CN102712897B - 心脏组织来源细胞 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及使用人心脏组织来源细胞修复受损心肌的方法和组合物。具体地讲，本发明提供使用不表达端粒酶的扩增人心脏组织来源细胞修复受损心肌的方法和组合物。
Description
技术领域
本发明要求于2009年7月9日提交的序列号为61/224,446的专利申请的优先权。
技术领域
本发明涉及使用人心脏组织来源细胞修复受损心肌的方法和组合物。具体地讲，本发明提供使用不表达端粒酶的扩增的人心脏组织来源细胞修复受损心肌的方法和组合物。
背景技术
在美国，急性心肌梗塞(AMI)是死亡的主要原因。AMI由心脏区域突发持久地缺乏血流导致，通常是冠状动脉变窄而引发的。供血不足时，组织会出现缺血，从而导致肌细胞和血管结构的死亡。该坏死组织区域称为梗死部位，并将最终成为疤痕组织。剩余的心肌细胞不能再造坏死组织，心脏功能随时间推移而恶化。恶化的形式可以是与受损心肌重塑相关的心肌功能的丧失。
急性心肌梗塞的一些当前疗法主要做法是溶栓或者血管成形术，以打开凝块血管，并恢复对梗死部位的供血。这些治疗可有效地减小梗死部位面积，并改善心脏收缩功能，但不会逆转与受损心肌重塑相关的心肌功能的丧失。其他疗法，例如血管紧张素转化酶抑制剂(ACEI)和β-阻滞剂也可改善整体功能和存活率。然而，这些药物的治疗效果仅可使急性心肌梗塞后的患者的存活率提高不到5％。
细胞移植可能是急性心肌梗塞的另一种潜在疗法。例如，Orlic等人(Nature 410：701-705(2001))报道了将Lin-c-kit+骨髓细胞注射至受损心肌。Orlic等人声称：“我们的研究表明，局部递送骨髓细胞可从头生成心肌，从而改善冠状动脉疾病的结局。(Our studiesindicate that locally delivered bone marrow cells can generate de novomyocardium，ameliorating the outcome of coronary artery disease.)”。
又如，Nygren等人(Nature Medicine 10：494-501(2004))声称：“我们证实，未分级的骨髓细胞及纯化的造血干细胞和祖细胞群体可有效地移植到梗死的心肌内。然而移植物移入是短暂行为，实际上是造血性质的。相比之下，在梗死的心肌外部较少频率地观察到的骨髓来源的心肌细胞，这些细胞仅通过细胞融合而产生。(We show thatunfractionated bone marrow cells and a purified population of hematopoieticstem and progenitor cells efficiently engraft within the infarctedmyocardium.Engraftment was transient，however，and hematopoietic in nature.Incontrast，bone marrow-derived cardiomyocytes were observed outside theinfarcted myocardium at a low frequency and were derived exclusively throughcell fusion.)”。
然而，骨髓来源的细胞治疗AMI的机制仍不清楚。例如，Murry等人(Nature 428：664-668(2004))声称：“我们使用局限于心肌细胞的且遍在表达的报告转基因来跟踪145例移植入成年小鼠正常和受损心脏的造血干细胞的命运。当使用这些遗传技术跟踪细胞命运时，未检测到造血干细胞转分化为心肌细胞，并且与未移植干细胞的心脏相比，移植干细胞的心脏未表现出明显的心肌细胞增加。这些结果表明，造血干细胞不易获得心脏表型，并对梗死修复的临床研究提出了忠告。([W]e used both cardiomyocyte-restricted andubiquitously expressed reporter transgenes to track the fate ofhaematopoietic stem cells after 145 transplants into normal and injured adultmouse hearts.No transdifferentiation into cardiomyocytes was detectable whenusing these genetic techniques to follow cell fate，and stem-cell-engraftedhearts showed no overt increase in cardiomyocytes compared to sham-engraftedhearts.These results indicate that haematopoietic stem cells do not readilyacquire a cardiac phenotype，and raise a cautionary note for clinical studiesof infarct repair.)”。
又如，Werner等人(Nature Clinical Practice Cardiovascular Medicine 5：78-79(2008))声称：“然而，关于最有效的祖细胞亚群、祖细胞加强的最好技术、潜在的作用机制以及本方法的长期安全性和有效性，仍然有很多问题需要解答。此外，采用[骨髓细胞]疗法治疗AMI患者的数个试验产生了阴性结果，可能是因为AMI后[骨髓细胞]施用时间安排不一，所使用的祖细胞制备方法有差异，或二者兼有。(There are many questions，however，still to be answered with regard to the most effective progenitorcell subpopulation，the best technique for progenitor cell augmentation，theunderlying mechanisms of action，and the long-term safety and effectiveness ofthe method.Moreover，several trials of[bone marrow cell]therapy in patientswith AMI have produced negative results，possibly because of variation in thetiming of[bone marrow cell]administration after AMI，differences in themethods of progenitor cell preparation used，or both.)”。
又如，Balsam等人(Nature 428：668-673(2004))声称：“我们的数据表明，即使在受损心脏的微环境中，富含c-kit的BM细胞、Lin-c-kit+ BM细胞和c-kit+Thy1.1loLin-Sca-1+长期重建造血干细胞只经历传统的造血命运。(Our data suggest that even in themicroenvironment of the injured heart，c-kit-enriched BM cells，Lin- c-kit+ BMcells and c-kit+ Thy1.1loLin-Sca-1+long-term reconstituting haematopoieticstem cells adopt only traditional haematopoietic fates.)”。
另一种可能的细胞来源是胚胎干细胞。例如，Gold等人(WO2005090558)公开了从胚胎干细胞产生心肌细胞系细胞以用于再生医学的方法。
又如，Gold和Hassanipour(WO2007002136)公开了灵长类多能干细胞分化心肌细胞系细胞的方法。
另一种可能的细胞来源是心脏祖细胞。心脏祖细胞已在人和大鼠心脏中得以鉴定。心脏祖细胞能自我更新并且具有专能性(multipotent)，可产生所有心肌谱系。
例如，美国专利申请US20040126879A1公开了CD31+、CD38+和c-kit-心脏干细胞治疗受损心肌的用途。
又如，Oh等人(PNAS 100：12313-12318(2003))公开了存在成体心脏来源的心脏祖细胞，其表达Sca-1、CD31和CD38，并且不表达CD4、CD8、B220、Gr-1、Mac-1、TER119、c-kit、Flk-1、e-钙粘蛋白、von Willebrand因子、CD45和CD34。
又如，美国专利申请US 20080241111A1公开了制备哺乳动物心脏组织来源的细胞的方法，该细胞通过以下步骤制备：(i)酶法处理来自哺乳动物的心脏组织片段来制得细胞悬浮液；(ii)通过密度梯度法从所述细胞悬浮液分离一群心脏组织来源的细胞；以及(iii)在含有成纤维细胞生长因子和表皮生长因子的培养基中悬浮培养所得的心脏组织来源的细胞群，然后选择并分离形成悬浮细胞球的细胞。
又如，美国专利申请US 20080213231A1公开了由来源于人或小鼠骨骼肌组织的多能干细胞组成的多能干细胞群；这些多能干细胞是c-met阴性、Pax-7阴性、Myf-5阴性、MyoD阴性、肌细胞生成素阴性、M-钙粘蛋白阴性、CD105阳性、CD90阳性、c-kit阴性和CD45阴性的；在人来源干细胞的情况下，这些多能干细胞是CD34阴性的，而在小鼠来源干细胞的情况下是CD34阳性的；并且这些多能干细胞群通过单个细胞的增殖获得。
又如，Laugwitz等人(Nature 433：647-653(2005))公开了产后大鼠、小鼠和人心肌中的isl1-1+心脏祖细胞。
又如，Messina等人(Circulation Research 95：911-921，(2004))公开了“从出生后心房或心室人活检标本的传代培养物以及从鼠心脏中分离生长为自贴壁细胞团(我们称为“心球”)的未分化细胞的方法。这些细胞具有克隆形成性的(clonogenic)，表达了干细胞和内皮祖细胞抗原/标记物，并且显示具有成体心脏干细胞的性质(isolation ofundifferentiated cells that grow as self-adherent clusters(that we havetermed“cardiospheres”)from subcultures of postnatal atrial or ventricularhuman biopsy specimens and from murine hearts.These cells are clonogenic，express stem and endothelial progenitor cell antigens/markers，and appear tohave the properties of adult cardiac stem cells)”。Messina等人声称：“新发育的人和小鼠心肌球显示表达了内皮标记物(KDR(人)/flk-1[小鼠]、CD-31)和干细胞标记物(CD-34、c-kit、sca-1)([N]ewly developing human and mouse cardiospheres revealedexpression of endothelial(KDR(human)/flk-1[mouse]，CD-31)and stem cell(CD-34，c-kit，sca-1)markers)”。
又如，Smith等人(Circulation 115(7)：896-908(2007))声称：“生长在原代培养物中的经皮穿刺心内膜心肌活检标本可发育为称为心球的多细胞团，该心球接种后可产生心球来源的细胞(CDC)(Percutaneous endomyocardial biopsy specimens grown inprimary culture developed multicellular clusters known as cardiospheres，whichwere plated to yield cardiosphere-derived cells(CDCs))”。
又如，美国专利申请US20070020758公开了分离、扩增和保存来自人或动物组织活检标本的心脏干细胞的方法，以用于心肌或其他器官的细胞移植和功能修复。
又如，Beltrami等人(Cell 114(6)：763-776(2003))公开了“存在具有心脏干细胞性质的Lin-c-kitPOS细胞。它们能自我更新、具有克隆形成性和专能性，从而可产生肌细胞、平滑肌和内皮细胞(the existence of Lin- c- kitPOS cells with the propertiesof cardiac stem cells.They are self-renewing，clonogenic，and multipotent，giving rise to myocytes，smooth muscle，and endothelial cells)”。
又如，WO 2008054819公开了标记物isl1+/Nkx 2.5+/flk1+阳性的心血管干细胞，以及可沿内皮、心脏和平滑肌细胞系分化的心血管干细胞。
又如，WO 2008109839A1公开了包含CXCR4多肽和FIk-I多肽的干细胞的富集群，其中所述干细胞能够分化为表达Mef2C、GATA-4、心肌蛋白(Myocardin)和Nkx2.5多肽的细胞。
又如，WO 2008081457A2公开了分离心脏干细胞的方法，该方法包括使包含心脏干细胞的组织与包含分散酶Il的组合物在足以诱导细胞解离的条件下接触，从而分离心脏干细胞。
又如，WO 2008058273A2公开了从心房或心室心脏组织获得哺乳动物干细胞样肌源细胞(MDC)的方法，该方法包括以下步骤：从心房或心室心脏组织分离细胞，形成细胞悬浮液；并且在包含促分裂原的培养基中培养细胞，从而形成包含MDC的组合物。
又如，WO 2008054819A2公开了分离心血管干细胞的方法，该方法包括使细胞群与对Islet1、Nkx2.5和flk1有反应性的试剂接触，以及从非反应性细胞分离出反应性阳性细胞。
又如，美国专利申请US 20070212423A1公开了分离肌源的c-kit-/c-met-心肌细胞前体细胞的方法，该方法包括从肌肉细胞悬浮液分离直径小于40μm的细胞；在固体基底上的组织培养基中培养细胞；以及在培养基的悬浮液中分离细胞；从而分离肌源的c-kit-/c-met-心肌细胞前体细胞。
又如，美国专利申请US 20050058633公开了分离的哺乳动物肌源c-kit-/c-met心肌细胞前体细胞。
又如，WO 2004019767公开了分离的具有c-kitneg/CD31+/CD38+并表达端粒酶逆转录酶的哺乳动物心肌细胞干细胞。
又如，WO 2008083962A1公开了心肌细胞祖细胞(CMPC)，其特征在于它们的细胞表面上具有Sca-1或类Sca-1表位和CD31。
又如，美国专利申请20080213230A1公开了制备富含干细胞或祖细胞的分离细胞群的方法，该方法包括：(a)培养组织样品；(b)在所述培养期间，获得在贴壁成纤维细胞上迁移的细胞；(c)对(b)中获得的一种或多种细胞进行克隆，以产生一种或多种克隆形成性细胞群；(d)鉴定一种或多种具有所需表型的克隆形成性细胞群；(e)使用干细胞或祖细胞的一种或多种细胞表面或内部标记物，通过细胞分选，从一种或多种步骤(d)中鉴定的克隆形成性细胞群分离干细胞或祖细胞；以及(f)在不含饲养细胞的调理培养基中培养分离的干细胞或祖细胞；从而获得富含干细胞或祖细胞的分离细胞群。
然而，使用心脏祖细胞的一个障碍是缺乏分离或扩增细胞的有效方法。因此，仍然需要有效分离和扩增心脏祖细胞，以便它们能够有效治疗要评估的受损心肌。
发明内容
