temperatura ambiente.

De preferência, quando um filme de HA / polímero é utilizado como material inicial, uma reticulação de éter é formada primeiramente com epóxido em condições alcalinas ou, desde que o filme de HA / polímero não contenha grupos amino livres, com glutaraldeído em condições ácidas, seguido pela formação de uma reticulação de éster usando-se epóxido em condições ácidas. Quando um filme de HA polímero contém grupos amino uma base schiff com uma ligação imino pode ser formada usando-se glutaraldeído em condições ácidas. Esta ligação de imino pode ser convertida em uma ligação amina usando-se um agente de redução.

Alternativamente, o reticulador poderá ser adicionado a uma solução acidulada ou alcalina de HA e um segundo polímero. Em condições ácidas o pH da solução inicial é de preferência pH 4 ou menor e para uma solução alcalina o pH é de preferência pH 10 ou maior. A concentração do polímero total, i.e., HA mais outro polímero da solução está adequadamente na faixa de 1 a 10%, peso / peso. A reação poderá ser efetuada em uma temperatura na faixa de 15 a 50°C. O tempo para completar a reação de reticulação poderá geralmente variar de cerca de 1 hora até alguns dias. De preferência, quando uma solução de HA e um segundo polímero são utilizados uma reticulação de éter é primeiramente formada com um epóxido em condições alcalinas, seguido pela formação de uma reticulação éster utilizando-se um epóxido (de preferência o mesmo epóxido da primeira etapa) em condições ácidas. Em um outro método uma solução de HA e um segundo polímero poderão ser submetidos a uma reação de primeira reticulação, o primeiro intermediário sendo seco para formar um filme e o referido filme sendo submetido a uma outra reação de reticulação conforme descrito acima para produzir um produto de dupla reticulação na forma de um filme. De preferência, para obter-se um derivado de HA duplamente reticulado de acordo com este procedimento, uma reticulação de éter é primeiramente formada com um epóxido em condições alcalinas seguido pela formação de uma reticulação de éster utilizando-se um epóxido (de preferência o mesmo epóxido da primeira etapa) em condições ácidas.

Em outra realização desta invenção, a reticulação múltipla de HA com um segundo polímero, especialmente a reticulação dupla, poderá ser efetuada em uma reação de uma só etapa, compactando-se o HA e o segundo polímero simultaneamente com dois agentes diferentes de reticulação, adequados para a reticulação de dois grupos funcionais diferentes nas mesmas condições. Assim sendo, por exemplo, para formar ambos os grupos éter e éster em uma só etapa o HA e o segundo polímero poderão ser contatados com uma mistura de glutaraldeído e 1,2, 7, 8-diepoxioctano.

A relação entre o agente de reticulação e os polímeros totais (HA + segundo polímero) utilizados em cada estágio deste processo geralmente estará na faixa de 1:10 a 10:1 em peso.

A natureza exata do produto poderá ser variada pelas escolha apropriada das condições de reação para se controlar o grau de reticulação e portanto as propriedades do produto. Fatores que influenciam o grau de reticulação e portanto a natureza do produto final incluem a forma do material inicial de HA utilizado, a natureza do segundo polímero, a relação de alimentação entre o agente de reticulação e o HA e o segundo polímero, o tempo de reação, a temperatura e o pH. O produto poderá ser obtido na forma de um gel ou filme e poderá ser claro ou opaco. A capacidade de absorção de água e a bioestabilidade variarão dependendo da natureza exata do produto.

Um produto de acordo com a invenção poderá ser obtido na forma de um filme ou folha utilizando-se materiais iniciais de HA e outro polímero na forma de uma solução, filme ou folha e executando-se o processo sem agitação. Um filme ou folha não reticulado composto de um HA e de um segundo polímero poderá ser obtido misturando-se HA e o referido segundo polímero em solução e secando-se para obter um filme ou folha. Será visto que quando o HA mais o copolímero são usados na forma de um filme ou folha, isto irá absorver água quando colocado em solução aquosa, como uma solução tampão de PBS, e incha para formar um gel. Se desejado, opcionalmente um filme intermediário poderá ser formado depois da primeira etapa de reticulação, conforme descrito acima. O produto poderá ser claro ou opaco, dependendo do grau de reticulação e da natureza do outro polímero (s) para o qual o HA é reticulado. Assim sendo por exemplo a reticulação de HA com um polímero como PVA pode resultar em um produto opaco na forma de filme ou folha. Produtos de HA / polímero altamente reticulados são geralmente opacos e poderão mesmo ser brancos em cor.

