SK287874B6

SK287874B6 - A method of preparing a collagen sponge, a device for extracting a part of a collagen foam, and en elongated collagen sponge

Info

Publication number: SK287874B6
Application number: SK1036-2003A
Authority: SK
Inventors: Alfred Schaufler
Original assignee: Nycomed Pharma As
Priority date: 2001-01-25
Filing date: 2002-01-25
Publication date: 2012-02-03
Also published as: IL157096A0; CA2434964C; NZ527166A; CZ20032198A3; BG108121A; EP1368419A2; EA006700B1; HK1058371A1; HUP0303893A2; BR0206705B1; EP1547626A3; BRPI0206708B8; ME00587B; MXPA03006687A; NZ527167A; CN1290907C; BRPI0206705B8; WO2002058749A3; JP4104462B2; EA006686B1

Abstract

Method of preparation a collagen sponge involves the following steps: prepare a collagen gel, into the collagen gel is stiring air to obtain a collagen foam which is dried to yield a dry block of collagen sponge with three-dimensional structure. From the block of collagen sponges are separated parts of sponge with cavity a diameter greater than 0.75 mm and less than 4 mm.

Description

Oblasť techniky

Predložený vynález sa týka spôsobu prípravy kolagénovej huby. Kolagénová huba pripravená podľa tohto vynálezu je najmä vhodná v chirurgii, a to primáme na zástavu kapilárneho krvácania. Kolagénovú hubu je možné tiež použiť ako nosič určený na pokrytie prípravkom fibrinového lepidla. Opísané je zariadenie na oddelenie časti kolagénovej peny. Pozdĺžna kolagénová huba podľa vynálezu je primáme určená na gastrointestinálne použitie.

Doterajší stav techniky

Kolagén sa ako hemostatické činidlo používa už od konca šesťdesiatych rokov minulého storočia. Kolagén je u všetkých cicavcov najbežnejším štruktúrnym proteínom. Monomémy proteín asi s 300 kDa (tropokolagén) sa v určitých miestach kovalentne zosieťuje. Hotový proteín je preto nerozpustný a vytvára charakteristické vlákenká s vysokou pevnosťou v ťahu. Boli opísané mnohé podtriedy kolagénu, pričom najbežnejším je kolagén typu 1, hlavný kolagénový typ v koži, šľachách, kostiach a rohovke. Kolagén je vláknitý proteín pozostávajúci v podstate z trojskrutkovice s dĺžkou asi 290 nm. Päť týchto troj skrutko vie (tropokolagénových molekúl) je usporiadaných do mikrovlákien s priemerom asi 3,6 nm. Tieto mikrovlákna majú poláme a nepoláme segmenty, ktoré sú ľahko dostupné pre špecifické interfibriláme a intrafibriláme interakcie. Mikrovlákna sú zbalené do tetragonálnej mriežky a tvoria subfibrily s priemerom asi 30 nm. Tieto subfibrily sa potom usporiadajú do kolagénových vlákienok, čiže základnej jednotky spojivového tkaniva, ktorá má priemer niekoľko stoviek nanometrov a ktorá je preto neviditeľná vo svetle mikroskopu ako tenká čiarka, pozri odkaz 1. Kolagénový gél a kolagénová huba tak, ako sa vyrobia v priebehu výrobného procesu, obsahujú tieto vlákenká ako najmenšie jednotky, ako to bolo dokázané mikroskopiou.

Kolagén je možné použiť ako materiál na utesnenie poranenia, eventuálne s poťahom obsahujúci fibrinové lepidlo. Fibrinové lepidlá, t. j. kombinácie fibrinogénu, trombínu a aprotinínu, sa úspešne terapeuticky používajú už mnoho rokov na lepenie tkanív a nervov a na utesnenie povrchov, ktoré slabo krvácajú. Jednou z nevýhod fibrinového lepidla je, že v prípade väčšieho krvácania sa lepidlo obvykle odplaví už pred tým, ako dôjde k dostatočnej polymerizácii fibrínu. Na prekonanie tohto problému začali chirurgovia manuálne aplikovať kvapalné fibrinové lepidlá na absorbujúce nosiče, ako je kolagénová pletenina.

Napriek značnému úspechu týchto kombinovaných aplikácií nebol tento spôsob kvôli niektorým nevýhodám použitý v širokom meradle. Príprava je totiž relatívne ťažkopádna, spôsob vyhotovenia vyžaduje skúsenosť a zručný personál a prípravok nie je v stavoch núdze pohotovo k dispozícii a čas na prípravu je v rozmedzí 10 až 15 minút. Tieto faktory stimulovali vývoj zlepšeného výrobku, čo viedlo k vývoju pevného kombinovaného prostriedku kolagénového nosiča pokrytého poťahom pevného fibrinogénu, pevného trombínu a pevného aprotinínu, ako je to opísané v patente EP 0 059 265. Výrobok opísaný v EP 0 059 265, ktorý sa predáva pod obchodným názvom TachoComb®, je možné aplikovať priamo na poranenie. Keď sa poťah dostane do kontaktu s vodnými tekutinami ako je krv, ďalšími telesnými tekutinami alebo fyziologickým roztokom, jeho zložky sa rozpustia a vznikne fibrín. Výrobok sa aplikuje na poranenie s miernym pritlačením a kolagén sa pevne naviaže (prilepí) na poranený povrch. Dôjde k zástave krvácania a poranenie sa uzatvorí.

Okrem určitej stimulačne] aktivity pri koagulácii krvi je fúnkciou kolagénu v prostriedku TachoComb® hlavne to, že tento nosič absorbuje a dodáva mechanickú stabilitu koagulačnému prípravku, ktorým je pokrytý. Ďalšie výhody kolagénu, zvlášť jeho hubovitej formy, sú jeho biodegradabilita, jeho relatívne vysoká pevnosť v ťahu, dokonca za mokra, jeho vysoká rezistencia proti prienikom kvapalní a vzduchu a jeho vysoká pružnosť za mokra.