本发明提供了分离和扩增来源于人心脏组织的细胞的方法。根据本发明的方法分离和扩增的细胞不表达端粒酶，并且可用于治疗或修复受损心肌。
本发明提供了不表达端粒酶的人心脏组织来源细胞的纯化群体。
本发明提供了产生不表达端粒酶的人心脏组织来源细胞的方法，该方法包括以下步骤：
a.获得心脏组织，
b.解离心脏组织，
c.消化心脏组织以释放细胞，
d.从释放的细胞除去心肌细胞，以及
e.培养剩余的细胞。
在一个实施例中，本发明提供了治疗或修复患者的受损心肌的方法，该方法包括以下步骤：
a.获得不表达端粒酶的人心脏组织来源细胞群，以及
b.以足以治疗或修复受损心肌的量给患者施用人心脏组织来源细胞群。
在一个实施例中，用于治疗患者的人心脏组织来源细胞经低温冷藏。
附图说明
图1概述了本发明细胞的分离程序。获得细胞群的方法的细节在实例1中进行了描述。
图2概述了本发明的人心脏组织来源细胞的分离。获得细胞初始群体的方法的细节在实例1中进行了描述。
图3概述了本发明的人心脏组织来源细胞的备选分离方法。
图4示出了本发明的人心脏组织来源细胞(hCTC)的形态。除非另外指明，否则所有图像均在100倍放大倍数下示出。分图a：是示出从预接种细胞获得的细胞悬浮液的图像，该细胞从初始消化获得。黑色箭头示出了相亮非贴壁S细胞；分图b：黑色箭头示出了相亮S细胞团。白色箭头示出了从初始接种获得的贴壁细胞(图像在200倍放大倍数下示出)；图c示出了赚接S细胞培养物而获得的A2细胞；图d示出了A2细胞培养物中转接的相亮S细胞。
图5示出了接种密度对hCTC生长潜力的影响。x轴表示在来自冷冻瓶的hCTC(A1)和hCTC(S)细胞混合物接种后培养的天数。y轴表示hCTC(A3)细胞的累计总群体倍增数。
图6示出了降低的氧水平对hCTC(A3)细胞生长潜力的影响。
图7示出了大鼠心脏组织来源rCTCA2细胞(rCTC(A2))的生长潜力。x轴表示在转接来自冷冻瓶的rCTC(S)细胞后培养的天数。y轴表示rCTC(A2)细胞的累计总群体倍增数。
图8示出了hCTC(A3)细胞在低温冷藏和用潜在施用装置(由30号注射针组成)进行模拟递送后的回收率和存活率。回收的活细胞数示于左边的y轴。细胞存活率示于右边的y轴。实心菱形描述细胞存活率；空心正方形描述细胞回收率。细节在实例6中进行了描述。
图9示出了rCTC(A2)细胞在低温冷藏和用潜在施用装置(由30号注射针组成)进行模拟递送后的回收率和存活率。回收的活细胞数示于左边的y轴。细胞存活率示于右边的y轴。实心正方形描述通过注射针前的细胞回收率；实心三角形描述通过注射针前的细胞存活率；空心正方形描述通过注射针后的细胞存活率；空心三角形描述通过注射针后的细胞回收率。细节在实例6中进行了描述。
图10示出了流式细胞术确定的hCTC(A3)细胞表面标记物的表达。在每个柱状图中，虚线是同种型抗体对照。实线是抗原染色结果。抗原在各图中示出。x轴是对数标度的藻红蛋白(PE)强度。y轴是细胞计数。
图11示出了hCTC(A3)细胞(上面的分图)和成人真皮成纤维细胞-NHDF(产品目录号：CC-2511，Lonza，下面的分图)之间细胞表面标记物表达的比较。在每个柱状图中，x轴是对数标度的PE强度。y轴是细胞计数。虚线描述抗体同种型对照。实线是抗原染色结果。阳性群体的门控基于同种型对照中1％阳性群体进行。各个标记物在每个柱状图中显示。
图12示出了流式细胞术确定的rCTC(A2)细胞表面标记物的表达。虚线描述同种型对照。实线是CD31(左边的分图)和CD90(右边的分图)的抗原染色结果。
图13示出了定量实时聚合酶链式反应(qRT-PCR)确定的hCTC(A3)细胞中心脏特异性基因的基因表达。细节在实例8中进行了描述。y轴表示GAPDH的百分比，并且分为下标度和上标度。下标度的范围是从0至0.01％，上标度的范围是从0.05％至0.15％。缩写的含义如下：MHC意指肌球蛋白重链；心脏TF意指转录因子；NHDF意指人新生儿真皮成纤维细胞；h-心脏意指人心脏。数据以平均值±标准偏差(n＝3)表示。
图14示出了小鼠心脏组织来源(A2)细胞(mCTC(A2))与新生大鼠心肌细胞(产品目录号为R357-6W，Cell Application(Austin，TX))的共培养物中小鼠特异性肌球蛋白重链(MHC)的表达上调。每个样品中小鼠MHC基因表达水平以小鼠GAPDH百分比来表示。y轴表示小鼠GAPDH的百分比。缩写的含义如下：如实例9中所描述，mCTC意指分化培养基中培养的mCTC(A2)细胞；CM意指心肌细胞；mCTC+CM意指mCTC与大鼠心肌细胞CM在分化培养基中的共培养物。数据以平均值±标准偏差(n＝3)表示。
图15示出了猪心脏组织来源(A3)细胞(pCTC(A3))观察到的生长曲线，该细胞根据实例10中描述的方法培养。x轴表示接种后培养的时间。y轴表示累计总群体倍增数。
图16示出了流式细胞术检测的pCTC(A3)细胞表面标记物的表达。虚线描述同种型对照。实线是CD90(左上分图)、CD105(右上分图)、猪内皮细胞标记物(左下分图)、CD16(中下分图)、CD45(右下分图)的抗原染色结果。
图17示出了急性心肌梗塞后心脏重塑的示意图。该示意图复制自Pfeffer M.的Atlas of Heart Failure(《心力衰竭图集》，Colucci W编辑，1999年)。
图18示出了在已诱导急性心肌梗塞的动物体内施用本发明的心脏组织来源细胞对缩短分数(FS)的影响，如超声心动描记术所测定的。缩短分数是每个心动周期中由舒张变为收缩的百分比变化(FS％)，可反映心脏的整体功能。所示数据是AMI诱导后5天(D5)或28天(D28)的各个动物中记录的缩短分数。以x轴上显示的剂量给动物施用rCTC(A2)细胞或hCTC(A3)细胞。
图19示出了在已诱导急性心肌梗塞的动物体内施用本发明的心脏组织来源细胞对局部室壁运动评分(RWMS)的影响，如超声心动描记术所测定的。每个被垂直实线分开的分图是研究中的实验组。5D和28D分别反映AMI诱导后5天和28天。RWMS是在以5D为基线，28D为随访情况下测定的。以x轴上显示的剂量给动物施用rCTC(A2)或hCTC(A3)细胞。
图20示出了在已诱导急性心肌梗塞的动物体内施用本发明的心脏组织来源细胞对左心室舒张末期内径(LVEDD)的影响。LVEDD是舒张末期左心室内径的量度。LEVDD在心肌梗塞诱导后5天(5D)和28天(28D)测定。所示数据是各个动物的相对变化[(28D-5D)/5D]。以x轴上显示的剂量给动物施用rCTC(A2)或hCTC(A3)细胞。
图21示出了对各实验组中LVEDD相对变化进行比较的统计分析。使用单向方差分析(ANOVA)对数据进行F检验。第1组：溶媒；第2组：rCTC(A2)细胞1×106个细胞(目标剂量)；第3组：hCTC(A3)细胞1×104个细胞(目标剂量)；第4组：hCTC(A3)细胞1×105个细胞(目标剂量)；第5组：hCTC(A3)细胞1×106个细胞(目标剂量)。
图22示出了施用人心脏组织来源细胞对左心室收缩末期内径(LVESD)的影响。LVESD是每个心动周期中收缩末期心室内径的量度。每个被垂直实线分开的分图是研究中的实验组。LVESD在心肌梗塞诱导后5天(5D)和28天(28D)测定。所示数据是单个动物在每个时间点的记录。以x轴上显示的剂量给动物施用rCTC(A2)或hCTC(A3)细胞。
图23示出了在出现心肌梗塞的各个动物体内施用人心脏组织来源细胞后第5天和第28天的心脏功能，用超声心动描记术测定的四个参数(FS、RWMS、LVESD、LVEDD)表示。每个黑点描述X轴所示时间点的各个动物的心脏功能。黑色实线示出了每个动物中从5D至28D的变化趋势。每个图描述通过超声心动描记术测定的一个参数。
图24示出了缩短分数和心脏组织来源细胞剂量之间的相关性。Y轴是在心肌梗塞且细胞施用后第28天相对于第5天的绝对变化(28D-5D)。X轴是线性标度的hCTC(A3)剂量。数据以平均值±标准偏差(n＝35)表示。
图25示出了LVEDD变化和本发明的人心脏来源组织剂量之间的相关性。y轴描述在心肌梗塞且细胞施用后第28天相对于第5天的绝对变化(28D-5D)。x轴描述了线性标度的hCTC(A3)细胞剂量。数据以平均值±标准偏差(n＝35)表示。
图26示出了施用至患心肌梗塞的动物心脏的hCTC(A3)细胞的滞留量。滞留量由大鼠心脏中检测到的β-微球蛋白的表达水平评估。图“a”示出了以x轴上显示的剂量施用后4周时的hCTC(A3)细胞滞留量。图“b”示出了hCTC(A3)细胞滞留量的时间历程，其中x轴描述细胞在大鼠MI心脏中施用后的天数，y轴表示目标剂量的百分比。图“c”示出了使用所检测细胞的平均百分比表示的hCTC(A3)细胞随着时间过去的滞留量，将细胞施用后立即检测的人细胞数量设置为100％。x轴描述细胞在大鼠MI心脏中施用后的天数。
图27示出了大鼠MI中hCTC(A3)滞留量和重塑阻止之间的相关性。左分图示出了相关性坐标图。x轴描述对数标度的细胞数；y轴描述重塑变化(ΔLVEDD，28D-5D)。图中绘制了每个动物施用后4周的细胞数及相应的ΔLVEDD。右分图示出了线性回归的统计分析。
图28示出了人NuMA(核基质抗原)在大鼠心肌中的定位，该心肌已用hCTC(A3)细胞(目标剂量为1×106个细胞)处理。左分图示出了目标剂量为1×106的hCTC处理的大鼠心肌在400倍放大下观察到的阳性人NuMA染色结果。右分图示出了溶媒对照动物中的染色结果。
图29示出了人NuMA在另一个动物中的定位，该动物接受了目标剂量为1×106的hCTC(A3)细胞。左上分图示出了低倍图像(100倍放大)，该图示出了两个NuMA阳性细胞团。右上分图是NuMA阳性细胞团的高倍图像(400倍放大)。左下分图是NuMA阳性细胞团的高倍图像。右下分图是示出具有类肌细胞形态的NuMA阳性细胞核的高倍图像。
图30示出了人和大鼠心肌中观察到的NuMA的抗体对照染色结果。上面两张图像示出了人心脏中具有高度核特异性(未使同种型对照染色，右分图)的NuMA阳性染色结果(左分图)。下面两张图像示出了大鼠心脏对照，表明NuMA抗体对人细胞具有特异性。
图31示出了hCTC(A3)处理组或溶媒处理组中心肌肥大的记分评估。目标剂量示于y轴。接受hCTC(A3)细胞的动物接受了1×104、1×105或1×106个细胞的目标剂量。浅灰色区域示出了整个心脏中非肥大切片的比例。深灰色区域示出了整个心脏中肥大切片的比例。
图32示出了梗死面积评估。左分图示出了相对梗死面积(整个左心室区域中梗死面积的百分比)；右分图示出了绝对梗死面积。黑点描述每个单独的动物。组的梗死平均面积以黑色实线示出。
图33示出了hCTC(A3)细胞处理组或溶媒处理组中毛细血管密度的染色结果。接受hCTC(A3)细胞的动物接受了1×104、1×105或1×106个细胞的目标剂量。分图“a”示出了心肌中梗死边界区域的毛细血管密度，如同工凝集素B4染色所检测的。分图“b”示出了边界区域的毛细血管密度，如CD31染色所检测的。
图34示出了非梗死区域的肌细胞密度。分图“a”示出了来自溶媒处理动物(左分图)和1×105个hCTC(A3)细胞处理动物(右分图)的心肌的H&E染色的代表性图像。分图“b”示出了心脏非梗死区域中观察到的肌细胞密度，以肌细胞数/mm2表示。数据以平均值±标准偏差(n＝6)表示；图c示出了通过Ki-67和肌球蛋白重链的双重染色观察到的增殖肌细胞。数据以平均值±标准偏差(n＝6)表示。
图35示出了大鼠心肌中响应所有目标剂量hCTC(A3)细胞处理的差异表达基因。
图36示出了hCTC和hMSC细胞施用对患急性MI的大鼠心脏组织的影响的定量。分图“a”示出了左心室游离壁中梗死区域与健康组织的比率。分图“b”示出了对所有组的动物的心脏中所观察到的扩张的评级。分图“c”示出了存活心肌。
图37示出了施用hCTC(A3)细胞和人间充质干细胞(产品目录号：PT-2501，Lonza(Walkersville，MD))对患急性MI的大鼠心脏组织的影响。并列示出了来自每个动物的两块切片：一块取自乳头肌和心房层面之间的中线，并且另一块取自乳头肌。左边两列来自溶媒处理组；中间两列来自hMSC处理组(目标剂量1×106)；右边两列来自hCTC(A3)细胞处理组(目标剂量1×105)。
图38示出了在心肌梗塞且细胞施用后第28天，施用hCTC(A3)细胞对患有急性MI的大鼠的心脏功能的影响。通过超声心动描记术测定三个参数(FS、LVESD、LVEDD)。图中示出了在心肌梗塞且细胞施用后第28天相对于基线(在心肌梗塞且细胞施用后第7天)的变化。图中示出了来自不同供体的三个hCTC(A3)细胞批次、人真皮成纤维细胞和pCTC(A3)细胞。
图39示出了在心肌梗塞且细胞施用后第84天，施用hCTC(A3)细胞对患有急性MI的大鼠的心脏功能的影响。通过超声心动描记术测定三个参数(FS、LVESD、LVEDD)。图中示出了在心肌梗塞且细胞施用后第84天相对于基线(在心肌梗塞且细胞施用后第7天)的变化。检查了人真皮成纤维细胞以及由不同供体制备的三个不同的hCTC(A3)细胞批次。
具体实施方式
将本发明的具体实施方式部分分成以下几个分部分，来描述或举例说明本发明的某些特征、实施例或应用，这是为了使公开内容清楚起见，并非限制本发明。
定义
如本文所用，术语“受损心肌”指处于缺血状态下的心肌细胞。这些缺血状态可由心肌梗塞或其他心血管疾病或相关症状引起。
如本文所用，“急性心肌梗塞”指通常称为“心脏病发作”的病症，其中当对心脏部分的供血中断时，可导致一些心脏细胞死亡。该病症的最常见原因是动脉粥样硬化易损斑块破裂后发生冠状动脉闭塞(阻塞)，所述斑块是动脉壁中脂质(如胆固醇)和白细胞(尤其是巨噬细胞)的不稳定集合。如果长时间不治疗，所产生的缺血(供血限制)和缺氧可导致心脏肌肉组织(心肌)损坏和/或死亡。
如本文所用，术语“hCTC(S)群体”或“hCTC(S)”指人心脏组织来源细胞的非贴壁群体，该细胞群是根据本发明的方法在人心脏组织解离、酶法消化以及过滤后经细胞的初始培养而获得的。
如本文所用，术语“hCTC(A1)群体”或“hCTC(A1)细胞”指人心脏组织来源细胞的贴壁群体，该细胞群是根据本发明的方法在人心脏组织解离、酶法消化以及过滤后经细胞的初始培养而获得的。
如本文所用，术语“hCTC(A2)群体”或“hCTC(A2)细胞”指hCTC(S)细胞经体外培养获得的贴壁细胞群。
如本文所用，术语“hCTC(A3)群体”或“hCTC(A3)细胞”指hCTC(S)和hCTC(A1)细胞的混合物经体外培养获得的贴壁细胞群。
衍生本发明细胞的方法
本发明提供了产生不表达端粒酶的人心脏组织来源细胞的方法，该方法包括以下步骤：
a.获得心脏组织，
b.解离心脏组织，
c.消化心脏组织以释放细胞，
d.从释放的细胞除去心肌细胞，以及
e.培养剩余的细胞。
心脏组织可手工解离。作为另外一种选择，心脏组织可机械解离。
心肌细胞可通过任何合适的方法从释放的细胞除去。例如，心肌细胞可通过过滤、离心或通过FACS除去。
在一个实施例中，过滤由心脏组织消化而释放的细胞以除去心肌细胞。过滤步骤的目的是排除尺寸比本发明的人心脏组织来源细胞大的细胞。在一个实施例中，本发明的人心脏组织来源细胞的直径为约5微米至约50微米，并且选择孔径为50微米的过滤器，以使本发明的人心脏组织来源细胞可通过过滤器。
在一个实施例中，将通过过滤器的人心脏组织来源细胞在体外培养。在一个实施例中，体外培养的人心脏组织来源细胞在过滤步骤后为非贴壁细胞和贴壁细胞的混合物。
本发明的人心脏组织来源细胞可贴附到任何固体基底。在一个实施例中，固体基底是聚碳酸酯。作为另外一种选择，固体基底可以是聚苯乙烯。作为另外一种选择，固体基底可以是玻璃。固体基底也可用包含胞外基质蛋白(例如胶原或层粘连蛋白等)的吸附层包被。
初始培养步骤后获得的本发明贴壁细胞在本文中是指人心脏组织来源(A1)细胞群或hCTC(A1)细胞。初始培养步骤后获得的本发明非贴壁细胞在本文中是指人心脏组织来源(S)细胞群或hCTC(S)细胞。
在一个实施例中，hCTC(A1)细胞通过培养扩增。本发明的hCTC(A1)细胞可在任何合适的组织培养基中培养。例如，在一个实施例中，心脏组织来源细胞可在补充有1,000g/lD-葡萄糖、584mg/l L-谷氨酰胺和110mg/l丙酮酸钠以及10％FBS的DMEM中培养。可向培养基中添加抗生素，例如青霉素50U/ml和链霉素50μg/ml。作为另外一种选择，可向心脏组织的解离和酶法消化后获得的细胞悬浮液中添加抗生素。本发明的hCTC(A1)细胞可以约1,000至约10,000个活细胞/cm2的接种密度接种在组织培养基底上。本发明的hCTC(A1)细胞可在5-20％v/v的大气氧下培养。
