KR101401944B1 - 콜라겐과 피브린이 혼합된 조직 실란트 및 그 제조방법 - Google Patents

콜라겐과 피브린이 혼합된 조직 실란트 및 그 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 콜라겐과 피브린이 혼합된 조직 실란트 및 그 제조방법에 관한 것이다.
본 발명은 이를 위해 피브리노겐과 아프로티닌을 이용하여 제1물질을 혼합하는 단계; 트롬빈과 염화칼슘 및 콜라겐을 이용하여 제2물질을 혼합하는 단계; 및 제1물질과 제2물질을 상호 혼합하여 제3물질을 제조하는 단계;가 포함된다.
상기와 같이 구성된 본 발명은 현재 시중에 있는 피브린 실란트의 단점인 강도와 분해성을 보완함과 아울러 세포친화적이면서 혈액 내 포함되어 있는 혈소판을 활성화시켜 조직재생을 유도할 수 있도록 한 것이고 이로 인해 제품의 품질과 신뢰성을 대폭 향상시키므로 사용자인 소비자들의 다양한 욕구(니즈)를 충족시켜 좋은 이미지를 심어줄 수 있도록 한 것이다.

Description

콜라겐과 피브린이 혼합된 조직 실란트 및 그 제조방법{tissue sealant of collagen and fibrin Mixed and method of manufacturing the same}
본 발명은 콜라겐과 피브린이 혼합된 조직 실란트 및 그 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 현재 시중에 있는 피브린 실란트의 단점인 강도와 분해성을 보완함과 아울러 세포친화적이면서 혈액 내 포함되어 있는 혈소판을 활성화시켜 조직재생을 유도할 수 있도록 한 것이고 이로 인해 제품의 품질과 신뢰성을 대폭 향상시키므로 사용자인 소비자들의 다양한 욕구(니즈)를 충족시켜 좋은 이미지를 심어줄 수 있도록 한 것이다.
주지하다시피 의료용 실란트는 외과용 점착, 접착 및 지혈에 이르기까지 다양한 분야에 적용되고 있고 오랜 역사를 지니고 있다. 의료용 실란트 재질은 인체 조직에 직접적으로 적용되므로, 생체에 적합한 물질이 사용되어야 하고 본질적으로 체액이나 혈액으로 유입될 수 있으므로 보다 엄밀한 생체적합하고 생분해 물질이 사용되어야 하며 멸균이 가능하고 독성이나 위해가 나타나지 않아야 한다. 또한, 실란트는 조직 내 적용된 이후에도 생체조직과의 친화도가 높아서 원래의 조직으로 재생을 방해하지 않는 재료를 선정하는 것이 중요하다.
현재 실란트의 재료로는 시아노아크릴레이트, 폴리우레탄, 젤라틴, 피브린 등을 이용하여 제품에 적용하고 있다. 일반적으로 의료용 실란트는 피부, 혈관, 소화기, 뇌신경, 성형외과, 정형외과 등의 여러 영역에서 사용되고 있다. 이러한 실란트에 요구되는 특성은 수분환경에서의 신속한 접착력, 멸균가능하고 무독성, 창상면에서의 충분한 기계적 물성, 생분해성, 지혈효과 및 생체 치유에 방해되지 않아야 한다.
시아노아크릴레이트는 주로 공업용으로 사용되고 있는 물질로, 의료용으로는 5% 이하로 사용되지만 봉합사 대체 가능성 때문에 선진국 중심의 연구가 활발히 진행되고 있다. 하지만, 적용 후에 충격에 약하고 내열성, 내수성이 떨어지는 단점과 일부 조직독성과 취약성의 문제 때문에 현재 제한적으로 사용되고 있다.
폴리우레탄은 접착부의 유연성이 유지되는 장점을 갖는 물질로, 물과의 반응성이 좋아 빠르게 경화되고 경화물질이 탄성을 유지하는 장점이 있다. 반면에, 합성원료인 방향족 디이소시아네이트가 생체 독성이 있다는 단점이 있다.
젤라틴을 이용한 글루는 생체 유래 실란트로서, 젤라틴과 레조시놀을 포르말린으로 가교시킨 제품과 젤라틴과 폴리글루타민산과 카르보디이미드를 이용한 제품이 있다. 이 제품들은 포르말린과 카르보디이미드의 화학적 가교제를 사용하여 독성을 낼 수 있다. 가교제를 포르말린으로 사용하는 제품의 경우, 일부 국가에서는 사용되고 있지만, 일본 등에는 아직 인허가 진행 중이며 유효성 등의 검토가 진행 중이다.
