RU2679616C1 - Способ приготовления тромбофибринового сгустка, обладающего ростстимулирующими свойствами - Google Patents
Способ приготовления тромбофибринового сгустка, обладающего ростстимулирующими свойствами Download PDFInfo
- Publication number
- RU2679616C1 RU2679616C1 RU2018123988A RU2018123988A RU2679616C1 RU 2679616 C1 RU2679616 C1 RU 2679616C1 RU 2018123988 A RU2018123988 A RU 2018123988A RU 2018123988 A RU2018123988 A RU 2018123988A RU 2679616 C1 RU2679616 C1 RU 2679616C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- platelet
- btp
- thrombofibrin
- clot
- granules
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title abstract description 26
- UCTWMZQNUQWSLP-UHFFFAOYSA-N adrenaline Chemical compound CNCC(O)C1=CC=C(O)C(O)=C1 UCTWMZQNUQWSLP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 49
- 239000008187 granular material Substances 0.000 claims abstract description 27
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims abstract description 25
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 23
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 claims abstract description 18
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 claims abstract description 18
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims abstract description 15
- 210000004623 platelet-rich plasma Anatomy 0.000 claims abstract description 14
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims abstract description 12
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims abstract description 11
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims abstract description 11
- 238000002347 injection Methods 0.000 claims abstract description 8
- 239000007924 injection Substances 0.000 claims abstract description 8
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 7
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 16
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 abstract description 5
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 abstract description 4
- UCTWMZQNUQWSLP-VIFPVBQESA-N (R)-adrenaline Chemical compound CNC[C@H](O)C1=CC=C(O)C(O)=C1 UCTWMZQNUQWSLP-VIFPVBQESA-N 0.000 abstract description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 abstract description 2
- 229940102884 adrenalin Drugs 0.000 abstract 1
- 210000001772 blood platelet Anatomy 0.000 description 94
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 14
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 10
- 206010052428 Wound Diseases 0.000 description 8
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 8
- 230000010118 platelet activation Effects 0.000 description 7
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 6
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 6
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 6
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 5
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 4
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- DPKHZNPWBDQZCN-UHFFFAOYSA-N acridine orange free base Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC2=NC3=CC(N(C)C)=CC=C3C=C21 DPKHZNPWBDQZCN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 3
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 description 3
- DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-N benzoquinolinylidene Natural products C1=CC=CC2=CC3=CC=CC=C3N=C21 DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 3
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 2
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 2
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 2
- 210000001840 diploid cell Anatomy 0.000 description 2
- 229960001484 edetic acid Drugs 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 2
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 2
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 2
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 2
- HRZFUMHJMZEROT-UHFFFAOYSA-L sodium disulfite Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S(=O)S([O-])(=O)=O HRZFUMHJMZEROT-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 235000010262 sodium metabisulphite Nutrition 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 210000002536 stromal cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 2
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 2
- 229930182837 (R)-adrenaline Natural products 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 1
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 101000621371 Homo sapiens WD and tetratricopeptide repeats protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000892274 Human adenovirus C serotype 2 Adenovirus death protein Proteins 0.000 description 1
- 101000820656 Rattus norvegicus Seminal vesicle secretory protein 4 Proteins 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 239000011127 biaxially oriented polypropylene Substances 0.000 description 1
- 229920006378 biaxially oriented polypropylene Polymers 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 1
- 230000006835 compression Effects 0.000 description 1