Um produto de acordo com a invenção na forma de um gel poderá ser obtido pela hidratação de um filme, o qual poderá por exemplo ser preparado conforme descrito acima. Se necessário o filme poderá ser subdividido em pequenos pedaços para facilitar a absorção de água.

Para obter-se um produto de acordo com a invenção na forma de um gel opaco, os materiais iniciais de HA e do outro polímero poderão ser utilizados na forma de uma solução, filme ou folha e o processo inteiro efetuado com agitação e sem a formação de um filme em nenhum estágio.

Qualquer que seja o método de reticulação utilizado, a complementação da reação pode rotineiramente ser controlada por métodos bem conhecidos na arte, por exemplo, a reação poderá ser completada neutralizando-se uma mistura da reação e a precipitação do solvente para obter-se um produto com o grau desejado de reticulação.

O produto final poderá ser isolado do meio da reação por procedimento convencionais.

Deve ficar aqui entendido que quando é requerido um produto contendo mais do que duas reticulações diferentes, ele deve ser preparado por uma combinação apropriada de reações em seqüência ou simultâneas de reticulação conforme descrito acima.

O ácido hialurônico (HA) e o alginato podem ser reticulados através de grupos hidroxila e carboxila, resultando em ligações de reticulação de éter e éster. Poderá se verificar, portanto, que quando a reticulação é efetuada da forma etapa por etapa, a ligação de éter deve ser formada antes da ligação de éster. De preferência, uma primeira reação de reticulação é efetuada utilizando-se um reticulador de epóxido, tal como 1,2,7,8-diepóxi- octano, em condições alcalinas, seguida por uma segunda reação de reticulação com um epóxido tal, como 1,2,7,8-diepóxi-octano em condições ácidas.

Nesta realização, a reticulação pode acontecer através de grupos hidroxila e carboxila presentes em ambos os polímeros, e, portanto, o ácido hialurônico (HA) forma duas ligações funcionais diferentes (éter e éster) com o alginato. Outros polímeros aniônicos, tais como o carbóxi-metil- celulose e a goma de gelano, e outros polímeros que possuem dois grupos funcionais diferentes, podem ser reticulados duas vezes com HA de uma forma semelhante.

No caso de polímeros aniônicos contendo somente grupos carboxila, tais como o poli(ácido acrílico), se verifica que somente uma única reticulação será formada com o HA, através de uma ligação éster. Uma segunda reticulação, de acordo com a presente invenção, poderá ser formada entre duas moléculas de HA, ou entre o HA reticulado e um polímero diferente.

Em outra realização específica, o ácido hialurônico (HA) poderá ser reticulado com o polímero não-iônico de poli(álcool vinílico) (PVA). A este respeito o HA e o PVA são reticulados através de grupos hidroxila, formando uma ligação éter e o HA é ainda mais reticulado até outra molécula de HA através de grupos carboxila, formando uma ligação éster.

O ácido hialurônico (HA) e o poli(álcool vinílico) (PVA) poderão primeiramente ser misturados em solução, a qual pode ser seca para produzir um filme de HA/PVA, que não é reticulado. A reticulação poderá ser feita pelos métodos descritos acima. De preferência, a reticulação é efetuada da maneira etapa por etapa, com uma formação de uma reticulação de éter entre o HA e o PVA, seguida pela formação de uma reticulação de éster entre duas moléculas de HA.

De preferência, a ligação de éter é formada usando-se um epóxido em condições alcalinas e a ligação de éster é formada usando-se um epóxido em condições ácidas.

Vantajosamente, o epóxido é o 1,2,7,8-diepóxi-octano.

Ainda, em outra realização específica, o ácido hialurônico (HA) poderá ser reticulado com o biopolímero quitosano (CS). O quitosano é um polímero linear de anidroglucosamina. O quitosano disponível comercialmente, de fato é uma mistura com quitina, o primeiro sendo um derivado desacetilado do último. Neste relatório, o termo (quitosano) será usado para significar o quitosano puro, assim como misturas do mesmo com uma quitina. Nesta realização, o quitosano forma uma rede interpenetrante (IPN) com o HA. Assim sendo o quitosano e o HA são ligados através dos seus grupos amino e hidroxila, respectivamente, e o HA é reticulado até uma outra molécula de HA através dos grupos carboxila, formando ligações éster.

