BR112015013755B1

BR112015013755B1 - Adesivo tecidual no qual o colágeno e a fibrina estão misturados e método para preparar o adesivo

Info

Publication number: BR112015013755B1
Application number: BR112015013755-5A
Authority: BR
Inventors: Ji Chul Yoo; Se Ken Yeo; Jang Hoon Kim; Jun Keun Lee; Dong Sam Suh; Cheong Ho Chang
Original assignee: Sewoncellontech Co., Ltd.
Priority date: 2012-12-11
Filing date: 2013-01-09
Publication date: 2019-05-14
Also published as: JP2016502448A; EP2932989A4; AU2013357988A1; WO2014092239A1; SI2932989T1; CA2894815A1; CA2894815C; US20150320904A1; TR201911079T4; LT2932989T; KR101401944B1; AU2013357988B2; PT2932989T; DK2932989T3; ES2739656T3; PL2932989T3; CY1121846T1; CN104902937A; HRP20191347T1; EP2932989B1

Abstract

resumo adesivo tecidual no qual o colágeno e a fibrina estão misturados e método para preparar o adesivo a presente invenção refere-se a um adesivo tecidual no qual o colágeno e a fibrina estão misturados e a um método para o seu preparo. para esse efeito, o método da presente invenção compreende as etapas de: misturar um primeiro material usando fibrinogênio e aprotinina; misturar um segundo material usando trombina, cloreto de cálcio e colágeno; e preparar um terceiro material misturando o primeiro material e o segundo material. o adesivo tecidual preparado pelo método pode suplementar as fraquezas, ou seja, a resistência e degradabilidade, do adesivo de fibrina que está atualmente disponível no mercado comercial. além disso, o adesivo tecidual da presente invenção é citofílico e ativa as plaquetas sanguíneas contidas no sangue de modo a induzir a regeneração tecidual. assim, a qualidade e a confiabilidade de produtos pode ser significativamente melhorada para satisfazer as várias necessidades de consumidores que são usuários, pelo qual apresentando boa imagem.

Description

“ADESIVO TECIDUAL NO QUAL O COLÁGENO E A FIBRINA ESTÃO MISTURADOS E MÉTODO PARA PREPARAR O ADESIVO”

CAMPO DA TÉCNICA [001]A presente invenção refere-se a um adesivo tecidual no qual o colágeno e a fibrina estão misturados e a um método para preparar o adesivo e, mais especificamente a presente invenção destina-se a suplementar a resistência e a degradabilidade, que são indicados como uma fraqueza de um adesivo de fibrina no mercado. Ou seja, a presente invenção refere-se a um adesivo tecidual que, ao mesmo tempo em que apresenta afinidade com células, ativa plaquetas contidas no sangue para induzir a regeneração tecidual e, assim, a qualidade e a confiabilidade de produtos que podem ser significativamente melhoradas para satisfazer várias necessidades de consumidores que são usuários.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO [002]Tal como é do conhecimento geral, os adesivos médicos têm sido aplicados a vários campos que variam da adesão e ligação cirúrgica à homeostase, e possuem um longo histórico. Por ser diretamente aplicado a tecidos humanos, o material a ser empregado na criação de um adesivo médico precisa ser biocompatível. Tendo em vista a possível circulação substancialmente livre do material do adesivo médico em líquidos corporais ou no sangue, há necessidade de que o material do adesivo médico seja rigorosamente biocompatível e biodegradável, possa ser esterilizado e não deve exibir toxicidade e provocar danos. Além disso, é importante selecionar um material adesivo que tenha alta afinidade com tecidos biológicos, mesmo depois de ser aplicado nos tecidos, e assim não interferir com a regeneração em tecidos originais.

[003]Atualmente, cianoacrilato, poliuretano, gelatina, fibrina ou os semelhantes, como material adesivo médico, são aplicados a produtos. Os adesivos médicos têm sido usados de modo geral em diversos campos, como na pele, vasos sanguíneos, órgãos digestivos, nervos cerebrais, na cirurgia plástica, ortopedia e áreas seme

2/20 lhantes. É necessário que tais adesivos disponham de força adesiva imediata em ambiente com umidade, possam ser esterilizados e que não sejam tóxicos, além de não interferirem com propriedades mecânicas suficientes, a biodegradabilidade, a homeostase efetiva e na cicatrização do corpo em vista da ferida.

[004]O cianoacrilato é usado principalmente para fins industriais e no máximo em 5% é empregado para uma finalidade médica. Contudo, pela possibilidade de uma sutura poder ser substituída pelo cianoacrilato, estudos sobre seu uso estão sendo conduzidos ativamente, especialmente em países desenvolvidos. No entanto, o cianoacrilato é vulnerável a impacto, apresenta deterioração na resistência ao calor e na resistência à água depois de ser aplicado, e retêm toxicidade e vulnerabilidade a alguns tecidos e, portanto, o cianoacrilato é usado atualmente com restrições.