在一个实施例中，在细胞达到大约80％汇合度后，对本发明的hCTC(A1)细胞进行传代。作为另外一种选择，在细胞达到大约90％汇合度后，对本发明的hCTC(A1)细胞进行传代。作为另外一种选择，本发明的hCTC(A1)细胞每一至七天传代一次。
在一个实施例中，hCTC(S)细胞通过培养扩增。在一个实施例中，本发明的hCTC(S)细胞可在任何合适的组织培养基中培养。例如，在一个实施例中，心脏组织来源细胞可在补充有1,000g/l D-葡萄糖、584mg/l L-谷氨酰胺和110mg/l丙酮酸钠以及10％FBS的DMEM中培养。可向培养基中添加抗生素，例如青霉素50U/ml和链霉素50μg/ml。作为另外一种选择，可向心脏组织的解离和酶法消化后获得的细胞悬浮液中添加抗生素。本发明的hCTC(S)细胞可在5-20％v/v的大气氧下培养。在一个实施例中，组织培养基每三天更换一次。
在一个实施例中，hCTC(S)细胞随着培养时间的增加变为贴壁的。hCTC(S)细胞变为贴壁时的培养时间为约1天至约7天。hCTC(S)细胞变为贴壁后获得的贴壁细胞群在本文中称为人心脏组织来源(A2)细胞群或hCTC(A2)细胞。
在一个实施例中，hCTC(A2)细胞通过培养扩增。本发明的hCTC(A2)细胞可在任何合适的组织培养基中培养。例如，在一个实施例中，心脏组织来源细胞可在补充有1,000g/lD-葡萄糖、584mg/l L-谷氨酰胺和110mg/l丙酮酸钠以及10％FBS的DMEM中培养。可向培养基中添加抗生素，例如青霉素50U/ml和链霉素50μg/ml。作为另外一种选择，可向心脏组织的解离和酶法消化后获得的细胞悬浮液中添加抗生素。本发明的hCTC(A2)细胞可以约1,000至约10,000个活细胞/cm2的接种密度接种在组织培养基底上。本发明的hCTC(A2)细胞可在5-20％v/v的大气氧下培养。
在一个实施例中，在细胞达到大约80％汇合度后，对本发明的hCTC(A2)细胞进行传代。作为另外一种选择，在细胞达到大约90％汇合度后，对本发明的hCTC(A2)细胞进行传代。作为另外一种选择，本发明的hCTC(A2)细胞每一至七天传代一次。
在一个实施例中，hCTC(A1)细胞和hCTC(S)细胞的混合物通过培养扩增。在一个实施例中，hCTC(A1)细胞和hCTC(S)细胞的混合物随着培养时间的增加形成贴壁细胞群。hCTC(S)细胞变为贴壁时的培养时间为约2天至约14天。hCTC(A1)细胞和hCTC(S)细胞的混合物变为贴壁后获得的贴壁细胞群在本文中称为人心脏组织来源(A3)细胞群或hCTC(A3)细胞。
在一个实施例中，hCTC(A3)细胞通过培养扩增。本发明的hCTC(A3)细胞可在任何合适的组织培养基中培养。例如，在一个实施例中，心脏组织来源细胞可在补充有1,000g/lD-葡萄糖、584mg/l L-谷氨酰胺和110mg/l丙酮酸钠以及10％FBS的DMEM中培养。可向培养基中添加抗生素，例如青霉素50U/ml和链霉素50μg/ml。作为另外一种选择，可向心脏组织的解离和酶法消化后获得的细胞悬浮液中添加抗生素。本发明的hCTC(A3)细胞可以约1,000至约10,000个活细胞/cm2的接种密度接种在组织培养基底上。本发明的hCTC(A3)细胞可在5-20％v/v的大气氧下培养。
在一个实施例中，在细胞达到大约80％汇合度后，对本发明的hCTC(A3)细胞进行传代。作为另外一种选择，在细胞达到大约90％汇合度后，对本发明的hCTC(A3)细胞进行传代。作为另外一种选择，本发明的hCTC(A3)细胞每一至七天传代一次。
获得本发明的人心脏组织来源细胞的一种方法概述于图1中。获得本发明的人心脏组织来源细胞的备选方法概述于图2中。获得本发明的人心脏组织来源细胞的备选方法概述于图3中。
本发明的细胞可来源于整个心脏的解离及随后对解离组织的消化。作为另外一种选择，本发明的细胞可来源于部分心脏组织的解离及随后对解离组织的消化。该部分可得自心脏的任何部分，例如心房或心室、心尖或心脏任何一侧。
解离的心脏组织可使用酶(例如胶原酶和分散酶)消化。酶可单独或者组合使用。在一个实施例中，解离的心脏组织使用胶原酶和分散酶的混合物消化。
胶原酶可在约0.1U/ml至约10U/ml的浓度下使用。作为另外一种选择，胶原酶可在约0.1U/ml至约5U/ml的浓度下使用。作为另外一种选择，胶原酶可在约5U/ml的浓度下使用。作为另外一种选择，胶原酶可在约1U/ml的浓度下使用。
分散酶可在约0.5U/ml至约50U/ml的浓度下使用。作为另外一种选择，胶原酶可在约0.5U/ml至约10U/ml的浓度下使用。作为另外一种选择，胶原酶可在约10U/ml的浓度下使用。作为另外一种选择，胶原酶可在约5U/ml的浓度下使用。
解离的组织可用酶处理约5分钟至约5小时。作为另外一种选择，解离的组织可用酶处理约30分钟至约5小时。作为另外一种选择，解离的组织可用酶处理约30分钟至约4小时。作为另外一种选择，解离的组织可用酶处理约30分钟至约3小时。作为另外一种选择，解离的组织可用酶处理约30分钟至约2小时。作为另外一种选择，解离的组织可用酶处理约30分钟至约1小时。在一个实施例中，解离的组织用酶处理约2.5小时。
如果需要，可将本发明的心脏组织来源细胞暴露于(例如)特异性识别心脏组织来源细胞表达的蛋白标记物的试剂(如抗体)以鉴定和选择心脏组织来源细胞，从而获得基本上纯的心脏组织来源细胞群。
本发明的细胞
本发明提供了人心脏组织来源细胞群，该细胞群不表达端粒酶，可通过培养维持和扩增，并可用于治疗和修复受损心肌。本发明的心脏组织来源细胞的性质汇总于表1中。
在一个实施例中，本发明的不表达端粒酶的人心脏组织来源细胞表达以下标记物中的至少一种：CD49e、CD105、CD59、CD54、CD90、CD34和CD117。
在一个实施例中，本发明的不表达端粒酶的人心脏组织来源细胞不表达以下标记物中的至少一种：MDR、CD19、CD16、CD31、CD45和Isl-1。
在一个实施例中，本发明的不表达端粒酶的人心脏组织来源细胞表达以下标记物：CD49e、CD105、CD59、CD54、CD90、CD34和CD117。
在一个实施例中，本发明的不表达端粒酶的人心脏组织来源细胞不表达以下标记物：MDR、CD19、CD16、CD31、CD45和Isl-1。
在一个实施例中，本发明的人心脏组织来源细胞进一步分化为心肌细胞。该分化可在施用给患者之前或之后发生。分化是指一种或多种与原始细胞不同的特性或功能的获得或拥有程度不断增大的行为(即细胞特化)。分化可(例如)通过筛查细胞的表型变化(即鉴定细胞的形态变化和/或细胞上的表面标记物)检测。可使用能够使本发明的心脏组织来源细胞分化为心肌细胞的任何方法。
例如，本发明的心脏组织来源细胞还可根据美国专利申请US20040126879中公开的方法分化为心肌细胞。
又如，本发明的心脏组织来源细胞还可根据WO2004019767中公开的方法分化为心肌细胞。
治疗或修复受损心肌的方法
心肌受损由多种心脏疾病引起，例如急性心肌梗塞、慢性心肌梗塞、充血性心力衰竭等。本发明的心脏组织来源细胞可用作修复受损心肌的疗法。在一个实施例中，本发明的心脏组织来源细胞可用作修复由于急性心肌梗塞而受损的心肌的疗法。
在一个实施例中，本发明提供了治疗患者的受损心肌的方法，该方法包括以下步骤：
a.获得不表达端粒酶的人心脏组织来源细胞群，以及
b.以足以治疗受损心肌的量给患者施用人心脏组织来源细胞群。
在一个实施例中，本发明提供了修复患者的受损心肌的方法，该方法包括以下步骤：
a.获得不表达端粒酶的人心脏组织来源细胞群，以及
b.以足以修复受损心肌的量给患者施用人心脏组织来源细胞群。
在一个实施例中，将制备的人心脏组织来源细胞群施用给患者，而无需培养细胞。在替代实施例中，在施用给患者前将制备的心脏组织来源细胞群在体外培养。
人心脏组织来源细胞群在体外培养和扩增的情况下，培养和扩增的细胞群可以是hCTC(A1)细胞群。作为另外一种选择，培养和扩增的细胞群可以是hCTC(A2)细胞群。作为另外一种选择，培养和扩增的细胞群可以是hCTC(A3)细胞群。
本发明的人心脏组织来源细胞可通过本领域中任何合适的方法施用给患有心肌受损的患者。此类方法是本领域普通技术人员易于选择的。
例如，给受损心肌施用本发明的人心脏组织来源细胞可通过受损心肌的直接注射进行。作为另外一种选择，本发明的人心脏组织来源细胞可系统施用。在系统递送本发明的人心脏组织来源细胞时，可通过以下方法提高细胞递送至受损心肌的效率：例如用至少一种其他试剂处理患者，或采用能够提高给受损心肌递送细胞的另一种方法。
例如，本发明的人心脏组织来源细胞可连同另一种选自以下的试剂施用：干细胞因子(SCF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、基质细胞衍生因子-1、青灰因子、血管内皮生长因子、巨噬细胞集落刺激因子、粒细胞-巨噬细胞刺激因子和白介素-3。
在一个实施例中，根据美国专利申请US20020061587公开的方法联合施用本发明的人心脏组织来源细胞和另一种试剂。
在一个实施例中，根据美国专利申请US2002162796公开的方法联合施用本发明的人心脏组织来源细胞和另一种试剂。
例如，可通过将患者的心脏循环与患者的体循环分离，并且将包含细胞的溶液灌注至心脏循环来提高细胞递送至受损心肌的效率。该方法的例子在WO2007067502中有所公开。
在一个实施例中，根据Iwasaki、Kawamoto等人(Circulation 113：1311-1325；2006)公开的方法给患者施用本发明的人心脏组织来源细胞。
在替代实施例中，根据Sherman、Martens等人(Nature Clinical PracticeCardiovascular Medicine 3，suppl 1：S57-64；2006)公开的方法使用可插入冠状动脉的导管给患者施用本发明的人心脏组织来源细胞。
在替代实施例中，使用能够标测心肌电活动的导管给患者施用本发明的人心脏组织来源细胞。在一个实施例中，根据Perin、Dohmann等人(Circulation 107：2294-2302；2003)和Perin、Silva等人(Journal of Molecular and Cellular Cardiology 44：486-495；2008)公开的方法使用能够标测心肌电活动的导管给患者施用本发明的心脏组织来源细胞。在替代实施例中，根据Sherman、Martens等人(Nature Clinical PracticeCardiovascular Medicine 3，suppl 1：S57-64；2006)公开的方法给患者施用本发明的心脏组织来源细胞。
在替代实施例中，根据Hashemi、Ghods等人(European Heart Journal 29：251-259；2008)公开的方法使用能够进行心肌内注射的导管给患者施用本发明的人心脏组织来源细胞。
本发明进一步通过如下实例举例说明，但不受限于如下实例。
实例1
人心脏组织来源细胞的分离
材料和方法-消化酶混合物制备：在本发明中用于从人心脏分离心脏组织来源细胞的消化酶混合物制备为溶于磷酸盐缓冲盐水(PBS，Gibco，Invitrogen(Carlsbad，CA))的2X混合物储液。混合物储液浓度为0.2U/ml或2U/ml胶原酶(Serva Electrophoresis GmbH(Heidelberg，Germany))和10U/ml分散酶II(Roche Applied Science(Indianapolis，Indiana))。这些酶混合物储液保存在-40℃下。在消化前，将酶混合物滤过0.22μm真空过滤系统(Corning Incorporated(Acton，MA))。对于人心脏消化，将2U/ml胶原酶储液用于消化程序。消化酶的终浓度为1U/ml胶原酶和5U/ml分散酶。整个人心脏消化和人心脏组织来源细胞(hCTC)分离的方法汇总于图1中。
材料和方法-人心脏：整个移植废弃心脏得自国家发展研究院(NationalDevelopment and Research Institutes)(NDRI，New York，NY)。移植废弃心脏的获得时间在40-98小时之间。将整个器官浸入生长培养基(DMEM+10％胎牛血清)中，并且保存在4℃下直到细胞分离处理为止。
材料和方法-人心脏组织处理：将整个心脏组织转移至生物安全柜中，并置于方形生物测定皿(Corning Inc.(Acton，MA))内。使用无菌解剖刀(Bard Parker，BectonDickinson(Hancock，NY))除去多余脂肪组织。将整个第一心脏切成小块(2-3cm3)。然后将四分之三的小组织块手工切碎成细块(尺寸为1-2mm3)。该过程需要两小时完成。将四分之一组织块转移至PRO250匀浆器室(Pro Scientific(Oxford，CT))。将封盖置于室上，并且接上PRO250电机，电机的速度设置为3。在不添加任何缓冲液的情况下将组织块在室温下匀浆10秒，并且用肉眼观察组织。当组织切碎时匀浆完成(所得碎片的尺寸小于1mm3)。
材料和方法-人组织消化：将手工处理和匀浆的组织块都转移至单独的250ml锥形试管(Corning Inc.(Corning，NY))中。添加100ml室温PBS，将每个试管中的组织洗涤三次，每次洗涤时将试管翻转五次。然后将试管直立放置，让组织沉淀。使用2ml抽吸移液管(BDfalcon，BD Biosciences(San Jose，CA))吸出上清液。将消化酶混合物储液(2X)添加至250ml试管中，酶与组织的比率为1∶1。酶的终浓度为1U/ml胶原酶和5U/ml分散酶II。将装有组织和酶的试管转移至设置为225rpm的37℃回旋振荡器(Barnstead Lab (Melrose Park，IL))中，温育2.5小时。温育后，将试管转移回生物安全柜。通过在试管中添加室温PBS，将细胞悬浮液稀释。为了除去任何剩余的未消化组织，将细胞悬浮液滤过8英寸直径250μm标准试验筛(Sigma-Aldrich(St.Louis，MO))至500ml玻璃烧杯中。此步骤后，将玻璃烧杯中的细胞悬浮液再滤过100μm细胞过滤网(BD Falcon)至多个50ml锥形试管(BD Falcon)中。然后使用Sorvall Legend T离心机(Thermo Fisher Scientific，Inc(Waltham，MA))将细胞悬浮液在室温下以338×g离心5分钟进行洗涤，以沉淀细胞。将上清液吸出，并且将细胞沉淀物重悬于PBS中，合并到单独的50ml试管中，手工切碎方法和匀浆方法各使用一管。用40ml室温PBS再洗涤细胞悬浮液三次。洗涤后，将沉淀物重悬于20ml ACK裂解缓冲液(Lonza(Walkersville，MD))中，并在室温下温育10分钟，以裂解任何剩余的红细胞。温育后，用40ml室温PBS再洗涤细胞悬浮液两次。最后一次离心后，将沉淀物重悬于20ml室温生长培养基(DMEM、1,000mg/L D-葡萄糖、L-谷氨酰胺和110mg/L丙酮酸钠、10％胎牛血清、青霉素50U/ml、链霉素50μg/ml)中，并计数。
材料和方法-细胞计数：总活细胞密度和存活率分析使用Vi-CellTM XR(BeckmanCoulter(Fullerton，CA))进行。Vi-CellTM细胞存活率分析仪使用视频捕获技术获得流动池中细胞的多达100张图像并进行图像分析，实现了用于细胞存活率评估的台盼蓝染色排除法自动化。Vi-Cell的计数精密度为±6％。样品根据制造商说明书(Reference Manual PN383674 Rev.A(《参考手册PN 383674修订版A》))制备和分析。简而言之，将RBC裂解后所得的最终细胞悬浮液的500μL等分试样转移至Vi-CellTM 4ml样品瓶中，并且使用Vi-CellTMXR细胞存活率分析仪分析。使用以下默认的细胞类型属性：