Predložený vynález sa primáme týka výroby kolagénovej huby, ktorú možno použiť ako nosič pre fibrinogén, trombín a/alebo aprotinín, napríklad ako v prostriedku TachoComb®. Kolagénovú hubu možno tiež použiť priamo, to znamená bez pokrytia, a to ako bandáž na miestne poranenie, ako podporu pri zástave krvácania, ako prevenciu obnovenia krvácania, na slabé, difúzne krvácania z parenchýmových orgánov, na aplikáciu na popáleniny, kožné štepy, preležaniny alebo kožné defekty alebo ako bandáž na miestne poranenia.

V predchádzajúcich dieloch v odbore bolo navrhnuté množstvo spôsobov prípravy kolagénového nosiča. Patent WO 36/05 811 opisuje plnivovú mikrohubu na imobilizáciu bioaktívnych materiálov v pohyblivých systémoch bioreaktora, kde táto mikrohuba obsahuje vysoko zosieťovanú kolagénovú matricu. Vysoko zosieťovaná kolagénová matrica sa pripraví rozomletím zdroja kolagénu typu I, II alebo III, kde sa získajú vlákna s priemerom rádovo 1 až 50 pm s dĺžkou do 200 pm. Rozomletý kolagén sa spracuje na rozpustný kolagén, ktorý je rozpustný v rozpúšťadle alebo sa nerozpustný kolagén, ktorý sa disperguje v rozpúšťadle zmiešaním s týmto rozpúšťadlom, ako je octová kyselina, mliečna kyselina, propiónová kyselina alebo maslová kyselina. Pri dispergovaní kolagénu sa miešanie uskutoční miešačkou pomocou vysoko rýchlostného miešania tak, aby sa získali mikrovlákna kolagénu. Ďalej sa s kolagénovou kvapalnou zmesou zmieša zvážené aditívum a táto kompozičná zmes sa spracuje na malé kvapôčky a zmrazením sa spevní. Na výrobu ma2 lých častíc je opísaných množstvo techník. Zmrazená kompozitná zmes sa vymrazí sa zníženého tlaku, kde kombinácia zmrazenia a sušenia sa uvádza ako lyofilizácia. Na lyofilizovaný kolagénový matricový kompozit sa pôsobí takým spôsobom, aby sa kolagén zosieťoval. Kolagén je možné zosieťovať použitím buď chemických sieťovacich činidiel, hlbokou dehydratáciou počas zvýšenej teploty, alebo kombináciou obidvoch týchto metód. Kolagénová matrica má byť rezistentná proti kolagenáze a inej enzymatickej degradácii, čím robí tieto materiály zvlášť vhodnými na kultiváciu mikroorganizmov. Po premytí zosieťovanej kolagénovej matrice možno mikrohuby sterilizovať a aseptický zabaliť. V plnivovej mikrohube je kolagénová matrica svojou pórovou štruktúrou otvorená proti povrchu a má strednú veľkosť póru v rozsahu 1 až 150 pm, pričom póry matrice tvoria 70 až 98 % objemu mikrohuby. Mikrohuba má ďalej strednú veľkosť častíc 100 až 1 000 pm a špecifickú hmotnosť 1,05. Plnivom môže byť kov alebo zliatiny kovu, kovové oxidy a keramika.

US patent č. 5 660 857 opisuje spôsob prípravy kompozitu obsahujúceho nerozpustnú proteínovú matricu a olejovitý materiál, ktoré sú vhodné ako materiály pre chirurgické obväzy a biomedicínske implantáty a ako kozmetický materiál na aplikáciu na koži. Spôsob US patentu č. 5 660 57 obsahuje kroky zmiešania proteínu, olejovitého materiálu a vody za vzniku emulzie olejovitého materiálu vo vodnej disperzii proteínu a následne sušenie alebo lyofilizácia emulzie za vzniku filmu alebo huby. Nerozpustný vláknitý protein je prevažne tvorený nerozpustným kolagénom, ktorý možno vhodne získať z hovädzej kože. V jednom vyhotovení môže byť kolagén pred použitím napučaný v mliečnej kyseline.

Patent WO 99/13 902 opisuje spôsob výroby rastovej matrice pre meningeálne tkanivo a obsahuje krok prípravy fyziologicky kompatibilného kolagénu, ktorý je v podstate bez aktívnych vírusov a priónov. Kolagén sa vytvaruje do formy filmu, huby, netkaného kolagénu alebo plsti. Kolagén sa získa spôsobom obsahujúcim vyčistenie kože, šliach, väzov alebo kostného tuku. Materiál sa potom podrobí pôsobeniu enzýmu, čím kolagénový materiál napučí. Kolagénový materiál potom ďalej napúča v kyslom roztoku. Potom sa kolagénová zmes zhomogenizuje. Získaný výrobok môže byť matricou vo forme kolagénovej huby, netkanej matrice, plsti alebo filmu, alebo kompozitu dvoch alebo viacerých v predchádzajúcom texte uvedených foriem. Kolagénovú hubu je možné získať úpravou spôsobov tvorby kolagénových húb, ktoré sú opísané v US patente č. 5 019 087. Hubu možno pripraviť lyofilizáciou kolagénovej disperzie pripravenej podľa patentu WO 99/13 902. Dosiahnutá hustota huby je 0,1 až 120 mg/cm³. Podľa opisu patentu WO 99/13 902 je veľkosť póru v rozpätí 10 až 500 pm. Opísané sú laminátové typy kolagénovej huby a kolagénový film.

US patent č. 5 618 551 sa týka nezosieťovaného a potenciálneho zosieťovateľného, pepsínom spracovaného kolagénového alebo želatínového prášku modifikovaného oxidatívnym štepením vo vodnom roztoku, kde tento prášok je rozpustný v kyslom pH a stabilný je aspoň jeden mesiac pri skladovaní pri teplote pod 0 °C. Patent sa ďalej týka spôsobu prípravy prášku, ktorý obsahuje prípravu kyslého roztoku pepsínom spracovaného kolagénu, ďalej podrobenie kyslého vodného roztoku kontrolovanej oxidácii pri laboratórnej teplote, vyzrážanie oxidovaného, nezosieťovaného, pepsínom spracovaného kolagénu v kyslom pH a oddelenie, skoncentrovanie a dehydratáciu nezosieťovaného, pepsínom spracovaného kolagénu tak, aby sa získal vo forme reaktívneho kyslého prášku a zmrazenie a skladovanie získaného reaktívneho kyslého prášku pri teplote pod 0 °C.

