ES2709548A1

ES2709548A1 - Hidrogel biocompatible, procedimiento de preparacion y uso del mismo

Info

Publication number: ES2709548A1
Application number: ES201731218A
Authority: ES
Inventors: Fernandez Luis Garcia; Lasa Blanca Vazquez; Roman Del Barrio Julio San; Gibert Ana Maria Torrent; Bonaventura Eulalia Montell
Original assignee: Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC
Current assignee: Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC
Priority date: 2017-10-16
Filing date: 2017-10-16
Publication date: 2019-04-16
Also published as: WO2019077182A1

Abstract

Hidrogel biocompatible, procedimiento de preparación y uso del mismo. La presente invención se refiere a un hidrogel biocompatible para la regeneración del tejido cartilaginoso y óseo. El hidrogel está formado por el entrecruzamiento de ácido hialurónico y quitosano mediante un diisocianato. La presente invención también se refiere al procedimiento de preparación y uso del mismo.

Description

DESCRIPCION

Hidrogel biocompatible, procedimiento de preparacion y uso del mismo

La presente invention se refiere a un hidrogel biocompatible para la regeneration del tejido cartilaginoso y oseo. Tambien se refiere al procedimiento de preparacion y uso del mismo. Por tanto, la presente invencion se encuadra en el sector biomedico y farmaceutico, mas concretamente, en el campo de la regeneracion de tejidos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION

En la actualidad, las lesiones oseas y cartilaginosas siguen siendo un reto en el campo biomedico. Las patologlas del cartllago articular suponen la perdida de la estructura y de la funcion del tejido y son una de las principales causas de discapacidad en personas mayores. El tratamiento estandar para la regeneracion de lesiones oseas consiste en un injerto de hueso autologo del propio paciente. Aunque la posibilidad de rechazo es minima, este metodo presenta ciertas limitaciones como la cantidad de tejido donante o la morbilidad de la zona del mismo. Para solventar estos inconvenientes existen otras alternativas como son los biomateriales. Un biomaterial se define como una sustancia farmacologicamente inerte, de origen natural o sintetico, disenada para ser implantada o incorporada dentro del sistema vivo para tratar, aumentar o reemplazar cualquier tejido, organo o funcion del cuerpo. El tipo de biomateriales empleados con fines de regenerativos en el campo de la biomedicina ha experimentado una evolucion notable a medida que ha aumentado el conocimiento sobre las interacciones de los mismos con el cuerpo humano.

Entre los biomateriales desarrollados se encuentran los soportes multicapa de colageno y glicosaminoglicanos, que son soportes preparados mediante la superposition de capas de colageno y glicosaminoglicanos inspirados en la estructura del tejido osteocondral. El problema de estos sistemas es la pobre integration entre capas y la falta de permeabilidad a nutrientes debido a su baja porosidad. Recientemente se estan desarrollando nuevos soportes basados en hidrogeles, que son estructuras tridimensionales formadas por pollmeros reticulados, capaces de absorber gran cantidad de agua y de proporcionar un microambiente acuoso muy similar al de la matriz extracelular. Son porosos, por lo que permiten el paso de nutrientes y de productos de desecho, necesarios para la supervivencia celular. Ademas tienen que ser biodegradables para poder ser sustituidos por la matriz extracelular una vez se haya regenerado el tejido. El acido hialuronico es uno de los compuestos utilizados en la fabrication de hidrogeles por ser este un compuesto (glicosaminoglicano) muy abundante en la matriz extracelular del cartllago que presenta unas funciones biologicas interesantes, ya que es un material esencial para la hidratacion de tejidos, organization de estructuras de proteoglicanos y diferenciacion de celulas.

Algunos ejemplos de materiales biocompatibles se encuentran divulgados en el documento CN100384923C, que describe un metodo para la preparation de un material de acido hialuronico-quitosano entrecruzado con una carbodiimida para aplicaciones bioqulmicas. El documento US6703444B2 se refiere a un proceso para la production de derivados de acido hialuronico reticulado y biopollmeros y sus usos en aplicaciones cosmeticas, medicas y farmaceuticas. La publication de Clara R. Correia et al.: Tissue Engineering: Part C, Vol. 17, No. 7, 2011, hace referencia a biomateriales compuestos de quitosano y el acido hialuronico como materiales muy prometedores en aplicaciones de ingenierla de tejidos y medicina regenerativa.

A pesar de conocerse composiciones de biomateriales y, en particular, hidrogeles en base a acido hialuronico, estas presentan inconvenientes ya que los metodos utilizados hasta el momento para la formation del gel incluyen componentes de alta toxicidad (carbodiimidas, dextranos oxidados,...) o la formacion de hidrogeles poco estables donde el acido hialuronico se encuentra formando parte de una red semiinterpenetrada por lo que se va perdiendo con el tiempo.