- 238000007906 compression Methods 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 229960005139 epinephrine Drugs 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 210000003608 fece Anatomy 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 1
- 230000023597 hemostasis Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000002386 leaching Methods 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 1
- 230000018127 platelet degranulation Effects 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 208000010110 spontaneous platelet aggregation Diseases 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008215 water for injection Substances 0.000 description 1
- 230000029663 wound healing Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
- A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Public Health (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области медицины, а именно регенеративной медицины, и может быть использовано для стимуляции репаративных процессов в поврежденных тканях. Способ получения тромбофибринового сгустка включает забор венозной крови пациента, выделение богатой тромбоцитами плазмы (БоТП), введение в БоТП раствора 10%-ного хлорида кальция и инкубацию БоТП, при этом дополнительно к раствору 10%-ного хлорида кальция в БоТП вводят препарат для инъекций «Адреналин гидрохлорид-Виал» из расчета 5-7 мкл 10%-ного раствора хлорида кальция и 20-25 мкл препарата «Адреналин гидрохлорид-Виал» на 100 мкл БоТП, содержащей не менее 100 тыс. тромбоцитов с гранулами на 1 мкл, осуществляют инкубацию БоТП при температуре 20-22°С для образования тромбоцитарного геля, при этом время инкубации БоТП составляет 20-30 мин при содержании тромбоцитов с гранулами свыше 35%, 30-50 мин - при содержании тромбоцитов с гранулами 10-35%, после чего осуществляют дополнительную инкубацию образованного геля до образования тромбофибринового сгустка с его последующим отбором. Тромбофибриновый сгусток, полученный вышеописанным способом, обладает ростстимулирующими свойствами. 1 ил., 3 табл.
Description
Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится к области медицины, а именно регенеративной медицины, и может быть использовано для стимуляции репаративных процессов в поврежденных тканях.
Уровень техники
Из уровня техники известен метод получения тромбоцитарного геля из богатой тромбоцитами плазмы с использованием хлорида кальция и тромбина [Amable P.R., Carias R.B., Teixeira M.V., da Cruz Pacheco I., 
do Amaral R.J., Granjeiro J.M., Borojevic R. Platelet-rich plasma preparation for regenerative medicine: optimization and quantification of cytokines and growth factors. Stem Cell Res Ther. 2013. 4 (3):67].
Однако известный метод требует длительной оптимизации процедур центрифугирования, не позволяет после ретракции тромбофибринового сгустка сохранить в составе геля биологически активные вещества, секретируемые тромбоцитами, не содержит данных о влиянии полученного геля на жизнеспособность диплоидных клеток человека,
Наиболее близким к заявляемому является способ получения тромбоцитарного геля на основе богатой тромбоцитами аутоплазмы [Применение аппликаций богатой тромбоцитами аутоплазмы в лечении больных с хроническими ранами различной этиологии. Методические рекомендации, авт.Оболенский В.Н., Ермолова Д.А, Макаров М.С., Конюшко О.И., Сторожева М.В., Лаберко Л.А., Боровкова Н.В. - М., Департамент здравоохранения города Москвы, 2013. -16 с.]. В состав тромбоцитарного геля входит богатая тромбоцитами плазма (БоТП), выделенная из крови пациента, и 10% раствор хлорида кальция; 1 мл препарата содержит 934-952 мкл БоТП и 48-66 мкл 10% раствора хлорида кальция. У пациента осуществляют забор крови в стерильные одноразовые вакутейнеры с 3,8% цитратом натрия. Для выделения БоТП исходную кровь центрифугируют в течение 8 мин при 460 g. Затем с помощью дозатора в асептичных условиях отбирают нижнюю фракцию плазмы, наиболее богатую тромбоцитами. Для получения тромбоцитарного геля в плазму с тромбоцитами вводят 10% раствор хлорида кальция из расчета 50-70 мкл на 1 мл БоТП и инкубируют БоТП при 37°С в течение 20-30 мин. Инкубация может производиться как в стерильных одноразовых пробирках, так и в стерильных стеклянных чашках. Биологическую эффективность БоТП пациента оценивают in vitro на примере культуры фибробластов человека линии М-22. Экспериментально установлено, что адекватно подобранная доза БоТП в 1,5-2,5 раза увеличивает пролиферативную активность клеток М-22 без нарушения их жизнеспособности. Применение тромбоцитарного геля в виде сгустка при лечении больных с длительно незаживающими ранами различной этиологии позволило значительно ускорить процесс заживления ран, сократить время пребывания в стационаре, сократить стоимость лечения более чем в 2 раза, улучшить качество жизни больного (Оболенский В.Н. и др. Стимуляция регенераторных процессов в хронических ранах с помощью богатой тромбоцитами аутоплазмы: клинико-экспериментальное исследование. Клиническая и экспериментальная хирургия, Журнал имени академика Б.В.Петровского, 2016, Т. 4, №1, с. 38-43).
