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Die
kovalente Verbindung mit Kolloiden ermöglicht es Stoffe
durch Phagozytose in Zellen des Immunsystems einzubringen, welche
ohne diese Modifikation nicht bzw. nur verschwindend gering aufgenommen
werden würden. In
EP
1230935 A1 wird die chemische Bindung von arzneilich wirksamen
Stoffen an ein Polysaccharid unter Ausbildung eines Linkers dargestellt.
Die Aufnahme von Stoffen durch darauf spezialisierte Zellen des
Retikulohistiozytären Systems ist für eine Vielzahl
von Kolloiden und Partikeln belegt. Die Einbringung von größeren
Molekülen in nicht auf die Phagozytose spezialisierte Zellen
des Körpers stellt jedoch ein Problem dar.
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Darüber
hinaus werden durch Makrophagen phagozytierte Partikel und Kolloide
nach Aufnahme in die Zelle sehr schnell in Lysosomen aufgenommen und
dort durch eine Vielzahl lytischer Enzyme abgebaut. Das enzymatische
Potential von Lysosomen ist hoch; eine Vielzahl von Arzneistoffen
wird durch lysosomale Enzyme entsprechend schnell abgebaut. Von Chlamydia
trachomatis ist bekannt, daß das Bakterium durch eukariotische
Epithel-Zellen aufgenommen wird ohne in den Lysosomen enzymatisch
abgebaut zu werden. Diese Aufnahme kann durch die Anwesenheit von
Heparinen bzw Heparinsulfat signifikant vermindert werden.
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Stephens
et al. zeigen, daß diesem Effekt eine Blockade
der Heparin-Bindungsdomäne zugrunde liegt. Im Gegenzug
zeigen die Autoren, daß Polystyren-Mikrosphären
nach Beschichtung mit Heparin durch Endozytose in eukaryotische
Zellen aufgenommen werden. Heparin selbst bindet an eine Vielzahl
von Enzymen. Patienten mit einer erhöhten Superoxiddismutaseaktivität
im Blutserum weisen häufig eine mutierte Variante des Enzyms
auf (CHU et al.) Die mutierte Variante (R213G)
besitzt auf der Position 213 statt der Aminosäure Arginin
ein Glycin.
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Deshalb
ist die Anbindung des Enzyms an Heparin nicht möglich.
Die betroffenen Patienten weisen deshalb eine erhöhte Aktivität
für das Enzym auf, weil das Enzym vermehrt im Serum und
nicht in der Zelle vorliegt. Für Träger dieses
Gendefektes bedeutet das ein 2,3fach erhöhtes Risiko für
das Auftreten ischämischer Herzerkrankungen.
EP 083 768 B1 beschreibt
direkte Heparin-Protein Konjugate bei denen die terminale Aldose
des Heparins an die N-terminale Aminogruppe eines Serpins gebunden
ist, um den Effekt von Serpinen auf die Blutgerinnung und auf Atemnotsyndrome
zu verstärken. Nach Kopplung an Heparine werden Proteine
und Enzyme sehr schnell aus dem Serum eliminiert. Kleine Eiweiße
unter 70 kDalton verschwinden schon während der ersten Nierenpassage
fast vollständig.
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Darüberhinaus
sind für eine ganze Reihe von Proteinen Probleme bezüglich
der Stabilität und Löslichkeit bekannt, die durch
die kovalente Bindung an ein wasserlösliches Polysaccharid
günstig beeinflußt werden können.
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Heparin
gehört zur Gruppe der Glucosaminoglykane, welche aus linearen
Ketten sulfatierter Disaccharideinheiten bestehen. Jede Disaccharideinheit
besteht aus je einer Hexuronsäure die wechselnd aus Glucuron-
oder Iduronsäure und einer 2 Amino-2-desoxy-D-glucose bzw.
N-sulfo-D-glucosamin zusammengesetzt ist. Wie Polysaccharide weisen
Heparin und Glucosaminoglucane am terminalen Ende eine freie Aldehydgruppe
auf. Heparin kommt intrazellulär fast ausschließlich
in Mastzellen vor. Höher sulfatierte Heparine-Heparinsulfate-
werden jedoch organübergreifend fast überall auf
den Zellmembranen höherer Säuger gefunden.