Nesta realização, um filme de HA/quitosano não-reticulado poderá ser preparado antes da primeira reação de reticulação. Se desejado, glicerol ou polietileno glicol de baixo peso molecular poderão ser incorporados no filme como um plastificante. Um filme de HA/quitosano não-reticulado poderá ser preparado misturando-se uma solução de HA com uma solução de quitosano e secando a mistura para se obter um filme. No entanto, uma mistura simples de quitosano e HA formará um precipitado devido ao complexo iônico. Verificou-se que a precipitação poderá ser evitada pela adição de cloreto de sódio ou ácido clorídrico na mistura. De preferência, é adicionado cloreto de sódio em uma concentração de IM a 2M, e o ácido clorídrico em uma concentração de 0,IM a 0,5M. Este método também pode ser utilizado para misturar o HA com outros polímeros policatiônicos e polímeros sintéticos contendo amina.

A primeira reação de reticulação entre o HA e o quitosano é, de preferência, executada no filme de HA/quitosano não-reticulado utilizando-se um epóxido em condições alcalinas e a segunda reação de reticulação para formar uma reticulação HA-HA é, de preferência, efetuada utilizando-se um epóxido em condições ácidas. O epóxido é de preferência 1, 2,7,8-diepóxi-octano.

Outros polímeros tendo somente um grupo funcional podem ser reticulados em PVA e quitosano com HA de uma forma semelhante. Neste caso, uma segunda reticulação pode ser formada entre duas moléculas de HA ou com outro polímero tendo um grupo funcional apropriado.

Em uma realização preferida, a presente invenção fornece um processo para a preparação de derivados de HA/polímeros duplamente reticulados, o referido processo compreendendo o contato de HA e de um segundo polímero com um ou mais agentes de reticulação em condições adequadas para se formar duas ligações diferentes entre as moléculas de HA e o referido segundo polímero. De preferência as reações de reticulação são efetuadas em seqüência. Assim sendo, o processo em dois estágios de acordo com a invenção é composto de:

(a) reticulação do HA com um segundo polímero através de um primeiro grupo funcional e posteriormente

(b) nova reticulação do produto de (a) através de um segundo grupo funcional, onde o referido primeiro e o segundo grupos funcionais representam entidades químicas diferentes.

Derivados reticulados de HA / polímero preparados de acordo com a invenção presente contêm pelo menos dois tipos diferentes de ligações de reticulação, por exemplo tanto ligações éter como éster.

Acredita-se que derivados de HA / polímero de múltiplas reticulações (por exemplo dupla) preparados de acordo com a invenção presente são novos. Assim sendo, em um outro aspecto a invenção presente fornece derivados de HA / polímero de múltiplas reticulações (i.e., HA reticulado para um ou mais polímeros e opcionalmente para outras moléculas de HA, através de duas ou mais ligações funcionais diferentes) obteníveis pelo processo descrito aqui anteriormente.

Em um outro aspecto a invenção presente fornece o HA reticulado para um ou mais polímeros diferentes de HA onde o HA e o referido polímero (s) são reticulados por pelo menos dois tipos diferentes de ligação. Especialmente a invenção presente fornece o HA reticulado para um segundo polímero onde o HA e o referido segundo polímero são reticulados por dois tipos diferentes de ligação.

A invenção presente também fornece o HA reticulado para um ou mais polímeros diferentes de HA onde o HA é reticulado para o referido polímero (s) e para outras moléculas de HA por pelo menos dois tipos diferentes de ligação.

Derivados de HA / polímeros duplamente reticulados de acordo com a invenção presente poderão ter um grau de reticulação na faixa de 10 a 50%, por exemplo 15 a 30, de preferência 20 a 25% (onde 100% é representado pela reticulação de todos os grupos OH na posição C6 e todos os grupos COOH na posição C5). O grau de reticulação poderá ser medido por análise elementar ou análise NMR no estado sólido. As proporções das diferentes ligações funcionais no produto variarão dependendo dos tipos de ligações funcionais presentes e das condições de reação utilizadas para formar os mesmos. Para um produto duplamente reticulado contendo ligações éter e éster a relação destas ligações poderá variar de 50:50 a 95:5, por exemplo 60:40 a 80:20 de ligações éter:éster.