[005]O poliuretano é um material que mantém a flexibilidade de uma região de fixação, e tem como vantagens endurecer rapidamente em decorrência da boa reatividade com a água, e o material endurecido mantém sua elasticidade. Por outro lado, o poliuretano tem como desvantagem o fato de que diisocianato aromático, que é uma matéria-prima sintética, é biologicamente tóxico.

[006]Uma cola utilizando gelatina é um adesivo bioderivado, e seus exemplos incluem um produto no qual ocorre reticulação da gelatina e resorcinol pela ação de formalina e um produto usando gelatina, ácido poliglutâmico e carbodiimida. Esses produtos podem exibir toxicidade quando se usa um agente reticulante químico à base de formalina e carbodiimida. Produtos que empregam a formalina como agente reticulante têm sido usados em alguns países, mas a autorização de sua licença está em andamento e sua efetividade está sendo testada no Japão e em outros países.

[007]A cola de fibrina é um produto obtido aplicando o princípio de formação de fibrina pelo uso de fibrinogênio, trombina, cloreto de cálcio e os semelhantes como materiais. A cola de fibrina possui adesão rápida, não requer calor ou pressão, não é afetada significativamente pelo ambiente de uma região colada e retém vantagens

3/20 biológicas por ser biocompatível e biodegradável. Contudo, a cola de fibrina apresenta desvantagens, pois lhe faltam propriedades físicas e sua taxa de biodegradação é relativamente alta quando comparada com um adesivo que utiliza um material sintético. A fim de superar tais desvantagens, pesquisas sobre a inibição de enzimas fibrinolíticas por intermédio da adição de aprotinina visando desacelerar a taxa de degradação de um polímero de fibrina e reter uma forma estão sendo conduzidas. O uso de colágeno como aditivo para suplementar tais desvantagens trará uma contribuição significativa para complementar uma formulação de cola de fibrina.

[008]A fibrina usada para uma cola de fibrina é aplicada e comercializada como adesivo natural ou hemostático, e possui biocompatibilidade e biodegradabilidade. A fibrina é conhecida por ser em geral absorvida no procedimento de cicatrização de feridas dentro de diversas semanas e por não provocar efeitos colaterais, tais como inflamação, respostas imunes, necrose tecidual ou hipertrofia fibrótica. Além disso, a fibrina é um suporte natural para fibroblastos, e desempenha uma importante função na cicatrização de feridas. O conceito de um produto à base de fibrina foi estabelecido na década de setenta. O primeiro produto foi comercializado na Europa em 1982 e depois tem sido usado até o momento. Recentemente, verificou-se o seu uso como suporte para engenharia de tecidos biológicos em muitos estudos, e a fibrina tem sido aplicada em vários campos, como na ortopedia, odontologia e neurocirurgia.

[009]O colágeno que pode ser utilizado como aditivo para suplementar as desvantagens da cola de fibrina é uma componente proteico estrutural. O colágeno constitui tecidos moles, como a derme, tendões/ligamentos e vasos sanguíneos, além de tecidos duros, como ósseo e cartilaginoso, e representa aproximadamente 1/3 do conteúdo proteico do corpo inteiro em mamíferos. São conhecidos mais de vinte tipos de colágeno, sendo o colágeno tipo I, constituinte da pele, tendões/ligamentos, ossos e os semelhantes, responsável por aproximadamente 90% do colágeno no corpo. O colágeno é a proteína que é formada por três fitas e possui

4/20 peso molecular de 300.000 daltons (aproximadamente 100.000 daltons para cada fita). No colágeno, glicina, que é a menor unidade entre os aminoácidos (com o menor peso molecular), é conectada repetidamente (-G X Y-; glicina é continuadamente repetida, e X e Y variam). Portanto, a glicina representa aproximadamente 1/3 dos aminoácidos que constituem o colágeno. O colágeno tem sido atualmente usado com finalidade médica em campos da homeostasia, como agente para cobertura de feridas, vasos sanguíneos artificiais, melhora do enrugamento, e para fins semelhantes No caso do homeostático, Aviten, que é um produto em pó de colágeno extraído da pele fetal bovina, foi desenvolvido pela primeira vez em 1974, e desde então tem sido utilizado.

[010]Acima de tudo, a característica mais importante do colágeno usado no campo da regeneração médica é o fato de que o colágeno é um material que é biologicamente compatível no tecido humano e exibe afinidade com células, e assim é importante na adesão e crescimento de células e na manutenção da viabilidade. Além disso, o colágeno estimula plaquetas contidas no sangue para induzir fatores de crescimento contidos nas plaquetas, pelo qual regenerando tecidos danificados. Adicionalmente, o colágeno possui uma estrutura de hélice tripla e sua degradabilidade pode ser relativamente mantida, quando comparado a uma estrutura simples de proteína e, portanto, o colágeno pode servir como arcabouço no corpo.