结果-从整个心脏消化获得的细胞收获量：整个第一心脏在采用手工切碎方法时消化后的收获量为在解离和酶法消化后得到4,300万个活细胞。存活率为65％。机械匀浆过程产生1,200万个活细胞，存活率为63％。由于超过3倍的组织经历手工过程，两种过程之间的收获量和存活率无差异。基于该结果，随后的人心脏使用机械匀浆处理。消化后，总收获量通常为3,400-6,400万个活细胞/心脏。如表2中所示，存活率为55-81％。
实例2
本发明的人心脏组织来源细胞的选择和体外培养
将人心脏的解离和酶法消化后获得的细胞悬浮液扩增，以用于进一步实验分析。
从人心脏的解离和酶法消化获得的细胞的初始接种：根据实例1中描述的方法，将从人心脏的解离和酶法消化获得的细胞悬浮液添加至T225组织培养瓶(Corning Inc.(Corning，NY))中。将10ml细胞悬浮液添加至每个培养瓶中，培养瓶中装有50ml生长培养基(DMEM、1,000mg/L D-葡萄糖、584mg/L L-谷氨酰胺和110mg/L丙酮酸钠、10％胎牛血清、青霉素50U/ml、链霉素50μg/ml，Invitrogen(Calsbald，CA))。初始培养物的最终体积为60ml。将细胞在37℃下在含20％O2和5％CO2的气氛中培养2天。这段时间后，可观察到异质的细胞培养物。可观察到非贴壁、相亮细胞(本文称为hCTC(S)细胞)，并且可观察到贴壁细胞(本文称为hCTC(A1)细胞)。参见图4。
初始培养步骤后获得的hCTC(S)细胞与Anversa(Beltrami，Barlucchi等人，2003；Cell 114(6)：763-76)描述为心脏干细胞的细胞具有类似的形态。参见图4a。此外，可观察到类似于Messina等人(Messina，De Angelis等人，2004；Circulation Research 95(9)：911-21)描述的细胞团，如图4b中所示。
hCTC(S)群体的扩增：在一项研究中，在初始的两天培养期后，将hCTC(S)细胞从培养瓶中取出。将hCTC(S)细胞转移至50ml锥形试管。将hCTC(S)细胞在室温下以338×g离心5分钟。弃去上清液，并且将细胞沉淀物重悬于20ml新鲜生长培养基中。重悬后对hCTC(S)细胞计数。从初始培养步骤获得的hCTC(S)细胞的总数为约1,000-1,400万个总细胞。将一部分hCTC(S)细胞以100-150万/ml低温冷藏于保藏培养基中，并且保存在-140℃下。剩余的细胞通过培养扩增。将hCTC(S)细胞以5,000个细胞/cm2的接种密度转接在培养瓶中。培养2天后，hCTC(S)细胞变为贴壁的，并且形成均质的贴壁细胞群，该细胞群在本文称为hCTC(A2)群体或hCTC(A2)细胞。一旦本发明的hCTC(A2)细胞在hCTC(S)接种后约10-14天达到80％汇合度，将细胞用胰蛋白酶消化，所述消化通过以下步骤进行：吸出生长培养基，用60ml室温PBS洗涤，然后向每个培养瓶添加4ml胰蛋白酶-EDTA(Invitrogen(Carlsbad，CA))。将hCTC(A2)细胞在室温下温育大约5分钟，直到细胞脱离。向每个培养瓶添加6ml生长培养基，并且将细胞悬浮液转移至新的50ml锥形试管(BD Falcon，BD Biosciences(San Jose，CA))。移取500μL等分试样，转移至Vi-cell样品杯中，以便使用Vi-CellTM细胞存活率分析仪计数，如实例1中所描述。将这些细胞以5,000个细胞/cm2或3,000个细胞/cm2转接。
hCTC(S)细胞扩增也可使用低温冷藏细胞进行。将S细胞的冰冻试剂瓶在37℃下解冻，并用PBS洗涤一次。然后对细胞计数，并且以5,000个细胞/cm2接种在培养瓶的生长培养基中。每天观察细胞扩增和汇合度。
通过肉眼观察，培养2天后非贴壁hCTC(S)细胞显著减少，并且非贴壁hCTC(S)经10-14天时间的培养其数量不会增加。培养2天后所培养的hCTC(S)细胞开始附着于培养瓶上，并且生长为贴壁细胞。它们在hCTC(S)细胞接种后10-14天达到80％汇合度。虽然在培养中仍然可观察到一些hCTC(S)细胞，但是该非贴壁群体的数量在培养中不会增加。这可能是由于在培养中非贴壁hCTC(S)的形态变为贴壁hCTC(A2)。由于2天后hCTC(S)细胞附着于培养瓶上，非贴壁细胞的数量变得非常低，故而不对其计数。
相比之下，来源于hCTC(S)细胞的贴壁hCTC(A2)细胞显示出一些生长潜力，如图5a中所示可达10PDL。当hCTC(A2)细胞以5,000个细胞/cm2或3,000个细胞/cm2接种时，该群体的生长率在1-3PDL/传代之间，直到其在9-10PDL达到平台。然而，PDL计算是基于接种在培养物中的初始细胞数量(即hCTC(S)细胞数量)，PDL的估算可能不完全准确。
hCTC(A1)群体的扩增：从包含初始两天接种的细胞的培养瓶除去包含hCTC(S)细胞的培养基后，向培养瓶中存在的剩余贴壁细胞添加60ml新鲜生长培养基。将hCTC(A1)细胞培养直至细胞达到80％汇合度。这段时间后，将细胞用胰蛋白酶消化，所述消化通过以下步骤进行：吸出生长培养基，用60ml室温PBS洗涤，并且添加4ml胰蛋白酶-EDTA(Invitrogen(Carlsbad，CA))。将细胞在室温下温育大约5分钟，直到细胞脱离。向每个培养瓶添加6ml生长培养基，并且将细胞悬浮液转移至新的50ml锥形试管(BD Falcon，BD Biosciences(SanJose，CA))。移取500μL等分试样，转移至Vi-cell样品杯，以便使用Vi-CellTM细胞存活率分析仪计数。然后将一部分细胞用低温冷藏培养基(90％FBS和10％DMSO)重悬，并且以100-150万个细胞/ml保留并保存在-140℃下。通过以3,000个细胞/cm2从冰冻试剂瓶转接细胞来扩增剩余的细胞。转接后三天更换用过的培养基，将细胞在第7天进行传代。这些细胞每7天通过胰蛋白酶消化进行传代，在第3天更换培养基。
hCTC(A3)群体的扩增：洗涤一瓶hCTC(A1)和一瓶hCTC(S)细胞，然后合并至50ml锥形试管(BD Falcon，BD Biosciences(San Jose，CA))中。将5,000个细胞/cm2或3,000个细胞/cm2的合并细胞悬浮液混合物添加至单独的T225培养瓶中。每个培养瓶中添加60ml/瓶的新鲜生长培养基，并且将细胞在37℃、20％大气O2下培养2天。这段时间后，大多数细胞形成贴壁细胞群，该细胞群在本文称为hCTC(A3)群体或hCTC(A3)细胞。一旦细胞达到80％汇合度，将细胞通过胰蛋白酶消化进行传代，并且以5,000个细胞/cm2或3,000个细胞/cm2的接种密度转接以鉴定适当的接种密度，并且在37℃、20％大气O2下培养。hCTC(A3)细胞通常在接种后7天达到80％汇合度。每天用肉眼观察非贴壁hCTC(S)细胞，培养2天后这些细胞显著减少，使得hCTC(A3)细胞变为均质的细胞群。这平均需要约2天。hCTC(A3)群体能够以1-3PDL/传代的速率扩增。当hCTC(A3)细胞以5,000个细胞/cm2的密度接种时，hCTC(A3)在达到衰老前能够达到9-10PDL。相比之下，当hCTC(A3)细胞以3,000个细胞/cm2的密度接种时，hCTC(A3)在达到衰老前能够达到24PDL。参见图5b。
本发明的人心脏组织来源细胞的鉴定：hCTC(A2)和hCTC(A3)细胞每次传代时显示出1-3PDL的类似生长率。两种细胞都需要约7天来达到80-90％传代汇合度。当它们来源于hCTC(S)细胞群时，观察到这两种细胞群之间的总PDL差异可能是由于最初低估了hCTC(A2)细胞的PDL。
在通过本发明的方法分离的所有人心脏组织来源细胞群中，未观察到细胞表面标记物或基因的表达差异。hCTC(A1)、hCTC(S)、hCTC(A2)和hCTC(A3)细胞不表达端粒酶。参见表1的本发明人心脏组织来源细胞以及本领域心脏祖细胞中所表达基因的列表。根据本发明的方法分离的所有细胞群显示出GATA4和Nkx2.5基因的阳性表达。未观察到肌球蛋白重链的表达。在本发明的所有细胞群中，通过基因表达检测干细胞标记物c-kit。参见表8。通过流式细胞术检测到本发明的人心脏组织来源细胞为CD105和CD90阳性。本发明的细胞不表达CD31、CD45和CD16。参见表8。
未观察到本发明的人心脏组织来源细胞群有显著的特征差异。选择hCTC(A3)群体用于进一步鉴定。
实例3
人心脏组织来源细胞的体外细胞培养
细胞密度和缺氧对细胞生长有影响(Tavaluc R等人，Cell Cycle 6:20，2554-2562，2007年10月15日)。细胞相互接触可降低细胞生长潜力，低接种密度可减少细胞接触的可能性，从而增加生长潜力。缺氧或低O2分压已显示出可降低细胞生长的接触抑制(Nonomura Y.等人；The Journal of Rheumatology，2009年4月，第36卷第4期，第698-705页)。在本发明中，与5,000个细胞/cm2相比，3,000个细胞/cm2的接种密度显示出更大的生长潜力。
为了比较O2水平对细胞生长的影响，每次传代后，将hCTC(A3)细胞以3,000个细胞/cm2接种在T225培养瓶中。将细胞在20％O2或5％O2的气氛中培养。在第3天，用60ml新鲜生长培养基更换用过的培养基。在第7天，根据实例2中描述的方法收集hCTC(A3)细胞。通过在观察到衰老之前对累计总PDL进行检查，来确定生长动力学。实验的总持续时间大于100天，在此期间内，细胞传代16-17次。hCTC(A3)细胞在常氧条件(20％O2)下培养时，生长曲线在PDL24达到平台。然而，当PDL12的hCTC(A3)细胞在低氧条件(5％O2)下培养时，生长曲线在PDL28达到平台，如图6中所示。
实例4
大鼠心脏组织来源细胞的分离
将8-12周龄的Sprague-Dawley大鼠用异氟醚麻醉，并且打开腹腔。移开肠子，切断主动脉。将27号注射针插入胸腔静脉，并且用10ml含有5U/ml肝素的PBS灌注心脏。然后通过将10ml含有5U/ml肝素的PBS注入胸主动脉来对心脏进行逆行灌注。小心操作，确保心脏在整个手术期间保持搏动。然后将整个心脏从胸腔摘除，并置于冰冷的Hank’s缓冲液中。将五个分离的大鼠心脏合在一起，用于解离和酶法消化。
然后将分离的大鼠心脏用20ml室温PBS洗涤两次，并弃去上清液。然后在室温下用外科手术刀将心脏手工切碎，并且将切碎的组织转移至三个50ml试管中。然后将切碎的组织用25ml PBS洗涤三次，每次洗涤时将试管翻转五次。
将组织块转移至单独的50ml锥形试管(Corning Inc.(Corning，NY))中。添加30ml室温PBS，将每个试管中的组织洗涤三次，每次洗涤时将试管翻转五次。然后将试管直立放置，让组织沉淀。使用2ml抽吸移液管(BD falcon，BD Biosciences(San Jose，CA))吸出上清液。将消化酶混合物储液(2×)添加至50ml试管中，酶与组织的比率为1∶1。混合酶的终浓度为1U/ml胶原酶和5U/ml分散酶II。将装有组织和酶的试管转移至设置为225rpm的37℃回旋振荡器(Barnstead Lab(Melrose Park，IL))中，温育2.5小时。温育后，将试管转移回生物安全柜。通过在试管中添加室温PBS，将细胞悬浮液稀释。为了除去任何剩余的未消化组织，将细胞悬浮液滤过8英寸直径100μm细胞过滤网(BD Falcon)，然后滤过40μm细胞过滤网(BD Falcon)至六个50ml锥形试管(BD Falcon)。大鼠CTC所用过滤器尺寸小于人细胞所用过滤器尺寸，因为大鼠和人之间的肌细胞大小存在差异。然后使用Sorvall Legend T离心机(Thermo Fisher Scientific，Inc(Waltham，MA))将细胞悬浮液在室温下以338×g离心5分针进行洗涤，以沉淀细胞。将上清液吸出，并且将细胞沉淀重悬于生长培养基中，合并到一个盛有20ml生长培养基的50ml试管中，然后取样确定细胞收获量。获得的典型收获量为1,000万个细胞/心脏，存活率为70％。
在大鼠心脏组织来源细胞的制备中，使用0.1U/ml或1U/ml胶原酶储液消化心脏组织。3小时温育后，如实例1中所述，将20ml生长培养基添加至每个试管中。然而，用0.1U/ml胶原酶消化的大鼠心脏组织未产生任何细胞。
将解离和酶法消化心脏组织获得的细胞悬浮液接种于T225组织培养瓶(CorningInc.(Corning，NY))中，所述接种通过转移10ml进每个瓶中来进行。将35ml生长培养基(DMEM、1,000mg/L D-葡萄糖、584mg/L L-谷氨酰胺和110mg/L丙酮酸钠、10％胎牛血清、青霉素50U/ml、链霉素50μg/ml，Invitrogen(Calsbald，CA))添加至每个培养瓶中，使每个培养瓶内的最终体积为45ml。在37℃下、20％O2和5％CO2的气氛中进行两天的初始细胞培养。初始两天培养后，取出非贴壁rCTC(S)细胞，转移至50ml锥形试管中，在室温下以338×g离心5分钟。弃去上清液，并将细胞沉淀重悬于20ml生长培养基中。对细胞计进行数，并且以5,000个细胞/cm2的接种密度重新接种于T225培养瓶中。将rCTC(S)细胞在生长培养基中培养。在经历额外两天的培养后，注意到rCTC(s)细胞变为贴壁的。由rCTC(S)细胞变为贴壁时形成的贴壁细胞群称为rCTC(A2)细胞群或rCTC(A2)细胞。
根据实例2中描述的方法，在第7天通过胰蛋白酶消化收集rCTC(A2)细胞并传代。将rCTC(A2)细胞以5,000个细胞/cm2的密度接种于T225培养瓶中，每个培养瓶中含45ml生长培养基。当细胞达到大约80％汇合度时进行细胞传代。观察到的rCTC(A2)细胞生长曲线在图7中示出。
实例5
表达GFP的小鼠心脏组织来源细胞的分离
将五只8-12周龄的FVB.Cg-Tg(ACTB-EGFP)B5Nagy/J小鼠(GFP小鼠，Jackson Lab(Bar Harbor，Maine))用异氟醚麻醉，并且打开腹腔。移开肠子，切断主动脉。将27号注射针插入胸腔静脉，并且用10ml含有5U/ml肝素的PBS灌注心脏。然后通过将10ml含有5U/ml肝素的PBS注入胸主动脉来对心脏进行逆行灌注。小心操作，确保心脏在整个手术期间保持搏动。然后将整个心脏从胸腔摘除，并置于冰冷的Hank’s缓冲液中。
将五个分离的GFP小鼠心脏组合在一起，用于解离和酶法消化。然后将分离的小鼠心脏用20ml室温PBS洗涤两次，并弃去上清液。然后在室温下用外科手术刀将心脏手工切碎，并且将切碎的组织转移至三个50ml试管中。然后将切碎的组织用25ml PBS洗涤三次，每次洗涤时将试管翻转五次。将组织块转移至单独的50ml锥形试管(Corning Inc.(Corning，NY))中。添加30ml室温PBS，将每个试管中的组织洗涤三次，每次洗涤时将试管翻转五次。然后将试管直立放置，让组织沉淀。使用2ml抽吸移液管(BD falcon，BD Biosciences(SanJose，CA))吸出上清液。将消化酶混合物储液(2X)添加至50ml试管中，酶与组织的比率为1∶1。混合酶的终浓度为1U/ml胶原酶和5U/ml分散酶II。将装有组织和酶的试管转移至设置为225rpm的37℃回旋振荡器(Barnstead Lab(Melrose Park，IL))中，温育2.5小时。温育后，将试管转移回生物安全柜。通过在试管中添加室温PBS，将细胞悬浮液稀释。为了除去任何剩余的未消化组织，将细胞悬浮液滤过8英寸直径100μm细胞过滤网(BD Falcon)，然后滤过40μm细胞过滤网(BD Falcon)至6个50ml锥形试管(BD Falcon)。大鼠CTC所用过滤器尺寸小于人细胞所用过滤器尺寸，因为大鼠和人之间的肌细胞大小存在差异。然后使用SorvallLegend T离心机(Thermo Fisher Scientific，Inc(Waltham，MA))将细胞悬浮液在室温下以338×g离心5分钟进行洗涤，以沉淀细胞。将上清液吸出，并且将细胞沉淀重悬于生长培养基中，合并到一个盛有20ml生长培养基的50ml试管中，然后取样确定细胞收获量。获得的典型收获量为1,000万个细胞/心脏，存活率为70％。