Em geral um produto de acordo com a invenção presente tem um grau maior de reticulação, isto quer dizer, uma rede mais densa de reticulações do que um derivado de HA / polímero de reticulação única. Verificou-se que um alto grau de reticulação reduz a capacidade de absorção de água do HA reticulado, resultando em uma estabilidade maior em solução aquosa. Adicionalmente verificou-se que o HA reticulado apresenta uma estabilidade maior contra a degradação por hialuronidase, e contra a degradação devida aos radicais livres, indicando uma bioestabilidade aumentada. Conforme indicado acima a bioestabilidade do produto final irá depender, em parte, da natureza dos outros polímeros aos quais o HA é reticulado. O segundo e qualquer outro polímero subseqüente deverá portanto ser escolhido de acordo com as propriedades desejadas, e isto dependerá da capacidade do trabalhador adestrado.

Um produto opaco de acordo com a invenção presente geralmente tem um grau mais elevado de reticulação e portanto menor capacidade de absorção de água e maior estabilidade, do que um produto claro. Tais produtos são adequados para implantação a longo prazo. Um produto claro, por exemplo um filme claro, de acordo com a invenção presente tem uma capacidade de absorção de água maior do que um produto opaco, mas no entanto não é solúvel em água, e tais produtos são especialmente adequados para implantes dérmicos, para a cura de ferimentos (absorção do exsudado) e aplicações reabsorventes de curto prazo.

O processo de etapas múltiplas descrito acima é preferido quando é desejado um produto altamente reticulado com baixa capacidade de absorção de água. A reticulação simultânea resulta geralmente em um produto insolúvel em água, mas com uma capacidade de absorção de água maior do que um produto preparado utilizando-se um processo de múltiplos estágios (por exemplo dois estágios) em condições semelhantes de reticulação.

Além disso verificou-se que utilizando-se um primeiro HA / polímero reticulado como material inicial para a segunda etapa de reticulação é produzido um produto (o qual poderá ser na forma de filme ou poderá ser convertido em um gel) com capacidade de absorção de água menor do que um produto de HA / polímero duplamente reticulado preparado a partir de uma solução de HA / polímero em condições semelhantes de reticulação (i.e. sem nenhuma formação de filme intermediário). Na realidade verificou-se que a capacidade de absorção de água nos produtos resultantes pode variar de 400% a 1000% para materiais iniciais em filme e gel respectivamente.

Os derivados reticulados de acordo com a invenção presente poderão ser usados em uma variedade de aplicações farmacêuticas, médicas (incluindo cirúrgicas) e cosméticas.

Assim sendo, eles por exemplo poderão ser úteis na cura de ferimentos, por exemplo, como uma cobertura dérmica de um ferimento.

Eles poderão também ser úteis evitando aderências, por exemplo evitando o crescimento de tecido entre órgãos após uma cirurgia.

Derivados de HA reticulados de acordo com a invenção presente poderão também ser aplicados no campo oftalmológico por exemplo para a substituição de fluido vítreo, como escudo da córnea para a administração de drogas nos olhos ou como lentes.

Derivados reticulados de HA de acordo com a invenção presente poderão também ser úteis em cirurgia, por exemplo como implantes sólidos para o aumento de tecido rígido, por exemplo reparo ou substituição de cartilagem ou de osso, ou para o aumento de tecido macio, como o implante no seio, ou como revestimento para implantes de uso a longo prazo no corpo, como implantes no seio, catéteres, cânulas, próteses de ossos, substituição de cartilagens, mini bombas e outros modos de administração de drogas, órgãos artificiais e vasos do sangue, malhas para o reforço de tecidos, etc. Eles poderão também ser utilizados como lubrificantes de juntas no tratamento de artrite.

Um outro uso para derivados da invenção presente é na administração de agentes terapeuticamente ativos incluídos em qualquer das aplicações anteriormente mencionadas. Agentes terapeuticamente ativos poderão ser agentes quimioterapêuticos ou fatores biologicamente ativos (por exemplo citoquinas) e incluem agentes antiinflamatórios, antibióticos, analgésicos, anestésicos, promotores de cura de ferimentos, agentes cistostáticos, imunoestimulantes, imunossupressivos e antivirais.