피브린 글루는 피브리노겐, 트롬빈, 염화칼슘 등을 재료로써, 피브린 형성의 원리를 이용하여 제품에 적용한 제품이다. 접착이 빠르고 열이나 압력이 불필요하며 접착부위의 환경에 크게 영향을 받지 않고 생체적합하며 생분해 특성 등의 생물학적 장점을 갖는 반면에 합성물질을 이용한 실란트와 비교하여 물리적 특성이 부족하고 생분해 속도가 상대적으로 빠르다는 단점이 있다. 이러한 단점을 극복하기 위해서 피브린 중합체의 분해속도를 느리게 하고 형태를 유지시키기 위해 아프로티닌을 첨가하여 피브린 분해효소의 저해시키는 노력들을 하고 있다. 이러한, 단점을 보완하기 위해, 콜라겐을 첨가물질로써 사용하는 것은 피브린 글루 제형 보완에 크게 기여할 것이다.
피브린 글루에 사용되는 피브린은 천연재료 접착제/지혈제로써 응용되어 산업화되어 있으며, 생체적합성 및 생분해성을 가진다. 피브린은 몇 주 내에 일반적으로 상처치유 과정에서 흡수되며, 염증반응, 면역반응, 조직괴사 혹은 섬유비대증 등의 부작용이 없는 것으로 알려져 있다. 또한, 피브린은 섬유아세포를 위한 천연지지체 등의 형태로 상처치료에 중요한 역할을 담당한다. 피브린 제품은 1970년대에 개념이 정립되어 1982년 유럽에서 최초의 제품이 상업화되어 현재까지 사용되고 있다. 최근 많은 연구에서 피브린을 생체 조직공학적 지지체로서 입증되고 있으며, 정형외과, 치과, 신경외과 등 다양한 분야에 적용되고 있다.
피브린 글루의 단점을 보완하기 위해 첨가물질로써 사용될수 있는 콜라겐은 구조 단백질 성분이다. 진피(dermis), 건/힘줄(tendon/ligament), 혈관 등 연조직 그리고 뼈, 연골과 같은 경조직을 구성되어, 포유류의 경우, 전체 단백질의 1/3 정도를 차지하고 있다. 콜라겐의 형태는 20가지 이상으로 알려져 있으며, 피부나 건/힘줄, 뼈 등을 구성하는 콜라겐 type I 이 콜라겐 중 90% 정도를 차지하고 있다. 콜라겐의 구조는 3가닥으로 구성된 분자량(molecular weight) 300,000 달톤(Dalton) (한가닥 100,000 Dalton 정도) 의 단백질이고, 아미노산 중 가장 작은 단위(분자량이 가장 작은)인 Glycine 이 반복적으로( - G X Y - ; Glycine은 계속 반복적으로, X, Y 는 달라지는 구성) 연결되어 있다. 따라서, Glycine이 콜라겐을 구성하는 아미노산에서 1/3 을 차지하고 있다. 콜라겐을 현재 의료용으로 사용하고 있는 분야는 지혈제, 창상피복제, 인공혈관, 주름개선용 등에 사용되고 있으며, 지혈제의 경우엔 1974년 calf skin 에서 추출한 콜라겐 분말형태인 Aviten 이라는 제품이 최초로 개발되어 현재까지도 사용되고 있다.
무엇보다도 콜라겐을 의료재생 분야에 사용하는 가장 큰 특징은 인체조직에 생체적합하여 세포 친화성을 보이는 물질이어서 세포의 부착과 성장 그리고 생존력 유지에 중요한 물질이라는 것이다. 또한, 혈액 내에 포함되어 있는 혈소판을 자극하여 혈소판 내 포함되어 있는 성장인자를 유도하여 결손된 조직을 재생하는데 역할을 한다. 뿐만 아니라, 콜라겐의 구조는 삼중나선 구조는 단일구조의 단백질보다 상대적으로 분해성이 유지되어 인체 내에서 스캐폴드 역할을 할 수 있다.
이러한 물질의 결합은 기본적으로 조직실란트가 지녀야 하는 생분해성 특성을 지니고 재생을 방해하지 않는 특성을 유지할 뿐만 아니라, 피브린 글루의 부족한 물성인 물리적 특성을 보완하고 분해정도를 늦추어 분해성의 재생골격을 제공할 것이다. 그래서 단순 실란트로써의 역할에 부가하여 조직 재생을 촉진하고 재생과정을 가속하여 치료과정을 단축시킬 것이다. 그리고 신속하게 사용하기 위하여 프리필드 타입으로 장착하여 냉동보관하는 제형도 가능하다.