Patent GB 1 292 326 opisuje spôsob a zariadenie na prípravu kolagénových disperzií s ohľadom na ich aplikáciu, kde sa pripraví suspenzia kolagénových vlákien a následne sa vnesie do reakčného priestoru s miešacím zariadením. V reakčnom priestore je podtlak, pri ktorom sa suspenzia počas miešania a kontrolovaného okysľovania prostredníctvom minerálnej alebo organickej kyseliny prevedie na disperziu. Podľa opisu patentu GB 1 292 326 môže byť príprava hubovitých kolagénových výrobkov realizovaná z disperzie alebo gélov kolagénu. V tomto kontexte dokument odkazuje na lyofilizáciu a na disperziu alebo gély, ktoré sú veľmi bohaté na vzduchové bublinky. Patent GB 1 292 326 ďalej spomína problém uspokojivého spôsobu kontroly zavádzania alebo eliminácie vzduchových bubliniek. Dokument v dvoch príkladoch opisuje kolagénovú disperziu neobsahujúcu vzduchové bublinky, ktorá má obsah kolagénu 2,5 % a prevzdušnenú disperziu kolagénu s koncentráciou kolagénu 2,5 %.

Chemical Abstracts, Columbus Ohio, USA, zväzok 89, 13. júla 1983, č. 24, uvádzajú kolagén získaný zo živočíšnych tkanív, ako je koža alebo šľacha z kostí, ktorý bol vystavený pôsobeniu kyseliny. Kolagén sa dialýzou preskupí, pričom sa počas tohto procesu vytvorí sieť vysoko dvoj lomných kryštalických vlákien. Kolagén možno vytvarovať do 0,5 mm až 2 cm prúžkov alebo zmiešať so vzduchom za vzniku húb alebo dispergovať ako krém.

Podstata vynálezu

Bolo zistené, že úspešné pokrytie kolagénovej huby prípravkom fibrínového lepidla je závislé od štruktúry kolagénovej huby. Cieľom predloženého vynálezu je vyrobiť kolagénovú hubu s určitou štruktúrou, ktorá je vhodná na pokrytie prípravkom fibrínového lepidla tak, aby sa získal materiál na hojenie a uzatvorenie poranenia. Ďalším cieľom tohto vynálezu je dosiahnuť zlepšené fyzikálne vlastnosti huby, ako je jej vlhkosť, pružnosť, hustota a modul pružnosti v porovnaní s hubami podľa doterajšieho stavu techniky. Cieľom je tiež získať kolagénovú hubu, ktorá je vzduchotesná a kvapalinotesná v tom zmysle, že keď sa kolagénová huba aplikuje na poranenie, nedovolí vzduchu alebo kvapaline cez ňu presakovať. Ešte ďalším cieľom vynálezu je pripraviť materiál na uzatváranie poranení, ktorý je možné použiť v gastrointestinálnom trakte alebo na priedušnici.

Predmetom vynálezu je spôsob prípravy kolagénovej huby, ktorý zahŕňa tieto kroky:

- pripraví sa kolagénový gél,

- do kolagénového gélu sa vmieša vzduch tak, že sa získa kolagénová pena,

- kolagénová pena sa vysuší tak, že sa získa suchý blok kolagénovej huby s trojrozmernou štruktúrou s usporiadanými dutinami, ktoré sú oddelené a v podstate úplne uzatvorené stenami kolagénového materiálu,

- z bloku kolagénovej huby sa oddelia časti huby s priemerom dutiny väčším ako 0,75 mm a menším ako 4 mm alebo časti so stredným diagonálnym rozmerom dutiny 3 mm.

Termínom priemer dutiny sa v tomto kontexte označuje najväčšia priama vzdialenosť od steny k stene dutiny, to znamená najväčšej diagonálnej priamej vzdialenosti v dutine. Dutiny môžu mať polygonálny tvar, ako je oktogonálny tvar.

Bolo zistené, že priemer dutiny väčší ako 0,75 mm a menší ako 4 mm alebo stredný priemer dutiny maximálne 3 mm, robí kolagénovú hubu zvlášť vhodnú na pokrytie prípravkom fibrínového lepidla. Kolagénový gél má výhodne hmotnosť sušiny v rozpätí 2 až 20 mg sušiny na 1 g gélu, prednostne 4 až 18 mg, najmä 5 až 13 mg a výhodne je 6 až 11 mg na 1 g gélu. Dynamická viskozita kolagénového gélu, meraná ako krútivá sila, je výhodne 2 až 20 N.cm, prednostne je 6 až 8 N.cm. Kolagénová huba má výhodne taký obsah vody, ktorý nie je väčší ako 20 %, prednostne 10 až 15 %, výhodne ako 18 %. Modul pružnosti kolagénovej huby je výhodne v rozpätí 5 až 100 N/cm², ako je 10 až 50 N/cm² a hustota huby je výhodne 1 až 10 mg/cm³, ako je 2 až 7 mg/cm³.

Bolo zistené, že kolagénová huba pripravená spôsobom podľa tohto vynálezu je vzduchotesná a kvapalinotesná v tom zmysle, že keď sa kolagénová huba aplikuje na poranenie, tak nedovolí vzduchu alebo kvapaline prejsť kolagénovou hubou. Kvapaliny sa absorbujú do huby. Tento efekt sa primáme dosiahne v dôsledku tej skutočnosti, že krok vmiešania vzduchu do kolagénového gélu poskytne kolagénovú hubu, ktorá má trojrozmernú štruktúru s usporiadanými oddelenými dutinami a v podstate celkom uzatvorenými stenami kolagénového materiálu, a to v protiklade k známym kolagénovým hubám, ktoré majú vláknitú štruktúru.

Kolagénový gél môže obsahovať materiál rôznych typov, ako je kolagén typu I, II alebo III z cicavčích, transgénnych alebo rekombinantných zdrojov, ale je možné použiť aj všetky ďalšie typy kolagénu. Kolagén môže obsahovať materiál zo šliach vybraných zo skupiny pozostávajúcej z konských šliach a hovädzích šliach.