Однако данный метод не включает оценку качества тромбоцитов пациента в клинической практике, что создает риск получения геля с низким уровнем ростовых факторов, не позволяет получить тромбоцитарный гель в отсутствие термостата, не позволяет выделить из тромбоцитарного геля тромбофибриновый сгусток, обладающий выраженными рост-стимулирующими свойствами.
Раскрытие изобретения
Задачей изобретения является усовершенствование способа получения тромбоцитарного геля и тромбофибринового сгустка на его основе, для использования в лечении больных с длительно незаживающими ранами различной этиологии.
Техническим результатом, на достижение которого направлено заявленное изобретение, является получение тромбофибринового сгустка, обладающего рост-стимулирующими свойствами, за счет активации тромбоцитов человека и использовании температурного режима, позволяющего провести активацию тромбоцитов без их полной дегрануляции.
Технический результат достигается при осуществлении способа получения тромбофибринового сгустка, включающего забор венозной крови пациента в стандартную пробирку с антикоагулянтом, выделение богатой тромбоцитами плазмы (БоТП), введение в БоТП раствора 10% хлорида кальция и инкубацию БоТП, оценку содержания в БоТП биологически полноценных тромбоцитов (тромбоцитов с гранулами), при этом дополнительно к раствору 10% хлорида кальция вводят в БоТП препарат для инъекций «Адреналина гидрохлорид-Виал» из расчета 5-7 мкл 10%-го раствора хлорида кальция и 20-25 мкл препарата «Адреналина гидрохлорид-Виал» на 100 мкл БоТП, содержащей не менее 100 тыс. тромбоцитов с гранулами на 1 мкл, инкубацию БоТП осуществляют при температуре 20-22°С для образования тромбоцитарного геля, при этом время инкубации БоТП составляет 20-30 мин при содержании тромбоцитов с гранулами свыше 35%, 30-50 мин при содержании тромбоцитов с гранулами 10-35%, после чего осуществляют дополнительную инкубацию образованного геля в течение 10-20 мин для образования тромбофибринового сгустка и отбор тромбофибринового сгустка.
Краткое описание чертежей
Изобретение поясняется чертежами, где на фиг. 1 представлена фотография витально окрашенных (трипафлавином и акридиновым оранжевым) мезенхимальных мультипотентных стромальных клеток человека через 3 суток культивирования без ТФ и в присутствии ТФ, полученных двумя разными методами (метод-прототип и заявляемый метод). Увеличение ×40; а - без ТФ (контроль); б - ТФ, полученный методом-прототипом; в - ТФ, полученный заявляемым методом.
Осуществление изобретения
Заявляемый способ приготовления тромбофибринового сгустка включает следующие этапы:
1. Забор венозной крови пациента в стандартную пробирку с антикоагулянтом CPD (цитрат) или ЭДТА.
2. Выделение богатой тромбоцитами плазмы (БоТП), для получения которой образцы крови пациента центрифугируют при 300-400 g в течение 4-5 минут, после чего отбирают супернатант.
3. Приготовление витального красителя с использованием, например, трипафлавина и акридинового оранжевого.
4. Оценка содержания в БоТП биологически полноценных тромбоцитов (тромбоцитов с гранулами), %.