[011]A ligação de tal material pode fundamentalmente reter características biodegradáveis que o adesivo tecidual precisa dispor e manter características que não interfiram com a regeneração. Adicionalmente, a ligação de tal material pode complementar propriedades físicas que faltam à cola de fibrina, e desacelerar a taxa de degradação, proporcionando assim, ossos degradáveis de regeneração. Assim, o adesivo tecidual promoverá a geração de tecidos e acelerará o procedimento de regeneração visando encurtar o processo da terapia, além de uma função como um simples adesivo. Além disso, para que possa ser utilizado imediatamente, o adesivo

5/20 tecidual pode estar em uma formulação que seja montada em um tipo previamente carregado e armazenado congelado.

[012]O adesivo tecidual é um produto que reduz o fardo de um paciente no procedimento cirúrgico e maximiza a satisfação em casos em que uma ferida é suturada e recoberta, tal como acarretar risco mais baixo de dor e infecção, quando comparado aos métodos convencionais, e encurtar o tempo da operação. Por conseguinte, o adesivo tecidual será altamente favorecido neste campo, e a escala comercial será gradualmente expandida. Além do mais, tal produto ajuda a geração de tecidos, e é usado para um sistema de liberação de fármacos e um arcabouço para regeneração, assim contribuindo para um campo da medicina regenerativa.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Problema técnico [013]O Documento 1 de patente: Publicação de Patente Coreana N^o 20120125465 (Pedido de Patente N^o 2012-7018109, título: Dry powder fibrin sealant [Adesivo de fibrina em pó seco]) foi depositado.

[014]Portanto, a presente invenção foi desenvolvida em vista dos problemas citados acima, e a presente invenção provê um adesivo tecidual no qual a colágeno e a fibrina estão misturados e um método para preparar o adesivo, em que a presente invenção tem como primeiro objeto incluir as etapas de: misturar um primeiro material usando fibrinogênio e aprotinina; misturar um segundo material usando trombina, cloreto de cálcio e colágeno; e misturar o primeiro material e o segundo material entre si para preparar um terceiro material; de acordo com um segundo objeto da presente invenção, verificou-se que, como resultado da comparação de força física, um adesivo contendo colágeno mostrava alta resistência; de acordo com um terceiro objeto da presente invenção, verificou-se que, como resultado de testes de degradabilidade em longo prazo/curto prazo, um adesivo contendo colágeno mostrava baixa degradabilidade; de acordo com um quarto objeto da presente invenção, verifi

6/20 cou-se que, por intermédio da observação por microscopia eletrônica, colágeno e fibrinogênio ao serem combinados exibem uma estrutura estável; de acordo com um quinto objeto da presente invenção, verificou-se que, como resultado da comparação de crescimento e viabilidade utilizando condrócitos, osteoblastos e células derivadas do tecido adiposo, uma estrutura contendo colágeno exibia boa taxa de crescimento e alta viabilidade; de acordo com um sexto objeto da presente invenção, verificou-se que a inclusão de colágeno mantém alta resistência e uma estrutura estável e fornece um material dispondo de afinidades com células/sangue, dessa forma ajudando em grande medida a regeneração de uma região excluída/danificada; um sétimo objeto da presente invenção é ativar plaquetas incluídas no sangue para induzir a regeneração de tecidos; e um oitavo objeto da presente invenção é melhorar significativamente a qualidade e a confiabilidade de produtos, dessa forma satisfazendo várias necessidades de consumidores que são usuários, assim proporcionando boa impressão.

Solução técnica [015]De acordo com um aspecto da presente invenção, é provido um método para preparar um adesivo tecidual no qual o colágeno e a fibrina estão misturados, em que o método inclui: misturar fibrinogênio e aprotinina para preparar um primeiro material; misturar trombina, cloreto de cálcio e colágeno para preparar um segundo material; e misturar o primeiro material e o segundo material entre si para preparar um terceiro material.

[016]De acordo com outro aspecto da presente invenção, é provido um adesivo tecidual no qual o colágeno e a fibrina estão misturados, em que o adesivo tecidual é preparado pelas etapas de: misturar fibrinogênio e aprotinina para preparar um primeiro material; misturar trombina, cloreto de cálcio e colágeno para preparar um segundo material; e misturar o primeiro material e o segundo material entre si para preparar um terceiro material.

7/20

Efeitos vantajosos [017]Conforme apresentada acima, a presente invenção inclui as etapas de: misturar um primeiro material usando fibrinogênio e aprotinina; misturar um segundo material usando trombina, cloreto de cálcio e colágeno; e misturar o primeiro material e o segundo material entre si para preparar um terceiro material.

[018]De acordo com a presente invenção dispondo da característica técnica precedente, verificou-se que, como resultado da comparação de força física, um adesivo contendo colágeno mostrava alta resistência.