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Die
gerinnungshemmende Wirkung des Heparins beruht in erster Linie auf
seiner Affinität zu dem Serin-Protease-Inhibitor Antithrombin
III. Die kleinste Heparineinheit, die diese Wirkung auf ATIII besitzt,
umfaßt 5 Saccharideinheiten mit einer 3-O-Sulfatgruppe
an der Glucosamingruppe. Dieses Pentasaccharid kann einen Heparin
ATIII Komplex bilden, der den Gerinnungsfaktor Xa hemmt. Auch Thrombin
kann durch die Bindung an spezifische Heparin-Strukturen inhibiert
werden, die jedoch auf einem nur 5 Saccharideinheiten aufweisenden
Pentasaccharid nicht vorhanden sind. Für die Hemmung von
Thrombin sind Heparinverbindungan mit mindestens 18 Saccharideinheiten
notwendig.
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Molekülgröße
und Sulfatierungsgrad haben nicht nur bei der selektiven Wirkung
des Heparins auf Gerinnungsfaktoren entscheidende Bedeutung, sondern
auch bei den Wechselwirkung mit einer Vielzahl körperlicher
Cytokine und Wachstumsfaktoren. Eine Wechselwirkung von Heparin
mit dem Fibroblast-Growth-Factor (FGF) setzt eine Mindestanzahl von
18 Glucosaminoglucan-einheiten mit einer spezifischen Sulfatierung
des an C2 befindlichen Sauerstoffatoms voraus. Sulfatierte Heparine
ab 8 Saccharideinheiten zeigen einen inhibitorischen Effekt auf die
Angiogenese. Für diese sulfatierten Octasaccharide wird
eine Behinderung der Gefäßeinsprossung in Tumorzellen
diskutiert. Gleichzeitig scheinen diese Heparine keinen Effekt auf
die Blutgerinnung zu haben. Molekülgröße
und chemische Eigenschaften wie Anzahl und Lokalisation der Sulfat-,
Carboxyl- und Aminogruppen haben entscheidenden Einfluß auf
die Wirkung von Heparinen. Die Sulfatgruppen und in 2. Linie die Carboxylgruppen
der Iduron- oder Glucurongruppen bewirken, daß Heparin
eines der am stärksten elektronegativ geladenen Moleküle
in Säugetieren ist. Die Molekülgröße
sowie Menge und Position der Sulfat- und Carboxylgruppen erzeugen dabei
ein spezifisches Ladungsmuster bzw. eine spezifische Ladungsverteilung
der Heparinmoleküle. Die spezifische Ladungsverteilung
spielt eine entscheidende Rolle bei der Affinität der Verbindungen
sowohl an gerinnungsaktive Eiweiße und Proteasen, als auch
an die Heparin-Bindungsdomänen von Endothelzellen. Die
an Zellmembranen wirkende transportvermittelnde Funktion der Heparine
ist noch stärker von der Ladungsstruktur des Glucosaminoglucans
abhängig. Deshalb unterscheidet sich der kovalente Einbau
von Heparinen in wasserlösliche Polysaccharide als Transportvermittler
wesentlich vom Einbau der arzneilich wirksamen Stoffe. Das Heparin muß dergestalt
an das Polysaccharid gekoppelt werden, dass eine Bindungsstelle
mit einer definierten Anzahl von Disaccharideinheiten und Ladungen
stereoselektiv an die Heparin-Bindungsdomäne der Zellen
passt. Das bedeutet, daß dieser Abschnitt des Heparins
chemisch ungebunden und darüberhinaus vom restlichen Molekül
sterisch unbehindert bleiben muss. Wie bei der spezifischen Wirkung
des Heparins auf ATIII und Thrombin kommt auch hier der Kettenlänge
und Anzahl der von dem Polysaccharid frei abstehenden sulfatierten
Hexuronsäure und Aminodesoxglucose eine große
Bedeutung zu. Darüberhinaus gibt es Hinweise darauf, daß sich
die für die Heparin-Bindungsdomänen relevanten
Abschnitte des Heparinmoleküls eher in der Mitte des Heparinmoleküls
befinden. Der zur beschriebenen Anlagerung an die Bindungsdomänen
genutzte Teil des Moleküls ist aufgrund der Carboxyl- und
Sulfatgruppen stark elektronegativ geladen. Die Blockade bzw. Störung
dieses stereospezifisch relevanten Ladungsmusters durch die kovalente
Verbindung mit dem Polysaccharid mittels eines Linkers muß für
diese Stellen unterbunden werden.