5. Введение в БоТП раствора 10% хлорида кальция и препарата «Адреналин-Виал» из расчета 5-7 мкл 10% хлорида кальция и 20-25 мкл препарата для инъекций «Адреналина гидрохлорид-Виал» на 100 мкл БоТП.
6. Инкубация активированной БоТП при комнатной температуре (20-22°С) в пробирке, эппендорфе или емкости с плоским дном для получения тромбоцитарного геля, при этом время инкубации БоТП составляет 20-30 мин при содержании тромбоцитов с гранулами свыше 35 (предпочтительно до 75%), при содержании тромбоцитов с гранулами от 10 до 35% (включительно) время инкубации БоТП составляет 30-50 мин.
7. Выделение тромбофибринового сгустка. Для выделения тромбофибринового сгустка образованный гель дополнительно инкубируют в тех же условиях (20-22°С) в течение 10-20 мин, после чего в стерильных условиях пинцетом отбирают тромбофибриновый сгусток.
На первом этапе решения поставленной задачи был осуществлен подбор оптимального индуктора активации тромбоцитов для получения тромбоцитарного геля. Способность к активации имеют только биологически полноценные тромбоциты (клетки с гранулами). В физиологических условиях воздействие стандартных/канонических индукторов активации (коллаген, АДФ, тромбин и др.) вызывает быстрый и необратимый выброс гранул за пределы тромбоцита, также тотальная дегрануляция тромбоцитов происходит при внесении в плазму хлорида кальция (стандартный способ получения тромбоцитарного геля). В обоих случаях тромбоцитарный материал находится при температуре 37°С, оптимальной для дегрануляции; из-за этого основной объем тромбоцитарных гранул выходит за пределы тромбоцитов и практически не фиксируются в составе тромбофибриновых сгустков. С другой стороны, существуют различные неканонические пути активации тромбоцитов, которые позволяют активировать тромбоциты даже при 20-22°С.Стоит особо подчеркнуть, что в процессе неканонической активации тромбоцитов при 20-22°С формирование тромбоцитарных агрегатов не сопровождается быстрой и тотальной дегрануляцией, т.е. по крайней мере, часть гранул сохраняется в активированных тромбоцитах при 20-22°С в течение нескольких часов [Макаров М.С. Неканонические способы активации тромбоцитов человека // Медицинский алфавит. Современная лаборатория. - 2015. - Т. 3, №11. - С. 30-35.]. Таким образом, необходимо было подобрать индуктор активации, позволяющий получать тромбоцитарный гель в условиях 20-22°С.
Среди известных препаратов, потенциально способных активировать тромбоциты, был выбран препарат для инъекций «Адреналина гидрохлорид-Виал». В состав препарата входит эпинефрин (адреналин) в концентрации 1 мг/мл, натрия дисульфит, натрия хлорид, эдетовая кислота (ЭДТА, этилендиаминтетрауксусная кислота), хлористоводородная кислота, вода для инъекций. Адреналин вызывает активацию тромбоцитов in vivo и in vitro путем воздействия на специфические адреналин-зависимые рецепторы. Дисульфит натрия и хлористоводородная кислота обладают выраженными восстановительными (электрон-донорскими) свойствами, что также может способствовать активации тромбоцитов. В среде с высоким восстановительным редокс-потенциалом происходит активация рецепторов на поверхности тромбоцитарных мембран, которые запускают каскад внутриклеточных сигналов и в результате стимулируют адгезию и агрегацию тромбоцитов [Murphy D.D., Reddy Е.С., Moran N., O'Neill S. Regulation of platelet activity in a changing redox environment. // Antioxid Redox Signal. - 2014. - Vol. 20, №13. - P. 2074-2089.]. Таким образом, препарат «Адреналина гидрохлорид-Виал» потенциально способен запускать активацию тромбоцитов разными путями, причем совмещение этих путей может оказывать синергетический эффект и усиливать образование тромбоцитарного геля.