La presente invention se refiere a una nueva composition en forma de hidrogel biocompatible mediante su entrecruzamiento con diisocianatos que presenta ventajas o mejoras frente a los ya conocidos como es la ausencia de toxicidad o un grado de hinchamiento adecuado, que sin llegar a deformar el gel, absorbe una cantidad mucho mayor de llquido en comparacion con otros sistemas.

DESCRIPCION DE LA INVENCION

En un primer aspecto, la presente invencion se refiere a hidrogel biocompatible caracterizado por comprender acido hialuronico y quitosano entrecruzados con al menos un agente de entrecruzamiento, donde dicho agente de entrecruzamiento es un diisocianato.

En una realization preferida, el diisocianato es seleccionado de la lista que comprende hexametilen diisocianato, tetraetilen diisocianato y diisocianato de lisina; mas preferiblemente el diisocianato es diisocianato de lisina.

Este tipo de agente de entrecruzamiento no ha sido utilizado hasta el momento y proporciona estabilidad al sistema frente a otro tipo de enlaces hidrolizables.

Asl, los diisocianatos (en este caso di-isocianato de Lisina), puede reaccionar de dos formas distintas:

• Di-isocianato de lisina (LDI), que al reaccionar con los grupos amina del quitosano formara grupos urea, mas estables que los grupos imina frente a la hidrolisis.

• Sin embargo, tambien se da la posibilidad de que el acido hialuronico reaccione con LDI a traves de sus grupos OH libres del residuo de N-acetil glucosamina, formando grupos uretano. En este caso, se formarla una red interpenetrada, mas estable que la red semi-interpenetrada. En la red semi-interpenetrada las cadenas de acido hialuronico quedan entrecruzadas entre las del quitosano de forma flsica, es decir, sin formas enlaces qulmicos, por lo que su estabilidad es baja, sin embargo en las redes interpenetradas se dan uniones qulmicas entre todas las cadenas, lo cual aporta estabilidad al sistema.

Por lo tanto, la mayor parte del LDI queda integrado en el gel.

En una realization preferida, la relation molar entre el agente de entrecruzamiento y los grupos -NH2 en el hidrogel esta entre 3:1 y 7:1, mas preferiblemente es 5:1.

En una realizacion preferida, la relacion en peso entre el quitosano y el acido hialuronico en el hidrogel esta entre 1:0,5 y 1:1; mas preferiblemente es 1:1.

En otra realizacion preferida, el gel comprende ademas sulfato de condroitina. Preferiblemente, la relacion en peso entre el acido hialuronico y sulfato de condroitina en el hidrogel es de entre 1:0,05 y 1:0,5; mas preferiblemente de 1:0,2.

Otro aspecto de la invention se refiere al procedimiento de preparation de la composition descrita en el primer aspecto de la invencion.

El procedimiento comprende las siguientes etapas:

a) disolucion de acido hialuronico en una solution acuosa de un copollmero de polietilen-propilenglicol al 0,5-1,5% en peso y acido acetico, donde la proportion en volumen entre la solucion acuosa del copollmero de polietilenpropilenglicol y el acido acetico esta entre 1000:10 y 1000:1, y donde

la concentration de acido hialuronico en la disolucion es de entre 10 y 30 mg/mL, mas preferiblemente de 20 mg/mL de disolucion,

b) adicion de quitosano a la disolucion anterior,

c) adicion de un diisocianato a la solucion obtenida en la etapa b) seguida de agitacion para obtener una dispersion,

d) mantenimiento de la dispersion obtenida en la etapa c) a temperatura de entre 20 y 65°C durante al menos 3 horas para permitir el entrecruzamiento, formandose as! el hidrogel.

En una realizacion preferida, la disolucion de la etapa a) se prepara a una temperatura entre 20 y 65°C, mas preferiblemente de 37°C.

En una realization preferida, el copollmero de polietilen-propilenglicol mencionado en la etapa a), que es un agente estabilizante de las burbujas que se forman, es Pluronic® F127.

En una realizacion preferida, el copollmero de polietilen-propilenglicol, esta al 1% en la solucion acuosa.

En una realizacion preferida, en la etapa a), la proportion en volumen entre la solution acuosa del copollmero de polietilen-propilenglicol y el acido acetico esta entre 1000:10 y 1000:1

En una realizacion preferida, la cantidad de quitosano anadida en la etapa b) es tal que la proporcion en peso entre el quitosano y el acido hialuronico esta entre 1:0,5 y 1:1; mas preferiblemente es 1:1.

