JPH0372872A - 無血清培地及びそれを用いた哺乳類細胞の培養法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〈産業上の利用分野〉 本発明は無血清培地及び哺乳類細胞の培養法に関する。

さらに詳細には、本発明は、既知成分からなり、哺乳類
細胞、特に心筋細胞の培養に適した無血清培地及びそれ
を用いた哺乳類細胞の培養法に関する。

〈従来の技術及び発明が解決しようとする課題〉近年、
培養心筋細胞が、心筋細胞の増殖、分化、形態、生理学
、生化学、薬理学などの多方面の研究モデルに用いられ
ている。心筋細胞の培養に用いられる培地としては、通
常、基礎培地に１０乃至２０％程度の血清が添加された
培地が用いられる。

しかし、血清はロット間の変動が大きく、さらに血清中
には多くの未知物質や不純物などが含まれており、これ
らが細胞の増殖に影響を及ぼし、心筋細胞の解析的研究
の障害となっている。最近、種々の哺乳類細胞の培養に
おいて、血清添加培地の代わりに、細胞成長因子、ホル
モン、結合タンパク質、細胞接着因子、栄養素など既知
成分からなる無血清培地が開発されはじめている。こう
した既知成分からなる物質で、心筋細胞の培養が可能に
なれば、ホルモンや薬剤の心筋細胞の作用機序解明に大
きな手がかりとなり、ひいては、心筋梗塞、狭心症、心
筋症、心筋炎など心疾患の病因解析するうえですぐれた
モデル系を提供することになろう。このような観点から
、心筋細胞を無血清培地で培養する試みが行われており
、例えば下記の文献が知られている。

■ＭｏｈａＩＩｅｄ、　Ｓ、　Ｎ、　Ｗ、、　ｅｔ　ａ
ｔ、　　（Ｉｎ　Ｖｉｔｒｏ、　Ｖｏｌ。

１９、ｐ４７１−４７８．１９８３） この文献では、脈動するラット新生児心筋細胞を、下記
の培地を用い、フィブロネクチンで前処理された培養フ
ラスコ中で、９０日間以上培養できたことが報告されて
いる。

基礎培地：　　［Ｆ１２：Ｄｕｌｌｂｅｃｃｏ’ｓ−Ｍ
Ｅ　（１：１）］添加ホルモン、細胞成長因子等： インシュリン（５μｇ　／　１ｊ１　）　、）ランスフ
ェリン（５μｇ／嘗１）、セレン（５μｇ／猷）、フェ
トウィン（０，０２５％〉、牛血清アルブミン（１％）
　ハイドロコーチシン（５μｇ／ｉｆ）　　Ｔ４　　（
０，１μｇ／ｍｌ）　　ＥＧＦ（１０μｇ／ｙｆ） ■Ｉｃｅｋｓｏｎ、　Ｇ、に、　ｅｔ　ａｔ、　（Ｅｘ
ｐ、　Ｃｅ１ｌ　Ｒｅｓ、。

Ｖｏｌ、　１５５．　ｐＨ３−１２０，１９８４）この
文献では、新生児ラット心筋細胞を、下記培地を用い、
コラーゲン処理された培養フラスコ中で３週間培養でき
たことを報告している。

基礎培地：　　［Ｆ１２：Ｄｕｌｌｂｅｃｃｏ’ｓ−Ｍ
Ｅ　（１：１）］添加ホルモン、細胞成長因子等： インシュリン（２５μｍ；／ｙ１）、ノヘイドロコーチ
ゾン（０，１μＭ）、トランスフェリン（２５μｇ／ｘ
ｉ）、フェトウィン（１■／ｍｌ）■Ｎａｇ、　Ａ、　
Ｃ，ｅｔ　ａｌ、　（Ｉｎ　Ｖｌｔｒｏ　Ｃｅ１ｌ　＆
Ｄｅｖ。