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Heparin
weist als streng lineares Glucosaminoglucan zur Bindung an andere
Moleküle nutzbare funktionelle Gruppen auf. Im Bereich
der Iduron- und Glucuronsäure liegen Carboxylgruppen an
C6 vor. An C2 und C3 und C1 der ersten Saccharideinheit befinden
sich Hydroxylgruppen. Jede 2. Saccharidgruppe trägt am
C2-Atom eine Aminogruppe. Diese Aminogruppe und die Carboxylgruppe
können sulfatiert sein. Schließlich trägt
Heparin am terminalen Ende eine Aldehydgruppe.
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Das
mit Arzneistoffen kovalent verbundene Polysaccharid ist besonders
ausgewählt aus der Gruppe Hydroxy-alkyl-Stärke.
Die Hydroxyalkylgruppen sind zur Behinderung des enzymatischen Abbaus
des Polysaccharids im Serum und zur Verbesserung der Wasserlöslichkeit
in das Molekül eingeführt worden. Der Substitutionsgrad
DS ist definiert als Verhältnis der Gesamtzahl der substituierten
Monomereinheiten zur Gesamtzahl der Monomereinheiten. Die molare
Substitution MS ist definiert als Verhältnis der Gesamtzahl
der Substituenten zur Gesamtzahl der Monomereinheiten. Im folgenden
wird bei der Einführung von Substituenten ein Substitutionsgrad
DS angegeben.
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Der
stereoselektiven Substitution kommt bei einer niedrigen Anzahl von
Disaccarideinheiten eine größere Bedeutung zu
als bei größeren Heparinmolekülen. Bei
Heparinen mit einer kleineren Anzahl von Disaccharideinheiten steht
nur ein kleiner Abschnitt von spezifisch geladenen Disaccharideinheiten
zur Bindung an die Heparin-Bindungsdomäne zur Verfügung.
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Es
ist bekannt, daß Punktmutationen einiger Proteine codierender
Gene zu einem Austausch von Diamino-mono-carbonsäuren durch
andere Aminosäuren führen. Bei einigen dieser
Fälle (Superoxiddismutase) geht diese Veränderung
der Aminosäuresequenz mit dem Verlust der Fähigkeit
zur Bindung an Heparinsulfate einher, wodurch die Protein nicht mehr
in die Zelle transportiert wird. Auch diese Befunde belegen, daß die
Einbindung von Heparinen in Makromoleküle als Transportvermittler,
also zum Zweck der Regulation des Durchtritts durch Zellmembranen
seitens des Makromoleküls an regioselektive Bedingungen
geknüpft ist. Der Verlust von nicht durch Peptidbindungen
gebundenen Aminogruppen bedeutet hier den Verlust der Fähigkeit
der Einbindung des Transportvermittlers Heparin. Mit der unspezifischen
kovalenten Bindung an Heparin wird in der Medizintechnik häufig
versucht die Bildung von Blutgerinnseln an Implantaten zu unterbinden.
In
CA 2362233 wird die
Verbindung eines anderen Glucosaminoglucans, der Hyaluronsaure mit
Chitosan und Alginaten offenbart. Als Linker kommen dabei bifunktionale
Diepoxyalkanverbindungen zur Anwendung. Bei den in
CA 2362233 dargestellten Verkmüpfungsprodukten
handelt es sich um hochvernetzte Hydro-Gele und Filme, die weder
zur Infusion in den menschlichen oder tierischen Körper
noch zur Aufnahme in Zellen geeignet sind. Transportvermittelnde Funktionen
sind durch eine mehrfache Quervernetzung aller Bestandteile von
vornherein unmöglich.
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Beschreibung der Erfindung
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Für
die erfindungsgemäße Einbringung von arzneilich
wirksamen Stoffen in spezifische Organe und Zellsysteme des Körpers
müssen die folgenden Bedingungen erfüllt sein:
- 1. Die Aufnahme der Arzneistoff-Polysaccharid-verbindung
erfolgt auch in Zellen, die nicht auf Phagozytose spezialisiert
sind.
- 2. Nach dem Durchtritt durch die äußere Zellmembran
soll die Arzneistoff-Polysaccharidverbindung nicht in Lysosomen
aufgenommen, und nicht enzymatisch abgebaut werden.
- 3. Der Arzneistoff soll mit einem wasserlöslichen Polysaccharid
chemisch verbunden sein, wobei die Arzneistoff-Polysaccharidverbindung
im Blut gelöst bleibt und und hinreichend lange im Blut zirkuliert.