[019]Adicionalmente, de acordo com a presente invenção, verificou-se que, como resultado de testes de degradabilidade em longo prazo/curto prazo, um adesivo contendo colágeno mostrava baixa degradabilidade.

[020]Adicionalmente, de acordo com a presente invenção, verificou-se que, por intermédio da observação por microscopia eletrônica, colágeno e fibrinogênio são combinados para exibir uma estrutura estável.

[021]Adicionalmente, de acordo com a presente invenção, verificou-se que, como resultado da comparação de crescimento e viabilidade utilizando condrócitos, osteoblastos e células derivadas do tecido adiposo, uma estrutura contendo colágeno exibia boa taxa de crescimento e alta viabilidade.

[022]Adicionalmente, de acordo com a presente invenção, verificou-se que a inclusão de colágeno mantém alta resistência e uma estrutura estável e fornece um material dispondo de afinidades com células/sangue, dessa forma ajudando em grande medida a regeneração de uma região excluída/danificada.

[023]Adicionalmente, a presente invenção provê ativar plaquetas incluídas no sangue para induzir a regeneração de tecidos.

[024]A presente invenção pode melhorar significativamente a qualidade e a confiabilidade de produtos através dos efeitos precedentes, dessa forma satisfazendo várias necessidades de consumidores como seus usuários, assim proporcionando

8/20 boa impressão e, portanto, a presente invenção é muito útil.

[025]A seguir, serão descritas detalhadamente modalidades preferidas da presente invenção para obter os efeitos acima com referência aos desenhos anexos.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DOS DESENHOS [026]A Figura 1 é uma imagem micrográfica eletrônica de um adesivo tecidual no qual o colágeno e a fibrina estão misturados, de acordo com a presente invenção (20.000 X, secagem ao ponto crítico).

[027]A Figura 2 é um diagrama conceitual mostrando a ligação de colágeno e uma célula.

[028]A Figura 3 é um diagrama conceitual mostrando a ativação de plaquetas em colágeno.

[029]A Figura 4 é um gráfico comparativo mostrando as taxas de degradação de adesivos teciduais, nos quais, o colágeno e a fibrina estão misturados de acordo com a presente invenção.

[030]A Figura 5 é um gráfico mostrando as taxas de proliferação de condrócitos em adesivos teciduais, nos quais, o colágeno e a fibrina estão misturados de acordo com a presente invenção.

[031]A Figura 6 ilustra imagens confirmando a proliferação e a viabilidade de condrócitos em adesivos teciduais, nos quais, o colágeno e a fibrina estão misturados de acordo com a presente invenção.

[032]A Figura 7 é um gráfico mostrando as taxas de proliferação de osteoblastos em adesivos teciduais nos quais, o colágeno e a fibrina estão misturados de acordo com a presente invenção.

[033]A Figura 8 ilustra imagens confirmando a proliferação e a viabilidade de osteoblastos em adesivos teciduais, nos quais, o colágeno e a fibrina estão misturados de acordo com a presente invenção.

[034]A Figura 9 ilustra imagens confirmando a proliferação e a viabilidade de célu

9/20 las derivadas do tecido adiposo em adesivos teciduais nos quais, o colágeno e a fibrina estão misturados de acordo com a presente invenção.

[035]A Figura 10 é um diagrama de um estado no qual um adesivo tecidual, nos quais o colágeno e a fibrina estão misturados de acordo com a presente invenção, é carregado em uma seringa de duas vias.

Modo para executar a invenção [036]Um adesivo tecidual no qual o colágeno e a fibrina estão misturados e um método para prepará-lo de acordo com a presente invenção são como mostrados nas Figuras 1 a 10.

[037]Nas descrições a seguir, quando é determinado que as descrições detalhadas de funções conhecidas ou de constituições associadas com a presente invenção obscurecem a essência da presente invenção, as descrições detalhadas destas serão omitidas.

[038]Além disso, os termos a serem descritos adiante são definidos em consideração a funções da presente invenção e, assim, as definições dos termos deverão ser interpretadas por todo o presente relatório descritivo, pois os termos podem ser interpretados de acordo com a intenção do produtor ou de costume.

[039]Em primeiro lugar, a presente invenção inclui uma etapa de misturar um primeiro material utilizando fibrinogênio e aprotinina.

[040]Além disso, a presente invenção inclui uma etapa de misturar um segundo material utilizando trombina, cloreto de cálcio e colágeno.

[041]Além disso, a presente invenção inclui uma etapa de misturar o primeiro material e o segundo material entre si para preparar um terceiro material, e assim um adesivo tecidual, no qual colágeno e fibrinogênio estão misturados, é preparado.

[042]Especialmente, de acordo com a presente invenção, de preferência, o fibrinogênio possui uma concentração de 65-130 mg/mL e a aprotinina possui uma concentração de 1.000-3.000 KIU/mL.