Для оценки эффективности данного препарата был проведен ряд экспериментов. Морфофункциональный анализ тромбоцитов проводили с помощью метода, основанного на витальном окрашивании тромбоцитов с последующим их анализом с помощью флуоресцентной микроскопии [Патент РФ на изобретение №2485502 «Способ оценки морфофункционального статуса тромбоцитов человека», авторы Хубутия М.Ш., Макаров М.С., Хватов В.Б., Высочин И.В., Кобзева Е.Н., Боровкова Н.В., Конюшко О.И., 20.06.2013]. По данным литературы, массовая активация тромбоцитов происходит при концентрации адреналина 1 мМ (1*10-3 М) и выше [Michelson A.D. Platelets. 3rd ed. - Amsterdam: Academic Press, 2013, 1351 р.]. При добавлении препарата «Адреналина гидрохлорид-Виал» в плазму с тромбоцитами до концентрации 1 мМ при 22°С выраженной активации тромбоцитов не происходит, при 37°С формируются многочисленные тромбоцитарные агрегаты, одновременно с этим происходит дегрануляция большинства биологически полноценных тромбоцитов. Стоит особо отметить, что при более низких концентрациях адреналина формирование агрегатов в условиях 37°С не сопровождается тотальной активацией тромбоцитов, часть клеток остается неактивированной (табл. 1). При использовании 1 мМ адреналина через 30 мин активируется 64-65% тромбоцитов с гранулами, через 1 час - 100%. Однако тромбоцитарный гель при этом не формируется. Препарат «Адреналина гидрохлорид-Виал» содержит ЭДТА, который обладает хелатерирующим действием и блокирует свободный кальций, необходимый для активации плазменного звена гемостаза. В стандартном способе получения тромбоцитарного геля в плазму с тромбоцитами добавляют 10% раствор хлорида кальция до конечной концентрации 30-40 мМ и экспонируют при 37°С. Это позволяет получить тромбоцитарный гель из плазмы при 37°С, но не при 22°С. Если же препарат «Адреналина гидрохлорид-Виал» внести в плазму вместе с хлоридом кальция, то уже через 10-15 мин в плазме наблюдается интенсивная агрегация тромбоцитов, которое приводит к образованию тромбоцитарного геля даже при 22°С (табл. 1). В плазме с нормальным уровнем тромбоцитов с гранулами (35-75%) тромбоцитарный гель под действием 1 мМ адреналина и 35 мМ хлорида кальция формируется через 20-30 мин. Если уровень тромбоцитов с гранулами снижен (10-35%), время образования геля увеличивается до 50 мин. Если содержание тромбоцитов с гранулами в плазме составляет менее 10%, тромбоцитарный гель не формируется даже при очень длительной экспозиции. Таким образом, для получения тромбоцитарного геля наиболее пригодна плазма, полученная из крови с нормальным уровнем биологически полноценных тромбоцитов. Для формирования тромбоцитарного геля в образце БоТП общее содержание тромбоцитов с гранулами должно составлять не менее 100 тыс/мкл. Исследования показли, что для достижения эффективной концентрации адреналина и хлорида кальция в конечном растворе на 100 мкл исходной плазмы с тромбоцитами необходимо внести 20-25 мкл препарата «Адреналина гидрохлорид-Виал» и 5-7 мкл 10% раствора хлорида кальция (табл. 2). В зависимости от требуемого объема тромбоцитарного геля указанные объемы плазмы, препарата «Адреналина гидрохлорид-Виал» и хлорида кальция следует кратно уменьшать или увеличивать.
In vitro в тромбоцитарном геле сразу после его формирования начинается процесс ретракции (сжатия) тромбофибринового сгустка в его составе, в результате чего уже через 30-50 мин тромбоцитарный гель распадается на 2 фракции: нерастворимый гелеобразный тромбофибриновый сгусток и жидкую сыворотку, в которую выходит основная часть ростовых факторов и других биологически активных веществ, секретируемых тромбоцитами. Это процесс особенно выражен при получении тромбоцитарного геля в узких сосудах - пробирках, вакутейнерах и т.п. Таким образом, если тромбоцитарный гель не используется непосредственно после изготовления, то даже при коротком хранении лишь небольшой его объем сохраняет гелевую консистенцию - тромбофибриновый сгусток (ТФ).