Os fatores terapeuticamente ativos poderão ser limitados, fisicamente ou quimicamente, ao derivado de HA reticulado por métodos bem conhecidos na arte.

Os derivados reticulados de HA poderão ser usados com uma variedade de formas incluindo membranas, esferas, esponjas, tubos, folhas e implantes formatados.

A invenção será agora mais ilustrada pelos seguintes exemplos não limitantes.

Os seguintes procedimentos foram utilizados para medir-se a estabilidade dos produtos. Metodologia

Avaliação da capacidade de absorção de água

20 mg (Wd) de cada uma das amostras reticuladas secas foram imersas em uma solução tampão formulada de PBS durante 24 horas para formar um gel totalmente inchado. O gel úmido foi filtrado e a água residual na superfície foi removida utilizando-se papel absorvente. O gel úmido foi pesado para fornecer o Ws. Assim sendo a capacidade de absorção de água (WAC) (%) pode ser calculada de acordo com a seguinte fórmula:

WAC (%) = (Ws-Wd) /Wd χ 100 Resistência à digestão hialuronidase

20 mg de HA reticulado foram colocadas em suspensão em 6 ml de solução tampão de PBS (pH igual a 7,2) contendo 1000 U de hialuronidases e incubadas a 37°C por 24 horas.

Depois disso, o filme foi removido e lavado utilizando-se solução tampão de PBS e toda a solução de lavagem foi recolhida para obter- se um total de 10 ml de solução. Esta solução foi fervida por 30 minutos para provocar a precipitação de hialuronidase. A solução foi então centrifugada a 4000 rpm /10 minutos. A solução sobrenadante foi ajustada para 25 ml utilizando-se solução de PBS em um frasco volumétrico. A concentração de HA foi medida usando-se um teste de Carbazola.

A perda de peso de HA devida à digestão de hialuronidase pode ser calculada usando-se a seguinte fórmula:

Perda de peso de HA (% )= [HA] χ 25 / [HA J0 χ 100 na qual, [HA] é a concentração de HA, [HA]0 é o teor original de HA (mg). Resistência à radicais livres

Agentes de Ferton foram usados para criar radicais livres, os quais foram formados por 25 microlitros de ácido ascórbico 0,1 e 0,25 microlitros de H2O2 0,1 M em 5 ml de solução de PBS. 20 mg da amostra foram adicionadas a esta solução. O tempo de digestão foi 24 horas a 37 ° C. Depois disto, o filme ou gel foi removido e lavado utilizando-se a solução tampão de PBS e toda a solução de rinsagem foi recolhida para obter-se um total de 25 ml utilizando-se solução de PBS em um frasco volumétrico. A concentração de HA foi medida utilizando-se um ensaio de Carbazola. A perda de HA foi calculada usando-se a mesma fórmula que para a digestão de hialuronidase.

Exemplo 1

Preparação de HA / PVA reticulado

Soluções aquosas a 1% de HA e 5% de PVA foram preparadas respectivamente e misturadas para produzir uma solução homogênea de HA / PVA com composição variada de HA (ver tabela 1). A solução foi formatada em um prato petri e seca por quatro dias para obter-se um filme.

O filme resultante foi colocado em suspensão em uma mistura de solvente de CHCl3 / solução ácida ou alcalina / reticulador de 1,2, 7, 8- diepoxioctano ou de glutaraldeído. A reação de reticulação foi efetuada na temperatura ambiente por um tempo fixo (24 horas).

Uma quantidade adicional de agente de reticulação foi adicionada, e se necessário o pH foi ajustado, e a mistura foi deixada em repouso na temperatura ambiente por outras 24 horas, para efetuar a segunda reação de reticulação. As condições detalhadas de reticulação são mostradas na tabela 1. Depois da reticulação, as amostras foram lavadas com IPA e acetona por três vezes, imersas em IPA / água deionizada (60 / 40) durante a noite e então lavadas com acetona e secas em um forno a 37°C para obter-se um peso constante. Tabela I: Formação de PVA-HA reticulado (CPH)

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E = 1,2,7,8-diepóxi-octano

G = glutaraldeído

H+ representa um pH em torno de 4

OH- representa um pH em torno de 10

CPH-1, CPH-5, CPH-9, CPH-10, CPH-11+12 foram todos preparados utilizando-se uma só etapa de reticulação para fins comparativos.