3小时温育后，如实例4中所述，将20ml生长培养基添加至每个试管中。为了除去任何剩余的未消化组织，将细胞悬浮液滤过8英寸直径100μm细胞过滤网(BD Falcon)，然后滤过40μm细胞过滤网(BD Falcon)至六个50ml锥形试管(BD Falcon)。使用Sorvall Legend T离心机(Thermo Fisher Scientific，Inc(Waltham，MA))将细胞悬浮液在室温下以338×g离心5分钟进行洗涤，以沉淀细胞。将上清液吸出，并且将细胞沉淀重悬于生长培养基中，合并到一个盛有20ml生长培养基的50ml试管中，然后取样确定细胞收获量。基于2次分离，获得的典型收获量为1,000万个细胞/心脏，存活率为70％。mCTC(A2)群体用于随后研究。在研究前，将细胞扩增用于传代两次。
实例6
细胞低温冷藏、存活率和回收率
制备本发明的大鼠和人心脏组织来源细胞用于低温冷藏。简而言之，来自hCTC(A3)或rCTC(A2)群体的细胞通过扩增低温冷藏的早期传代hCTC(A3)和rCTC(A2)细胞而获得。细胞以3,000个细胞/cm2接种后，在37℃、20％大气O2下培养，并且在培养7天后进行传代，培养的第3天更换培养基。在12-14PDL时收集细胞。
将细胞用胰蛋白酶消化并重悬于包含2％DMSO的CRYOSTOR D-LITETM(BiolifeSolutions，Inc(Bothell，WA))中用于低温冷藏，然后使用带有DeltaT软件的Integra 750Plus程序冷冻仪(Planer(Middlesex，U.K.))将所得细胞悬浮液低温冷藏于Nalgene 2mL无菌内旋盖聚丙烯冻存管(Nalgne Nunc(Rochester，NY))中。在放入保持在15℃的程序冷冻仪之前细胞和溶液处于室温下。将样品温度探头置于盛有冻存缓冲液的瓶中。使用以下程序进行低温冷藏：
当温度达到-140℃时，将样品转移至液氮罐储存。
低温冷藏后本发明的人心脏组织来源细胞的存活率和回收率：在液氮罐(-140℃)中储存一个月后，将一瓶以100万个细胞/瓶悬浮于CRYOSTOR D-LITETM中的hCTC(A3)细胞在室温下解冻。然后将试剂瓶转移至生物安全柜。将50μL(含50万个细胞)样品转移至装有50μL台盼蓝溶液的1.8mL微量离心管。将10μL转移至血细胞计数器并计数，以便对该细胞制备物进行双重计数。这些计数确定了t0通过注射针前的回收率和存活率。在未进行室温温育时，为了确定通过注射针后(t0通过注射针后)的细胞存活率和回收率，将100μL细胞悬浮液通过30号注射针(BD产品目录号：305106)吸入1mL结核菌素注射器(BD产品目录号：309602)。然后使样品再次通过注射针注入1.8mL微量离心管。将100μL台盼蓝添加至该试管中，并且如上所述进行双重计数。该过程在室温温育10min、20min、30min的时间后进行，以及30分钟不通过注射针的情况下进行。
在储存一个月后，hCTC(A3)细胞解冻后的存活率确定为94％。如表3和图8中所示，细胞回收率为54万，类似于低温冷藏前的原细胞数。
在室温温育30分钟(该时间是大鼠梗塞手术期间细胞施用必需的时间)后，人心脏组织来源细胞通过30号施用针后测试的存活率大于90％。如表3和图8中所示，其回收率类似于通过注射针前的细胞数。
将hCTC(A3)细胞扩增至PDL12，并储存用于将来的体内研究。对储存的细胞样品检查核型异常。结果汇总于表4中。
大鼠CTC生物相容性：如上所述，将一瓶以200万个细胞/瓶悬浮于CRYOSTOR D-LITETM中的rCTC(A2)细胞解冻。然后将试剂瓶转移至生物安全柜。将50μL样品转移至装有50μL台盼蓝溶液的1.8mL微量离心管。将10μL转移至血细胞计数器并计数，以便对该细胞制备物进行三重计数。为了确定通过注射针后的细胞收获量和存活率基线，同时在通过注射针前和通过注射针后在0、10、20、30min的温育时间进行细胞计数。在每个时间点，将100μL细胞悬浮液通过30号注射针(BD产品目录号：305106)吸入1mL结核菌素注射器(BD产品目录号：309602)。然后使样品再次通过注射针注入1.8mL微量离心管。将100μL台盼蓝添加至该试管中，并且如上所述进行三重计数。该过程在室温温育10min、20min和30min的时间后进行，以模拟大鼠急性心肌梗塞模型中细胞施用的潜在过程。
在液氮中储存一个月后，rCTC(A2)细胞解冻后的存活率为94％。细胞的回收率为140万/ml，约为原细胞浓度(200万/ml)的70％。在室温温育30分钟(该时间是大鼠梗塞手术期间注射必需的时程)后，rCTC(A2)细胞在通过注射针后的存活率大于90％。如表5和图9中所示，其回收率类似于通过注射针前的回收率。
实例7
本发明的心脏组织来源细胞的鉴定
在心脏组织来源细胞群中确定细胞表面蛋白的表达，该细胞群通过本发明的方法从大鼠和人心脏组织获得。测试的细胞表面标记物在表6中示出。人真皮成纤维细胞群作为对照包括于其中。
超过90％的hCTC(A3)细胞群表达CD59、CD105、CD54和CD90(单独分析)。大约30％的hCTC(A3)细胞群表达CD34，它是内皮祖细胞的一种干细胞标记物。同时，约30％的hCTC(A3)显示出c-Kit阳性。相比之下，小于5％的hCTC(A3)细胞群表达CD31、CD45或CD16。参见图10、11和表7。hCTC(A1)、hCTC(A1)和hCTC(S)细胞群还显示出类似的细胞表面标记物表达。参见表8。此外，rCTC(A3)细胞群观察到类似的结果。参见图12。CD54(即，细胞间粘附分子-1(ICAM))结合到白细胞上的整联蛋白，并介导白细胞迁移出血管屏障到达组织(Yang L等人，Blood 106(2)：584-92，2005年7月)。因此，当hCTC(A3)施用至冠状动脉时，该分子的细胞表面表达可促进hCTC(A3)从脉管系统至心肌的易位。
实例8
心脏组织来源细胞的基因表达分析
采集以下心脏组织来源细胞群的RNA样品：hCTC(A1)、hCTC(A2)、hCTC(A3)、rCTC(A2)和mCTC(A2)(RNA从每个细胞群的100万个细胞采集)。
通过所采集样品的实时PCR确定一组基因的表达情况。实时PCR反应根据表9中定义的反应混合物引发，并且所测基因的引物在表10中示出。检查两类基因：心脏特异性基因和干细胞基因。心脏特异性基因还可分为分化标记物(例如肌球蛋白重链(MyHC))和未分化心脏标记物(例如GATA-4和Nkx2.5)。干细胞基因还可归类为干细胞标记物c-kit、胚胎心脏标记物islet-1和细胞分裂标记物端粒酶。管家基因—3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)用作基准，使每个样品中的表达水平归一化。
实验发现，所测基因的表达情况在hCTC(A1)、hCTC(A2)和hCTC(A3)群体中是类似的。参见表10。hCTC(A1)、hCTC(A2)和hCTC(A3)群体中表达了干细胞标记物c-kit(Ct：27-29)，而端粒酶和islet-1的表达不可检测：当Ct值为40时未检测到基因的信息。在hCTC(A1)、hCTC(A2)和hCTC(A3)群体中，心脏标记物GATA 4和Nkx2.5分别在CT值为25和32-34时表达，而在任一个hCTC(A1)、hCTC(A2)和hCTC(A3)群体中均未观察到肌球蛋白重链或心脏肌动蛋白的表达。参见表10。
这些数据表明，本发明的心脏组织来源细胞是“类祖细胞的”，即与心肌细胞(1％)和人成纤维细胞(12％)相比，在hCTC(A1)、hCTC(A2)和hCTC(A3)群体中，祖细胞标记物与分化细胞标记物表达的比率大于50,000。参见表10、表11和图13。
rCTC(A2)细胞也表达心脏谱系基因，例如GATA-4(Ct：28)和Nkx2.5(Ct：27)。然而，与人心脏组织来源细胞不同，Nkx2.5在大鼠心脏组织来源细胞中的表达水平高于人心脏组织来源细胞中观察到的水平。标记物c-kit、Islet-1和端粒酶也在rCTC(A2)细胞中表达。参见表12。类似的从大鼠心脏获得的心脏组织来源细胞、小鼠心脏组织来源细胞也表达Nkx2.5、c-kit、Islet-1和端粒酶。参见表13。
实例9
心脏组织来源细胞可分化为心肌细胞
首先将根据实例5中描述的方法获得的mCTC(A2)细胞(200K)在生长培养基中培养2天，然后通过胰蛋白酶消化收集，并且在与大鼠心肌细胞(100万，产品目录号：R357，CellApplication，Inc.(Austin，TX))以1∶5的比率混合之前计数。将大鼠心肌细胞培养5天后，用胰蛋白酶消化并计数，然后与mCTC(A2)细胞混合。将细胞混合物接种于层粘连蛋白处理的6孔板(产品目录号：354595 BD Biosciences，NJ)上5天。通过在包含DMEM-F12(1∶1)+10％马血清的组织培养基(Sigma)(下文称为分化培养基)中培养细胞混合物来测试mCTC(A2)细胞分化的能力。在20％O2的气氛、37℃下，将细胞在分化培养基中培养5天。这段时间后，收集细胞，并提取RNA。对来自mCTC(A2)细胞和大鼠心肌细胞的共培养物，以及来自mCTC(A2)细胞的平行培养物的总RNA进行测试，得出鼠肌球蛋白重链的基因表达情况。使用以下鼠肌球蛋白重链引物：
类型 名称 序列
正向引物 MHC-小鼠-F GAAACACCTGAAGAATTCTCAAGCT
反向引物 MHC-小鼠-R TTGGCATGGACAGCATCATC
探针 MHC-小鼠-P ACTTGAAGGACACCCAGC
与单一mCTC(A2)细胞的平行培养物相比，mCTC(A2)细胞与大鼠心肌细胞的共培养物可使鼠肌球蛋白重链的表达增加9倍。参见图14。这些数据表明，本发明的心脏来源细胞能够分化为心肌细胞，并且本发明的细胞与心肌细胞的共培养可促进分化。
实例10
猪心脏组织来源细胞的分离、扩增和鉴定
每次分离时，从Marshall Bioresources(North Rose，NY)获得8-12周龄的哥廷根小型猪(mini swine)的单个心脏。在收集之前，灌注心脏以放空血液，在运输期间将整个器官浸于冰上的DMEM+10％FBS中。从切取至组织消化的时间在48-96小时之间。根据以下描述的过程进行四次单独分离。
将心脏切为小块(尺寸为大约2至3cm3)。如实例1中所述，这些组织块的匀浆通过机械匀浆来进行，以产生尺寸小于1mm3的心脏组织碎片，然后转移至一个250ml锥形试管(Corning Inc.(Corning，NY))，并洗涤三次。将消化酶混合物储液(2X)添加至250ml试管中，酶与组织的比率为1∶1。酶的终浓度为1U/ml胶原酶和5U/ml分散酶II。将装有组织和酶的试管转移至设置为225rpm的37℃回旋振荡器(Barnstead Lab(Melrose Park，IL))中，温育2.5小时。温育后，为了除去任何剩余的未消化组织，将细胞悬浮液滤过8英寸直径250μm标准试验筛，以除去未消化的结缔组织和脂肪组织(Sigma-Aldrich(St.Louis，MO))，然后进一步滤过100μm细胞过滤网，以除去心肌细胞(BD Falcon)。将包含通过过滤器的细胞的培养基转移至多个50ml锥形试管(BD Falcon)。然后洗涤细胞悬浮液。洗涤后，将沉淀物重悬于20ml ACK裂解缓冲液(Lonza(Walkersville，MD))中，并在室温下温育10分钟，以裂解任何剩余的红细胞。温育后，用40ml室温PBS再洗涤细胞悬浮液两次。最后一次离心后，将沉淀重悬于20ml室温生长培养基中，并计数。在解离和酶法消化后，在20ml体积中细胞的收获量通常为2700万个细胞。存活率通常为80％。
将解离和酶法消化获得的细胞悬浮液添加至T225组织培养瓶(Corning Inc.(Corning，NY))中。将10ml细胞悬浮液添加至每个培养瓶中，培养瓶中装有50ml生长培养基(DMEM、1,000mg/L D-葡萄糖、584mg/L L-谷氨酰胺和110mg/L丙酮酸钠、10％胎牛血清、青霉素50U/ml、链霉素50μg/ml，Invitrogen(Calsbald，CA))。初始培养物的最终体积为60ml。将细胞在37℃下在含20％O2和5％CO2的气氛中培养2天。这段时间后，可观察到异质的细胞培养物。可观察到非贴壁、相亮细胞(本文称为pCTC(S)细胞)，并且可观察到贴壁细胞(本文称为pCTC(A1)细胞)。
根据本发明方法的猪心脏解离和酶法消化，以及随后的细胞扩增可产生以下细胞群：pCTC(S)、pCTC(A1)、pCTC(A2)和pCTC(A3)细胞。本发明的猪心脏组织来源细胞的形态类似于本发明的人心脏组织来源细胞。选择pCTC(A3)群体用于进一步鉴定和随后的体内研究。
pCTC(S)细胞和pCTC(A1)细胞经培养而初始扩增为T225培养瓶中的混合物。每个培养瓶中添加60ml/瓶的新鲜生长培养基，并且将细胞在37℃、20％O2下培养2天。这段时间后，大多数细胞形成贴壁细胞群，该细胞群在本文称为pCTC(A3)群体或pCTC(A3)细胞。培养2天后，通过肉眼观察，非贴壁细胞的数量减少，使得pCTC(A3)细胞变为均质的细胞群。这平均需要2天。一旦细胞达到90-100％汇合度，将pCTC(A3)细胞传代，并以3000个细胞/cm2重新接种。pCTC(A3)细胞在培养中的扩增超过人心脏组织来源细胞的生长。pCTC(A3)细胞在3-4天中生长至超过90％汇合度。参见图15中本发明的pCTC(A3)细胞观察到的生长曲线。
如实时PCR所确定，pCTC(A3)细胞不表达端粒酶或肌球蛋白重链。然而，pCTC(A3)细胞表达GATA-4。在本发明的猪心脏组织来源细胞中，未检查Nkx2.5的表达。细胞表面标记物的单染色显示，pCTC(A3)细胞群的超过90％对CD105和CD90的表达是阳性的。少于5％的pCTC(A3)细胞表达CD45、CD16或猪内皮细胞标记物(产品目录号MCA1752，Serotec)。该标记物是组织相容性复合物II型分子，该分子在很多组织中的毛细血管内皮上鉴定，如Wilson等人(Immunology.1996年5月；88(1)：98-103)所示。参见图16和表14。未检查其他细胞群例如pCTC(A1)或pCTC(A2)细胞。
实例11
用本发明的心脏组织来源细胞治疗急性心肌梗塞
大鼠急性心肌梗塞模型：大鼠心肌梗塞模型已成功用于测试诸如ACEI和β-阻滞剂之类的试剂作为人AMI疗法的效力。在实验的所有阶段，根据当地规章制度处理动物。
大鼠心肌梗塞模型业已建立，用于模拟心肌梗塞后的人病理生理，以及梗塞后心脏功能的进一步恶化(Pfeffer M.A.等人，Circ Res 1979；44：503-12；Litwin S.E.等人，Circulation 1994；89：345-54；Hodsman G.P.等人，Circulation 1988；78：376-81)。
用氯胺酮和甲苯噻嗪(分别为60和10mg/kg IP)麻醉雌性裸大鼠(体重250至300g；Shizuoka Agricultural Cooperation Association(Shizuoka，Japan))，并且通过气管插管施加正压呼吸。在左四肋间隙打开胸部，把心脏从腹内取出，并切割心包膜。此后，用镊子夹住心脏，并且在冠状动脉左前降支下、距其原位大约2mm处用6-0Proline缝合线打成环。通过拉动绑扎线永久封闭动脉来诱导心脏的AMI。可用肉眼观察到梗死心肌的变色。如下面细胞施用中所描述，梗塞诱导后约20min，在变色区的边界区域注射心脏组织来源细胞悬浮液或溶媒。注射后，关闭胸部，并且将大鼠放回其笼中。在手术后每个特定时间，通过麻醉下切除心脏来处死大鼠。
将保存在-80℃下的低温冷藏hCTC(A3)和rCTC(A2)细胞群在冰上解冻，并且在给测试动物施用前确定它们的存活率。在本研究中使用的所有细胞群中，细胞存活率均大于95％。
冠状动脉左前降支绑扎后20分钟，给测试动物施用细胞。在变色区的边界区域注射低温冷藏hCTC(A3)细胞群。测试动物接受在120μl Cryostor D-lite中的以下目标剂量之一(15只动物/目标剂量)：1×104个细胞(低剂量)、1×105个细胞(中剂量)或1×106个细胞(高剂量)。在变色区的边界区域注射低温冷藏rCTC(A2)细胞群，作为平行实验。测试动物接受在120μl Cryostor D-lite中的以下目标剂量之一(15只动物/目标剂量)：1×106个细胞。