Гелевые препараты считаются гораздо более предпочтительными по сравнению с жидкими препаратами, поскольку они лучше фиксируются на ране или раневом покрытии, отсутствует риск вымывания или быстрой деградации растворенных факторов. Однако при использовании стандартных методик получения тромбоцитарного геля основная часть биологических веществ остается в жидкой фракции и не фиксируется в составе ТФ. На примере культуры мезенхимальных мультипотентных стромальных клеток человека (ММСК) нами установлено, что ТФ, полученные стандартным способом (метод-прототип), in vitro увеличивают рост клеток лишь в 1,1 раза (рис. 1а, б). В то же время, ТФ, полученные из БоТП с использованием оригинальной методики, увеличивают пролиферативную активность диплоидных клеток человека в 1,5-1,8 раза без видимого нарушения жизнеспособности клеток (рис. 1в, табл. 2). Также оценивали насыщенность образцов ТФ ростовыми факторами, в частности тромбоцитарным фактором роста (PDGF). PDGF обладает выраженными рост-стимулирующими свойствами in vivo и in vitro, создание эффективных раневых покрытий, насыщенных БоТП представляет актуальную задачу регенеративной медицины [Nurden А.Т., Nurden P., Sanchez M., Andia I., Anitua E. Platelets and wound healing. Frontiers in Bioscience, 2008; vol. 13, no. 9, pp. 3532-3548]. Установлено, что уровень тромбоцитарного фактора роста в ТФ, изготовленном оригинальным способом, был в 3-5 раз выше, чем в ТФ, полученном из той же БоТП с использованием стандартной методики. Если при стандартной методике получения тромбоцитарного геля в составе ТФ сохранялось менее 12% от всего объема PDGF исходной БоТП, то при использовании оригинальной методики сохранность PDGF в ТФ превышала 50% (табл. 3).
Таким образом, предложенная методика приготовления тромбоцитарного геля позволяет получать тромбофибриновые сгустки, обладающие выраженным рост-стимулирующим эффектом.
В конкретном примере реализации изобретения был получен тромбоцитарный гель, который включал (на 1000 мкл препарата): 770 мкл БоТП пациента с желательным уровнем тромбоцитов с гранулами 35-75%; 192 мкл препарата для инъекций «Адреналина гидрохлорид-Виал»; 38 мкл раствора 10% хлорида кальция.
Приготовление тромбофибринового сгустка состояла из следующих этапов:
1. Забор 5 мл венозной крови пациента в стандартную пробирку с антикоагулянтом CPD (цитрат) или ЭДТА в соотношении 7:1. Для получения больших объемов геля общий объем забранной крови может быть кратно увеличен.
2. Выделение богатой тромбоцитами плазмы (БоТП), для получения которой образцы крови пациента центрифугируют при 300-400 g в течение 4-5 минут, после чего отбирают супернатант.
3. Приготовление витального красителя путем разведения 10 мг трипафлавина и 20 мг акридинового оранжевого при комнатной температуре в 100 мл фосфатного буфера (рН - 7,2-7,4).
4. Оценка содержания в БоТП биологически полноценных тромбоцитов (тромбоцитов с гранулами), %. БоТП и витальный краситель смешивают в отношении 1:1, окрашивание проводят в микропробирке в течение 2-5 мин при комнатной температуре, после чего 5 мкл пробы с окрашенными тромбоцитами переносят на предметное стекло и накрывают покровным стеклом, в люминисцентном микроскопе оценивают долю тромбоцитов с гранулами (%) в расчете на 150-200 клеток.