Tabela 2: Bioestabilidade de H/PVA reticulado em relação à digestão hialuronidase.

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Exemplo 2

Preparação de derivados de HA/quitosano (CS)

Um filme de HA/CS/glicerol foi preparado com percentagens diferentes de HA. O reticulador poderia ser adicionado antes da moldagem ou depois da moldagem. Neste exemplo, o filme de HA/CS/glicerol seco foi utilizado para a reticulação. Tipicamente, como um exemplo, uma folha inteira de HA/CS 920% de HA) (200 mg) foi colocada em suspensão em um recipiente com 40 mililitros de acetona/NaOH (pH= 12) para ser encharcada por 1 hora, e depois 0,4 ml de 1,2,7,8-diepóxi-octano foi adicionado no meio reacional para uma reação durante 24 horas, na temperatura ambiente.

Depois desta reação, o pH foi ajustado até um pH = 4 - 5 e 0,4 ml adicional (dependendo da concentração de HA) de 1,2,7,8-diepóxi-octano foi adicionado para prosseguir a segunda esterificação por mais 24 horas. Depois da purificação, foi possível verificar que o filme de HA/CS formado é mais resistente e mais flexível no estado seco do que a amostra sem glicerol. Ele é transparente, sem cor (em alguns casos tem uma cor ligeiramente amarela, dependendo da condição de reticulação) e tem alta absorção de água.

O PEG de baixo peso molecular poderia ser utilizado como uma alternativa para o glicerol.

Exemplo 3

Preparação de HA/CS reticulado com 20% de HA em peso (filme)

Dois (2,0) ml de HA (1% em uma formulação de solução tampão de PBS) e 8,0 ml de CS (1% em solução de HCl a 0,1M) foram preparados, respectivamente, e misturados para produzir uma solução homogênea de HA/CS. A solução foi moldada em uma placa petri e seca na temperatura ambiente, por uma semana, para produzir um filme seco. O filme seco foi colocado em um vaso com 10 mililitros de solução aquosa de NaOH a ΙΝ/acetona misturadas (30/70). Uma quantidade de 0,2 ml de 1,2,7,8- diepóxi-octano foi adicionada à reação por 24 horas, na temperatura ambiente. Depois da primeira reticulação, 0,5 ml adicional de HCl a IN foi adicionado para manter o pH abaixo de 4. Mais 0,2 ml de 1,2,7,8-diepóxi-octano foi adicionado para reagir por mais 24 horas, na temperatura ambiente. O filme foi removido e lavado utilizando-se 3/1 de acetona/água destilada, três vezes e 3/1 de i-propanol (IPA)/água destilada, mais três vezes, e armazenado em uma solução de formulação de PBS.

Exemplo 4

Preparação de HA/CS reticulado com 30% de HA em peso (na forma de gel) A amostra seca de HA foi dissolvida em uma solução de NaCl a 1,25M, para produzir uma solução a 1% de HA/NaCl. Cinco (5,0) ml de uma solução de HA foram misturados com 5,0 ml de solução de CS (1% em HCl a 0,1M) para produzir uma mistura homogênea. Uma quantidade de 0,2 ml de glutaraldeído e 0,2 ml de 1,2,7,8-diepóxi-octano foram adicionados simultaneamente para reagir durante 2,5 horas, a 40°C.

O gel formado foi lavado utilizando-se 3/1 de acetona/água destilada, três vezes, e IPA/água destilada (3/1) três vezes, e foi guardado em uma solução de formulação de PBS.

Exemplo 5

Preparação de HA/CS reticulado com 50% de HA em peso (filme) Uma amostra sólida de HA seca foi dissolvida em uma solução de HCl a 0,1 M para produzir uma solução a 1% de HA/HC1. Cinco (5,0) ml desta solução de HA foram misturados com 5,0 ml de CS (1% em HCl a 0,1M) para produzir uma mistura homogênea. A solução foi moldada e seca na temperatura ambiente, por uma semana, para produzir um filme seco. O filme foi reticulado de acordo com o mesmo procedimento descrito no exemplo 4. Assim sendo, foi obtido um filme de biomatriz de HA/CS contendo 50% de HA (baseado na relação de alimentação).