조직실란트는 상처 수술부위의 봉합, 도포할 경우 종래의 방법보다 덜 고통스럽고, 감염위험이 적고 수술 시간이 단축되는 등 환자의 시술적 부담을 줄이고 만족도를 극대화하는 제품으로 이 분야는 크게 각광받을 것이며 시장규모도 점차 확대되고 있다. 또한, 이러한 제품의 개발은 조직의 재생을 도울 뿐 아니라, 앞으로 약물전달시스템 및 재생용 스캐폴드 등으로 사용하여 재생의학 분야에도 크게 기여할 것이다.
대한민국 공개특허 제2012-0125465호(출원번호 제2012-7018109호)(명칭: 건조 분말 피브린 실란트)가 출원된바 있다.
본 발명은 상기와 같은 종래 기술의 제반 문제점을 해소하기 위하여 안출한 것으로, 피브리노겐과 아프로티닌을 이용하여 제1물질을 혼합하는 단계와, 트롬빈과 염화칼슘 및 콜라겐을 이용하여 제2물질을 혼합하는 단계 및 제1물질과 제2물질을 상호 혼합하여 제3물질을 제조하는 단계가 포함됨을 제1목적으로 한 것이고, 상기한 기술적 구성에 의한 본 발명의 제2목적은 물리적 강도 비교 결과 콜라겐이 포함된 실란트가 높은 강도를 보이는 것을 확인하였고, 제3목적은 장기/단기 분해성 시험 결과 콜라겐이 포함된 실란트가 분해됨이 낮음을 보이는 것을 확인하였으며, 제4목적은 전자현미경 관찰을 통해 콜라겐과 피브린이 결합되어 안정된 구조를 보임을 확인하였고, 제5목적은 연골세포, 뼈세포, 지방추출 세포를 이용하여 성장 및 생존력을 비교한 결과 콜라겐이 포함된 구조에서 성장률이 좋았으며 높은 생존력을 보여주는 것을 확인하였으며, 제6목적은 콜라겐이 포함되면 높은 강도와 안정된 구조 유지 및 세포/혈액 친화적인 물질이 공급되어서 결손/손상 부위의 재생을 돕는데 큰 도움이 된다는 것을 확인하였고, 제7목적은 혈액 내 포함되어 있는 혈소판을 활성화시켜 조직재생을 유도할 수 있도록 한 것이며, 제8목적은 이로 인해 제품의 품질과 신뢰성을 대폭 향상시키므로 사용자인 소비자들의 다양한 욕구(니즈)를 충족시켜 좋은 이미지를 심어줄 수 있도록 한 콜라겐과 피브린이 혼합된 조직 실란트 및 그 제조방법을 제공한다.
이러한 목적 달성을 위하여 본 발명은 피브리노겐과 아프로티닌을 이용하여 제1물질을 혼합하는 단계; 트롬빈과 염화칼슘 및 콜라겐을 이용하여 제2물질을 혼합하는 단계; 및 제1물질과 제2물질을 상호 혼합하여 제3물질을 제조하는 단계;가 포함됨을 특징으로 하는 콜라겐과 피브린이 혼합된 조직 실란트의 제조방법을 제공한다.
또한 본 발명은 피브리노겐과 아프로티닌을 이용하여 제1물질을 혼합하는 단계; 트롬빈과 염화칼슘 및 콜라겐을 이용하여 제2물질을 혼합하는 단계; 및 제1물질과 제2물질을 상호 혼합하여 제3물질을 제조하는 단계를 거쳐 콜라겐과 피브린이 혼합된 조직 실란트를 제공한다.
상기에서 상세히 살펴본 바와 같이 본 발명은 피브리노겐과 아프로티닌을 이용하여 제1물질을 혼합하는 단계와, 트롬빈과 염화칼슘 및 콜라겐을 이용하여 제2물질을 혼합하는 단계 및 제1물질과 제2물질을 상호 혼합하여 제3물질을 제조하는 단계가 포함된다.
상기한 기술적 구성에 의한 본 발명은 물리적 강도 비교 결과 콜라겐이 포함된 실란트가 높은 강도를 보이는 것을 확인하였다.
그리고 본 발명은 장기/단기 분해성 시험 결과 콜라겐이 포함된 실란트가 분해됨이 낮음을 보이는 것을 확인하였다.
또한 본 발명은 전자현미경 관찰을 통해 콜라겐과 피브린이 결합되어 안정된 구조를 보임을 확인하였다.