5. Введение в БоТП раствора 10% хлорида кальция и препарата «Адреналин-Виал» из расчета 5-7 мкл 10% хлорида кальция и 20-25 мкл препарата для инъекций «Адреналина гидрохлорид-Виал» на 100 мкл БоТП. В конкретном примере реализации изобретения для приготовления 1 мл тромбоцитарного геля смешивали 770 мкл БоТП, 192 мкл препарата для инъекций «Адреналина гидрохлорид-Виал» и 38 мкл раствора 10% хлорида кальция.
6. Инкубация активированной БоТП при комнатной температуре (20-22°С) в пробирке, эппендорфе или емкости с плоским дном. Для получения тромбоцитарного геля время инкубации БоТП составляет 20-30 мин при содержании тромбоцитов с гранулами свыше 35, при содержании тромбоцитов с гранулами от 10 до 35% (включительно) время инкубации БоТП составляет 30-50 мин.
7. Выделение тромбофибринового сгустка. Для выделения тромбофибринового сгустка образованный гель дополнительно инкубируют в тех же условиях (20-22°С) в течение 10-20 мин, после чего в стерильных условиях пинцетом отбирают тромбофибриновый сгусток.
Был получен тромбофибриновый сгусток, обладающий рост-стимулирующими свойствами, продемонстрированными на фиг. 1.
Claims (1)
- Способ получения тромбофибринового сгустка, включающий забор венозной крови пациента, выделение богатой тромбоцитами плазмы (БоТП), введение в БоТП раствора 10%-ного хлорида кальция и инкубацию БоТП, отличающийся тем, что дополнительно к раствору 10%-ного хлорида кальция в БоТП вводят препарат для инъекций «Адреналин гидрохлорид-Виал» из расчета 5-7 мкл 10%-ного раствора хлорида кальция и 20-25 мкл препарата «Адреналин гидрохлорид-Виал» на 100 мкл БоТП, содержащей не менее 100 тыс. тромбоцитов с гранулами на 1 мкл, осуществляют инкубацию БоТП при температуре 20-22°С для образования тромбоцитарного геля, при этом время инкубации БоТП составляет 20-30 мин при содержании тромбоцитов с гранулами свыше 35%, 30-50 мин - при содержании тромбоцитов с гранулами 10-35%, после чего осуществляют дополнительную инкубацию образованного геля до образования тромбофибринового сгустка с его последующим отбором.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2018123988A RU2679616C1 (ru) | 2018-07-02 | 2018-07-02 | Способ приготовления тромбофибринового сгустка, обладающего ростстимулирующими свойствами |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2018123988A RU2679616C1 (ru) | 2018-07-02 | 2018-07-02 | Способ приготовления тромбофибринового сгустка, обладающего ростстимулирующими свойствами |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2679616C1 true RU2679616C1 (ru) | 2019-02-12 |
Family
ID=65442564
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2018123988A RU2679616C1 (ru) | 2018-07-02 | 2018-07-02 | Способ приготовления тромбофибринового сгустка, обладающего ростстимулирующими свойствами |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2679616C1 (ru) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2717448C1 (ru) * | 2019-04-02 | 2020-03-23 | Государственное бюджетное учреждение здравоохранения города Москвы Научно-исследовательский институт скорой помощи имени Н.В. Склифосовского Департамента здравоохранения г. Москвы | Способ получения богатой тромбоцитами плазмы и способ получения тромбофибринового геля или сгустка с сывороткой, содержащие факторы роста, из нестабилизированной венозной крови |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2002058749A2 (en) * | 2001-01-25 | 2002-08-01 | Nycomed Pharma As | Carrier with solid fibrinogen and solid thrombin |