Preferiblemente, la disolucion formada en la etapa b) se mantiene bajo agitation durante al menos 2 horas previamente a la adicion del diisocianato.

En una realizacion preferida, en la etapa b) se anaden unas gotas de HCl hasta la completa disolucion de quitosano, preferiblemente HCl 1N. Preferiblemente, se anade un 12,5% (v/v) de HCl 1N a la disolucion, de manera que se consigue una disolucion completa del quitosano.

Preferiblemente, en la etapa b) se llevo a cabo a una temperatura entre 20 y 65°C, mas preferiblemente de 37°C.

En una realizacion preferida de la invention, en la etapa b) se anade, ademas del quitosano, sulfato de condroitina. Preferiblemente, la cantidad de sulfato de condroitina anadida en la etapa b) es tal que la proporcion en peso entre el acido hialuronico y el sulfato de condroitina esta entre 1: 0,05 y 1:0,5, mas preferiblemente, es 1:0,2.

En otra realizacion preferida, en la etapa c) la cantidad de diisocianato anadida es tal que la relation molar entre el diisocianato y los grupos -NH2 del quitosano esta entre 3:1 y 7:1, mas preferiblemente es 5:1.

Preferiblemente, la agitacion que se lleva a cabo en la etapa c) se realiza mediante un dispositivo homogeinizador de alta potencia (como UltraTurrax®) a 10000-20000 rpm, mas preferiblemente a 15000 rpm. La agitacion mediante un dispositivo de alta potencia se realiza preferiblemente entre 0,5 y 2 min, mas preferiblemente durante 1 min.

Preferiblemente, la etapa d) se lleva a cabo a 37°C.

En una realizacion preferida de la invention, el hidrogel obtenido en la etapa d) se lava con agua destilada y se seca por liofilizacion, de manera que se obtiene una membrana porosa seca.

Otro aspecto de la invencion se refiere al uso del hidrogel para la fabrication de un dispositivo de uso medico. En una realizacion preferida el dispositivo de uso medico es para la regeneration del tejido oseo o cartilaginoso, tal como una membrana porosa o un aposito.

A lo largo de la description y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras caracterlsticas tecnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y caracterlsticas de la invencion se desprenderan en parte de la descripcion y en parte de la practica de la invencion. Los siguientes ejemplos y figuras se proporcionan a modo de ilustracion, y no se pretende que sean limitativos de la presente invencion.

BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS

FIG. 1: Muestra imagenes de microscopla optica de membranas preparadas segun la presente invencion con diferente tipo de agitacion: A) agitacion magnetica; B) agitacion mediante UltraTurrax® y C) agitacion mediante UltraTurrax® a mayor aumento.

FIG. 2: Muestra imagenes de microscopla optica de membranas preparadas segun la presente invencion con diferentes proporciones LDI/NH2 (mol/mol): A) 3:1; B) 5:1 y C) 7:1.

FIG. 3: Grafica que muestra el hinchamiento en funcion del tiempo de membranas entrecruzadas con LDI (LDI/NH2 5:1) con relaciones quitosano (Q):acido hialuronico(HA) 1:1 y 1:0,75 respectivamente y membranas entrecruzadas con dextranos con relaciones Q:HA 1:1 y 1:0,75 respectivamente.

FIG 4: Grafica que muestra la citotoxicidad de las membranas con el tiempo A) membranas entrecruzadas con dextranos; B) membranas entrecruzadas con LDI segun la presente invencion.

FIG 5: Grafica que muestra la perdida en peso de las membranas de la presente invencion con y sin sulfato de condroitina (SC) en funcion del tiempo.

FIG 6: A) muestra grafico de HPLC del acido hialuronico (HA) y del sulfato de condroitina (SC); B) muestra grafico de HPLC de los productos de degradation de los geles con el tiempo.

FIG 7: Graficas que muestran la carga maxima necesaria para la separation del hidrogel y del hueso en cuatro situaciones diferentes: hueso en contacto con el hidrogel hidratado, hueso en contacto con el hidrogel hidratado y anadiendo pegamento de fibrina, hueso perforado en contacto con el hidrogel hidratado y pegamento de fibrina y hueso perforado en contacto con el hidrogel hidratado y sangre humana: A) para el hidrogel preparado con SC (Q:HA: SC 1:1:0,2 en peso); B) para el hidrogel preparado sin SC (Q:HA 1:1 en peso).

FIG 8: Grafica que muestra la fluorescencia obtenida en el ensayo alamar blue de adhesion celular a diferentes tiempos para las membranas preparadas segun el procedimiento de la invencion: Q:HA:SC 1:1:0,2 en peso y Q:HA 1:1 en peso.