- 4. Die Arzneistoff-Polysaccharidverbindung soll keinen Einfluß auf
die Blutgerinnung haben.
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Die
Probleme werden gelöst durch die erfindungsgemäße
Modifikation des den arzneilich wirksamen Stoff tragenden Polysaccharids.
Das zur Aufnahme in Zellen modifizierte Polysaccharid wird dargestellt
durch:
- A. Die ladungsabhängige Immobilisation
des Heparin im Bereich des zur Bindung an die Heparin-Bindungsdomäne
vorgesehenen Ladungsmusters.
- B. Durch geeignete chemische Modifikation des Polysaccharids
durch Einführung zusätzlicher funktioneller Gruppen,
die zur Einbindung des Heparins unter Ausbildung spezifischer Linker
geeignet sind.
- C. Durch die regio- und stereoselektive chemische Verbindung
mit dem Transprotvermittler Heparin.
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Der
zur Assoziation an die Heparin-Bindungsdomäne vorgesehene
Teil des Heparinmoleküls wird erfindungsgemäß an
nanostrukturierte positiv geladene Körper angelagert und
von der kovalenten Einbindung in das Hydroxy-alkyl-Stärke
und/oder Carboxy-alkyl-Stärke Molekül freigehalten.
In einem einfachen Beispiel der Erfindung wird eine Kupferplatte
mit einem Isolator beschichtet und mit einem Laser an ausgewählten
Stellen von der Isolatorschicht befreit. Besonders vorteilhaft können
die Ladungsstrukturen der Heparin-Bindungsdomänen durch
Rasterelektronenmikroskopie erfaßt und entsprechende Ladungsmuster
zur Immobilisation der Heparinmoleküle in die Isolatorschicht
gebrannt werden. Auch kann die Rasterelektronenmikroskopie zur Einbringung
geeigneter Ladungsmuster in die Isolatorschicht des Anlagerungskörpers
genutzt werden. Dem Fachmann sind entsprechende Anwendungen der
Lasertechnik bekannt. Die Immobilisation der entsprechenden Heparin-Domänen
kann auch direkt an anderen positiv geladenen Molekülen
erfolgen. Besonders geeignet sind hierfür stark positiv
geladene Polymere, die unter den Reaktionsbedingungen der erfindungsgemäßen
Synthesen als Film und Polykation vorliegen. Bei Linkem, die unter
alkalischen Reaktionsbedingungen reagieren liegt beispielsweise
Chitosan als Polykation vor, an das Heparin sich gut anlagert. Hier
ist zu beachten, dass bei der kovalenten Bindung des Heparins an
das Polysaccharid keine Verbindung zwischen einer funktionellen
Gruppe des Chitosans mit dem Polysaccharid erfolgen soll sondern
nur zwischen dem Polysaccharid und dem immobilisierten Heparin.
In diesem Fall wird eine Verbindung zwischen zusätzlich
in das Polysaccarid eingeführten Carboxylgruppen und den
Carboxylgruppen des Glucoronsäure- bzw. Iduronsäureanhydrids des
Heparins geknüpft.
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Für
die sowohl bei dem Polysaccharid als in Heparinen vorhandenen Hydroxylgruppen
kommen Linker zur Verwendung, die ausgesucht sind aus,
Isocyanat-(-NCO)
Carboxyl-(-COOH)
Carbonsäurehalogenid-(-C(O)Cl),
-C(O)Br, und/oder C(O)I),
Carboxyalkylen-(-(CH2)4-COOH, mit q = 1 bis 10
Ester-Gruppen-(-COOAlk,
wobei Alk eine Alkylgruppe mit ein bis sieben Kohlenstoffatomen
ist).
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Wenn
bifunktionelle und trifunktionelle Moleküle zur Bildung
von Linkern verwendet werden, die identische oder unterschiedliche
funktionelle Gruppen aufweisen, die beide mit den funktionellen
Gruppen des Heparins als auch mit den funktionellen Gruppen des
Polysaccharids reagieren, kann es zur unerwünschten Verbindung
der Heparinmoleküle und Polysaccharidmoleküle
untereinander (Vernetzung) kommen. Diese Reaktionsprodukte konkurieren
mit den erwünschten Verbindungen zwischen Heparinen und
Polysaccharid. Deshalb sind besonders geeignet: Bipolyfunktionelle
Moleküle mit unterschiedlichen funktionellen Gruppen, die
einerseits mit einer funktionellen Gruppe reagieren die nur auf dem
Heparin, andererseits mit einer funktionellen Gruppe reagieren die
nur dem Polysaccharid vorhanden ist.