Ｂｌｏｌ、、　Ｖｏｌ、２１．　ｐ５５３−５６２．１
９８５）この文献では、ニワトリ胎児心筋細胞を、下記
の培地を用いて培養できたことを報告している。

基礎培地：　　Ｐ１２ 添加ホルモン、細胞成長因子等： フェトウィン（０，０２５％）、アスコルビン酸（（１
，０２■／ｍｌ＞、牛血清アルブミン（１％）、ＥＣＧ
Ｓ（５０μｇ／’１１＞　、ＥＧＦ　（ｔｏμｇ／ＩＩ
）、ハイドロコーチシン（５μｇ　／　ｘｉ　）、Ｔ４
　　（１０μＭ）及びその他の成分（インシュリン、ト
ランスフェリン、セレン） しかしながら、上記文献に記載された培地は、無血清培
地といいながら大量の牛血清アルブミンやフェトウィン
（胎児及び新生児牛血清から得られたα−グロブリン）
が培地に添加されており、とても成分既知物質からなる
無血清培地という理念からはほど遠い。これら牛血清ア
ルブミン及びフェトウィンの添加は、牛血清アルブミン
にあっては主に脂質の結合タンパク質としての役割を果
たし、細胞に必要な脂質を供給するものと考えられ、一
方、フェトウィンは、その効果の一部として、この画分
に含まれているフィブロネクチンが心筋細胞の培養フラ
スコへの接着を促進するものと考えられている。このよ
うに、従来、無血清培地と称されている培地は血清成分
を含有し、特に牛血清アルブミンの１％添加は血清濃度
に換算すると２０％に相当し、とても無血清培地とはい
いがたいものである。

また、心臓組織（特に心室）には、心筋細胞の他、血管
内皮細胞、血管平滑筋細胞、線維芽細胞など、他の細胞
も共存している。血清はこれら細胞の増殖を促進する作
用を有するので、従来の血清添加培地では、線維芽細胞
や血管内皮、平滑筋細胞の増殖も促進され、心筋細胞と
の混合培養になってしまう。よって心筋細胞の選択的培
養には無血清培地が不可欠である。

さらに、本発明者らは、培地への血清の添加は、心筋収
縮を含む分化発現を促進し、さらに高濃度血清添加（５
％以上）は心筋細胞のＤＮＡ合成を阻害することを認め
た。すなわち、種々の濃度の血清を添加した血清添加培
地を用いて、ＤＮＡ合成、蛋白合成を調べると、５％以
上の血清濃度で、特にＤＮＡ合成の著しい阻害が認めら
れた。低濃度（２％）血清添加では、長期培養が可能で
あり、心筋細胞同志が集合し、筋原線繊状を形成し、光
学顕微鏡下でより強い心筋収縮が観察された。この結果
からも、血清中には、ＤＮＡ合成に関与する物質と共に
分化促進因子が混在しており、心筋細胞の解析的研究に
は、血清培地は適切でない。

本発明は上記従来技術の欠点を解消するために創案され
たもので、本発明者らが鋭意研究した結果、ＭＣＤＢ１
０７培地を基礎培地とし、これに特定の既知成分を添加
した培地を用いると、哺乳類細胞、特に心筋細胞を長時
間、安定的に培養できることを見出して完成した。すな
わち、本発明の目的は、既知成分からなる無血清培地及
びそれを用いた哺乳類細胞の培養法を提供することにあ
る。

く課題を解決するための手段〉 上記の課題を解決すべくなされた本発明の無血清培地は
、ＭＣＤＢ１０７培地とインシュリン及びトランスフェ
リンより選ばれた少なくとも一種の化合物とからなり、
更に必要に応じてデキサメサゾン及びノルエピネフリン
より選ばれた少なくとも一種の化合物が添加されている
ことを特徴とするものであり、また本発明の哺乳類細胞
の培養法は、哺乳類細胞を上記の無血清培地中で培養す
ることを特徴とするものである。

本発明において使用されるＭＣＤＢ１０７培地は公知の
培地であり、従来から基礎培地として使用されているＦ
１２培地を基にして、セレンを含む（０種類の微量金属
を添加し、へペス緩衝剤を用いてより安定な緩衝系培地
としたものである（例えば、Ｍｃｋｅｅｈａｎ　Ｗ、Ｌ
、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｉｎ　Ｖｉｔｒｏ、　Ｖｏｌ、Ｉ
Ｅｆ。

ｐ４７５−４８５．１９８０参照）。このＭＣＤＢ１０
７培地は、元来、ヒト線維芽細胞のコロニー様増殖の無
血清培養基礎培地として開発されたものであるが、その
後ヒト血管内皮細胞、平滑筋細胞の無血清基礎培地とし
ても適していることが判明し、哺乳類心筋細胞の基礎培
地としても利用できる。このＭＣＤＢ　１０７培地は、
例えば、極東製薬■から販売されている。