그리고 본 발명은 연골세포, 뼈세포, 지방추출 세포를 이용하여 성장 및 생존력을 비교한 결과 콜라겐이 포함된 구조에서 성장률이 좋았으며 높은 생존력을 보여주는 것을 확인하였다.
아울러 본 발명은 콜라겐이 포함되면 높은 강도와 안정된 구조 유지 및 세포/혈액 친화적인 물질이 공급되어서 결손/손상 부위의 재생을 돕는데 큰 도움이 된다는 것을 확인하였다.
더하여 본 발명은 혈액 내 포함되어 있는 혈소판을 활성화시켜 조직재생을 유도할 수 있도록 한 것이다.
본 발명은 상기한 효과로 인해 제품의 품질과 신뢰성을 대폭 향상시키므로 사용자인 소비자들의 다양한 욕구(니즈)를 충족시켜 좋은 이미지를 심어줄 수 있도록 한 매우 유용한 발명인 것이다.
이하에서는 이러한 효과 달성을 위한 본 발명의 바람직한 실시 예를 첨부된 도면에 따라 상세히 설명하면 다음과 같다.
도 1 은 본 발명에 적용된 콜라겐과 피브린이 혼합된 조직 실란트의 전자 현
미경 사진(20,000X, 임계점 건조)
도 2 는 본 발명 콜라겐과 세포와의 결합 개념도.
도 3 은 본 발명 콜라겐의 혈소판 활성화 개념도.
도 4 는 본 발명에 적용된 콜라겐과 피브린이 혼합된 조직 실란트의 분해도
비교 그래프.
도 5 는 본 발명에 적용된 콜라겐과 피브린이 혼합된 조직 실란트 내에서의
연골세포 증식율 그래프.
도 6 은 본 발명에 적용된 콜라겐과 피브린이 혼합된 조직 실란트 내에서의
연골세포 증식 및 생존률 확인사진.
도 7 은 본 발명에 적용된 콜라겐과 피브린이 혼합된 조직 실란트 내에서의
뼈세포 증식율 그래프.
도 8 은 본 발명에 적용된 콜라겐과 피브린이 혼합된 조직 실란트 내에서의
뼈세포 증식 및 생존률 확인사진.
도 9 는 본 발명에 적용된 콜라겐과 피브린이 혼합된 조직 실란트 내에서의
지방추출 세포 증식 및 생존률 확인사진.
도 10 은 본 발명에 적용된 콜라겐과 피브린이 혼합된 조직 실란트를 듀얼장
치에 장착한 상태도.
본 발명에 적용된 콜라겐과 피브린이 혼합된 조직 실란트 및 그 제조방법은 도 1 내지 도 10 에 도시된 바와 같이 구성되는 것이다.
하기에서 본 발명을 설명함에 있어, 관련된 공지 기능 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명은 생략할 것이다.
그리고 후술되는 용어들은 본 발명에서의 기능을 고려하여 설정된 용어들로서 이는 생산자의 의도 또는 관례에 따라 달라질 수 있으므로 그 정의는 본 명세서 전반에 걸친 내용을 토대로 내려져야 할 것이다.
먼저, 본 발명은 피브리노겐과 아프로티닌을 혼합하여 제1물질을 제조하는 단계가 구비된다.
그리고 본 발명은 트롬빈과 염화칼슘 및 콜라겐을 혼합하여 제2물질을 제조하는 단계가 구비된다.
또한 본 발명은 제1물질과 제2물질을 상호 혼합하여 제3물질을 제조하는 단계가 구비되어 콜라겐과 피브린이 혼합된 조직 실란트를 제조하게 된다.
특히 본 발명에 적용된 상기 피브리노겐의 농도는 65~130 mg/mL, 아프로티닌의 농도는 1,000~3,000 KIU/mL로 이루어짐이 바람직하다.
그리고 상기 트롬빈의 농도는 40~600 U/ml, 염화칼슘의 농도는 4~140 mmol/mL, 콜라겐의 농도는 60 mg/mL 이하로 이루어짐이 바람직하다.
이때 상기 피브리노겐의 농도는 65~130 mg/mL가 바람직한 것으로, 이는 피브리노겐이 65mg/mL 이하일 경우에는 물리적 강도가 약해지고, 피브리노겐이 130 mg/mL 이상일 경우에는 물리적 구조가 조밀해져 공극 크기가 작아져서 세포의 활성을 저해시킬 수 있기 때문에 상기 피브리노겐의 농도는 65~130 mg/mL가 바람직하다.