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Dieses
setzt in der Regel eine entsprechende chemische Veränderungen
auf der Seite Polysaccharids, seltener des Heparins voraus. Die
Ausbeute an den erfindungsgemäßen Kopplungsprodukten kann
durch die Immobilisation des Heparins an geeignete Anlagerungskörper
deutlich erhoht werden.
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Die
bifunktionelle Moleküle zur Ausbildung von Linkern sind
ausgesucht aus gesättigten oder ungesättigten,
aliphatischen oder alicyclischen Kohlenwasserstoffresten mit 1 bis
22 Kohlenstoffatomen; Aryl-, Aryl-C1-C4-Alkyl- und Aryl-C2-C6-Alkenylgruppen,
Heteroaryl- und Heteroaryl-Alkenylgruppen mit 4-8 Kohlenstoffatomen
im Heteroarylrest mit einem oder zwei Heteroatomen ausgewählt
aus N, O und S.
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Für
die bei Heparinen vorhandene Carboxylgruppen der Glucuronsäure
bzw. Iduronsäure kommen besonders geeignet Verbindungen
infrage, die ausgewählt sind aus der Gruppe der Diepoxyalkane mit
2 bis 8 CH2 Gruppen., besonders bevorzugt sind 1,2,3,4-Diepoxybutan,
1,2,7,8-Diepoxyoctan, sowie Glutaraldehyd. Diepoxyalkane bilden
unter sauren pH Werten von 2–4 Esterbindungen, in akalischen pH-Bereichen – pH > 10 Etherbindung aus.
Glutaraldehyd reagiert unter einem pH von 4 mit Esterbindungen
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Für
die Ausbildung von Esterbindungen müssen in die Stärkepolymere
Carboxyalkylgruppen eingerführt werden. Besonders bevorzugt
sind Carboxy methyl-Hydroxyethyl-stärken, mit einem DS für Carboxymethylgruppen
von 0,03 und einem DS für Hydroxyethylgruppen von 0,2–0,3,
einem Molekulargewicht von 30.000 bis 300.000. Bei sehr kleinen
Heparinmolekülen mit 1–4 Saccharideinheiten muß eine Bindung
an das Polysaccharid erfolgen, die das lineare Heparinmolekül
von dem Polysaccharid frei abstehen läßt.
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In
einer besonderen Ausgestalteung der Erfindung werden durch reduktive
Aminierung Aminogruppen in eine Hydroxy-alkyl-stärke oder
Carboxyalkylstärke eingeführt. Mit den eingeführten
Aminogruppen des Polysaccharids können die terminalen Aldehydgruppen
des Glucosaminoglucans bzw. Heparins so eingeführt werden,
daß der Rest des Heparinmoleküls frei bleibt.
Dem Fachmann sind Verfahren zur reduktiven Aminierung von Cellulose
vor allem aus der Papierherstellung bekannt. Die durch reduktive
Aminierung eingeführten Aminogruppen können auch
für Reste mit Carboxylgruppen, terminalen Aldehydgruppen,
Carbonsäurehalogeniden, Carboxyalkylen oder Estern zur
kovalenten Bindung genutzt werden.
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Die
reduktive Aminierung von Polyglucanen, vorteilhaft von Hydroxyethylstärke
erfolgt mit Ammoniak, Alkylaminen, Dialkylaminen oder Ammoniumhydroxid
in Anwesenheit eines Reduktionskatalysators. Die Reaktion erfolgt
in einer Wasserstoffatmosphäre unter erhöhten
Druck- und Temperaturbedingungen. Als Katalysatoren werden Raney,
Nickel- bzw. Kobaltnickelkatalysatoren verwendet. Die aminierte
Polyalkylstärke kann mit dem Glucosaminoglucan unter Bildung
eines Imins umgesetzt werden. Im nächsten Schritt wird
das Imin zum Amin reduziert.