在所有测试动物中，低温冷藏细胞均置于总体积为120μl的低温冷藏培养基中。将一个目标剂量的细胞注射至心脏变色区周围的五个单独部位。接受低温冷藏培养基(120μl)注射的对照组也包括于研究中。
在AMI诱导后5和28天，用经胸超声心动描记术(SONOS 5500，Philips MedicalSystems)进行左心室(LV)功能评估。当进行超声心动描记术时，将大鼠用氯胺酮和甲苯噻嗪麻醉。LV舒张末期和收缩末期内径(分别为LVEDD和LVESD)以及缩短分数(FS)在中部乳头肌水平测量。FS通过测量收缩期内径(收缩末期)和舒张期内径(灌注末期)之间的差值百分比来反映心脏的泵血效应。局部室壁运动记分(RWMS)根据公布的标准评估：1分：室壁运动和增厚正常；2分：室壁运动和增厚减少；3分：不存在室壁运动和增厚；4分：向外运动或膨出。(参见例如Schiller、Shah等人(Journal of American Society of Echocardiographyvol 2：358-367；1989))。
简而言之，从超声心动图获得十七张连续切面图像，并且基于表15中的定义给出每个切面的室壁运动记分。所有17个节段的分数的总和用作室壁收缩性的指标。RWMS是收缩的直接量度。RWMS的减少表明了收缩的改善，并反映了心脏肌肉功能的改善。表15描述了每个分数的标准。
研究中观察到的死亡率为16％。如表16中所示，组之间的死亡率无显著差异。
结果
图17复制自Pffeffer等人(1999)的Atlas of Heart Failure，显示了梗塞后观察到的心脏病理变化。大鼠急性心肌梗塞模型已建立，用于模拟人患者的AMI和慢性心力衰竭。梗塞后，如人中，心室经历了一系列病理生理变化，首先是梗死区域处心肌更换为纤维组织。心室中的收缩和压力可导致梗死扩展、心室逐渐扩张，并最终导致左心室重塑，该重塑表现为心室的几何形状从椭圆形变为球状，并出现肌细胞肥大一类的细胞变化。
低温冷藏的hCTC(A3)细胞群改善了整体心脏功能和心脏收缩性，如分别通过缩短分数(FS)和局部室壁运动记分(RWMS)所测量的。整体心脏功能和心脏收缩性的改善可在hCTC(A3)细胞的所有目标剂量观察到。参见图18和19。
在施用后五天，施用了rCTC(A2)细胞或目标剂量为1×106的hCTC(A3)细胞的动物显示出(hCTC(A3))和(rCTC(A2))处理后的FS分别比溶媒处理动物小3.3％和3.8％。在细胞施用后四周，缩短分数的绝对值(通过第28天观察到的FS值减去第5天观察到的FS值计算)得到提高。参见图18及表17和18。用1×104个hCTC(A3)细胞处理的动物中FS的绝对值为9.687±1.329％(n＝12，P小于0.001)。用1×105个hCTC(A3)细胞处理的动物中FS的绝对值为10.9±1.6％(n＝11，P＜0.001)。用1×106个hCTC(A3)细胞处理的动物中FS的绝对值为12.9±1.8％(n＝10，P小于0.001)。有几种可能原因可解释rCTC细胞在本发明使用的实验模型中无效。虽然裸大鼠是免疫缺陷型，但是它们对外源细胞的排斥并未完全消除。在当前研究中，rCTC比人细胞更易受到裸大鼠的免疫排斥。由于免疫排斥，它们在心肌中的滞留量下降，从而影响到它们对心肌的作用。
在细胞施用四周后，在用hCTC(A3)细胞处理的动物中也可观察到RWMS下降。在梗塞和细胞施用后5天，用1×104个hCTC(A3)细胞处理的动物中RWMS分数为24.42±1.4，但是在梗塞和细胞施用后4周下降至21.08±1.7(n＝12，P小于0.001)。在梗塞和细胞施用后5天，用1×105个hCTC(A3)细胞处理的动物中RWMS分数为25.58±1.4，并且下降至21.08±1.9(n＝11，P小于0.001)。在梗塞和细胞施用后5天，用1×106个hCTC(A3)细胞处理的动物中RWMS分数为25.91±1.6，并且在梗塞和细胞施用后4周下降至20±1.7(n＝10，P小于0.001)。虽然rCTC(A2)处理未显示出缩短分数下降，但是观察到RWMS略有下降。在梗塞和细胞施用后5天，用1×106个rCTC(A2)细胞处理的动物中RWMS分数为25.29±1.9，并且在细胞施用后四周下降至23.86±2.3(n＝12，P＝0.09)。参见图19及表17和19。在rCTC(A2)处理动物中观察到的数据表明，虽然rCTC(A2)细胞未改善整体功能，但是它们改善了心脏收缩性，如RWMS所示。
在另一个方面，在用hCTC(A3)细胞处理的动物中观察到的数据表明，人心脏组织来源细胞改善了整体心脏功能和心脏收缩性。
在接受hCTC(A3)细胞的动物中，心脏重塑也得以阻止。心脏重塑是指缺血性损伤(例如心肌梗塞)后观察到的心脏大小、形状和功能的变化。观察到的变化包括梗死区域的心肌细胞死亡和室壁不成比例的变薄。薄室壁不能承受心脏上的压力和容量负荷。因此，首先在梗死区域出现心室扩张，随后扩展到代偿的非梗死心脏肌肉。由于心脏经历持续的扩张，随着时间的推移，心室尺寸变大，形状越来越不像椭圆而更接近球形，如超声心动描记术中内径增加所显示的。心室质量和容量的增加会更进一步给心脏功能带来不利影响。在舒张末期容量的增加最终会损害心脏收缩之间的松弛能力，进一步导致功能下降。心室扩大的严重性决定了患者的预后。心室扩大与心力衰竭患者的预期寿命缩短相关联。
急性心肌梗塞诱导后，动物左心室中心脏重塑的程度通过超声心动描记术测量舒张末期左心室内径(左心室舒张末期内径，LVEDD)和收缩末期左心室内径(左心室收缩末期内径，LVESD)来确定。LVEDD和LVESD的增加代表心脏重塑严重性增加。相反地，观察到的LVEDD和LVESD值的减少代表心脏重塑的逆转或心脏功能的改善。
在溶媒处理动物中，LVEDD从细胞施用后五天的0.74±0.020mm增加至细胞施用后4周的0.83±0.019mm。这相当于左心室相对增加12％[100％(D28-D5)/D5]。在用rCTC(A2)细胞处理的动物中，LVEDD从细胞施用后五天的0.69±0.022mm增加至细胞施用后4周的0.80±0.018mm。在用1×104个hCTC(A3)细胞处理的动物中，LVEDD从细胞施用后五天的0.70±0.012mm增加至细胞施用后4周的0.77±0.022mm。
在用1×105个hCTC(A3)细胞处理的动物中，LVEDD未显示出显著变化，其中LVEDD在细胞施用后五天为0.73±0.012mm，并且在细胞施用后4周为0.74±0.023mm，相对变化为1.4％(与溶媒组相比，p小于0.01)。相似地，在用1×106个hCTC(A3)细胞处理的动物中，LVEDD也未显示出显著变化，其中LVEDD在细胞施用后五天为0.76±0.011mm，并且在细胞施用后4周为0.71±0.028mm，减去细胞施用后五天的数据的相对变化为6.6％(与溶媒组相比，p小于0.001)。这些数据表明，1×105个hCTC(A3)的剂量和1×106个hCTC(A3)的剂量可阻止心脏重塑。参见图23、表17和表20。LVEDD的相对变化(100％(28D-5D)/5D)在表21和图20-21中示出。
在用1×104个hCTC(A3)细胞处理的动物中，LVEDD在第5天为0.71±0.045mm，并且在第28天为0.78±0.079mm。在用1×106个rCTC(A2)细胞处理的动物中，LVEDD在第5天为0.70±0.083mm，并且在第28天为0.80±0.071mm。与溶媒处理的动物相比，LVEDD无显著的差异，这表明与溶媒组相比，重塑未得到改善。参见表17和图23。
用人心脏组织来源细胞处理的动物也显示出左心室收缩末期内径(LVESD)的减少。LVESD是收缩末期心室大小的量度。该参数不仅表示重塑，也表示心脏肌肉的收缩性。LVESD的减少相当于收缩强度的增加。
在溶媒处理动物中，LVESD从第5天至第28天均增加。在用1×104个hCTC(A3)细胞处理的动物中，LVESD维持在相同水平(第5天为0.56±0.05cm，第28天为0.54±0.08cm)。在用1×105个hCTC(A3)细胞处理的动物中的LVESD(第5天为0.58±0.04cm，第28天为0.51±0.08cm)和1×106个hCTC(A3)细胞处理的动物中的LVESD(第5天为0.62±0.05cm，第28天为0.48±0.09cm)均减少。参见图22和表22。通过超声心动描记术在每个时间点从每个动物测量的所有四个参数的功能数据在图23中示出。第5天和第28天之间的趋势变化在每个组中一致。
hCTC(A3)细胞施用的目标剂量与心脏功能(如通过缩短分数(FS)测量的整体功能所确定)的分析显示出细胞剂量和功能改善之间的相关性(p＝0.001，n＝35)。参见图24。
相似地，可观察到hCTC(A3)细胞施用的目标剂量与心脏重塑(如LVEDD从第5天至第28天的绝对变化(28D-5D)所确定)的分析(p＝0.0002，n＝35)。参见图25。相关性已建立，并且其显示出指数变化，而不是线性变化。
实例12
大鼠急性心肌梗塞模型中人心脏组织来源细胞的滞留量
为了进一步理解人心脏组织来源细胞作为受损心肌疗法的机制和生物学有益效果，从上述实例中的人心脏细胞处理的动物心脏采集组织样品，以确定施用后四周的动物中人心脏组织来源细胞的滞留量。
将心脏从上述实例中人心脏组织来源细胞处理的动物摘除，并在细胞施用后四周收集。细胞滞留量通过组织学(n＝6/细胞剂量)和定量实时PCR(n＝4/细胞剂量)测定。
为了建立基线细胞滞留值，冠状动脉左前降支绑扎后20分钟，给测试动物施用hCTC(A3)细胞。在变色区的边界区域、每个动物的五个单独注射部位中注射低温冷藏的hCTC(A3)细胞群。给动物施用1×104、1×105或1×106个细胞的目标剂量。在0、1、3和7天处死动物，并摘除心脏，用于通过定量实时PCR(n＝3/处理组)进行细胞滞留分析。
在采得用于定量实时PCR的样品的情况下，处理心脏组织以获得总RNA。基于心脏样品中检测的人RNA的量，评估人细胞的滞留量。
在用hCTC(A3)细胞处理的动物中，细胞施用后4周可检测到来自人心脏组织来源细胞的RNA。细胞滞留量表现出剂量依赖性，接受1×106个hCTC(A3)细胞的动物比接受1×105个hCTC(A3)细胞的动物显示出更大的细胞滞留量。在接受1×104个hCTC(A3)细胞的动物中，基于样品中检测到的人RNA的量，估计细胞滞留量处于背景水平。
人RNA可在细胞施用后0、1天、3天和7天处死的动物心脏中检测到。施用后细胞滞留量即迅速下降，并且在细胞施用后24小时进一步下降。如图26的图c和d中所示，细胞施用后，仅有约8％的目标剂量剩余，如根据心脏样品中检测到的人RNA的量所评估。使用0时间点作为基线，当在细胞施用后24小时确定时，细胞滞留的水平进一步下降至大约0时间点的10％。细胞施用后第7天，细胞滞留的水平仍然保持在相同水平。
可观察到人心脏组织来源细胞滞留和心脏重塑阻止之间的相关性。在接受人心脏组织来源细胞的动物中，LVEDD的变化(D28-D5)与人心脏组织来源细胞的滞留相关联。可从图27中看出，相关性的趋势具有显著性，p值为0.023，r2值为41％。在高血压的良好处方药依那普利的临床药理学研究中(Lilian Murray等人，Br J Clin Pharmacol.1998；45(6)：559-566)，可观察到研究中依那普利和血压降低的显著相关性(p小于0.01)。然而，“模型的预测能力增加了(r2＝23.6％，p小于0.01)，但是仍然不能解释响应的大多数变量”。
在采得用于免疫组织化学的样品的情况下，将心脏包埋在OCT培养基中，并且在液氮中快速冷冻(n＝6/组)。在心脏的基部、中部和顶端水平切片。将包埋的冷冻组织送至QualTek Technology(Santa Barbara，CA)进行进一步组织学评估。将组织在室温下解冻，然后在福尔马林中重新固定并包埋于石蜡中，再切成5μm切片。将切片用抗人核基质抗原(hu NuMA)的抗体染色，以便识别大鼠心肌中的人心脏组织来源细胞。
免疫组织化学结果与qPCR的结果相符。在接受目标剂量为1×106个hCTC(A3)细胞的动物心肌中鉴定阳性人NuMA染色结果。参见图28的分图a和图29。染成深褐色的且染色特性显示出与人组织对照相似的NuMA阳性细胞在本文中以两个椭圆环示出，并且未显示出背景染色。细胞数量的估值为大约100个人细胞/切片。如图29的图d中所示，在高倍放大下，也可鉴定出类肌细胞人细胞。在溶媒处理动物中，未观察到人NuMA的染色。参见图28的分图a和b、图29和图30。
实例13
人心脏组织来源细胞减少急性心肌梗塞动物模型的肥大
为了进一步理解人心脏组织来源细胞作为受损心肌疗法的机制和生物学有益效果，从实例11中的人心脏细胞处理的动物心脏采集组织样品，以确定人心脏组织来源细胞的施用对心脏梗死面积普通病理的影响。
由QualTek(Santa Barbara，CA)的病理学家评估组织病理。病理学家对研究处理不知情。将心脏组织包埋在石蜡块中。获得整个器官每5μm的切片，并评估普通病理。通过评分系统进行肥大评估。在肥大心肌(1分)中，通常可发现具有扩大的细胞质和奇核的心肌细胞。否则，心肌评为0分。对出现肥大和无肥大的切片进行计数，在图31中以占总切片的比例示出，以表示整个心脏中肥大的比例。
在溶媒处理的动物心脏中观察到心肌肥大，其中大约70％的心肌显示出肥大(1分)。参见图31。当与溶媒处理的动物相比时，用人心脏组织来源细胞处理可显著减少心脏中观察到的肥大。在接受目标剂量为1×104、1×105或1×106的hCTC(A3)细胞的心脏中，肥大心肌减少至30％-50％。参见图31。
为了阐明心肌梗塞的严重性，在每个心脏的乳头肌水平的切片上进行Masson三色染色。通过直接测量梗死区域和非梗死区域确定梗死面积。按100％[梗死面积/(梗死面积+非梗死面积)]估算相对梗死面积。所有形态测量研究根据Iwasaki等人在Circulation.2006；113：1311-1325中描述的方法进行。
与溶媒组(24.1±2.9％)相比，在接受1×105(16.5±7.3％，p＝0.02)或1×106个hCTC(A3)细胞(14.8±8.6％，p＝0.01)的动物中观察到相对梗死面积减少的趋势。参见图32的分图a。相似地，与溶媒处理组(748±191)相比，也在接受1×105(557±221，p＝0.09)或1×106(537±261，p＝0.08)个hCTC(A3)细胞的动物中观察到实际梗死区域的梗死面积减少的趋势。参见图32的分图b。
在溶媒处理的动物心脏中观察到心肌肥大，其中大约70％的心肌显示出肥大(1分)。参见图31。当与溶媒处理的动物相比时，用人心脏组织来源细胞处理可显著减少心脏中观察到的肥大。在接受目标剂量为1×104、1×105或1×106的hCTC(A3)细胞的心脏中，肥大心肌减少至30％-50％。参见图31。hCTC能实现肥大减少可直接归因于营养作用或旁分泌作用，即hCTC分泌的细胞因子(如表24中所示)，和/或是由于肌细胞从头生成的增加而出现继发效应(如下面实例14中所讨论)。
实例14
在急性心肌梗塞的动物模型中人心脏组织来源细胞增加了毛细血管密度
为了进一步理解人心脏组织来源细胞作为受损心肌疗法的机制和生物学有益效果，从实例11中的人心脏细胞处理的动物心脏采集组织样品，以确定人心脏组织来源细胞的施用对梗死区域边界区毛细血管密度的作用。
随机选择五个在梗死区域的边界区采集的每个心脏左心室的组织切片，并且通过组织学检查对毛细血管密度进行形态测量评估，其中毛细血管可使用抗同工凝集素B4(Vector Laboratories(Burlingame，CA))或CD31的抗体来显现。同工凝集素B4对内皮细胞表面糖残基具有特异性，并已证实可识别多种状态下的内皮细胞，如Vasudevan等人在Nature Neuroscience 11：429-439(2008)中所描述，以及Schmidt等人在Development134，2913-2923(2007)中所描述。CD31也称为血小板内皮细胞粘附分子(PECAM)，已广泛用于鉴定内皮细胞，从而可鉴定包括心脏在内的各种组织中的脉管系统(Tabibiazar和Rockson，Eur Heart J，2001年，第22卷；903-918)。