FIG. 9: Grafica que muestra las propiedades reologicas de las muestras para las membranas preparadas segun el procedimiento de la invencion: Q:HA:SC 1:1:0,2 en peso y Q:HA 1:1 en peso.

FIG. 10: Fotografla que muestra el hinchamiento de las membranas porosas de Q/HA con LDI para distintas relaciones en peso HA:Q :A) 1:1; B) 1:0.75 y C) 1:0.5.

EJEMPLOS

A continuation se ilustrara la invention mediante unos ensayos realizados por los inventores, que pone de manifiesto la efectividad del producto de la invencion.

Ejemplo 1: Preparacion de membranas porosas

Para la preparacion de membranas porosas se ha utilizado la reaction de entrecruzamiento entre el quitosano (Q) y acido hialuronico (HA) utilizando diisocianato de lisina (LDI) como agente de entrecruzamiento.

Para ello, se disolvio la correspondiente cantidad de acido hialuronico a 37°C en 4 mL una disolucion acuosa de Pluronic® F127 al 1% en peso y acido acetico (4pL). Despues de la disolucion completa del acido hialuronico, se anadio quitosano y, opcionalmente, sulfato de condroitina. Con el fin de ayudar a la completa solubilidad del componente, se agregaron unas gotas (0,5 mL aprox) de acido clorhldrico (1N). Esta solution se dejo bajo agitation lenta para evitar la formation de burbujas y a 37° C durante al menos de 2 horas. La solucion obtenida se traslado a un pequeno vaso de precipitados y se anadio LDI, inmediatamente la solucion fue dispersada con un UltraTurrax® a 15000 rpm por 1 minuto o bien con agitacion magnetica durante 1 min. La dispersion final fue trasladada a molde de Teflon con la geometrla deseada y agitada suavemente para eliminar las burbujas grandes. Se dejo que el gel reticulara a 37°C en una camara cerrada al menos durante 3 horas. Despues de este tiempo, el gel se lavo con agua destilada y se seco por liofilizacion, obteniendo asl una membrana porosa seca.

En la Tabla 1 se muestran los experimentos realizados variando la concentration de quitosano (Q) y el modo de agitacion una vez anadido el LDI con relation en peso HA:Q es 1:1.

Tabla 1. Condiciones utilizadas en la preparacion de membranas porosas de Q/HA con LDI variando agitacion y concentracion de quitosano; relacion en peso HA:Q es 1:1:

Los mejores resultados se obtuvieron utilizando 20 mg/mL de quitosano, tanto con agitacion magnetica como con el UltraTurrax ®.

En la figura 1A se observa la membrana preparada mediante agitacion magnetica, los poros tienen una gran dispersion de tamanos (entre 10 y 300 micras de diametro) y parecen no estar conectados entre ellos. La segunda imagen (B) muestra la membrana preparada median agitacion con el UltraTurrax®, el tamano de poro es mucho mas homogeneo (entre 50 y 130 micras). Ademas, en este caso, como se observa en la tercera imagen (C), hay evidencia de interconexion entre poros.

Tabla 2. Condiciones utilizadas en la preparation de membranas porosas de Q/HA con LDI variando relation molar LDI/-NH2 para una misma concentration de quitosano (Q) en la mezcla de reaction y agitacion mediante UltraTurrax ® (UT); relacion en peso HA:Q es 1:1.

Las membranas A y B se pudieron cortar sin problema con una troqueladora de 1,2 cm de diametro. Estos discos se sumergieron en tampon fosfato durante una hora comprobandose como la composition con un menor grado de entrecruzamiento (A) ofrecla un mayor hinchamiento de la membrana. Aunque la composicion con menor grado de entrecruzamiento (A) ofrece un mejor comportamiento de hinchamiento, la composicion con un grado de entrecruzamiento mayor (B) ofrece una mejor distribution de tamano de poro (150±50 micras de diametro), tal y como puede verse en la figura 2).

Tabla 3. Condiciones utilizadas en la preparation de membranas porosas de Q/HA con LDI para distintas relaciones en peso HA:Q (Agitation UT).

Para comprobar el hinchamiento de estas membranas, se troquelaron discos de 1,2 cm de diametro y se introdujeron en tampon fosfato (PBS) a 37°C durante tres dlas, observandose como la membrana C es la que sufre un mayor grado de hinchamiento siendo estables las tres membranas y no observandose degradation alguna (vease figura 10).

En principio, la rigidez no afecta mucho a las propiedades finales, por lo que lo mas deseable es que la membrana no se hinche mucho, ya que, una vez implantada, un exceso de hinchamiento puede hacer que se salga de su lugar.