또한 상기 아프로티닌의 농도는 1,000~3,000 KIU/mL가 바람직한 것으로, 이는 아프로티닌이 1,000 KIU/mL 이하일 경우에는 조성물의 분해가 빨리 진행되고, 아프로티닌이 3,000 KIU/mL 이상일 경우에는 아나팔락시스를 유발하는 위험성이 증가하기 때문에 상기 아프로티닌의 농도는 1,000~3,000 KIU/mL가 바람직하다.
또한 상기 트롬빈의 농도는 40 ~ 600 U/ml가 바람직한 것으로, 이는 트롬빈이 40 U/ml 이하일 경우에는 조성물의 물리적 강도가 약해지고, 트롬빈이 600 U/ml 이상일 경우에는 조성물의 구조가 조밀해져서 세포친화적이지 못하고 겔화속도가 급격히 빨라져 적용부위에 실란트로써의 역할을 하지 못할 가능성이 있기 때문에 상기 트롬빈의 농도는 40 ~ 600 U/ml가 바람직하다.
또한 상기 염화칼슘의 농도는 4~140 mmol/mL이 바람직한 것으로, 이는 염화칼슘이 4 mmol/mL 이하일 경우에는 겔화속도가 너무 늦고, 염화칼슘이 140 mmol/mL 이상일 경우에는 높은 삼투압의 영향으로 세포에 좋지 않은 영향을 미칠 수 있기 때문에 상기 염화칼슘의 농도는 4~140 mmol/mL이 바람직하다.
마지막으로 상기 콜라겐의 농도는 60 mg/mL 이하로 이루어짐이 바람직하고, 특히 상기 콜라겐의 바람직한 농도는 10~30 mg/mL으로 이루어짐이 바람직하다.
즉, 상기 콜라겐이 10 mg/mL 이하일 경우에는 물리적 강도가 약해지고, 콜라겐이 30 mg/mL 이상일 경우에는 분해성과 안정된 구조 유지 및 세포 혈액내 친화적이지 못하므로 상기 콜라겐의 농도는 10~30 mg/mL으로 이루어짐이 바람직하다.
한편, 본 발명에 적용된 상기 콜라겐과 피브린이 혼합된 조직 실란트의 제조방법을 보다 구체적으로 설명하면 다음과 같다.
먼저, 피브리노겐과 아프로티닌이 혼합된 제1물질을 제조하는 단계를 거친다.
이후 트롬빈과 염화칼슘 및 콜라겐이 혼합된 제2물질을 제조하는 단계를 거친다.
이어서 상기 제1물질은 튜얼키트의 일측에 넣고, 제2물질은 튜얼키트의 타측에 넣은 후 상호 제1,2물질을 혼합하여 제3물질을 제조하는 단계를 거쳐 콜라겐과 피브린이 혼합된 조직 실란트를 제조하게 된다.
더하여 본 발명은 상기 피브리노겐과 트롬빈에 아프로티닌과 칼슘용액을 각각 주입하고, 트롬빈에는 콜라겐 용액을 혼합하여 듀얼키트에 장착하여 콜라겐과 피브린이 혼합된 조직 실란트를 제조하게 된다.
본 발명은 상기한 콜라겐과 피브린이 혼합된 조직 실란트를 제조하는 각 단계를 거쳐 콜라겐과 피브린이 혼합된 조직 실란트를 제조할 수 있게 된다.
상기한 본원발명 콜라겐과 피브린이 혼합된 조직 실란트 및 그 제조방법을 실시예를 들어 설명하면 다음과 같다.
(실시예 1)
본 발명과 종래기술의 물성 비교
본 발명의 물리적 특성을 확인하기 위하여 물성측정기를 이용하여 최대응력, 젤강도, 인장강도 등을 확인하였다.
1. 시료준비
1) 종래기술은 그린플라스트 제품을 사용하였다.
2) 본 발명의 구성물은 그린플라스트의 피브리노겐과 트롬빈 건조물에 아프로티닌용액과 칼슘용액을 각각 주입하여 용해시키고, 트롬빈 용액에는 3% 콜라겐 용액을 혼합하여 듀얼키트에 장착하여 준비한다.
3) 물성측정을 위해서 각각 시료를 원기둥모양 (Φ12 X 15 mm)의 주형에 담아 형태를 제작한다.