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Das
Glucosaminoglucan wird an einen geladenen Anlagerungskörper
immobilisiert. Die Aminogruppe des aminierten Polysaccharids reagiert
dann mit der endständigen Aldehydgruppen des Glucosaminoglucans
unter Ausbildung einer Schiffschen Base. Diese wird durch ein geeignetes
Reduktionsmittel ausgesucht aus der Gruppe der salzhaltigen Hydride, LiAlH4,
LiBH4, NaBH4, oder NaBH3CN zum Amin reduziert. Dabei muß berücksichtigt
werden, daß auch die aminierten Polysaccharide i. e. Hydroxyalkylstärken
jeweils eine terminale Aldehydgruppe aufweisen, die diese Reaktion
geben kann. Die Verwendung aminierter Polysaccharide ermöglicht
ein weiteres Verfahrens in 2 Schritten. Dabei wird das zum Einbau vorgesehene
Glucosaminoglucan in einem ersten separaten Schritt zum Lacton oxidiert,
welches in einem weiteren Schritt mit der Aminogruppe der aminierten
Hydroxyalkylstärke unter Bildung eines Carbonsäureamids
verbunden wird. Bevorzugt wird das Verfahren nach Hashimoto (Hashimoto
et al., Kunststoffe, Kautschuk, Fasern Vol. 9 (1992) s: 1271–1279)
verwendet.
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Bei
der Einführung von Heparin wurde das erste Verfahren mit
vorheriger Immobilisation des Heparins bevorzugt, da die Carboxylgruppen
der Glucosaminoglucane bei der selektiven Oxidation und Lactonisierung
des zweiten Verfahren unerwünscht umgesetzt werden können.
Die Immobilisation des Heparins ermöglicht eine Verminderung
unerwünschter Kopplungsreaktionen wie die Verbindung der
eingeführten Aminogruppen mit den terminalen Aldehydgruppen
der reduktiv aminierten Polysaccharide selbst.
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Reduktiv
aminierte Stärken sind geeignete Ausgangsstoffe für
Kopplungsreaktionen mit Molekülen ausgewählt aus
der Gruppe der Peptide und Proteine (Humanalbumin), Immunglobuline
und Glykoproteine. In besonderer Ausgestaltung des Verfahrens werden
Arzneimittelreste R1 und R2 über die Aminogruppen unter
Ausbildung eines Linkers in das Polysaccharid eingeführt.
Die Erfindung wird durch die nachfolgenden Beispiele näher
erläutert, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein.
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Beispiele
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Beispiel 1
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200
mg Heparin-Natrium werden in 10 ml PBS pH 7,5 gelöst und
auf eine mit einem Bandgenerator positiv aufgeladene Platte pipetiert.
Die Platte wird für 1 Woche geladen gehalten bis die Lösung
als Film getrocknet ist. Auf den Film werden 0,2 ml 1,2,7,8-Diepoxyethan
ALFA-AESA pipetiert und durch Rotation verteilt. 80 mg HES mit einem
DS von 0,4 werden nach dem von DeBelder und Granath beschriebenen
Verfahren mit Fluoresceinisothiocyanatresten R1 kovalent verbunden
(FITC-HES). Die FITC-HES wird in 10 ml einer Mischung aus 3 ml 1
N NaOH und 7 ml Aceton gelöst und unter Schütteln
auf die geladene Platte aufgetropft. Das Gemisch wird auf einen
pH um 10 eingestellt und in einem abgedunkelten Raum alle 30 Minuten
vorsichtig geschüttelt. Nach 12 Stunden wird die Lösung
entnommen gegen Aqua dest. dialysiert und gefriergetrocknet. Das
Reagenz wird in 10 ml PBS 7,5 aufgenommen. In einer Elektrophorese
wandert das Reagenz signifikant schneller als eine unbehandelte
FITC-HES.
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Beispiel 2
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200
mg Heparin-Natrium werden in Aqua dest. gelöst und wie
in Beispiel 1 behandelt. 10 ml einer 6%igen Carboxmethyl-Hydroxyethylstärke
mit einer molaren Substitution von für Carboxymethylgruppen
von 0,06 und einer molaren Substitution für Hydroxyethylgruppen
von 0,34 werden in 10 ml einer 0,1 N HCL Acetonlösung mit
einem Anteil an 0,1 N HCL von 30% und 70% Aceton gelöst
und zusammen mit 0,2 ml 1,2,7,8-Diepoxyoctan zugegeben und vorsichtig
geschüttelt.
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Das
Gemisch wird durch Zugaben der HCL/Aceton Lösung auf einen
pH zwischen 3 und 4 eingestellt und alle 30 Minuten vorsichtig geschüttelt..