En la siguiente tabla (Tabla 4) se muestran las condiciones utilizadas en la preparacion de membranas porosas de Q y HA con LDI cargadas con sulfato de condroitina (SC), compuesto que favorece la regeneration del cartllago.

Tabla 4. Condiciones utilizadas en la preparacion de membranas porosas de Q/HA con LDI cargadas con sulfato de condroitina (SC) (agitacion UT)

Ejemplo 2: Estudio del grado de hinchamiento de las membranas a 37°C en PBS

Las membranas A y B de la Tabla 3 se sumergieron en tampon PBS pH: 7,4 y 37 °C con el objetivo de estudiar el nivel de hinchamiento (vease figura 3).

Se comparo el hinchamiento con el de las membranas no porosas entrecruzadas con dextranos (son membranas ya descritas y conocidas en el estado de la tecnica).

Estas membranas entrecruzadas con dextranos se prepararon de la siguiente manera: Se disolvio la correspondiente cantidad de acido hialuronico y dextrano oxidado a 37°C en 2 mL de una disolucion acuosa de Tampon fosfato 0.025M pH=7.4. Por otra parte, se disolvio la correspondiente cantidad de quitosano a 37°C en 2 mL de una disolucion acuosa con acido acetico (4pL) y, opcionalmente, sulfato de condroitina. Despues de la disolucion completa de ambos compuestos se mezclaron las dos disoluciones y se dejaron bajo agitacion lenta para evitar la formation de burbujas y a 37°C durante al menos de 15 min. Pasado este tiempo la solution fue dispersada con un UltraTurrax® a 15000 rpm por 1 minuto y fue trasladada a un molde de Teflon con la geometrla deseada.

Se observa como las membranas porosas sintetizadas con LDI tienen un hinchamiento superior a las membranas no porosas entrecruzadas con dextranos. (Dentro de cada tipo de membranas la composition con mayor cantidad de acido hialuronico presenta un mayor grado de hinchamiento. Todas las membranas alcanzan el equilibrio pasadas unas horas.

Ejemplo 3: Ensayos de citotoxicidad de las membranas (Ensayo MTT)

El ensayo de citotoxicidad fue realizado en fibroblastos de piel humanos (HFB, Innoprot). Para la obtencion de los extractos, se introducen trozos de membrana (HA:Q:CS 1.1:0,2 y 1:0,75:0,2) en 5 ml de medio de cultivo a 37±1°C, en un bano termostatizado con agitacion. El medio de cultivo que contiene los extractos solubles de los materiales, fue obtenido despues de 1 dla de incubacion y reemplazado por medio fresco. Este procedimiento fue repetido a los 2, 7, 14 y 21 dlas despues del comienzo del experimento y en condiciones identicas. Todos los extractos fueron obtenidos bajo condiciones esteriles y congelados a -18°C.

Las celulas fueron sembradas en placa de 96 pocillos con una densidad de 11 x 104 celulas/ml e incubadas durante 24 horas a 37±1°C. Transcurrido este tiempo, el medio de cultivo fue eliminado y reemplazado con 100ml/pocillo de los extractos solubles de cada material, el THX (control), y a cada dla de extraction. En todos los casos, el numero de replicas fue de 16. Las placas fueron incubadas a 37±1°C, durante 24 horas. Posteriormente, se eliminaron los extractos y se anadio 100 pl/pocillo de Bromuro de [3-(4,5-dimethylthiazol - 2 -yl) - 2,5 - diphenyltetrazol (MTT) (0,5 mg/mL) y se incubaron las placas a 37°C durante 3 horas y 30 minutos. Como blanco, se utilizo una replica sin celulas sembradas ni adicion de extractos. Se elimino el MTT y se anadieron 100ml/pocillo de DMSO que disuelve los cristales violetas de formazan, formados por celulas viables. La densidad optica (D.O.) fue medida con un lector de placas Biotek ELX808IU, usando una longitud de onda de 570 nm Los valores de densidad optica (D.O.) fueron corregidos teniendo en cuenta la media de absorbancia del blanco.

En la figura 4 se observa que en las membranas entrecruzadas con dextranos (Figura 4A) en el primer dla existe una disminucion considerable de la viabilidad celular, esto se puede deber a la presencia de dextranos no entrecruzados que se liberan al medio en las primeras horas, afectando a la viabilidad celular. Posteriormente, la viabilidad celular se recupera indicando que la liberation de productos toxicos solo tiene lugar durante las primeras horas.

En el caso de las membranas entrecruzadas con LDI (figura 4B) se observa un ligero descenso en la viabilidad celular, no siendo inferior al 80%, por lo que estas membranas no resultan toxicas para las celulas.