Kolagénový gél môže ďalej alebo alternatívne obsahovať rekombinantý kolagénový materiál.

Obsah kolagénu oddelených častí huby je vo vzťahu k sušine huby výhodne 50 až 100 %, ako je 75 až 100 %, ako je 80 až 100 %, ako je 90 až 100 %, ako je 92 až 100 %, ako je 92 až 98 %, ako je 93 až 97 %, ako je 94 až 96 %.

Krok prípravy kolagénového gélu výhodne obsahuje kroky skladovania šliach pri teplote -10 až -30 °C a zlúpnutie šliach, odstránenie cudzieho proteínu zo šliach, zníženie obsahu choroboplodných zárodkov v šľachách, napučanie šliach, homogenizáciu napučaných šliach.

Kroky skladovania, zlúpnutia, odstránenia proteínu, zníženie obsahu choroboplodných zárodkov a napučanie majú za cieľ prečistiť surový materiál, pričom krok homogenizácie má za cieľ získať kolagén vo forme gélu.

Krok zníženia obsahu choroboplodných zárodkov výhodne obsahuje pridanie kyseliny k šľachám, a to kyseliny ako je organická kyselina, ako je mliečna kyselina. K šľachám sa navyše výhodne pridá organické rozpúšťadlo, ako je alkohol, ako je etanol. Krok napučania šliach ďalej výhodne obsahuje pridanie mliečnej kyseliny ku šľachám. Použitá mliečna kyselina môže byť 0,40 až 0,50 % mliečna kyselina, ako je 0,45 % mliečna kyselina.

Krok napučania šliach môže obsahovať udržovanie šliach pri teplote 4 až 25 °C, ako pri teplote 10 až 20 °C počas 48 až 200 hodín, ako počas 100 až 200 hodín.

Krok homogenizácie napučaných šliach sa výhodne uskutoční tak, aby sa získala veľkosť častíc fragmentov kolagénového gélu, to znamená guľôčok vlákien s priemerom 0,8 až 1,2 cm, ako je 1 cm. Fyzikálne vlastnosti kolagénového gélu sú navyše výhodne také, ako je to uvedené. Vhodné vlastnosti môžu byť napríklad dosiahnuté uskutočnením kroku homogenizácie napučaných šliach prostredníctvom ozubeného kotúčového mlynčeka alebo zodpovedajúceho homogenizačného zariadenia.

Krok vmiešania vzduchu do kolagénového gélu výhodne obsahuje kroky vmiešania okolitého vzduchu do gélu prostredníctvom mixéra tak, aby vznikla kolagénová pena, vedenie namiešanej kolagénovej peny do frakcionačného kanálika, oddelene kolagénového gélu a kolagénovej peny vo fŕakcionačnom kanáliku.

Aspoň časť kolagénového gélu oddeleného od kolagénovej peny vo fŕakcionačnom kanáliku sa môže viesť späť do mixéra. V tomto prípade pomer medzi množstvom kolagénového gélu, ktorý sa vedie späť do mixéra z frakcionačného kanálika a množstvom čerstvého kolagénového gélu vedeného do mixéra, je výhodne 0,1 až 0,5. Krok oddelenia kolagénového gélu a kolagénovej peny výhodne zahŕňa kroky oddelenia vybranej časti kolagénovej peny obsiahnutej vo fŕakcionačnom kanáliku, vedenie vybranej časti kolagénovej peny von z frakcionačného kanálika na jej vysušenie.

Vo zvýhodnenom uskutočnení tohto spôsobu sa udržuje vo fŕakoionačnom kanáliku teplota 15 až 40 °C, ako je 20 až 35 °C.

Po vmiešaní vzduchu do kolagénového gélu sa kolagénová pena môže homogenizovať počas 2 až 4 minút.

Pred krokom sušenia kolagénovej peny a po kroku vmiešania vzduchu do kolagénového gélu sa ku kolagénovej pene môže pridať neutralizačné činidlo, pričom kolagénová pena sa výhodne neutralizuje preto, aby sa z hodnoty pH obvykle 2,5 až 3,5 dosiahla hodnota pH kolagénovej peny 6,5 až 8,5. Možno použiť neutralizačné činidlo obsahujúce roztok amoniaku, pričom kolagénová pena sa výhodne neutralizuje počas 5 až 30 hodín, ako 10 až 20 hodín, ako 24 hodín.

Pred krokom sušenia kolagénovej peny sa kolagénová pena výhodne naplní do sušiaceho kontajnera, a to takým spôsobom, že počas plnenia sa do peny nedostane v podstate žiadny vzduch.

Krok sušenia výhodne obsahuje sušenie pri teplote 15 až 60 °C, ako pri 20 až 40 °C, počas 50 až 200 hodín, ako 100 až 150 hodín tak, aby sa získala vysušená kolagénová huba. Sušenie možno uskutočniť pri ľahko zníženom atmosférickom tlaku, ako pri tlaku 70 až 90 kPa (700 až 900 mbar), ako 80 kPa (800 mbar).

Kolagénová huba vyrobená spôsobom podľa tohto vynálezu výhodne spĺňa aspoň jedno z nasledujúcich kritérií:

Hodnota pH 5,0 až 6,0, obsah mliečnej kyseliny maximálne 5 %, obsah amoniaku maximálne 0,5 %, obsah rozpusteného proteínu vypočítaného ako obsah albumínu maximálne 0,5 %, obsah síranového popola maximálne 1,0 %, obsah ťažkých kovov maximálne 20 ppm, mikrobiologická čistota s maximálne 10³CFU/g, obsah kolagénu 75 až 100 %, hustota 1 až 10 mg/cm³, ako 2 až 7 mg/cm³, modul pružnosti 5 až 10 N/cm, ako 10 až 50 N/cm.

Krok oddelenia časti kolagénovej huby môže obsahovať rozdelenie kolagénovej huby na množstvo častí pomocou rozrezania. Získané časti je možné tvarovať do akejkoľvek žiaducej formy, ako je kónická, cylindrická, v tom je zahrnutá cylindrická s prstencovým prierezom, obdĺžniková, polygonálna, štvorcová a ploché prúžky alebo môže byť vhodnou granulačnou metódou prevedená na granulát atď.