10/20 [043]Além disso, de preferência, a trombina possui uma concentração de 40-600 U/ml, o cloreto de cálcio possui uma concentração de 4-140 mmol/mL e o colágeno possui uma concentração de no máximo 60 mg/mL.

[044]Neste caso, a concentração do fibrinogênio é preferivelmente de 65-130 mg/mL. Um valor inferior a 65 mg/mL de fibrinogênio enfraquece a força física, e um valor superior a 130 mg/mL de fibrinogênio leva à densificação da estrutura física, resultando na redução dos tamanhos de poros, dessa forma inibindo a atividade celular e, assim, a concentração de fibrinogênio é preferivelmente de 65-130 mg/mL.

[045]Adicionalmente, a concentração da aprotinina é preferivelmente de 1.0003,000 KIU/mL. Um valor inferior a 1.000 KIU/mL de aprotinina acelera a degradação de uma composição, e um valor superior a 3.000 KIU/mL de aprotinina aumenta o risco de causar anafilaxia e, assim, a concentração de aprotinina é preferivelmente de 1.000-3.000 KIU/mL.

[046]Adicionalmente, a concentração da trombina é preferivelmente de 40-600 KIU/mL. Um valor inferior a 40 U/ml de trombina enfraquece a força física de uma composição, e um valor superior a 60 U/ml de trombina leva à densificação da estrutura da composição, a qual, por conseguinte, não possui afinidade com células e aumenta rapidamente a taxa de gelificação, deixando de servir como adesivo em uma região aplicada, e assim a concentração da trombina é preferivelmente de 4060 U/ml.

[047]Adicionalmente, a concentração de cloreto de cálcio é preferivelmente de 4140 mmol/mL. Um valor inferior a 4 mmol/mL de cloreto de cálcio desacelera demais a taxa de gelificação, e um valor superior a 140 mmol/mL de cloreto de cálcio pode ter má influência sobre as células em decorrência de uma alta pressão osmótica e, assim, a concentração de cloreto de cálcio é preferivelmente de 4-140 mmol/mL.

[048]Finalmente, a concentração do colágeno é preferivelmente de no máximo 60 mg/mL. Especialmente, a concentração preferível do colágeno é de 10-30 mg/mL.

11/20 [049]Ou seja, Um valor inferior a 10 mg/mL de colágeno enfraquece a força física, e um valor superior a 30 mg/mL tem má influência sobre a degradabilidade e em uma estrutura estável e não possui afinidade com células e sangue, e assim a concentração do colágeno é preferivelmente de 10-30 mg/mL.

[050]Enquanto isso, o método para preparar um adesivo tecidual no qual o colágeno e a fibrina estão misturados de acordo com a presente invenção será descrito especificamente a seguir.

[051]Em primeiro lugar, é conduzida uma etapa de preparar um primeiro material incluindo fibrinogênio e aprotinina.

[052]Depois, é conduzida uma etapa de preparar um segundo material incluindo trombina, cloreto de cálcio e colágeno.

[053]Em seguida, é conduzida uma etapa de colocar o primeiro material em um lado de uma seringa de duas vias, e o segundo material no outro lado da seringa de duas vias e, então, misturar o primeiro e o segundo material entre si, e assim um adesivo tecidual no qual o colágeno e a fibrina estão misturados é preparado.

[054]De acordo com a presente invenção, as soluções de aprotinina e de cálcio são injetadas no fibrinogênio e na trombina, respectivamente, e a trombina é misturada com uma solução de colágeno, depois, as soluções resultantes são carregadas na seringa de duas vias, dessa forma preparando um adesivo tecidual no qual o colágeno e a fibrina estão misturados.

[055]De acordo com a presente invenção, um adesivo tecidual no qual o colágeno e a fibrina estão misturados pode ser preparado percorrendo as respectivas etapas para preparar um adesivo tecidual nas quais o colágeno e a fibrina estão misturados.

[056]O adesivo tecidual no qual o colágeno e a fibrina estão misturados e o método para prepará-lo de acordo com a presente invenção serão descritos pelos exemplos fornecidos.

Exemplo 1

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Comparação de propriedades físicas entre a presente invenção e a técnica anterior [057]A fim de verificar as propriedades físicas da presente invenção, o estresse máximo, a resistência do gel e a resistência à tração foram verificadas utilizando um medidor de propriedade física.

1. Preparo de amostras [058]Na técnica anterior, o produto Greenplast foi utilizado.

[059]Para os componentes da presente invenção, fibrinogênio seco e trombina do Greenplast foram dissolvidos em uma solução de aprotinina, à qual foi adicionada uma solução de cálcio, respectivamente. Nesse ponto, a solução de trombina estava misturada com uma solução de colágeno 3%. As soluções resultantes foram carregadas em uma seringa de duas vias.