Ejemplo 4: Estudio de deqradacion de las membranas

El estudio de degradation de las membranas (con y sin SC con proportion en peso Q/HA 1:1) se ha realizado sumergiendo las membranas en PBS a 37°C durante determinados periodos de tiempo. Una vez transcurridos estos periodos las muestras se han lavado con agua destilada para eliminar los restos de sales y se han liofilizado para obtener el peso final de la muestra. De esta forma se puede determinar la perdida de peso de la muestra con el tiempo.

Como se observa en la figura 5, hay una perdida de peso inicial de aproximadamente el 30% en las membranas de HA:Q (1:1) (sin SC) y de un 25% en las membranas de HA:Q:SC (1:1:0.2) (con SC). Esta perdida de peso inicial se debe principalmente a la liberation de cadenas de HA que no han sido integradas dentro de la estructura qulmica del hidrogel, por lo que tendremos una liberacion de HA inicial.

En el caso de las membranas de HA:Q:SC, la perdida de peso es menor y posteriormente se observa que hay una evolution con el tiempo. Esto puede ser debido a la incorporation del SC que hace que el porcentaje inicial de HA libre sea menor.

Se analizaron los extractos de las liberaciones a diferentes tiempos mediante HPLC con el objetivo de identificar los compuestos que se estaban liberando. Como se observa en la figura 6 se puede distinguir entre HA y SC por su tiempo de elucion. En la segunda grafica (6B) se observa como en los extractos obtenidos durante los primeros dlas hay presencia de HA y SC ademas de una serie de picos a tiempos de elucion mayores correspondientes a productos de bajo peso molecular como podrlan ser cadenas de acido hialuronico o quitosano que se hayan degradado. A partir del dla 5 ya no se observa la presencia de sulfato de condroitina, por lo que se supone que la practica totalidad de esta se libera durante los primeros dlas, ademas las senales correspondientes a compuestos de bajo peso molecular van desapareciendo con el tiempo.

Ejemplo 5: Medidas de adhesion de los hidroqeles HA:Q:SC (1:1:0,33 en peso)

Se han realizado medidas de adhesion de los geles sobre hueso en distintas condiciones. El hueso utilizado para realizar los ensayos ha sido la parte plana de la quilla de gallina.

Para la realization de las medidas los huesos se han recortado con el objetivo de obtener la parte mas plana del hueso y obtener la mayor superficie de contacto con el hidrogel.

Las medidas se han realizado en un equipo Instron equipado con una celula de medida de 50 N en la que se ha acoplado el sistema hueso-membrana hidrogel mediante la fijacion de unos soportes metalicos con cianoacrilato y una traction de 5 mm/min.

Las medidas se han realizado de dos formas distintas:

1 - Resistencia al desplazamiento en forma de deslizamiento o cizalla.

2 - La resistencia a la fuerza de bioadhesion. Ambos en tres situaciones diferentes:

• Hueso en contacto con el hidrogel hidratado

• Hueso en contacto con el hidrogel hidratado y anadiendo pegamento de fibrina • Hueso perforado en contacto con el hidrogel hidratado y pegamento de fibrina • Hueso perforado en contacto con el hidrogel hidratado y sangre humana

La figura 7 muestra los resultados promedio obtenidos de seis medidas en cada uno de los casos anteriores.

La fuerza necesaria para la separation del hidrogel hidratado en el caso en el que este puesto directamente en el hueso es muy baja (0,3 N). Esta fuerza se puede mejorar mediante la adicion de pegamento de fibrina a la interfaz («1 N) o haciendo agujeros en el hueso (>1 N en cizalla y 3,7-8 N en adhesion).

El mejor de los resultados se obtiene cuando se utiliza sangre en la interfaz y se deja coagular. Se ha elegido este sistema por su similitud con los tratamientos actuales consistentes en realizar perforaciones en el hueso para que sangre y forme un coagulo rico en factores de crecimiento. Utilizando este sistema se consiguen fuerzas superiores a los 25 N en adhesion.

Un aspecto muy destacable es que a pesar de que las membranas se aplican hidratadas para poder manipularlas y adaptarlas a la superficie del hueso, presentan una elevada capacidad de adsorcion de llquidos o de sangre, de tal forma que practicamente toda la sangre que se ha depositado inicialmente en el hueso es materialmente adsorbida por la membrana de hidrogel.

La fuerza necesaria para la separation del hidrogel y del hueso en el caso de adhesion con sangre en ocasiones fue superior a la estabilidad del hidrogel, por lo que el hidrogel fallo antes de separarse del hueso

Dado que el hueso de gallina es bastante poroso, los resultados se pueden extrapolar a las condiciones humanas.