Druhý predmet predloženého vynálezu sa týka spôsobu prípravy kolagénovej huby, ktorý obsahuje kroky prípravy kolagénového gélu, vmiešanie vzduchu do kolagénového gélu tak, aby sa získala kolagénová pena, vysušenie kolagénovej peny tak, aby sa získal vysušený blok kolagénovej huby s dutinami, z bloku kolagénovej huby oddelenie časti huby, ktoré majú nasledujúce vlastnosti: modul pružnosti v rozpätí 5 až 10 N/cm, hustotu v rozpätí 1 až 10 mg/cm³, priemer dutiny väčší ako 0,75 mm a menší ako 4 mm alebo stredný priemer dutiny maximálne 3 mm.

Predpokladá sa, že ktorýkoľvek z krokov a tiež všetky kroky spôsobu týkajúceho sa prvého predmetu tohto vynálezu možno tiež uskutočniť spôsobom týkajúcim sa druhého predmetu tohto vynálezu. Navyše ktorúkoľvek a všetky vlastnosti a rysy kolagénovej huby vyrobenej spôsobom podľa prvého vynálezu možno tiež získať spôsobom podľa druhého predmetu tohto vynálezu.

Tretí predmet predloženého vynálezu sa týka zariadenia na oddelenie časti kolagénovej peny a premeny inej časti kolagénovej peny na kolagénový gél, ktorá obsahuje fŕakcionačný kanálik so vstupom pre vtok kolagénovej peny, výstup pre časť toku kolagénovej peny a spodnú časť, ktorá je naklonená nadol v smere toku kolagénovej peny, aspoň jeden výtok pre kolagénový gél na spodnej častí frakcionačného kanálika, kde poloha výtoku je pohyblivá vo vertikálnom smere na konci frakcionačného kanálika.

Štvrtý predmet predloženého vynálezu sa týka pozdĺžnej kolagénovej huby majúcej naprieč idúci otvor alebo vývrt a pružnú stenu. Vo zvýhodnenom vyhotovení môže byť takáto kolagénová huba použitá na uzatváranie poranení alebo obnovu stien gastrointestinálneho traktu a priedušnice u cicavcov. Kolagénová huba tak môže mať kruhový alebo eliptický prierez. Kolagénová huba sa môže aplikovať ako výplň v gastrointestinálnom trakte alebo ako vonkajší rukáv použitý na vonkajší povrch gastrointestinálneho traktu.

Vnútorný priemer naprieč idúceho otvoru alebo vývrtu na použitie v rôznych častiach gastrointestináleho traktu alebo priedušnice u ľudí môže byť napríklad nasledujúci: črevá 0,5 až 6 cm, konečník 1 až 4 cm, hrubé črevo 2 až 6 cm, tenké črevo 0,5 až 3 cm, pažerák 0,5 až 2 cm, priedušnica 1 až 4 cm.

Kolagénovú hubu je možné napríklad použiť na uzatváranie poranení po chirurgickom odstránení vydutí na stenách gastrointestinálneho traktu, ako napr. po rektálnej chirurgii alebo po chirurgickom odstránení hemoroidov. Príklady indikácií na možné použitie kolagénovej huby podľa tohto vynálezu sú:

prekrytie poranení, podpora pri zástave krvácania ako slabého, difúzneho krvácania z parenchýmových orgánov, chirurgické zákroky na operačných miestach, kde sa pred aplikáciou kolagénovej huby uskutočnil elektrochirurgický zákrok alebo podviazanie, prevencia obnovenia krvácania (zabezpečenie stehov), aplikácia na popáleniny, bandáž na miestne poranenie, podanie liečiva, ako je podanie antibiotík.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Obrázky 1 a 2 obsahujú vývojový diagram ilustrujúci kroky obsiahnuté vo zvýhodnenom vyhotovení spôsobu podľa tohto vynálezu, obrázok 3 je fotografiou povrchu kolagénovej huby vyrobenej spôsobom podľa tohto vynálezu (láskavo poskytol Prof. Dr. Roman Carbon, Chirurgicá univerzitná klinika (Chirurgische Univ. Kliník), Erlangen, Nemecko) a obrázok 4 opisuje miešacie zariadenie na získanie a meranie viskozity kolagénového gélu.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Vo zvýhodnenom vyhotovení vynález zahŕňa nasledujúce kroky, ktoré sú ilustrované na obrázkoch 1 a 2:

Krok 1 Dodanie hlbokozmrazených konských šliach

Konské šľachy sa dodávajú a skladujú pri -18 až -25 °C.

Krok 2 Zlúpnutie konských šliach

V polozmrznutom stave sa zo šliach zlúpne tenká povrchová vrstva, a to manuálne alebo mechanickým odstránením nožom. Šľachy sa potom opäť hlboko zmrazia na -18 až -25 °C.

Krok 3 Mechanické krájanie zlúpnutých konských šliach

Zlúpnuté, zmrazené šľachy sa prípadne 30 minút dezinfikujú v 70 % etanole a do výrobných miestností prechádzajú v etanole. Potom sa šľachy premyjú a po premytí sa zhutnia do blokov a hlboko sa zamrazia na -18 až -25 °C. Zmrazené bloky šliach sa potom nakrájajú rezacím strojom s rotujúcim krájacím nožom na plátky s hrúbkou asi 1 mm.

Krok 4 Premytie a dezinfekcia plátkov šliach

Po odstránení rozpustných proteínov sa plátky šliach najprv namočia do vody pre injekcie na 3 až 6 hodín, potom sa premyjú vodou na injekcie alebo demineralizovanou vodou, alebo soľnými roztokmi obsahujúcimi Ca²⁺ a/alebo Mg²⁺ ióny s koncentráciou v rozpätí 1 až 10 mM, pokiaľ nie je supematant zbavený hemoglobínu. Plátky šliach sa potom 15 minút dezinfikujú v 70 % etanole a dvakrát premyjú v 0,45 % mliečnej kyseline v pitnej vode (sterilnej, filtrovanej a zbavenej pyrogénov), aby sa odstránil etanol.