Exemplo 6

Preparação de HA/CS reticulado com 60% de HA em peso (filme) Seis (6,0) ml de solução a 1% de HA/NaCl a 1,25M foram misturados com 4,0 ml de CS a 1% (em solução de HCl a 0,1 MO para produzir uma solução homogênea. A solução foi moldada e seca durante uma semana na temperatura ambiente para produzir um filme seco, no qual o NaCl serve como um indutor microporoso. O filme foi colocado em um vaso e 10 ml de NaOH a lN/acetona (30/70) foram adicionados para colocar o filme em suspensão. O processo de reticulação foi executado de acordo com o mesmo procedimento descrito no exemplo 4.

Finalmente, um filme com uma superfície estruturada porosa foi obtido.

Exemplo 7

Preparação de HA/CS reticulado com 80% de HA em peso (filme)

Uma amostra sólida e seca de HA foi dissolvida em solução de HCl a 2,OM para produzir uma solução a 1% de HA/HC1. Oito (8,0) ml desta solução de HA foram misturados com 2,0 ml de CS (1% em HCl a 0,1M) para produzir uma mistura homogênea. A solução foi moldada e seca na temperatura ambiente, durante uma semana, para produzir um filme seco.

O filme foi colocado em um frasco com uma rolha e 10 ml de HCl a 0,1 N/acetona (3/7 em volume) foram adicionados para colocar o filme em suspensão. Depois, uma mistura de 0,2 ml de glutaraldeído e 0,2 ml de 1,2,7,8-diepóxi-octano foi adicionada para reagir por 6 horas na temperatura ambiente. O filme foi purificado de acordo com o mesmo procedimento descrito no exemplo 4.

Exemplo 8

Teste de estabilidade de HA/CS reticulado com proporções diferentes de HA em peso

Uma série de filmes de HA/CS reticulados com relações de alimentação de HA variando de 20%, 30%, 40%, 50% a 60% foi preparada de acordo com a metodologia descrita no exemplo 6, para se obter as amostras CCH-5, 6, 7, 8 e 9. As amostras foram mergulhadas em uma solução de formulação de PBS durante a noite e os filmes úmidos foram pesados como um peso original (W0). Depois de estocados em solução de PBS durante duas semas, os filmes foram removidos e o excesso de água superficial foi cuidadosamente removido utilizando-se papel absorvente, e eles foram pesados outra vez para se obter o peso remanescente (Wr).

Assim sendo, a percentagem do peso remanescente pode ser calculada da seguinte fórmula:

Peso remanescente (%) = Wr/W0 χ 100% Os resultados estão mostrados na Tabela 4. Tabela 3: Comparação de quitosano de reticulação única e de reticulação

dupla (CS)ZHA (CCH)

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E: 1,2, 7, 8-diepóxi-octano; relação de alimentação de (HA + CS)/epóxido = 1/2 para cada estágio OH -: pH=12 ; H+: pH =4.

Tabela 4: Estabilidade de HA/CS (CCH) duplamente reticulado

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Claims (24)

1. Processo para a preparação de derivados multiplamente reticulados do ácido hialurônico (HA), caracterizado pelo fato de compreender a reticulação covalente de HA com um ou mais polímeros diferentes de HA, e opcionalmente com outra molécula de HA através de dois ou mais grupos funcionais diferentes, onde a referida reticulação é realizada pelo contato do HA com um outro polímero que não o HA com um ou mais agentes químicos de reticulação, de modo a formar duas ou mais reticulações quimicamente distintas entre o HA e o referido polímero, sendo que a dita reticulação é efetuada por intermédio de duas ou mais ligações diferentes escolhidas dentre ligações de éter, éster, sulfona, amina, imino e amida.

2. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o referido polímero é escolhido dentre um biopolímero du um polímero sintético.

3. Processo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o referido polímero sintético é escolhido dentre poli(álcool vinílico) (PVA), poli(óxido de etileno) (PEO), e poli(óxido de propileno) (PPO), assim como copolímeros de qualquer um destes polímeros, e de poli(ácido acrílico), poliacrilamida e outros polímeros sintéticos de hidroxila, carboxila e hidrófilos.