2. 물성측정
1) 물성측정기 : Rheometer (CR-500DX, Sun scienctific rheometer)
2) 시험항목 : 최대응력(N), 젤강도(g-cm), 인장강도(g/cm2)
3) 시험조건 : 진입거리(7.5mm), 테이블스피드(50mm/min), 최대응력(10kg), 아답터(No.1 Φ20mm)
3. 시험결과
구분 최대응력 젤강도 인장강도
N g-cm g/cm2
본 발명 19.3 1212.9 2493.7
종래기술 13.4 831.7 1692.2
(실시예 2)
본 발명과 인용발명 제품의 분해성 비교 (단기/장기)
본 발명 조성물의 분해성을 확인하기 위하여 피브린 글루 제품과 일정기간 동안 물질의 분해정도를 확인한다.
1. 분해성 (단기)
1) 시료준비
- 종래기술은 그린플라스트 제품을 사용하였다.
- 본 발명의 구성물은 그린플라스트의 피브리노겐과 트롬빈 건조물에 아프로티닌용액과 칼슘용액을 각각 주입하여 용해시키고, 트롬빈 용액에는 3% 콜라겐 용액을 혼합하여 듀얼키트에 장착하여 준비한다.
- 물성측정을 위해서 각각 시료를 원기둥모양 (Φ8 X 5 mm)의 주형에 담아 형태를 제작한다.
2) 분해성 확인 위한 처리 조건
- 용매는 두 가지 조건을 확인하였다. DMEM 배지만을 사용한 조건과 Liberase TM이 포함된 DMEM 배지를 사용한 조건으로 확인하였다.(Liberase TM의 농도는 10 ug/mL로 한다.)
- 시료는 12 well plate에 담아 12시간 동안 2시간 단위로 조성물의 잔존무게로써 분해성 양상을 확인한다.
3) 시험결과
- 효소처리한 분해조건에서는 종래기술의 제형이 12시간 내 90%이상의 분해됨을 확인하였고, 본 발명의 조성물은 12시간 동안 80% 정도 잔류됨을 확인할 수 있다. DMEM 조건에서는 12시간 동안은 분해정도를 확인할 수 없었다.
2. 분해성 (장기)
1) 시료준비
- 종래기술은 그린플라스트 제품을 사용하였다.
- 본 발명의 구성물은 그린플라스트의 피브리노겐과 트롬빈 건조물에 아프로티닌용액과 칼슘용액을 각각 주입하여 용해시키고, 트롬빈 용액에는 3% 콜라겐 용액을 혼합하여 듀얼키트에 장착하여 준비한다.
- 물성측정을 위해서 각각 시료를 원기둥모양 (Φ12 X 15 mm)의 주형에 담아 형태를 제작한다.
2) 분해성 확인 위한 처리 조건
- 용매는 DMEM을 사용하고 37℃ 조건에서 1달간 육안 관찰한다.
3) 시험결과
- 본 발명의 조성물은 1개월 이상 관찰되나, 종래기술의 제형은 3주 내에 분해되었다. 본 발명의 조성물이 종래기술 제형보다 분해기간이 긴 것이 확인되었다.
(실시예 3)
본 발명의 전자현미경 분석
본 발명 조성물의 구조를 전자현미경으로 관찰한다.
1. 시료준비
- 조성물의 제조는 그린플라스트의 피브리노겐 용액과 콜라겐이 포함된 트롬빈/칼슘용액에 각각 준비한다. 콜라겐 용액의 농도는 3%(w/v) 적용한다.
- 준비된 각각의 용액은 듀얼키트에 적용하여 전자현미경 관찰을 위한 트레이에 분주하여 겔화시킨다.
2. 실험방법
- 본 발명의 조성물은 임계점 건조시킨 후, 전자현미경 관찰한다.
- 조성물의 임계점 건조는 알코올 처리를 통하여 진행하고 임계점 건조기(Hitachi, HCP-2) 에서 진행한다.
- 전자현미경에서 관찰하기 위한 시료는 검체 절단하여 골드코팅을 실시한 후에 SEM(Hitachi, S3500)으로 관찰한다.
- 전자현미경 분석은 2만배 확대하여 관찰하였다.
3. 시험결과
전자현미경의 2만배 확대 관찰한 결과, 콜라겐과 피브린 성분이 서로 교차하여 가교되는 양상이 확인되었다. 콜라겐의 섬유구조도 관찰되었다. 이러한 물질의 교차를 통하여 물리적 특성이 보강됨을 예상할 수 있다.
(실시예 4)
본 발명의 세포 적합성 및 성장확인 시험(연골세포)
본 발명의 조성물 내에서 연골세포의 성장(proliferation)과 생존률(viability)의 양상을 확인하기 위하여, CCK-8 assay 및 Calcein-AM & EthD-1 staining을 이용하였다.