Krok 5 Výroba kolagénového gélu

Premyté plátky šliach sa namočia do 0,45 % mliečnej kyseliny na 2 až 5 dní, výhodne na 4 dni a potom sa zhomogenizujú na kolagénový gél. Vystavenie 0,45 % mliečnej kyseline je považované za jeden z hlavných krokov vírusovej inaktivácie.

Krok 6 Napenenie

Do kolagénového gélu sa pomocou rozpúšťacích miešadiel naženie vzduch. Vznikajúca pena sa frakcionuje a frakcia s veľkosťou bubliniek 1 až 3 mm sa odoberie. Pena sa z oceľovej nádoby vleje do suda, ktorým sa pomaly rotuje počas asi 3 minút, aby sa získala homogénna prepúšťa tekutiny, že umožní odvodnenie peny. Po 5 až 24 hodinách, výhodne 18 až 24 hodinách, sa vysušená pena vystaví plynnému amoniaku, generovanému napríklad z 26 % roztoku amoniaku čistoty DAB. Počas tohto procesu nadbytok amoniaku zmení pH peny do alkalickej oblasti. Amoniak sa odstráni počas následného sušiaceho procesu, kedy vznikne výrobok s neutrálnym pH.

Krok 7 Sušenie peny

Pena sa suší v teplom vzduchu v sušiacej komore z vysoko akostnej ocele počas 48 až 150 hodín, výhodne 120 až 150 hodín. Výsledkom je kolagénová huba tvarovaná do blokov.

Krok 8 Krájanie kolagénových blokov

Bloky, uvádzané tiež ako pruhy, kolagénu je možné napríklad použiť ako nosiče určené na pokrytie. Krájanie sa uskutoční pomocou vertikálneho krájacieho stroja. Najprv sa odrežú strany bloku, aby sa získal blok s vertikálnymi stranami s dĺžkou strany 50 cm. Tento blok sa potom vertikálne nareže na 4 pruhy so šírkou 11 cm. Tieto pruhy sa opäť zrežú na ich hornej a spodnej strane a potom sa nakrájajú na prúžky s rozmermi 50 cm x 11 cm x 0,4 až 0,7 cm. Hmotnosť prúžkov kolagénovej huby je výhodne taká, aby vyhovela ktorejkoľvek špecifikácii kolagénu vo finálnom výrobku, ktorá sa má dosiahnuť, a to ako pri výrobkoch TachoComb®H, Tacho Comb® a Tachotop®.

Krok 9 Triedenie prúžkov kolagénovej huby

Prúžky kolagénovej huby sa potom podrobia vizuálnej kontrole. Prúžky s jedným alebo viacerými nasledujúcimi nedostatkami sa odstránia:

prúžky majú stredný priemer dutiny menší ako 1 mm alebo väčší ako 3 mm, prúžky majú nehomogénnu štruktúru dutín, prúžky majú diery (jednotlivé dutiny s hĺbkou väčšou ako je hrúbka huby).

Vytriedené prúžky sa skladujú maximálne 1 rok v dezinfikovaných kontajneroch z ľahkého kovu pri teplote 15 až 22 °C.

Obrázok 3 je fotografiou povrchu kolagénovej huby vyrobenej spôsobom podľa tohto vynálezu, pričom táto fotografia bola urobená pri zväčšení 20 000 (láskavo poskytol Prof. Dr. Roman Carbon, Chirurgická univerzitná klinika (Chirurgische Univ. Kliník), Erlangen, Nemecko). Povrch, uvedený na fotografii obrázka 3, je povrchom priečneho rezu v kolagénovej hube pripravenej spôsobom podľa predloženého vynálezu. Tmavé plochy na fotografii predstavujú dutiny, zatiaľ čo svetlé plochy na fotografii predstavujú kolagénový materiál, v to zahŕňajúc steny kolagénového materiálu oddeľujúceho dutiny.

Obrázok 4 ukazuje miešacie zariadenie na získanie meradla viskozity kvapaliny, ktoré obsahuje nádobu upravenú tak, aby pojala kvapaliny a prostriedky na miešanie uvedenej kvapaliny. Miešacie prostriedky obsahujú tyčinku pripojenú k prvku v tvare vidličky. Kvapalina v nádobe sa mieša točením tyčinky, čo má za následok rotačný pohyb prvku v tvare vidličky. Prvok v tvare vidličky obsahuje primárnu časť 41, ku ktorej je pripojená tyčinka a prvú a druhú sekundárnu časť 42.

Sekundárne časti sú pripojené ku koncom primárnej časti. Ako prvok v tvare vidličky rotuje, jeho povrchy pohybujú kvapalinou a tak kvapalinu miešajú.

V jednom vyhotovení má zariadenie nasledujúce rozmery. Nádoba je 110 mm vysoká a 146 mm široká. Tyčinka je 220 mm dlhá a má priemer 10 mm. Primárna časť vidličky je 90 mm dlhá a 30 mm vysoká. Sekundárne časti 42 sú 90 mm vysoké a 30 mm široké. Vzdialenosť od vonkajšieho okraja sekundárnych častí 42 k vnútornému povrchu nádoby je 28 mm.

Príklad 1

Nasledujúca tabuľka I obsahuje hodnoty parametrov troch rôznych cyklov spôsobu podľa tohto vynálezu.