本発明の無血清培地は、上記のＭＣＤＢ１０７培地と、
インシュリン及びトランスフェリンより選ばれた少なく
とも一種の化合物とからなるもので、インシュリン及び
トランスフェリンは、細胞のＤＮＡ合成及び蛋白合成を
促進する作用を有する。本発明の無血清培地中における
インシュリン及びトランスフェリンの含量は特に限定さ
れないが、ＭＣＤＢ１０７培地１１１当り、インシュリ
ンで０．１〜５０μｇ１好ましくは１〜１５μｇであり
、トランスフェリンで０．１〜５０μｇ１好ましくは０
．３〜２０μｇ１さらに好ましくは１〜１５μｇである
。好ましい態様としては、インシュリンとトランスフェ
リンを併用した培地が挙げられ、両者を併用することに
より相乗的に効果が増加する。特にインシュリンとトラ
ンスフェリンをＭＣＤＢ１０７培地１　ｘｉ当り夫々約
１０μｇ添加した培地は細胞の長期培養に適しており好
ましい。

なお、本発明の無血清培地を、心筋細胞の脈動状態の試
験に使用する場合には、デキサメサゾン、ノルエピネフ
リン等の心筋細胞の脈動促進剤を添加するのが好ましい
。これら心筋細胞の脈動促進剤の添加量は、培地中の濃
度が、デキサメサゾン８−５ の場合は１０　−１ｏ　　Ｍ、好ましくは１０−６Ｍ程
度、ノルエピネフリンの場合は１Ｏ−７〜１０−’Ｍ、
好ましくは１０−５Ｍ程度となるように調製するのがよ
い。

好ましい態様としては、インシュリンとトランスフェリ
ンの存在下、デキサメサゾン及びノルエピネフリンの一
方又は両方を添加した培地で、この培地は血清添加培地
と同等又はより優れた効果をもたらす。

本発明の無血清培地は、ＭＣＤＢ１０７培地に、上記の
成分を所定量添加し、必要に応じて殺菌することにより
得られる。添加方法、殺菌方法等は特に限定されず、慣
用の方法を適宜用いることができる。また、成分既知の
物質であれば、その他の成分を培地に適宜添加してもよ
い。

本発明の無血清培地は、従来の培地と同様に使用するこ
とができるが、血清成分を含有しないので、培養器上へ
の細胞の接着を促進するため、フィブロネクチン、コラ
ーゲン等の細胞接着促進剤で処理された培養器を用いる
のが好ましい。

本発明の、無血清培地は哺乳類心筋細胞の培養に最適の
培地であるが、その他の哺乳類細胞の培養にも使用する
ことができる。

本発明の無血清培地を用いる哺乳類細胞の培養は、慣用
の方法に準じて行うことができ、培養法としては、例え
ば、静置培養法、攪拌培養法、タンク培養法、ホロファ
イバーを用いる方法等が挙げられる。

〈発明の作用・効果〉 本発明の無血清培地は、哺乳類細胞、特に心筋細胞の培
養の基礎培地として優れているＭＣＤＢ１０７培地と、
細胞のＤＮＡ合成及び蛋白合成を促進する作用を有する
インシュリン及び／又はトランスフェリンとからなるの
で、血清成分を含有しなくとも、哺乳類細胞を長期間安
定に培養することができる。さらに、デキサメサゾン及
びノルエピネフリンは、心筋細胞の脈動を促進する効果
があるので、これらを添加した系は心筋細胞の脈動状態
における試験の優れたモデルとなる。

従って、本発明の無血清培地及びそれを用いた哺乳類細
胞の培養法によれば、未知成分を含有する血清成分を全
く使用しておらず、成分既知物質からなる無血清培地の
ため、ＤＮＡ合成、増殖に関与する因子、また収縮など
分化に関与する因子の発見、固定が容易に試験できると
いう効果を奏する。

〈実施例〉 以下、本発明を参考例、試験例及び実施例に基づいて説
明するが、本発明はこれらの例に限定されるものではな
い。

参考例１ 以下の参考例及び試験例で用いるラット新生児心筋細胞
は、下記の方法で単離したものを使用した。

生後１〜５日の新生児ラット（ウィスター系）を用い、
屠殺後、５〜１０匹のラットの心臓から心室のみを摘出
し、ベトリ皿にとった。ハサミで組織を細かく切断し、
心室内に存在する血液細胞を除く目的で、ヘベス緩衝液
で２〜３回洗浄した。