1. 세포 및 조성물
- 세포는 인간을 제외한 동물의 연골세포를 사용하였다. 세포수는 조성물 혼합액 내 1,200 만개를 적용하였다.
- 조성물은 피브린글루 제품인 그린플라스트와 콜라겐을 각각 3%, 6% 콜라겐을 혼합하여 구성하였다.
- 조성물의 제조는 그린플라스트의 피브리노겐 건조물에 연골세포이 포함된 용액, 1 mL을 적용하여 용해시키고, 트롬빈/칼슘용액에 각각 농도의 콜라겐 용액, 1mL을 혼합하였다.
- 연골세포가 포함된 피브리노겐 용액과 콜라겐이 포함된 트롬빈 용액은 총 2 mL의 콜라겐-피브린 용액이 준비된다.
- 준비된 콜라겐-피브린 구성물은 배양을 위하여 24 well plate에 0.2 mL 씩 분주하고 2 - 3 일마다 DMEM 배지를 교체해 주면서 20일간 관찰한다.
2. CCK-8 assay
- 배양물이 담긴 well (24well plate)의 배지를 제거한다.
- 새로운 배지 1mL을 넣어준다.
- CCK-8 (Dojindo, CK04-11) 시약을 배지 용량의 10% 인 100uL씩 각각 well에 첨가한 후 5% CO2 배양기에서 37℃조건에서 3시간동안 반응시킨다.
- 반응이 완료되면, 반응액을 microplate reader 로 흡광도(450nm)를 측정한다.
- 측정된 OD값을 이용하여 배양 기간별 cell proliferation을 확인한다.
3. Calcein-AM & EthD-1 staining
- The LIVE/DEADViability/Cytotoxicity Assay Kit (Invitrogen, L3224)의 Calcein AM 과 EthD-1 이 각각 2μM, 4μM이 되도록 완충용액에 혼합하여 working solution을 만든다.
- 배양물을 새로운 24 well plate로 옮기고, working solution 1mL을 넣고 빛이 차단된 상태에서 20분간 반응시킨 후 형광현미경으로 live cell 과 dead cell을 관찰한다. 살아있는 세포는 초록색으로 죽은 세포는 빨간색으로 관찰된다.
4. 시험결과
가. CCK-8 assay (도 5)
나. Calcein-AM & EthD-1 staining(도 6)
(실시예 5)
본 발명의 세포 적합성 시험 (뼈세포)
본 발명의 조성물 내에서 뼈세포의 성장(proliferation)과 생존률(viability)의 양상을 확인하기 위하여, CCK-8 assay 및 Calcein-AM & EthD-1 staining을 이용하였다.
1. 세포 및 조성물
- 세포는 인간을 제외한 동물의 뼈세포를 사용하였다. 세포수는 조성물 혼합액 내 1,200 만개를 적용하였다.
- 조성물은 피브린글루 제품인 그린플라스트와 콜라겐을 각각 3%, 6% 콜라겐을 혼합하여 구성하였다.
- 조성물의 제조는 그린플라스트의 피브리노겐 건조물에 연골세포이 포함된 용액, 1 mL을 적용하여 용해시키고, 트롬빈/칼슘용액에 각각 농도의 콜라겐 용액, 1mL을 혼합하였다.
- 뼈 세포가 포함된 피브리노겐 용액과 콜라겐이 포함된 트롬빈 용액은 총 2 mL의 콜라겐-피브린 용액이 준비된다.
- 준비된 콜라겐-피브린 구성물은 배양을 위하여 24 well plate에 0.2 mL 씩 분주하고 2 - 3 일마다 α-MEM 배지를 교체해 주면서 20일간 관찰한다.
2. CCK-8 assay
- 배양물이 담긴 well (24well plate)의 배지를 제거한다.
- 새로운 배지 1mL을 넣어준다.
- CCK-8 (Dojindo, CK04-11) 시약을 배지 용량의 10% 인 100uL씩 각각 well에 첨가한 후 5% CO2 배양기에서 37℃조건에서 3시간동안 반응시킨다.
- 반응이 완료되면, 반응액을 microplate reader 로 흡광도(450nm)를 측정한다.
- 측정된 OD값을 이용하여 배양 기간별 cell proliferation을 확인한다.
3. Calcein-AM & EthD-1 staining
- The LIVE/DEADViability/Cytotoxicity Assay Kit (Invitrogen, L3224)의 Calcein AM 과 EthD-1 이 각각 2μM, 4μM이 되도록 완충용액에 혼합하여 working solution을 만든다.