Nach 12 Stunden wird die Lösung entnommen gegen Aqua dest.
dialysiert und gefriergetrocknet.
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Beispiel 4
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200
g einer Hydroxyethylstärke mit einem Molekulargewicht von
50.000 und einer molaren Substitution von 0,3 wird zusammen mit
einer 27%igen Ammoniumhydroxidlösung und 300 g eines Nickel/Kupfer/Chrom
Katalysators mit einem Nickelanteil von 75%, einem Kupferanteil
von 23% und einem Chromanteil von 2% in einen Autoclaven eingebracht.
Unter Zugabe von Wasserstoff wird über einen Zeitraum von
12 Stunden ein Druck bis 170 bar beaufschlagt. Die Temperatur wird
bis auf 220 Grad °C erhöht. Anschließend
wird das Gemisch entnommen, dialysiert und gefriertgetrocknet. 200
mg Heparin werden in 5 ml PBS 7,5 gelöst und auf ein mit
einem Bandgenerator positiv geladenes Petriglas pipetiert. 200 mg
der reduktiv aminierten Hydroxyethylstärke werden in 10
ml Aqua dest. gelöst und vorsichtig zugegeben. Danach werden
0,025 mg Natriumcyanoborhydrid NaBH3 CN werden zugemischt. Das Petriglas
wird vorsichtig geschüttelt. Nach 2 Stunden werden erneut
0,025 mg des Natriumcyanoborhydrids zugegeben und vorsichtig solange
geschüttelt, bis keine Bläschen mehr aufsteigen.
Die Zugabe von Natriumborhydrid wird 4mal in gleicher Weise wiederholt.
Danach wird das Reagenz über 72 Stunden stehen gelassen;
schließlich in einem Überschuß PBS 7,5
aufgenommen, dialysiert und gefriergetrocknet.
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Beispiel 5
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200
g einer Hydroxyethylstärke mit einem Molekulargewicht von
50.000 und einer molaren Substitution von 0,3 werden zusammen mit
einer 27%igen Ammoniumhydroxidlösung und 300 g eines Nickel/Kupfer/Chrom
Katalysators in einen Autoklaven eingebracht. Unter Zugabe von Wasserstoff
wird über einen Zeitraum von 12 Stunden ein Druck bis 300
bar beaufschlagt. Die Temperatur wird bis auf 270 Grad °C
erhöht. Anschließend wird das Gemisch entnommen,
dialysiert und gefriertgetrocknet. 200 mg Heparin werden in 5 ml
PBS (pH 7,5) gelöst und auf eine mit einem Bandgenerator
positiv geladene Petrischale pipetiert. 200 mg der reduktiv aminierten Hydroxyethylstärke
werden in 10 ml Aqua dest. gelöst und vorsichtig zugegeben.
Danach werden 0,025 mg Natriumcyanoborhydrid NaBH3 CN zugemischt. Die
Petrischale wird vorsichtig geschüttelt. Nach 2 Stunden
werden erneut 0,025 mg des Natriumcyanoborhydrids zugegeben und
vorsichtig solange geschüttelt, bis keine Bläschen
mehr aufsteigen. Die Zugabe von Natriumborhydrid wird 4mal in gleicher Weise
wiederholt. Danach wird das Reagenz über 24 Stunden stehen
gelassen. Nach erneuter Aufladung durch den Bandgenerator werden
10 mg Humanalbumin in 10 ml PBS (pH 7,5) zugegeben. Danach werden
0,025 mg Natriumcyanoborhydrid NaBH3CN zugemischt. Die Petrischale
wird vorsichtig geschüttelt. Die Zugabe von 0,025 mg Natriumcyanoborhydrid
NaBH3CN mit anschließendem Schütteln 4mal mit
und 4mal ohne laufenden Bandgenerator wiederholt. Das Reagenz wird
schließlich in einem Überschuß PBS (pH
7,5) aufgenommen, dialysiert und gefriergetrocknet.
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur
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- - EP 1230935
A1 [0001]
- - EP 083768 B1 [0004]
- - CA 2362233 [0012]
- - CA 23622233 [0012]
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Zitierte Nicht-Patentliteratur
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- - Stephens et
al. [0003]
- - CHU et al. [0003]
- - Hashimoto et al., Kunststoffe, Kautschuk, Fasern Vol. 9 (1992)
s: 1271–1279 [0024]