通过同工凝集素B4或CD31进行的毛细血管显现表明，人心脏组织来源细胞的施用可增加在梗死区域边界区的毛细血管密度。与溶媒处理组相比，细胞施用后四周，施用所有剂量的hCTC(A3)细胞都导致毛细血管密度的增加。参见图33的分图a和b。(对于同工凝集素B4染色，p＝0.0068，并且对于CD31染色，p＝0.0005)。
毛细血管密度增加的部分原因是本发明的人心脏组织来源细胞分泌了一些因子。这些营养因子可(例如)以旁分泌方式在心脏细胞上发挥作用。营养因子可直接或间接影响血管形成、血管功能和血液动力学、心脏肌肉重塑和功能、肌细胞增殖(例如肌细胞生成)、肌细胞肥大、纤维化或增加心脏细胞存活率。营养因子也可调节受试者的免疫反应。为了确定人心脏组织来源细胞是否分泌营养因子，从体外培养七天的hCTC(A3)细胞群收集培养基。在测定所分泌细胞因子的存在之前，将培养基样品保存在-80℃。
hCTC(A3)细胞分泌的细胞因子包括血管内皮生长因子(VEGF)和血管生成素2(ANG2)。参见表24。这些细胞因子在血管生成中发挥重要功能。更重要地，VEGF和ANG2的组合可协同引发和提高毛细血管出芽过程，如Maisonpierre等人在Science 277：55-60(1997)中所证实，以及Ramsauer等人在Journal of Clinical Investigation 110：1615-1617(2002)中所综述。
实例15
在接受本发明的人心脏组织来源细胞的动物中的非梗死区域人心脏组织来源细
胞增加了肌细胞密度
为了进一步理解人心脏组织来源细胞作为受损心肌疗法的机制和生物学有益效果，从实例11中的人心脏细胞处理的动物心脏采集组织样品，以确定人心脏组织来源细胞的施用对梗死区域的边界区大鼠肌细胞的增殖的作用以及对心脏的非梗死区域中肌细胞密度的作用。
将福尔马林固定、石蜡包埋的组织样品切成4μm切片。从每个动物选择一张大约第17次切片的载玻片。将切片与抗Ki-67(MIB-5)的抗体在室温下温育60分钟，在PBS中洗涤，并且与微聚物标记的亲和小鼠IgG二抗温育。将载玻片在PBS中洗涤，然后用可产生深蓝色/灰色反应产物的Vector SG底物显色。将在PBS中冲洗过的载玻片使用DAPI(KPL(Gaithersburg，Maryland))进行复染。阳性和阴性对照包括在每个染色方案中。
平行地，将福尔马林固定的切片与抗心脏肌球蛋白的抗体在室温下温育45分钟，在PBS中洗涤，并且与生物素化小鼠IgG二抗温育。在二次温育完成后，施用VectastainABC-AP试剂(Vectastain Universal ABC-AP Kit，Vector Laboratories，Inc.(Burlingame，CA))30分钟。将载玻片在PBS中洗涤，然后使用可产生暗粉色至红色反应产物的液体永固红色原(Liquid Permanent Red Chromogen)(Dako(Carpinteria，CA))显色。将在PB S中冲洗过的载玻片使用DAPI(KPL(Gaithersburg，Maryland))进行复染。阳性和阴性对照包括在每个染色方案中。
增殖的肌细胞通过Ki-67和肌球蛋白重链(MHC)双染色测量。对MHC染色所识别的总肌细胞计数。在一个高倍视野中的总肌细胞数量在所有剂量的溶媒和细胞处理组之间是类似的。与溶媒处理的(2.3±0.01％)动物或接受1×106(1.2±0.01％)个细胞的动物相比，在接受1×104(3.8±0.02％)或1×105(3.7±0.02％)个hCTC(A3)细胞的动物中，总肌细胞中的增殖肌细胞的比率更高。参见表25和图34。
在接受1×106个细胞的动物中，总肌细胞中增殖肌细胞低比率的一种可能解释是由于肌细胞响应hCTC(A3)处理而进入G0。Ki-67是细胞增殖标记物，存在于细胞周期的所有阶段。然而，当周期中的细胞退出进入G0期时，Ki-67不再存在。参见(例如)(ThomasScholzen 2000；Journal of Cellular Physiology；182(3)，311-322)。
H&E染色：将载玻片用2次更换二甲苯来脱蜡，每张载玻片10分钟，然后用2次更换无水乙醇来重新水合，5分钟每次，然后用95％乙醇处理2分钟，并且用70％乙醇处理2分钟。将载玻片在蒸馏水中短暂洗涤，然后在苏木精溶液中染色8分钟，在流动自来水中洗涤5分钟，在1％酸性乙醇中分色30秒，用流动自来水洗涤1分钟，在0.2％氨水中染色30秒至1分钟。然后将载玻片在流动自来水中洗涤5分钟，在95％乙醇(浸渍10次)中冲洗，然后在伊红-焰红B溶液中复染30秒至1分钟，用95％乙醇脱水，2次更换无水乙醇，5分钟每次，在2次更换二甲苯中洗涤，5分钟每次，并且用二甲苯类封固剂封固。
对于H&E染色载玻片，一个层面取样自每个动物。在每个层面中，选择五个400×视野(67,500μm2/视野)，所述视野包含横切肌原纤维，并且左心室壁中大多数剖面毛细血管远离梗死区。每个层面的肌细胞密度报告为五个视野的平均值，并且以mm2表示。计算每个处理组的平均值、平均值的标准偏差和标准误差。
在400×放大下，苏木精和伊红(H&E)染色组织中通常可见单个肌细胞。图35示出了从接受1×105个hCTC(A3)细胞的心脏样品以及从取自溶媒处理动物的样品获得的代表性图像。在表26中，溶媒组的平均值(1813±84/mm2)低于任何处理组的平均值(1×104个hCTC(A3)细胞：2210±227，1×105个hCTC(A3)细胞：2220±186，1×106个hCTC(A3)细胞：2113±186)。肌细胞密度增加的原因可能是增殖肌细胞(肌细胞生成)的增加和/或肌细胞肥大的减少，例如实例13中所描述。
实例16
人心脏组织来源细胞处理诱导大鼠心肌中差异的基因表达
为了理解人心脏组织来源细胞施用诱导的分子变化，进行基因谱研究以比较溶媒组和人心脏组织来源细胞处理组中的基因表达水平。细胞施用后四周，从接受1×104、1×105、1×106个hCTC(A3)细胞或溶媒的动物，从用于实例11中所描述研究的动物收集大鼠心脏。从样品收集总RNA。
将得自Affymetrix的HG-U133_Plus_2基因芯片用于进行样品中的基因表达分析。微阵列数据集使用Spotfire DecisionSite和“通过平均值归一化”功能在整个微阵列芯片进行归一化。单个芯片组织成用于比较的组(目标剂量为1×104、1×105和1×106hCTC(A3)和溶媒)。使用Spotfire DecisionSite建立p值和组之间的倍数变化。将至少3列数据的Present Call列中不存在P，至少2列中不存在组比较p值小于或等于0.05的基因过滤出来，以及至少2列中不存在倍数变化大于或等于2.0或小于或等于0.5的任何基因过滤出来。过滤集包括45个所关注的基因。然后将45个基因输入得自Spotfire DecisionSite的Principle Component Analysis(PCA)程序，以便使用该基因子集直观地示出组分离。参见表27，其中已鉴定和列出差异表达的基因。
在鉴定的基因中，转化生长因子β受体(TGFβR)在以任何剂量接受hCTC(A3)细胞的动物中下调。参见图35。TGFβR通路在先前的研究中已表明了心肌梗塞后可促进肥大(参见(例如)Watkins，Jonker等人，Cardiovasc Res.2006 Feb 1；69(2)：432-9)和重塑(Ellmers，Scott等人，Endocrinology.2008 Nov；149(11)：5828-34)。据报道，TGFβ和TGFβR的阻断可减少肥大后的重塑和纤维化(参见例如Ellmers，Scott等人，Endocrinology.2008年11月；149(11)：5828-34)。此外，据报道，梗塞后TGFβ和TGFβR通路的激活可增加肌细胞及心室的肥大和重塑(参见(例如)Matsumoto-Ida，Takimoto等人，Am J Physiol Heart CircPhysiol.2006 Feb；290(2)：H709-15)。
通过差异基因表达分析鉴定的另一个基因是神经元型一氧化氮合酶(NOS1)。梗塞后，NOS1在心脏中的表达增加。据报道，NOS1的过量表达可减少心肌的收缩性(参见例如Burkard，Rokita等人，Circ Res.2007年2月16日；100(3)：e32-44)。据报道，在人衰竭心脏中，NOS1在mRNA和蛋白质水平的表达显著增加，表明了NOS1在心脏功能不全发病中起到作用(参见例如Damy，Ratajczak等人，Lancet.2004年4月24日；363(9418)：1365-7)。与溶媒处理的心肌相比，在所有剂量的hCTC(A3)细胞处理的心肌中，NOS1表达减少了10倍多。
实例17
在大鼠急性心肌梗塞模型中人心脏组织来源细胞处理减少了梗死面积并阻止肥
大
在啮齿动物急性心肌梗塞模型中，将人心脏组织来源细胞治疗受损心肌的效力与骨髓来源间充质干细胞相比较。将96只8-10周龄的雌性裸大鼠(Charles RiverLaboratories)用于本研究。按实例11中所述方法进行外科手术。施用悬浮于100μl体积CryoStor D-lite中的1×105个hCTC(A3)细胞(第1批)。施用悬浮于100μl体积Cryostor D-lite中的1×106个人间充质干细胞(产品目录号：PT-2501，Lonza)，作为平行实验。使用与实例11中的描述类似的过程，其中基于外科医生的偏好作出以下修改：当梗死区域的变色可清晰观察到时，在大约LAD绑扎后10分钟，使用配有29号注射针的0.3ml胰岛素注射器，将细胞注射至梗死边界区域的两个部位，每个部位注射50μl。在细胞施用后28天处死动物，并摘除心脏用于随后的分析。
剪去心房，并用盐水冲洗心室。在切成四块2mm切片前，将心脏浸入10％中性缓冲福尔马林(NBF)中24h，对每块切片进行处理用于显微镜检查，包埋于石蜡中，切成5μm切片，并且用苏木精和伊红(H&E)和/或Masson三色染料染色。将来自每个动物的两块切片并列示出：一块取自乳头肌和基部层之间的中线，一块取自乳头肌。
所有组和时间点的组织切片均经盲控制，并且根据疾病的严重性(代偿失调/扩张和肥大)分成从最严重到最不严重的级别次序。给每个序数分配数字，最高的数字对应于疾病严重性最大。然后撤销盲控制，并且收集每个组的所有级别数值。
在包括梗死区在内的整个左心室游离壁采集所有图像。从每个动物的用三色染料染色的2块组织切片采集低倍(2X)图像，并且分析梗死面积。在采集的图像上使用Image-Pro Plus v 5.1软件(Media Cybernetics，Inc.(Bethesda，MD))进行梗死面积的自动形态测量分析。描出左心室游离壁的周边，并且指定为所关注的区域(AOI)。代表梗死的蓝染区所占的百分比以及代表功能性心肌的红染区所占的百分比是从每张图像获取的两个测量值。
在梗塞后28天，对用H&E和/或Masson三色染料染色的心脏组织切片进行检查。与溶媒处理的动物相比，用1×105个hCTC(A3)细胞处理的动物以及用1×106个人间充质干细胞处理的动物显示出梗死区域减少。也可观察到左心室和右心室扩张的减少。参见图36的分图a和b。另外，在接受1×105个hCTC(A3)细胞的动物以及用1×106个人间充质干细胞处理的动物的左心室游离壁中保留有功能性心肌。参见图36的分图c。
有趣的是，hCTC(A3)细胞和人间充质干细胞显示出对室间隔(IVS)的差异作用，其中hMSC显示出IVS的肥大扩大，而在接受hCTC(A3)细胞的动物中则未观察到此类变化。参见图37。心肌细胞肥大变化的迹象存在于两个组的间隔中，但是更显著地存在于接受hMSC的动物中。肥大肌细胞和IVS导致心脏的最终重塑，这表明与人间充质干细胞相比，本发明的人心脏组织来源细胞可对心脏功能起到更大有益效果。
实例18
在急性心肌梗塞动物模型中本发明的人心脏组织来源细胞的多批次和长期效力
多批次人心脏组织来源细胞由三个供体制备。供体信息在表28中描述。简而言之，第1批得自移植级心脏器官；第2批得自健康心脏，但是供体未达到移植的年龄标准；第3批得自诊断为衰竭的心脏病症—扩张性心肌病的供体。
将雌性裸大鼠(体重250至300g)用氯胺酮和甲苯噻嗪(分别为60和10mg/kg IP)麻醉。在左四肋间隙打开胸部，把心脏从腹内取出，并切割心包膜。此后，用镊子夹住心脏，并且在冠状动脉左前降支下、距其原位大约2mm处用6-0 Proline缝合线打成环。通过拉动绑扎线封闭动脉来诱导心脏的AMI。可用肉眼观察到梗死心肌的变色。
MI诱导后二十分钟，使大鼠接受1×106个来自第1、2或3批hCTC(A3)的hCTC(A3)细胞的心肌内移植。使动物接受1×106个pCTC(A3)细胞或人新生儿真皮成纤维细胞(产品目录号CC-2509，Lonza)或溶媒，作为平行实验。在施用前所有细胞群均低温冷藏，并且将悬浮于CryoStor Dlite中的细胞群以120μl的最终体积注射至心脏中。细胞在2个部位施用，每个部位注射50μl细胞悬浮液或CryoStor Dlite。注射完成后，关闭胸部。每组中编入10只动物。研究中观察到的死亡率为32％。如表29中所示，组之间的死亡率无显著差异。心脏功能的绝对值在表30中示出。
在细胞施用后1、4和12周，用经胸超声心动描记术(SONOS 5500，Philips MedicalSystems)进行LV功能的评估。测量以下参数：左心室(LV)舒张末期内径(LVEDD)、LV收缩末期内径(LVESD)、缩短分数(FS)、局部室壁运动记分(RWMS)。
在所有测试的参数中，细胞施用后28天和84天，第1批hCTC(A3)细胞的施用改善了心脏功能。参见图38和39。如局部室壁运动记分RWMS和FS所测量，在梗塞后84天，第2批hCTC(A3)细胞的施用能够改善心脏收缩性和整体心脏功能。
在细胞施用后7天，溶媒和细胞处理组之间FS是类似的。然而，细胞施用后84天，在第2批hCTC(A3)细胞和第1批hCTC(A3)细胞的处理组中，通过FS测量的心脏功能分别提高了9.5±6.0％(n＝8，p＜0.01)、8.9±4.1％(n＝8，p＜0.001)。参见图39和表30。在溶媒处理组(-1.0±3.3％)、第3批hCTC(-0.4±3.0％)和人成纤维细胞(4.1±2.1％)组中，观察到FS几乎无变化。参见图39和表30。与溶媒处理的动物相比，在接受hCTC(A3)第1批或第2批细胞的动物中，RWMS也减少，其中对于第1批细胞，从第7天的24.83±1.64减少至22.13±1.5(N＝8，p小于0.05)，对于第2批细胞，从25.44±1.0减少至23.13±2.2(N＝8，p小于0.05)，这与整体功能是相符的。参见表30。
如LVESD所示，在当前研究中，第1批或第2批hCTC(A3)细胞在梗塞后28和84天可阻止重塑。细胞施用后28天，在接受第1批hCTC(A3)细胞的动物中，LVESD减少(-8.9±4.1％)。在接受第2批hCTC(A3)细胞的动物中，LVESD保持在基线(-0.5±4.3％)。相反地，在溶媒处理的动物中，细胞施用后28天，LVESD增加16.4±5.2％。在接受第3批hCTC(A3)细胞或人成纤维细胞的动物中，LVESD分别增加9.1±2.3％和5.4±3.6％。参见图38和表30。
细胞施用后84天，在溶媒组中，LVESD增加16.3±2.8％。相似地，接受第3批hCTC(A3)细胞的动物，或人成纤维细胞处理的动物，在84天也显示出左心室的扩大。LVESD分别增加12.5±3.7％和7.6±3.7％。相比之下，在接受第1批hCTC(A3)细胞的动物中(-3.9±5.2％)，或在接受第2批hCTC(A3)细胞的动物中(-1.8±4.2％)未发生心脏重塑。参见图39和表30。
如LVEDD所测量，在接受第1批hCTC(A3)细胞的动物中(7天：0.80±0.10cm；84天：0.84±0.07cm，5％增量)，以及接受第2批hCTC(A3)细胞的动物中(7天：0.74±0.07cm；84天：0.82±0.06cm；6.7％增量)，舒张末期左心室扩张的增加得以阻止。相反地，在溶媒处理的动物中(7天：0.75±0.03cm；84天：0.86±0.06cm；14.6％增量)，以及接受人成纤维细胞的动物中(7天：0.73±0.034cm；84天：0.83±0.06cm；13.7％增量)，LVEDD增加。接受第3批hCTC(A3)细胞的动物也显示出LVEDD的增加(7天：0.73±0.04cm；84天：0.82±0.06cm；12.3％增量)。参见图39和表30。