[060]Para a aferição de propriedades físicas, cada amostra foi colocada em um molde de forma cilíndrica (Φ12 X 15 mm) para produzir uma forma.

2. Aferição de propriedades físicas [061]Medidor da propriedade física: Reômetro (CR-500DX, Reômetro científico Sun) [062]Itens em teste: estresse máximo (N), resistência do gel (g-cm), resistência à tração (g/cm2) [063]Condições do teste: distância da entrada (7,5 mm), velocidade da mesa (50 mm/minuto), estresse máximo (10 kg), adaptador (N^o1 Φ 20 mm)

3. Resultados do teste

Tabela 1

Classificação	Estresse máximo	Resistência do gel	Resistência à tração
N	g-cm	g/cm2
Presente invenção	19,3	1212,9	2493,7
Técnica anterior	13,4	831,7	1692,2

Exemplo 2

Comparação de degradabilidade entre a presente invenção e a técnica ante

13/20 rior (curto prazo/longo prazo) [064]A fim de verificar a degradabilidade da composição da presente invenção, averiguou-se a degradabilidade do produto cola de fibrina e do material por um período predeterminado.

1. Degradabilidade (curto prazo)

1) Preparo de amostras [065]Na técnica anterior, o produto Greenplast foi utilizado.

[066]Para os componentes da presente invenção, fibrinogênio seco e trombina de Greenplast foram dissolvidos em uma solução de aprotinina, à qual, adicionou-se uma solução de cálcio, respectivamente. Nesse caso, a solução de trombina foi misturada com uma solução de colágeno 3%. As soluções resultantes foram carregadas em uma seringa de duas vias.

[067]Para a aferição de propriedades físicas, cada amostra foi colocada em um molde de forma cilíndrica (Φ8 X 5 mm) para produzir uma forma.

2) Condições de tratamento para verificação da degradabilidade [068]Duas condições foram confirmadas para o solvente. Confirmou-se uma condição de usar somente um meio DEME e uma condição de usar um meio DMEM contendo Liberase TM (a concentração de Liberase TM foi definida em 10 ug/mL).

[069]A amostra foi colocada em uma placa de 12 cavidades, e o aspecto da degradação foi averiguado como peso de resíduo da composição a cada 2 horas por 12 horas.

3) Resultados do teste [070]Verificou-se que, na condição de degradação pelo tratamento enzimático, mais de 90% da formulação da técnica anterior apresentou degradação dentro de 12 horas, e cerca de 80% da composição da presente invenção manteve-se por 12 horas. Na condição DMED, a degradação não foi verificada por 12 horas.

2. Degradabilidade (longo prazo)

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1) Preparo de amostras [071]Na técnica anterior, o produto Greenplast foi utilizado.

[072]Para os componentes da presente invenção, fibrinogênio seco e trombina de Greenplast foram dissolvidos em uma solução de aprotinina, à qual, adicionou-se uma solução de cálcio, respectivamente. Nesse ponto, a solução de trombina foi misturada com uma solução de colágeno 3%. As soluções resultantes foram carregadas em uma seringa de duas vias.

[073]Para a aferição de propriedades físicas, cada amostra foi colocada em um molde de forma cilíndrica (Φ12 X 15 mm) para produzir uma forma.

2) Condições de tratamento para verificação da degradabilidade [074]DMEM foi utilizado para o solvente, e a observação a olho nu foi conduzida a 37 °C por um mês.

3) Resultados do teste [075]A composição da presente invenção foi observada por um mês ou mais tempo, mas a formulação da técnica anterior apresentou degradação dentro de três semanas. Verificou-se que o período de degradação da composição da presente invenção era mais longo do que aquele da formulação da técnica anterior.

Exemplo 3

Análise micrográfica eletrônica da presente invenção [076]A estrutura da composição da presente invenção foi observada por um microscópio eletrônico.

1. Preparo de amostras [077]Para o preparo da composição, uma solução de fibrinogênio de Greenplast e uma solução de trombina contendo colágeno /solução de cálcio foram preparadas. A concentração da solução do colágeno era 3% (p/v).

[078]Cada uma das soluções preparadas foi aplicada a uma seringa de duas vias para ser dispensada em bandejas para observação por microscopia eletrônica, e

15/20 depois gelificadas.

2. Métodos [079]A composição da presente invenção foi seca ao ponto crítico, sendo depois observada por um microscópio eletrônico.

[080]A secagem ao ponto crítico da composição foi conduzida por intermédio de tratamento com álcool em um secador de ponto crítico (Hitachi, HCP-2).

[081]A amostra para observação por microscopia eletrônica foi cortada e recoberta com ouro, sendo depois observada por meio de SEM (Hitachi, S3500).

[082]A análise por microscopia eletrônica foi conduzida na ampliação de 20.000X.