この組織断片は、０．１％コラゲナーゼ／　０．０５％
トリプシン溶液で、３７℃、２０〜３０分間温浴中で振
盪しながらインキュベートした。酵素処理された組織は
、ｔｉｏｏワイヤースクリーンの上に乗せられ、５−Ｉ
Ｉプラスチック注射筒のピストンで細胞の塊を非常に弱
い力でスクリーンに押しつけた。分散された細胞塊にヘ
ベス緩衝液をフラッシュして、ビーカー中に細胞浮遊液
を集め、１２００ｒｐａ＋　５分間遠心した。細胞のベ
レットはＭＣＤ８１０７基礎培地で細胞浮遊液を作り、
２５ｃｄのカルチュアーフラスコにまかれた。心筋細胞
は他の混在する血管内皮細胞や線維芽細胞に比べて培養
器壁に接着しにくいことを利用して選択的に分離可能で
ある。約１時間、３７℃、９５％空気／　５％ＣＯ２の
インキュベーターで短時間培養後、培養フラスコを取り
出し、振盪して心筋細胞の浮遊液を集めた。浮部細胞液
は、１２００ｒｐｏ＋　、　５分間遠心して、細胞ベレ
ットを調製した。

斯くして得られたラット新生児心筋細胞を用いた。

参考例２ ラット新生児心筋細胞ベレットを、任意の培地中で細胞
浮遊液とし、血球計算盤で細胞数を計測後、種々の濃度
のフィブロネクチンで処理された２４−ウェルカルチュ
アープレートに心筋細胞を１０５個播種した。ＭＣＤＢ
１０７基礎培地を用い、２４時間インキュベーター中で
インキュベートした後、伸展の頻度を測定した。細胞伸
展の頻度は、１００倍に拡大された倒立顕微鏡を用いて
、それぞれのランダムエリアを写真撮影し、約５００個
の心筋細胞を数えた。伸展の有無の指標としては、細胞
の形が円形のものを非伸展細胞、紡錘形もしくは菱形に
変化して確実に培養器壁に付着しているものを伸展細胞
として計測した。

なお、フィブロネクチンで処理された培養器の調製は、
細胞培養１時間前に、種々の濃度のフィブロネクチンを
含有する溶液１１１を２４−ウエルカルチュアープレー
トに添加した後、室温で１時間インキュベートして調製
したものを使用した。

その結果、フィブロネクチンは濃度に依存してラット新
生児心筋細胞の細胞伸展を促進し、フィブロネクチン非
存在下では細胞の伸展は極めて少なかった。最大細胞伸
展活性は約１０μｇ／ｌ！のフィブロネクチン濃度で認
められ、その時の伸展の頻度は約５０％であった。

試験例１ 基礎培地で培養後、同じＭＣＤＢ１０７培地に培地交換
し、同時に３Ｈ−チミジン（０，５μＣＩ／ｉｆ）及び
１４ｃｍロイシン（０，０５μ０１／ｆｆＺ）並びに所
定量のインシュリン（Ｉｎｓ）又はトランスフェリン（
Ｔｆ）を加えて、さらに４８時間培養した。常法に準じ
て、細胞の酸不溶性画分を調製し、液体シンチレーショ
ンカウンターで細胞の酸不溶性画分のアイソトープ活性
を計測した。なお、Ｉｎｓ及びＴｆ’を添加しない系（
すなわち、ＭＣＤＢ１０７培地単独）を比較例とした。

その結果を下記第１表及び第２表に示す。

第１表及び第２表に示されるように、インシュリン及び
トランスフェリンを培地に添加することにより、ＤＮＡ
への３Ｈ−チミジン取り込み量及び蛋白質への１４ｃｍ
ロイシンの取込み量が増加し、ＤＮＡ合或合成蛋白質合
成が促進された。

（以下余白） ぼす効果 新生児ラット心筋細胞を２４時間ＭＣＤＢ１０７第１表 第２表 心筋細胞細胞を播種した。この際、ＭＣＤＢ　１０７培
地にインシュリン（１０μｇｅｌ＞とトランスフェリン
（１０μｇ＃Ｕを添加した培地を用いた。細胞はそれぞ
れ所定日数培養した後、トリプシン溶液（２００μｇ１
１！ＥＤＴＡを含有する２５０μｇ／ｌ！トリプシン溶
液）で細胞分散を行い、マイクロセルカウンター（東亜
医用電子製）で細胞数を計測した。その結果を第１図に
示す。