4. Processo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o referido biopolímero é escolhido dentre polipeptídeos, celulose e seus derivados, como hidróxi-etil-celulose e carbóxi- metil-celulose, alginato, quitosano, lipídios, dextrano, amido, goma de gelano e outros polissacarídeos.

5. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que os grupos funcionais são escolhidos dentre hidroxila, carboxila e amino.

6. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o agente de reticulação é escolhido dentre formaldeído, glutaraldeído, divinil-sulfona, um polianidrido, um polialdeído, um álcool poli-hídrico, carbodi-imida, epicloridrina, etileno glicol, butanodiol-diglicidil-éter, diglicidil-éter, poliglicerol-poliglicidil- éter, polietileno glicol diglicidil-éter, polipropileno glicol-diglicidil-éter, ou um reticulador bis- ou poli-epóxi.

7. Processo de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 6, caracterizado pelo fato de que uma ligação de éter é formada utilizando-se um agente de reticulação escolhido dentre bis- e poli- epóxidos em condições alcalinas.

8. Processo de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 6, caracterizado pelo fato de que uma ligação de éster é formada utilizando-se um agente de reticulação escolhido dentre bis- e poli- epóxidos em condições ácidas.

9. Processo de acordo com a reivindicação 8 ou 9, carac- terizado pelo fato de que o reticulador é escolhido dentre o 1,2,3,4- diepóxi-butano e o 1,2,7,8-diepóxi-octano.

10. Processo de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 6, caracterizado pelo fato de que uma ligação éter é formada utili- zando-se um agente de reticulação de glutaraldeído em condições ácidas.

11. Processo de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 10, caracterizado pelo fato de que a reticulação de cada tipo de grupo funcional é efetuada em seqüência.

12. Processo de acordo com a reivindicação 11, caracteri- zado pelo fato de que compreende a reticulação de HA em um polímero diferente de HA através de um primeiro grupo funcional, e, posterior- mente, a reticulação adicional do produto através de um segundo grupo funcional, em que os referidos primeiro e segundo grupos funcionais re- presentam entidades químicas diferentes.

13. Processo de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o HA é, primeiramente, reticulado a um polímero diferente de HA através de grupos hidroxila, pela formação de ligações éter e subseqüentemente reticulado no referido polímero ou em outra molécula de HA através de grupos carboxila pela formação de ligações éster.

14. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6 ou 8 a 10, caracterizado pelo fato de que a reticulação de cada tipo de grupo funcional é efetuada simultaneamente.

15. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado pelo fato de ser para a preparação de HA duplamente reticulado.

16. Processo de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de compreender: (a) a reticulação de HA com um segundo polímero através de um primeiro grupo funcional, e, subseqüentemente, (b) uma nova reticulação do produto de (a) através de um segundo grupo funcional, em que os referidos primeiro e segundo grupos funcionais representam entidades químicas diferentes.

17. Acido hialurônico multiplamente reticulado, caracterizado pelo fato de ser obtido por um processo definido de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16.

18. Ácido hialurônico reticulado em um ou mais polímeros diferentes de ácido hialurônico, caracterizado pelo fato de que o ácido hialurônico e o(s) referido(s) polímero(s) é(são) reticulado(s) por pelo menos dois tipos diferentes de ligação funcional.

19. Acido hialurônico reticulado em um segundo polímero, caracterizado pelo fato de que o ácido hialurônico e o referido segundo polímero são reticulados por dois tipos diferentes de ligação funcional.

20. Ácido hialurônico reticulado em um polímero diferente de ácido hialurônico, caracterizado pelo fato de que o ácido hialurônico é reticulado no referido polímero e em outra molécula de ácido hialurônico por pelo menos dois tipos diferentes de ligação funcional.

21. Acido hialurônico multiplamente reticulado de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 20, caracterizado pelo fato de estar na forma de um filme.

22. Acido hialurônico multiplamente reticulado de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 20, caracterizado pelo fato de estar na forma de um gel.

23. Produto, caracterizado pelo fato de compreender HA multiplamente reticulado definido de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 22.

24. Uso de um derivado de ácido hialurônico multiplamente reticulado de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 22, caracterizado pelo fato de ser na preparação de um produto para uso farmacêutico, medicinal ou cosmético.