3. Resultados do teste [083]Como resultado da observação no microscópio eletrônico na ampliação de 20.000X, verificou-se que o colágeno e a fibrina se reticulam. A estrutura fibrosa do colágeno foi também observada. Pode-se prever que tal reticulação do material reforce as propriedades físicas.

Exemplo 4

Teste sobre compatibilidade e crescimento celular da presente invenção (condrócitos) [084]A fim de verificar a proliferação e a viabilidade de condrócitos na composição da presente invenção, usou-se o ensaio CCK-8 e a coloração por Calceína-AM e EthD-1.

1. Células e composição [085]Condrócitos de animais excluindo humanos foram utilizados. O número de células era 12.000.000 na mistura líquida da composição.

[086]Para a composição, Greenplast, que é um produto contendo cola de fibrina, foi misturado com 3% e 6% de colágeno, respectivamente.

[087]A composição foi preparada dissolvendo fibrinogênio seco do Greenplast em 1 mL de uma solução contendo condrócitos e misturando a solução de trombi

16/20 na/cálcio com 1 mL de uma solução de colágeno com cada concentração.

[088]A solução de fibrinogênio contendo condrócitos e a solução de trombina contendo colágeno foram usadas para preparar, no total, 2 mL de solução de colágenofibrina.

[089]Para cultura, o componente preparado de colágeno-fibrina foi dispensado em uma placa de 24 cavidades a 0,2 mL por cada cavidade, e a observação foi conduzida por 20 dias enquanto o meio DMEM era trocado a cada 2-3 dias.

2. Ensaio CCK-8 [090]O meio foi removido de cada cavidade (placa de 24 cavidades) contendo um material cultivado.

[091]1 mL de um novo meio foi colocado em cada cavidade.

[092]Um reagente CCK-8 (Dojindo, CK04-11) foi adicionado em 100 pL para cada cavidade, o que corresponde a 10% do volume do meio, seguido por uma reação em incubadora com CO2 5% a 37 °C por 3 horas.

[093]Quando concluída da reação, a absorbância (450 nm) do líquido de reação foi lida utilizando um leitor de microplacas.

[094]A proliferação celular de cada período de cultura foi verificada usando o valor medido de OD.

3. Coloração por Calceína-AM e EthD-1 [095]Uma solução de trabalho foi preparada misturando uma solução tampão com 2 pM e 4 pM de Calceína AM e EthD-1 do kit de ensaio LIVE/DEADViability/Cytotoxicity (Invitrogen, L3224), respectivamente.

[096]O material cultivado foi transferido para uma nova placa de 24 cavidades, e depois 1 mL da solução de trabalho foi inserido, seguido por uma reação na condição em que a luz era bloqueada por 20 minutos. Depois disso, as células vivas e as mortas foram observadas utilizando um microscópio de fluorescência. As células vivas eram observadas como verdes, e as mortas eram observadas como vermelhas.

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4. Resultados do teste

A. Ensaio CCK-8 (Figura 5)

B. Coloração por Calceína-AM e EthD-1 (Figura 6)

Exemplo 5

Teste de biocompatibilidade celular da presente invenção (osteoblastos) [097]A fim de verificar a proliferação e a viabilidade de osteoblastos na composição da presente invenção, usou-se o ensaio CCK-8 e a coloração por Calceína-AM e EthD-1.

1. Células e composição [098]Osteoblastos de animais excluindo humanos foram utilizados. O número de células era 12.000.000 na mistura líquida da composição.

[099]A composição foi configurada misturando Greenplast, que é o produto de cola de fibrina, com 3% e 6% de colágeno, respectivamente.

[0100]A composição foi prepara dissolvendo fibrinogênio seco do Greenplast em 1 mL de uma solução contendo condrócitos e misturando a solução de trombina/cálcio com 1 mL de uma solução de colágeno com cada concentração.

[0101]A solução de fibrinogênio contendo osteoblastos e a solução de trombina contendo colágeno foram utilizadas para preparar, no total, 2 mL de solução de colágeno-fibrina.

[0102]Para cultura, o componente preparado de colágeno-fibrina foi dispensado em uma placa de 24 cavidades a 0,2 mL por cada cavidade, e a observação foi conduzida por 20 dias enquanto o meio α-DMEM era trocado a cada 2-3 dias.

2. Ensaio CCK-8 [0103]O meio contendo material cultivado foi removido de cada cavidade (placa de 24 cavidades).

[0104]1 mL de um novo foi colocado em cada cavidade.

[0105]Um reagente CCK-8 (Dojindo, CK04-11) foi adicionado em 100 pL para cada

18/20 cavidade, o que corresponde a 10% do volume do meio, seguido por uma reação em uma incubadora com CO2 5% a 37 °C por 3 horas.

[0106]Quando concluída a reação, a absorbância (450 nm) do líquido de reação foi lida utilizando um leitor de microplacas.

[0107]A proliferação celular de cada período de cultura foi verificada utilizando o valor medido de OD.