- 배양물을 새로운 24 well plate로 옮기고, working solution 1mL을 넣고 빛이 차단된 상태에서 20분간 반응 시킨 후 형광현미경으로 live cell 과 dead cell을 관찰한다.
4. 시험결과
가. CCK-8 assay(도 7)
나. Calcein-AM & EthD-1 staining(도 8)
(실시예 6)
본 발명의 세포 적합성 시험 (지방추출세포)
본 발명의 조성물 내에서 지방추출세포의 성장(proliferation)과 생존률(viability)의 양상을 확인하기 위하여, CCK-8 assay 및 Calcein-AM & EthD-1 staining을 이용하였다.
1. 세포 및 조성물
- 세포는 지방으로부터 추출된 세포를 사용하였다. 세포수는 조성물 혼합액 내 1,200 만개를 적용하였다.
- 조성물은 피브린글루 제품인 그린플라스트와 콜라겐을 각각 3% 콜라겐을 혼합하여 구성하였다.
- 조성물의 제조는 그린플라스트의 피브리노겐 건조물에 연골세포이 포함된 용액, 1 mL을 적용하여 용해시키고, 트롬빈/칼슘용액에 각각 농도의 콜라겐 용액, 1mL을 혼합하였다.
- 지방추출세포가 포함된 피브리노겐 용액과 콜라겐이 포함된 트롬빈 용액은 총 2 mL의 콜라겐-피브린 용액이 준비된다.
- 준비된 콜라겐-피브린 구성물은 배양을 위하여 24 well plate에 0.2 mL 씩 분주하고 2 - 3 일마다 DMEM 배지를 교체해 주면서 20일간 관찰한다.
2. Calcein-AM & EthD-1 staining
- The LIVE/DEADViability/Cytotoxicity Assay Kit (Invitrogen, L3224)의 Calcein AM 과 EthD-1 이 각각 2μM, 4μM이 되도록 PBS에 혼합하여 working solution을 만든다.
- 배양물을 새로운 24 well plate로 옮기고, working solution 1mL을 넣고 빛이 차단된 상태에서 20분간 반응 시킨 후 형광현미경으로 live cell 과 dead cell을 관찰한다.
3. 시험결과
- Calcein-AM & EthD-1 staining(도 9)
한편 본 발명은 상기의 구성부를 적용함에 있어 다양하게 변형될 수 있고 여러 가지 형태를 취할 수 있다.
그리고 본 발명은 상기의 상세한 설명에서 언급되는 특별한 형태로 한정되는 것이 아닌 것으로 이해되어야 하며, 오히려 첨부된 청구범위에 의해 정의되는 본 발명의 정신과 범위 내에 있는 모든 변형물과 균등물 및 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
본 발명 콜라겐과 피브린이 혼합된 조직 실란트 및 그 제조방법의 기술적 사상은 실제로 동일결과를 반복 실시 가능한 것으로, 특히 이와 같은 본원발명을 실시함으로써 기술발전을 촉진하여 산업발전에 이바지할 수 있어 보호할 가치가 충분히 있다.

Claims (6)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 피브리노겐과 아프로티닌 그리고 트롬빈과 염화칼슘 및 콜라겐이 각각 상호 혼합되어 콜라겐과 피브린이 혼합된 조직 실란트를 제조하는 방법에 있어서,
    농도 65~130 mg/mL의 피브리노겐과, 농도 1,000~3,000 KIU/mL의 아프로티닌이 혼합된 제1물질을 제조하는 단계;
    농도 40~600 U/ml의 트롬빈과, 농도 4~140mmol/mL의 염화칼슘 및 농도 10~30 mg/mL의 콜라겐이 혼합된 제2물질을 제조하는 단계; 및
    제1물질은 튜얼키트의 일측에 넣고, 제2물질은 튜얼키트의 타측에 넣은 후 상호 제1,2물질을 혼합하여 제3물질을 제조하는 단계;가 포함됨을 특징으로 하는 콜라겐과 피브린이 혼합된 조직 실란트의 제조방법.
  5. 청구항 4 에 있어서,
    피브리노겐 용액과 트롬빈 용액에 아프로티닌 용액과 칼슘용액을 각각 주입하고, 트롬빈 용액에는 콜라겐 용액을 혼합하여 듀얼키트에 장착함을 특징으로 하는 콜라겐과 피브린이 혼합된 조직 실란트의 제조방법.
  6. 청구항 4 항의 제조방법으로 제조된 콜라겐과 피브린이 혼합된 조직 실란트.
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