实例19
心脏组织来源细胞的大小
方法和材料：在细胞计数期间，根据本发明的方法分析从人、小鼠、猪和大鼠心脏获得的心脏组织来源细胞的细胞大小。在细胞群消化后和转接前的总活细胞计数使用Vi-CellTM XR(Beckman Coulter(Fullerton，CA))进行。Vi-CellTM细胞存活率分析仪使用视频捕获技术获得流动池中细胞的多达100张图像并进行图像分析，实现了用于细胞存活率评估的台盼蓝染色排除法自动化。
样品根据制造商说明书(Reference Manual PN 383674 Rev.A(《参考手册PN383674修订版A》))制备和分析。简而言之，将RBC裂解后所得的最终细胞悬浮液的500μL等分试样转移至Vi-CellTM 4ml样品瓶中，并且使用Vi-CellTM XR细胞存活率分析仪分析。细胞大小通过计数细胞的平均直径确定。
hCTC(A3)细胞直径的平均值为16.7±2.13μm。rCTC(A2)细胞的直径为18.4±1.02μm，并且pCTC(A3)细胞的直径为17.2±0.42μm。基于这些数据，尺寸大于或等于20μm的过滤器可允许本发明的心脏组织来源细胞通过过滤器收集，并排除其他细胞类型。
实例20
本发明的心脏组织来源细胞的低温冷藏
得到可直接施用、在临床时不需要进一步处理的产品是有利的。为了得到此类产品，使用临床批准的低温冷藏溶液测试人心脏组织来源细胞的低温冷藏。此外，还测试了低温冷藏溶液在心肌中的毒性。
为了进行低温冷藏，将hCTC(A3)细胞通过胰蛋白酶消化收集于培养瓶。将细胞库低温冷藏于包含2％v/v DMSO的CryoStor DliteTM(BioLife Solutions，Inc.(Bothell，WA))中。根据J.G.Baust和J.M.Baust编辑的Advances in Biopreservation中描述的原理，CryoStor Dlite是无动物源低温冷藏液，其设计用于在超低温环境(-80℃至-196℃)下制备和保藏细胞。也可使用提供(例如)低温储存必需的电解质、渗透和缓冲条件的其他溶液。
使用带有DeltaT软件的Integra 750 Plus程序冷冻仪(Planer(Middlesex，U.K.))将细胞悬浮液低温冷藏于Nalgene 2mL无菌内旋盖聚丙烯冻存管(Nalgne Nunc(Rochester，NY))中。在放入保持在15℃的程序冷冻仪之前细胞和溶液处于室温下。将样品温度探头置于盛有冻存缓冲液的瓶中。使用以下程序低温冷藏细胞：
当温度达到-140℃时，将样品转移至液氮罐储存。
将本文通篇中所引用的出版物的全文以引用的方式并入本文。尽管已通过参考实例和优选的实施例对本发明的多个方面进行了阐述，但应当理解，本发明的范围不由前面的描述限定，而是由根据专利法的原理正确解释的权利要求书所限定。
表1：hCTC与其他心脏来源细胞的比较。
表2：心脏组织消化后的收获量和细胞存活率
| 分离时间 | 收获量(百万) | 存活率 |
| 20061130 | 61.9 | 65％ |
| 20071116 | 49.2 | 78％ |
| 20071127 | 64 | 55％ |
| 20080116* | 34 | 81％ |
*：处理一半心脏
表3：低温冷藏和通过注射针后的存活率
| 时间(min) | 细胞/mL(×106) | 存活率 |
| 通过注射针前 | 0.54 | 93.9 |
| 0 | 0.44 | 93.2 |
| 10 | 0.46 | 92.4 |
| 20 | 0.43 | 93.5 |
| 30 | 0.46 | 93.3 |
| 30-不通过注射针 | 0.46 | 94.4 |
表4：hCTC(A3)的核型
| 细胞计数 | 20 |
| 细胞分析数 | 20 |
| 核型： | 5 |
| 正常核型 | 5 |
表5：低温冷藏和通过注射针后大鼠CTC回收率和存活率.
*n＝3，数据表示平均值。时间表示室温下的温育时间，其反映了在心肌梗塞模型中细胞注射过程的制备时间。
表6：用于96孔板流式细胞术测定的抗体
| MigG1 | BD Pharmingen | 550083 |
| MigG2a | BD Pharmingen | 349053 |
| MigG2b | R&D Systems | IC0041P |
| CD9 | BD Pharmingen | 555372 |
| CD11a | BD Pharmingen | 555380 |
| CD16 | Caltag Laboratories | MHCD1604 |
| CD29 | BD Pharmingen | 556049 |
| CD31 | BD Pharmingen | 555446 |
| CD34 | BD Pharmingen | 550761 |
| CD44 | BD Pharmingen | 550989 |
| CD45 | BD Pharmingen | 555483 |
| CD49b | BD Pharmingen | 555669 |
| CD49e | BD Pharmingen | 555617 |
| CD54 | BD Pharmingen | 347977 |
| CD59 | BD Pharmingen | 555764 |
| CD62E | BD Pharmingen | 551145 |
| CD62L | BD Pharmingen | 555544 |
| CD62P | BD Pharmingen | 555524 |
| CD63 | BD Pharmingen | 556020 |
| CD73 | BD Pharmingen | 550257 |
| CD81 | BD Pharmingen | 555676 |
| CD90 | BD Pharmingen | 555596 |
| CD104 | BD Pharmingen | 555720 |
| CD105 | Caltag Laboratories | MHCD10504 |
| CD106 | BD Pharmingen | 555647 |
| CD117 | BD Pharmingen | 340529 |
| CD140b | BD Pharmingen | 558821 |
| CD141 | BD Pharmingen | 559781 |
| CD142 | BD Pharmingen | 550312 |
| CD146 | BD Pharmingen | 550315 |
| CD147 | Serotec | MCA1876PE |
| CD184 | BD Pharmingen | 555974 |
| MDR | BD Pharmingen | 557003 |
表7：平均荧光强度(MFI)和ΔMFI
| 抗体 | 同型 | ΔMFI | 总群体的百分比 | |
| CD16 | 127.05 | 108.21 | 18.84 | 2.27％ |
| CD31 | 105.16 | 99.36 | 5.8 | 1.45％ |
| CD45 | 109.37 | 99.36 | 10.01 | 5.26％ |
| CD34 | 178.41 | 99.36 | 79.05 | 16.29％ |
| CD59 | 1039.5 | 166.59 | 872.91 | 95.55％ |
| CD105 | 394.58 | 99.36 | 295.22 | 94.61％ |
| c-Kit | 67.63 | 24.75 | 42.88 | 30.60％ |
表8：三个hCTC细胞群中的细胞表面标记物。
| 表面标记物 | A1 | A2 | A3 |
| 同型 | 1％ | 1％ | 1％ |
| CD16 | 2.5％ | 0.8％ | 2.27％ |
| CD31 | 2.49％ | 0.64％ | 1.45％ |
| CD45 | 7.5％ | 2.94％ | 5.26％ |
| CD34 | 42.8％ | 6.27％ | 16.29％ |
| CD49e | 97.7％ | 85.9％ | N/A |
| CD59 | 96.5％ | 93.3％ | 95.55％ |
| CD105 | 97.8％ | 95.6％ | 94.61％ |
| c-Kit | 22.1％ | 2.54％ | 30.6％ |
表9：用于qPCR的引物组
| 引物 | 目录号 |
| 心脏肌动蛋白 | Hs00606316_m1 |
| C-kit | Hs00174029_m1 |
| GAPDH | Hs99999905_m1 |
| GATA4 | Hs00171403_m1 |
| Isl-1 | Hs01099687_m1 |
| Myh7 | Hs00165276-m1 |
| 巢蛋白 | Hs00156568_m1 |
| Nkx2.5 | Hs00231763-m1 |
| 端粒酶 | Hs0162669_m1 |
表10：从所述过程获得的不同细胞的比较
表11：扩增的hCTC中的基因表达
成纤维细胞：NHDF
表12：rCTC基因表达
*：r心脏：大鼠心脏
表13：小鼠GFP-CTC基因表达
表14：pCTC中的基因表达
| pCTC | 猪心脏 | |
| GATA-4 | 28.54 | 23.86 |
| MyHC | 不可检测 | 22.21 |
| 端粒酶 | 不可检测 | 不可检测 |
| 内部对照 | 15.25 | 15.07 |
表15：局部室壁运动记分定义
| 得分 | 室壁运动 | 定义 |
| 1 | 正常 | 正常向内运动和增厚 |
| 2 | 运动功能减退 | 室壁运动和增厚减少 |
| 3 | 失运动能 | 不存在运动或增厚 |
| 4 | 运动障碍 | 向外运动“膨出” |
表16：观察到的死亡率的汇总
| 组别 | 死亡率 |
| 溶媒 | 6.7％(1/15) |
| rCPC 1e6 | 13.3％(2/15) |
| hCPC 1e4 | 13.3％(2/15) |
| hCPC 1e5 | 26.7％(4/15) |
| hCPC 1e6 | 20％(3/15) |
表17：心脏功能汇总
表18：缩短分数绝对变化的统计分析
表19：局部室壁运动记分绝对变化的统计分析
表20：LVEDD绝对变化的统计分析
表21：LVEDD相对变化的统计分析
表22：LVESD绝对变化的统计分析
表23：从心脏的不同部分分离大鼠CTC
表24：hCTC分泌的细胞因子
Rules-Based Medicine
| PAI-1 | ng/mL | 68 | <低> |
| TIMP-1 | ng/mL | 58 | <低> |
| IL-6 | pg/mL | 736 | <低> |
| VEGF | pg/mL | 346 | <低> |
| MCP-1 | pg/mL | 623 | <低> |
| IL-8 | pg/mL | 54 | 1.5 |
| MIP-1α | pg/mL | 8.1 | 0.73 |
| 癌抗原19-9 | U/mL | 0.35 | <低> |
| 碱性FGF | pg/mL | 107 | <低> |
| 内皮素-1 | pg/mL | 7.1 | <低> |
| 嗜酸细胞活化趋化因子 | pg/mL | 26 | <低> |
| ICAM-1 | ng/mL | 0.13 | 0.044 |
| α-胎蛋白 | ng/mL | 0.12 | 0.065 |
| IL-1β | pg/mL | 0.16 | 0.098 |
| IL-10 | pg/mL | 0.36 | 0.32 |
| IL-12p70 | pg/mL | 7.4 | 7.1 |
| 癌抗原125 | U/mL | 0.86 | <低> |
| IL-7 | pg/mL | 13 | 13 |
| 谷胱甘肽S-转移酶 | ng/mL | 0.14 | 0.14 |
| IL-13 | pg/mL | 7.0 | 7.6 |
| SGOT | ug/mL | 1.5 | 1.7 |
| MMP-2 | ng/mL | 20 | <低> |
| IFN-γ | pg/mL | 0.59 | <低> |
| EGF | pg/mL | 0.86 | <低> |
表25：在边界区域的总肌细胞中增殖肌细胞的比率
表26：肌细胞密度(mm2)
表27：处理组与溶媒组中差异表达的基因
表28：hCTC供体信息
表29：多批次和长期效力研究中的死亡率
| 组别 | 死亡率 |
| 溶媒 | 40％(4/10) |
| hCTC第1批 | 20％(2/10) |
| hCTC第2批 | 20％(2/10) |
| hCTC第3批 | 40％(4/10) |
| 人成纤维细胞 | 40％(4/10) |
| pCTC | 10％(1/10) |
表30：通过超声心动描记术测量的心脏功能(绝对值)
Claims (13)
1.一种产生不表达端粒酶的人心脏组织来源细胞的方法，所述方法包括以下步骤：
a.获得人心脏组织，
b.解离所述人心脏组织，
c.消化所述人心脏组织以释放细胞，
d.从所述释放的细胞除去人心肌细胞，以及
e.培养剩余的细胞以制备纯化的人心脏组织来源细胞群，所述细胞具有分化为心肌细胞的潜力，其中所述细胞表达CD105、CD117、GATA4和Nkx2.5，但是不表达CD16、CD31、CD45、Isl-1和端粒酶，且能表达CD59和CD90。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述心脏组织是手工解离的。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述心脏组织是机械解离的。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述心脏组织用至少一种选自胶原酶和分散酶的酶消化。
5.根据权利要求1所述的方法，其中整个心脏用作所述心脏组织的来源。
6.一种纯化的人心脏组织来源细胞群，所述细胞不表达CD16、CD31、CD45、端粒酶和Isl-1，但表达GATA4、Nkx2.5和CD117，且能表达CD90、CD105和CD59。
7.一种纯化的人心脏组织来源细胞群，所述细胞不表达端粒酶，所述细胞对CD117、GATA4和 Nkx2.5的基因表达呈阳性，其是CD59、CD105和CD90阳性的；并且其不表达CD16、CD31、CD45和Isl-1。
8.根据权利要求6或7的纯化的人心脏组织来源细胞群或通过权利要求1-5中任一项的方法制备的人心脏组织来源细胞在制备用于治疗患者受损心肌的方法的制剂中的用途。
9.根据权利要求8所述的用途，其中所述心脏组织来源细胞的施用通过直接注射进所述受损心肌。
10.根据权利要求8所述的用途，其中所述心脏组织来源细胞的施用通过直接注射进紧密围绕所述受损心肌的所述心脏区域。
11.根据权利要求6或7的纯化的人心脏组织来源细胞群或通过权利要求1-5中任一项的方法制备的人心脏组织来源细胞在制备用于修复患者受损心肌的方法的制剂中的用途。
12.根据权利要求11所述的用途，其中所述心脏组织来源细胞的施用通过直接注射进所述受损心肌。
13.根据权利要求11所述的用途，其中所述心脏组织来源细胞的施用通过直接注射进紧密围绕所述受损心肌的所述心脏区域。
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Legal Events
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| GR01 | Patent grant | ||
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Granted publication date: 20180710 Termination date: 20190708 |