| RU2578853C1 (ru) * | 2015-04-13 | 2016-03-27 | Федеральное Государственное бюджетное учреждение "Государственный научный центр колопроктологии им. А.Н. Рыжих" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Способ лечения острой анальной трещины и длительно незаживающих ран анального канала |
-
2018
- 2018-07-02 RU RU2018123988A patent/RU2679616C1/ru active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2002058749A2 (en) * | 2001-01-25 | 2002-08-01 | Nycomed Pharma As | Carrier with solid fibrinogen and solid thrombin |
| RU2578853C1 (ru) * | 2015-04-13 | 2016-03-27 | Федеральное Государственное бюджетное учреждение "Государственный научный центр колопроктологии им. А.Н. Рыжих" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Способ лечения острой анальной трещины и длительно незаживающих ран анального канала |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| ОБОЛЕНСКИЙ В.Н. и др. Применение аппликаций богатой тромбоцитами аутоплазмы в лечении больных с хроническими ранами различной этиологии. Департамент здравоохранения города Москвы, 2013, стр.16. * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2717448C1 (ru) * | 2019-04-02 | 2020-03-23 | Государственное бюджетное учреждение здравоохранения города Москвы Научно-исследовательский институт скорой помощи имени Н.В. Склифосовского Департамента здравоохранения г. Москвы | Способ получения богатой тромбоцитами плазмы и способ получения тромбофибринового геля или сгустка с сывороткой, содержащие факторы роста, из нестабилизированной венозной крови |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Kushida et al. | Effects of platelet-rich plasma on proliferation and myofibroblastic differentiation in human dermal fibroblasts | |
| US10512660B2 (en) | Activator for mesenchymal stem cells, activated mesenchymal stem cells, and method for producing same | |
| Scarpone et al. | Isolation of clinically relevant concentrations of bone marrow mesenchymal stem cells without centrifugation | |
| EP0094244A1 (en) | Process for cell modification | |
| JP2006518764A (ja) | 細胞−ポリマー繊維組成物及びその使用 | |
| CN105769910B (zh) | 一种人羊膜间充质干细胞的应用 | |
| CN106754681B (zh) | 一种富血小板血浆及其制备方法与应用 | |
| Yin et al. | Platelet-rich plasma enhances the repair capacity of muscle-derived mesenchymal stem cells to large humeral bone defect in rabbits | |
| RU2679616C1 (ru) | Способ приготовления тромбофибринового сгустка, обладающего ростстимулирующими свойствами | |
| JP5713924B2 (ja) | 活性化白血球組成物 | |
| EP3258945A1 (en) | Modified blood clots | |
| RU2739515C1 (ru) | Способ приготовления лизата тромбоцитов с высоким содержанием факторов роста | |
| CN102712897B (zh) | 心脏组织来源细胞 | |
| US20240158746A1 (en) | Activation of immune cells | |
| US20170095593A1 (en) | Adipose-derived stem cell product | |
| Alsousou et al. | Platelet-rich plasma in regenerative medicine | |
| Thoesen et al. | Use of a centrifugation-based, point-of-care device for production of canine autologous bone marrow and platelet concentrates | |
| WO2005097154A2 (de) | Wundheilungsfördernde botenstoffmischung | |
| CN112043726B (zh) | 一种治疗勃起功能障碍的子宫内膜干细胞制剂及制备方法 | |
| TWI434931B (zh) | 細胞培養基之營養添加劑 | |
| Shchory et al. | Haemoglobin Synthesis in Human Fetal Liver Maintained in Short‐Term Tissue Culture | |
| Dahr et al. | Platelet-rich plasma enhances the cellular function of equine bone marrow-derived mesenchymal stem cells | |
| US9486465B2 (en) | Attractant for bone marrow stem cells and method for attracting bone marrow stem cells | |
| Cereceda et al. | Impact of platelet-derived mitochondria transfer in the metabolic profiling and progression of metastatic MDA-MB-231 human triple-negative breast cancer cells | |
| RU2665155C1 (ru) | Способ доставки биологически активных веществ в скаффолд |