Ejemplo 6: Ensayos de adhesion celular (Ensayo Alamar Blue)

Las membranas preparadas (HA:Q: 1:1 en peso y HA:Q:SC 1:1:0,33 en peso) se colocaron en placas de 24 pocillos y se esterilizaron mediante ciclos de congelation. Sobre las membranas se sembraron Fibroblastos de piel humana con una densidad de 14 x 104 celulas/mL. Tras la incubation a 37±1°C, y 5% CO2 durante 1, 7 y 14 dlas, se elimino el medio de los pocillos y se anadio una solution de Alamar Blue. Las placas fueron incubadas a 37±1°C durante 1 hora, tiempo suficiente para que el reactivo sea metabolizado por las celulas presentes en la superficie y nos de una medida indirecta de la adhesion celular a los hidrogeles. De cada pocillo fueron tomadas allcuotas de 100 pL y medidas en un lector de placas.

En ambas muestras tenemos una buena adhesion celular y el numero de celulas va creciendo con el tiempo (vease figura 8). Destaca que esta evolution es mucho mas pronunciada en el caso de los hidrogeles sin SC.

Ejemplo 7: Propiedades mecanicas de los hidrogeles

La determination de las propiedades mecanicas se llevo a cabo en un reometro oscilatorio de esfuerzo controlado de TA Instruments modelo ARG2, utilizando una geometrla de platos paralelos. Las muestras se midieron utilizando un plato superior de acero de 20 mm de diametro. Se realizaron ensayos dinamomecanicos, fijando el porcentaje de deformation en un 2% y manteniendo la fuerza normal inicial constante para todas las muestras. De esta forma se obtuvieron las propiedades viscoelasticas de los hidrogeles, definidas a partir de su modulo de almacenamiento (G’) y su modulo de perdidas (G’’).

Los barridos de deformacion se llevaron a cabo para determinar el rango de viscoelasticidad lineal del sistema. Este rango se define como el rango en el que el hidrogel cumple la ley de elasticidad de Hooke (a = G • y, siendo a el esfuerzo aplicado, G el modulo de relajacion y ^yla deformacion que sufre el material), y es el rango en el que el sistema presenta un comportamiento visco elastico. El barrido de deformacion se realizo entre 1x10"3 y 1000 por ciento de deformacion, fijando la frecuencia y la temperatura a 0.5 Hz y 25°C respectivamente.

El barrido de frecuencia se realizo con un 2% deformacion entre 0,01 y 20 Hz a 25°C como se observa en la siguiente figura. La diferencia entre los valores de G’ y G’’ es mayor del 25% lo que nos indica que los geles se encuentran entrecruzados qulmicamente. Valores menores del 25% indicarlan que el entrecruzamiento es de tipo flsico. Comparando ambos geles, observamos que los valores de los modulos de carga y perdida son inferiores en el caso de los geles con sulfato de condroitina (HA:Q:SC) lo que indica que estos geles van a ser menos estables mecanicamente, esto tambien se observa en la grafica de dureza, en donde se aprecia que los geles HA:Q:SC alcanzan antes el punto de rotura (vease figura 9).

Si tomamos los valores del modulo elastico en el rango en donde los geles son estables obtenemos los siguientes valores:

Q:HA = 5,48 ± 1,05 KPa

Q:HA:SC = 2,13 ± 1,38 KPa

Claims

REIVINDICACIONES

1. Hidrogel biocompatible caracterizado por comprender acido hialuronico y quitosano entrecruzados con al menos un agente de entrecruzamiento, donde el agente de entrecruzamiento es un diisocianato.

2. Hidrogel segun reivindicacion 1 donde el diisocianato es seleccionado de la lista que comprende hexametilen diisocianato, el tetraetilen diisocianato y el diisocianato de lisina.

3. Hidrogel segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores caracterizado porque la relacion molar entre el agente de entrecruzamiento y los grupos -NH2 del quitosano esta entre 3:1 y 7:1.

4. Hidrogel segun reivindicacion 3 caracterizado porque la relacion molar entre el agente de entrecruzamiento y los grupos -NH2 del quitosano es 5:1.

5. Hidrogel segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores caracterizada porque la relacion en peso entre el quitosano y el acido hialuronico esta entre 1:0,5 y 1:1.

6. Hidrogel segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores caracterizada porque la relacion en peso entre el quitosano y el acido hialuronico es 1:1.

7. Hidrogel segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores caracterizada porque comprende ademas sulfato de condroitina.