3. Coloração por calceína-AM e EthD-1:

[0110]Uma solução de trabalho foi preparada misturando uma solução tampão com 2 pM e 4 pM de Calceína AM e EthD-1 do kit de ensaio LIVE/DEADViability/Cytotoxicity (Invitrogen, L3224), respectivamente.

[0111]O material cultivado foi transferido para uma nova placa de 24 cavidades, e depois 1 mL da solução de trabalho foi inserido, seguido por uma reação na condição em que a luz é bloqueada por 20 minutos. Depois disso, as células vivas e as células mortas foram observadas utilizando um microscópio de fluorescência.

4. Resultados do teste

Ensaio CCK-8 (Figura 7)

Coloração por calceína-AM e EthD-1 (Figura 8)

Exemplo 6

Teste sobre biocompatibilidade celular da presente invenção (células derivadas do tecido adiposo) [0112]A fim de verificar a proliferação e a viabilidade de células derivadas do tecido adiposo na composição da presente invenção, usou-se ensaio CCK-8 e coloração por Calceína-AM & EthD-1.

1. Células e composição [0113]Utilizaram-se células derivadas do tecido adiposo. O número de células era 12.000.000 na mistura líquida da composição.

[0114]A composição foi configurada misturando Greenplast, que é o produto de co

19/20 la de fibrina, com 3% de colágeno, respectivamente.

[0115]A composição foi preparada dissolvendo fibrinogênio seco do Greenplast em 1 mL de uma solução contendo células derivadas do tecido adiposo e misturando a solução de trombina/cálcio com 1 mL de uma solução de colágeno com cada concentração.

[0116]A solução de fibrinogênio contendo células derivadas do tecido adiposo e a solução de trombina contendo colágeno foram usadas para preparar, no total, 2 mL de solução de colágeno-fibrina.

[0117]Para cultura, o componente preparado de colágeno-fibrina foi dispensado em uma placa de 24 cavidades a 0,2 mL por cada cavidade, e a observação foi conduzida por 20 dias enquanto o meio DMEM era trocado a cada 2-3 dias.

2. Coloração por calceína-AM e EthD-1 [0118]Uma solução de trabalho foi preparada misturando PBS com 2 pM e 4 pM de Calceína AM e EthD-1 do kit de ensaio LIVE/DEADViability/Cytotoxicity (Invitrogen, L3224), respectivamente.

[0119]O material cultivado foi transferido para uma nova placa de 24 cavidades, e depois 1 mL da solução de trabalho foi inserido, seguido por uma reação na condição em que a luz é bloqueada por 20 minutos. Depois disso, as células vivas e as mortas foram observadas utilizando um microscópio de fluorescência.

3. Resultados do teste

Coloração por Calceína-AM e EthD-1 (Figura 9) [0120]Entretanto, a presente invenção pode ser modificada de várias maneiras e concretizada em muitas formas diferentes para a aplicação da característica precedente.

[0121]Contudo, será observado que não há intenção de limitar a presente invenção a modalidades específicas apresentadas na descrição detalhada, mas que se pretende abranger todas as modificações, equivalentes ou substituições que pertençam

20/20 à ideia técnica e ao âmbito técnico da presente invenção, que são definidos pelas reivindicações anexas.

Aplicação industrial [0122]Os espíritos técnicos do adesivo tecidual no qual o colágeno e a fibrina estão misturados e do método para prepará-lo da presente invenção são de valor suficiente para proteção, pois os mesmos resultados são realmente reprodutíveis e, especialmente, a implementação da presente invenção pode promover o desenvolvimento técnico e contribuir para o desenvolvimento industrial.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Método para preparar um adesivo tecidual no qual colágeno e fibrina estão misturados CARACTERIZADO pelo fato de que compreende:

preparar um primeiro material incluindo fibrinogênio e aprotinina;

preparar um segundo material incluindo trombina, cloreto de cálcio e colágeno; e colocar o primeiro material em um lado de uma seringa de duas vias e o segundo material no outro lado da seringa de duas vias, e depois misturar o primeiro e o segundo material entre si, em que o fibrinogênio possui uma concentração de 65-130 mg/mL, a aprotinina possui uma concentração de 1.000-3.000 KIU/mL, a trombina possui uma concentração de 40-600 U/mL, o cloreto de cálcio possui uma concentração de 4-140 mmol/mL e o colágeno possui uma concentração de 10-30 mg/mL.
2. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que as soluções de aprotinina e de cálcio são injetadas no fibrinogênio e na trombina, respectivamente, e a trombina é misturada com uma solução de colágeno, e depois as soluções resultantes são carregadas na seringa de duas vias.
3. Adesivo tecidual no qual colágeno e fibrina estão misturados CARACTERIZADO pelo fato de que é preparado pelo método conforme definido na reivindicação 1 ou 2.