第１図から明らかなように、２４時間後の付着細胞率は
７Ｈ％であった。４〜５日目にかけて約２４％の細胞数
の増加がみられた。この培地で最大１８日間細胞数の減
少もなく長期間培養できた。細胞の生存率は１８日間、
常に９０％以上の高い値を示した。

試験例３ 試験例２ ラット新生児心筋細胞の無血清培地による培養フィブロ
ネクチンで処理された２４−ウェルヵルチュアープレー
トに８　Ｘ　１０４個のラット新生児カルチュアープレ
ートを用い、新生児ラット心筋細胞１０５個を２４時間
ＭＣＤＢ１０７培地で培養した。同じ培地で培地交換し
た後、インシュリン（Ｉｎｓ、　ＬＯｕｇｌｘｌ’）　
、　）ランスフェリン（Ｔｆ、　　１μｇ／ｌオ）、デ
キサメサゾン（０８Ｘ、　１μＭ）及びノルエピネフリ
ン（ＮＥ、　１０μＭ）を単独又は適宜組合わせて添加
して、４８時間培養後にカルチュアープレートをホット
プレートで３７℃に設定した倒立顕微鏡におき、脈動細
胞の割合と１分間当りの脈動頻度を測定した。なお、比
較例として、ＭＣＤＢ１０７培地に、牛胎児血清（ＰＯ
２）を２％添加した培地を用いて同様な実験を行った。

その結果を第３表に示す。

第３表に示されるように、デキサメサゾンは単独添加で
脈動細胞の割合及び脈動頻度を増加させた。この効果は
、インシュリン、トランスフェリン存在下で増強され、
インシュリン、トランスフェリン及びデキサメサゾンの
存在下では脈動細胞の割合、脈動頻度とも増加し、さら
にノルエピネフリンを添加すると脈動頻度が著しく増加
し、これらは血清を添加した培地と同等以上の効果を有
することが示された。

（以下余白） 第　　３ 表 実施例Ｉ ＭＣＤＢ１０７培地１ｇに、インシュリン及びトランス
フェリンをそれぞれ１０μｇ／ｌ！となるように溶解し
た。得られた溶液をメンブランフィルタ−（ポアサイズ
：０．２〜０．２２μ）で滅菌濾過して無血清培地を得
た。

実施例２ ＭＣＤＢ１０７培地１ｐに、インシュリン及びトランス
フェリンをそれぞれ１０μｇ　／　ｘｉとなるように溶
解し、更にデキサメサゾンを１μＭとなるように溶解し
た。得られた溶液をメンブランフィルタ−（ポアサイズ
：０．２〜０．２２μ）で滅菌濾過して無血清培地を得
た。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明の無血清培地を用いたラット新生児心
筋細胞の培養における培養日数と細胞数の関係を示す図
である。 第 図

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ＭＣＤＢ１０７培地と、インシュリン及びトランス
   フェリンより選ばれた少なくとも一種の化合物とからな
   る無血清培地。 ２、インシュリン及びトランスフェリンを含有する請求
   項１記載の無血清培地。 ３、培地中のインシュリン及びトランスフェリン含量が
   夫々１０μｇ／ｍｌである請求項２記載の無血清培地。 ４、デキサメサゾン及びノルエピネフリンより選ばれた
   少なくとも一種の化合物を含有する請求項１から３のい
   ずれかに記載の無血清培地。 ５、ＭＣＤＢ１０７培地とインシュリン及びトランスフ
   ェリンより選ばれた少なくとも一種の化合物とからなる
   無血清培地中で哺乳類細胞を培養する哺乳類細胞の培養
   法。 ６、無血清培地が、インシュリン及びトランスフェリン
   を含有する請求項５記載の哺乳類細胞の培養法。 ７、哺乳類細胞が心筋細胞である請求項５又は６に記載
   の哺乳類細胞の培養法。 ８、無血清培地が、デキサメサゾン及びノルエピネフリ
   ンより選ばれた少なくとも一種の化合物を含有する請求
   項５から７のいずれかに記載の哺乳類細胞の培養法。