8. Hidrogel segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores caracterizada porque la relacion en peso entre el acido hialuronico y el sulfato de condroitina es 1:0,33.

9. Procedimiento para preparar el material biocompatible descrito en las reivindicaciones anteriores caracterizado porque comprende las siguientes etapas:

a) disolucion de acido hialuronico en una solucion acuosa de un copollmero de polietilen-propilenglicol al 0,5-1,5% en peso y acido acetico, donde la proportion en volumen entre la solucion acuosa del copollmero de polietilen-propilenglicol y el acido acetico esta entre 1000:10 y 1000:1, y donde la concentration de acido hialuronico en la disolucion es de entre 10 y 30 mg/mL,

b) adicion de quitosano a la disolucion anterior,

d) mantenimiento de la dispersion obtenida en la etapa c) a temperatura de entre 20 y 65°C durante al menos 3 horas para permitir el entrecruzamiento, formandose asl el hidrogel.

10. Procedimiento segun reivindicacion 9 donde el copollmero de polietilenpropilenglicol es Pluronic® F127.

11. Procedimiento segun reivindicacion 9 o 10 donde la disolucion de la etapa a) se prepara a una temperatura entre 20 y 65°C.

12. Procedimiento segun reivindicacion 11 donde la disolucion de la etapa a) se prepara a una temperatura de 37°C.

13. Procedimiento segun cualquiera de las reivindicaciones 9-12 donde el copollmero de polietilen-propilenglicol esta al 1% en la solucion acuosa.

14. Procedimiento segun cualquiera de las reivindicaciones 9-13 donde la concentration de acido hialuronico en la disolucion preparada en la etapa a) es de 20 mg/mL.

15. Procedimiento segun cualquiera de las reivindicaciones 9-14 donde la proportion en peso utilizada entre el quitosano y el acido hialuronico esta entre 1:0,5 y 1:1.

16. Procedimiento segun reivindicacion 15 donde la proporcion en peso entre el quitosano y el acido hialuronico es 1:1.

17. Procedimiento segun cualquiera de las reivindicaciones 9-16 donde la disolucion formada en la etapa b) se mantiene bajo agitation durante al menos 2 horas previamente a la adicion del diisocianato.

18. Procedimiento segun cualquiera de las reivindicaciones 9-17 donde en la etapa b) se anade ademas HCl hasta la completa disolucion de quitosano.

19. Procedimiento segun cualquiera de las reivindicaciones 9-18 donde la etapa b) se lleva a cabo a una temperatura entre 20 y 65°C.

20. Procedimiento segun reivindicacion 19 donde la etapa b) se lleva a cabo a una temperatura de 37 °C.

21. Procedimiento segun cualquiera de las reivindicaciones 9-20 donde en la etapa b) se anade, ademas del quitosano, sulfato de condroitina.

22. Procedimiento segun reivindicacion 21 donde la proporcion en peso utilizada entre el acido hialuronico y el sulfato de condroitina es 1:0,33.

23. Procedimiento segun cualquiera de las reivindicaciones 9-22 donde la relacion molar utilizada entre el diisocianato y los grupos -NH2 del quitosano esta entre 3:1 y 7:1.

24. Procedimiento segun reivindicacion 23 donde la relacion molar utilizada entre el diisocianato y los grupos -NH2 del quitosano es 5:1.

25. Procedimiento segun cualquiera de las reivindicaciones 9-24 donde la agitacion en la etapa c) se realiza entre 10000-20000 rpm.

26. Procedimiento segun reivindicacion 25 donde la agitacion en la etapa c) se realiza a 15000 rpm.

27. Procedimiento segun cualquiera de las reivindicaciones 25-26 donde la agitacion en la etapa c) se realiza entre 0,5-2 min.

28. Procedimiento segun cualquiera de las reivindicaciones 9-27 donde el diisocianato es seleccionado de la lista que comprende hexametilen diisocianato, tetraetilen diisocianato y diisocianato de lisina.

29. Procedimiento segun cualquiera de las reivindicaciones 9-28 donde la etapa d) se lleva a cabo a 37°C.

30. Procedimiento segun cualquiera de las reivindicaciones 9-29 caracterizado porque el hidrogel obtenido en la etapa d) se lava con agua destilada y se seca por liofilizacion.

31. Uso del hidrogel definido en cualquiera de las reivindicaciones 1-8 para la fabrication de un dispositivo de uso medico.

32. Uso segun la revindication 31 donde el dispositivo de uso medico es para la regeneration del tejido oseo o cartilaginoso.

33. Uso segun cualquiera de las reivindicaciones 31-32 donde el dispositivo de uso medico es una membrana porosa, injerto o un aposito.