Tabuľka 1 Parametre troch cyklov spôsobu tohto vynálezu

	Cyklus 1	Cyklus 2	Cyklus 3
Zlúpnutie šliach: odpad ( %)	24	40	38
Biozáťaž pred zlúpnutím (CFU/g šliach)	7x10⁴	2,4xl0⁵	5xl0⁵
Biozáťaž po zlúpnutí (CFU/g šliach)	-	2x10³	5xl0³
Hmotnosť šliach na dávku (kg)	12,00	10,5	10,5
Premytie zlúpnutých šliach demineralizovanou vodou (min.)	30	30	30
Odstránenie rozpustného proteínu: premytie nakrájaných šliach demineralizovanu vodou až je omývací roztok bez hemoglobínu (hod.)	5	5	1,5
Dezinfekcia 70 %, etanolom (min.)	15	15	15
Premytie v 0,45 % mliečnej kyseline (min.)	21	21	21
Napučanie v 0,45 % mliečnej kyseline (hod.)	144	120	120
Homogenizácia	Ozubený mlyn Condux	Ozubený mlyn Condux	Ozubený mlyn Condux
Viskozita gélu (z krútivej sily)(N.cm)	6,9 až 7,8	6,9 až 7,8	7,1 až 9,4
Hmotnosť sušiny kolagénového gélu (mg/g)	6,3 až 8,3	8,9 až 9,4	7,8 až 9,4
Doba penenia na blok (min.)	37 až 47	51 až 58	54 až 62
Biozáťaž (CFU/ml mokrej peny)	-	2	1
Odvodňovacia perióda (hod.)	18,5	22	18
Doba neutralizácie (hod.)	24	24	24,5
Sušiaca perióda (hod.)	147	148,5	144,5
Hmotnosť na jeden blok (g)	200 až 256	195 až 228	177 až 257
Biozáťaž prúžkov kolagénovej huby (CFU/g)	Maž 1000	<18 až 124	<11 až 33
Výťažok prúžkov kolagénovej huby Dĺžka 110 mm Šírka 500 mm Výška 4 až 7 mm Hmotnosť 770 až 1500 mg/prúžok	405	379	433

Tabuľka II uvádza hodnoty parametrov piatich rôznych kolagénových húb získaných spôsobom podľa tohto vynálezu.

Tabuľka 11 Hodnoty parametrov piatich typov kolagénových húb

	Huba I	Huba II	Huba III
Hodnota pH (konkrétne 4 až 6)	5,4	5,1	5,4
Obsah mliečnej kyseliny (%)	2,6	2,8
Obsah amoniaku ( % )	0,2	0,2
Obsah rozpustného proteínu ( %)	0,1	0,05
Obsah síranového popola (%)	0,4	0,3
Mikrobiologická čistota (CFU/g)	14 až 1000	<18 až 124	<11 až 33
Obsah kolagénu vztiahnutý k sušine (%)	95	95	98
Obsah vody (%)	14	15	1 6
Modul pružnosti (N/cm)	10 až 45	15 až 50	12,3 až 41,0
Veľkosť dutiny (priemer, stredná hodnota j (mm)	2,3	2,1	2,9
Hustota (mg/cm³)	2,5 až 6,1	2,9 až 5,9	2,4 až 5,0

	Huba IV	Huba V
Hodnota pH	5,3
Obsah mliečnej kyseliny (%)	2,3
Obsah amoniaku (%)	0,1
Obsah rozpustného proteínu (%)	0,04
Obsah síranového popola (%)	0,3
Obsah ťažkých kovov (ppm)	<20	<20
Mikrobiologická čistota (CFU/g)	12 až 345	<15 až 48
Obsah kolagénu vztiahnutý k sušine (%)	95	96
Obsah vody (%)	14	12
Modul pružnosti (N/cm)	10,4 až 42,1	20 až 47
Veľkosť dutiny (priemer, stredná hodnota) (mm)	2,9	2,5
Hustota (mg/cm³)	2,9 až 5,3	2 až 6,8

Príklad 2

Tento príklad sa týka nepriameho merania viskozity kolagénového gélu meraním krútivej sily.

Na meranie krútivej sily bolo použité nasledujúce vybavenie:

Miešačka EUROSTAR POWER control-visc Programové vybavenie Windows IKASODFT dc Indikátor krútivej sily VISCOKLOCK VK 1 Zberač údajov DC 2

Špeciálna konštrukcia miešadla (vidličky) s definovanými rozmermi, pozri obrázok 4

Nálevka s vnútorným priemerom 14,6 cm a výškou 20,5 cm

Teplomer

Váhy

Nálevka sa naplnila množstvo 1500 g kolagénového gélu. Teplota vzorky bola 23 °C. Do stredu nálevky sa upevnilo vidličkové miešadlo. Potom sa začalo s meraním. Indikátor krútivej sily sa previedol na odpor miešadla v jednotkách N.cm, ktoré reprezentujú dynamickú viskozitu gélu.

Na overenie merania krútivej sily sa pripravil štandardný roztok 59 % polyetylénglykolu. Viskozita tohto roztoku sa zmerala pomocou Haakeho viskozimetra RV 20 Rotovisko. Dynamická viskozita η tohto roztoku bola v rozpätí η = 92 5 ± 25 mPa. s pri 23 °C. Táto viskozita bola nameraná uvedeným meracím vybavením pre gély a takto zmeraná hodnota krútivej sily by mala byť v rozpätí 3,66 N.m ± 5 % pri 23 °C.

Odkazy

1. Baer E., Gaethercole L. J. a Keller A.: Štruktúrna hierarchia šľachového kolagénu: predbežný súhrn (Structure hierarchies in tendom collagen: an interim summary), dokumenty Colstonskej konferencie 1974, 189, Hiltner A,, Cassidy J.J. a Baer E.: Mechanické vlastnosti biologických polymérov (Mechanical properties of biological polymers), Ann.Rev.Mater.Sci.15, 455(1985).

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Spôsob prípravy kolagénovej huby, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa tieto kroky:

- pripraví sa kolagénový gél,

- do kolagénového gélu sa vmieša vzduch tak, že sa získa kolagénová pena, kolagénová pena sa vysuší tak, že sa získa suchý blok kolagénovej huby s trojrozmernou štruktúrou s usporiadanými dutinami, ktoré sú oddelené a v podstate úplne uzatvorené stenami kolagénového materiálu,

- z bloku kolagénovej huby sa oddelia časti huby s priemerom dutiny väčším ako 0,75 mm a menším ako 4 mm alebo časti so stredným diagonálnym rozmerom dutiny 3 mm.
2. Spôsob podľa nároku 1,vyznačujúci sa tým, že obsah kolagénu v oddelených častiach huby je 50 až 100 %.
3. Spôsob podľa nároku 1 alebo 2, vyznačujúci sa tým, že kolagénový gél obsahuje kolagénový materiál rôznych typov aspoň z jedného zdroja vybraného z cicavčích, transgénnych alebo rekombinantných zdrojov.
4. Spôsob podľa nároku 3, vyznačujúci sa tým, že kolagén obsahuje materiál zo šliach vybraných zo skupiny pozostávajúcej z konských šliach a hovädzích šliach.
5. Spôsob podľa nároku 3 alebo 4, vyznačujúci sa tým, že krok prípravy kolagénového gélu zahŕňa tieto kroky:

- šľachy sa skladujú pri teplote -10 až -30 °C a potom sa odlúpnu,

- zo šliach sa odstráni cudzí proteín,

- v šľachách sa zníži obsah choroboplodných zárodkov,

- šľachy sa napučia a

- napučané šľachy sa homogenizujú.
6. Spôsob podľa nároku 5, vyznačujúci sa tým, že na zníženie obsahu choroboplodných zárodkov sa ku šľachám pridá kyselina a organické rozpúšťadlo.
7. Spôsob podľa nároku 6, vyznačujúci sa tým, že kyselinou je organická kyselina, prednostne kyselina mliečna.
8. Spôsob podľa nároku 6 alebo 7, vyznačujúci sa tým, že organickým rozpúšťadlom je alkohol, prednostne etanol.
9. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 5 až 8, vyznačujúci sa tým, že na napučanie šliach sa ku šľachám pridá kyselina mliečna.
10. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 5 až 9, vyznačujúci sa tým, že sa použije kyselina, ktorá má hodnotu pH v rozpätí 1 až 4, prednostne 1,5 až 3,5, prednostne 2,5 až 3,0.
11. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 5 až 10, vyznačujúci sa tým, že sa použije 0,45 % kyselina mliečna.
12. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 5 až 11,vyznačujúci sa tým, že pri napučaní šliach sa použije uloženie šliach pri teplote 4 až 25 °C počas 48 až 200 hodín.
13. Spôsob podľa nároku 12, vyznačujúci sa tým, že sa šľachy na napučanie uložia na 100 až 120 hodín.
14. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 5 až 13, v y z n a č u j ú c i sa t ý m , že pri homogenizácii sa napučané šľachy premenia na hmotu obsahujúcu častice šliach, kde tieto častice majú dĺžku alebo priemer 0,8 až 1,2 cm.
15. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 5 až 13,vyznačujúci sa tým, že pri homogenizácii sa napučané šľachy premenia na hmotu s viskozitou 505 až 5 055 mPa.s.
16. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 5 až 15, vyznačujúci sa tým, že homogenizácia napučaných šliach sa uskutočňuje pomocou ozubeného kotúčového mlyna alebo porovnateľného zariadenia.
17. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov 1 až 16, vyznačujúci sa tým, že kolagénový gél má dynamickú viskozitu 505 až 5055 mPa.s.
18. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov, vyznačujúci sa tým, že vmiešanie vzduchu do kolagénového gélu zahŕňa tieto kroky:

- okolitý vzduch sa vmieša do gélu pomocou mixéru, pričom vznikne kolagénová pena,

- namiešaná gélová pena sa privedie do frakcionačného kanálika a

- kolagénový gél a kolagénová pena obsiahnuté vo fŕakcionačnom kanáliku sa oddelia.
19. Spôsob podľa nároku 18, vyznačujúci sa tým, že sa aspoň časť kolagénového gélu oddeleného od kolagénovej peny vo fŕakcionačnom kanáliku odvádza späť do mixéra.
20. Spôsob podľa nároku 19, vyznačujúci sa tým, že pomer medzi množstvom kolagénového gélu, ktorý sa odvádza späť do mixéra z frakcionačného kanálika, a množstvom čerstvého kolagénového gélu uvádzaného do mixéra je 0,1 až 0,5.
21. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 18 až 20, vyznačujúci sa tým, že oddelenie kolagénovej peny od kolagénového gélu zahŕňa tieto kroky:

- oddelenie zvolenej časti kolagénovej peny obsiahnutej vo frakcionačnom kanáliku a

- odvedenie zvolenej časti kolagénovej peny von z frakcionačného kanálika na jej vysušenie.
22. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 18 až 21,vyznačujúci sa tým, že vo frakcionančom kanáliku sa udržuje teplota 15 až 40 °C.
23. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov, vyznačujúci sa tým, že po vmiešaní vzduchu do kolagénového gélu sa kolagénová pena ďalej homogenizuje počas 2 až 4 minút.
24. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov, vyznačujúci sa tým, že pred vysušením kolagénovej peny a po vmiešaní vzduchu do kolagénového gélu sa do kolagénovej peny pridá neutralizačné činidlo a kolagénová pena sa neutralizuje až do hodnoty pH kolagénovej peny v rozpätí 6,5 až 8,5.
25. Spôsob podľa nároku 24, vyznačujúci sa tým, že neutralizačné činidlo obsahuje roztok amoniaku.
26. Spôsob podľa nároku 24 alebo 25, vyznačujúci sa tým, že sa kolagénová pena neutralizuje počas 5 až 30 hodín.
27. Spôsob podľa nároku 26, vyznačujúci sa tým, že sa kolagénová pena neutralizuje počas 20 až 30 hodín.
28. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov, vyznačujúci sa tým, že sušenie kolagénovej huby sa uskutočňuje pri teplote 15 až 60 °C počas 48 až 200 hodín.
29. Spôsob podľa nároku 28, vyznačujúci sa tým, že sušenie sa uskutočňuje pri tlaku 70 až 90 kPa.
30. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov, vyznačujúci sa tým, že sušenie kolagénovej huby sa uskutočňuje pri teplote 15 až 40 °C počas 100 až 200 hodín.
31. Spôsob prípravy kolagénovej huby podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa tieto kroky:

- pripraví sa kolagénový gél,

- do kolagénového gélu sa vmieša vzduch tak, že sa získa kolagénová pena,

- kolagénová pena sa vysuší tak, že sa získa suchý blok kolagénovej huby s trojrozmernou štruktúrou s usporiadanými dutinami, ktoré sú oddelené a v podstate úplne uzatvorené stenami kolagénového materiálu,

- z bloku kolagénovej huby sa oddelia časti huby majúce nasledujúce vlastnosti:

- modul pružnosti v rozpätí 5 až 100 N/cm²,

- hustotu v rozpätí 1 až 10 mg/cm³,

- priemer dutiny väčší ako 0,75 mm a menší ako 4 mm alebo stredný priemer dutiny maximálne 3 mm.