ES2679271T3 - Células derivadas del tejido cardiaco - Google Patents

Abstract

Una población purificada de células derivadas de tejido cardíaco humano que no expresan telomerasa, y: a. expresan CD90, CD105, CD117, GATA4 y Nkx2.5; y b. no expresan CD16, CD31, CD45 y cadena pesada de miosina; y preferiblemente c. se pueden obtener mediante los pasos de: i. disociar tejido disociador cardiaco obtenido del corazón, ii. digerir el tejido cardíaco para liberar células tratando el tejido cardíaco con por lo menos una enzima, en donde la por lo menos una enzima comprende dispasa, iii. eliminar cardiomiocitos de las células liberadas, y iv. cultivar las células restantes.

Description

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DESCRIPCION

Células derivadas del tejido cardiaco

CAMPO DE LA INVENCION

La presente invención está dirigida a métodos y composiciones para reparar miocardio dañado usando células derivadas de tejido cardíaco humano. En particular, la presente invención proporciona métodos y composiciones para reparar miocardio dañado usando células derivadas de tejido cardíaco humano expandido que no expresan telomerasa.

ANTECEDENTES

El infarto agudo de miocardio (IAM) es la principal causa de muerte en los Estados Unidos. El IAM está provocado por una falta repentina y sostenida de flujo sanguíneo a un área del corazón, comúnmente provocada por el estrechamiento de una arteria coronaria. Sin suministro adecuado de sangre, el tejido se vuelve isquémico, lo que lleva a la muerte de los miocitos y las estructuras vasculares. Este área de tejido necrótico es referida como sitio de infarto, y eventualmente se convertirá en tejido cicatricial. Los cardiomiocitos restantes son incapaces de reconstituir el tejido necrótico y el corazón se deteriora con el tiempo. El deterioro puede ser en la forma de una pérdida de la función del músculo cardíaco asociada con la remodelación del miocardio dañado.

Algunas terapias actuales para el infarto agudo de miocardio se centran en la trombólisis o, alternativamente, angioplastia, para abrir el vaso coagulado y restaurar el suministro de sangre al sitio del infarto. Estos tratamientos pueden reducir eficazmente el tamaño del sitio del infarto y mejorar la función sistólica cardíaca, pero no revierten la pérdida de la función del músculo cardíaco asociada con la remodelación del miocardio dañado. Otras terapias como, por ejemplo, los inhibidores de la enzima conversora de angiotensina (IECA) y los betabloqueantes también mejoran la función y la supervivencia global. Sin embargo, los efectos terapéuticos de estos medicamentos solo pueden mejorar la supervivencia en menos de un 5% en pacientes post- IAM.

El trasplante de células puede ser otra terapia potencial para el infarto agudo de miocardio. Por ejemplo, Orlic et al. (Nature 410: 701 - 705 (2001)) informan de la inyección de células de médula ósea de Lin- c-kit+ en el miocardio dañado. Orlic et al afirman: "Nuestros estudios indican que las células de médula ósea administradas localmente pueden generar miocardio de nueva aparición, mejorando el resultado de la enfermedad arterial coronaria".

En otro ejemplo, Nygren et al. ((Nature Medicine 10: 494 - 501 (2004)) afirman: "Mostramos que las células de médula ósea no fraccionadas y una población purificada de células madre y progenitoras hematopoyéticas se injertan de manera eficiente dentro del miocardio infartado. El injerto fue transitorio, sin embargo, y de naturaleza hematopoyética. Por el contrario, se observaron cardiomiocitos derivados de médula ósea fuera del miocardio infartado a baja frecuencia y se derivaron exclusivamente a través de la fusión celular".

Sin embargo, el mecanismo mediante el cual las células derivadas de médula ósea tratan el IAM no está claro. Por ejemplo, Murry et al. (Nature 428: 664 - 668 (2004)) afirman: "Usamos transgenes informadores tanto expresados ubicuamente como restringidos a cardiomiocitos para rastrear el destino de las células madre hematopoyéticas después de 145 trasplantes en corazones de ratón adultos normales y lesionados No se detectó transdiferenciación en cardiomiocitos cuando se usaron estas técnicas genéticas para seguir el destino celular, y los corazones injertados con células madre no mostraron un aumento manifiesto en los cardiomiocitos en comparación con los corazones injertados con simulación. Estos resultados indican que las células madre hematopoyéticas no adquieren fácilmente un fenotipo cardíaco, y elevamos una nota de advertencia para los estudios clínicos de la reparación del infarto".

En otro ejemplo, Werner et al (Nature Clinical Practice Cardiovascular Medicine 5: 78-79 (2008)) afirman: "Sin embargo, aún quedan muchas preguntas por responder con respecto a la subpoblación de células progenitoras más efectiva, la mejor técnica para el aumento de células progenitoras, los mecanismos subyacentes de acción y la seguridad y eficiencia a largo plazo del método.

Además, varios ensayos de terapia de [células de médula ósea] en pacientes con IAM han producido resultados negativos, posiblemente debido a la variación en el momento de la administración de las [células de médula ósea] después del IAM, diferencias en los métodos de preparación de células progenitoras usados, o ambos".

En otro ejemplo, Balsam et al (Nature 428: 668 - 673 (2004)) afirman: "Nuestros datos sugieren que incluso

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en el microambiente del corazón lesionado, las células BM enriquecidas con c-kit, las células Lin-c-kit+ BM y las células madre hematopoyéticas reconstituyentes a largo plazo c-kit+ Thyl.1l0 Lin-Sca-1+ adoptan solo destinos hematopoyéticos tradicionales".

Otra posible fuente de células son las células madre embrionarias. Por ejemplo, Gold et al. (WO2005090558) divulga métodos para generar células del linaje de cardiomiocitos a partir de células madre embrionarias para su uso en medicina regenerativa.

En otro ejemplo, Gold y Hassanipour (WO2007002136) divulgan métodos para la diferenciación de células madre pluripotentes de primates en células del linaje de cardiomiocitos.

Otra posible fuente de células son las células progenitoras cardíacas. Se han identificado células progenitoras cardiacas en el corazón humano y de rata. Las células progenitoras cardiacas son autorenovables y multipotentes dando lugar a todos los linajes cardíacos.

Por ejemplo, la Solicitud de Patente de Estados Unidos US20040126879A1 divulga el uso de células madre cardiacas que son CD31+, CD38+ y c-kit' para tratar el miocardio dañado.

En otro ejemplo, Oh et al. (PNAS 100: 12313 - 12318 (2003)) divulgan la existencia de células progenitoras cardiacas derivadas de corazones adultos, que expresan Sca-1, CD31 y CD38, y que carecen de la expresión de CD4, CD8, B220, Gr-1, Mac-1, TER119, c-kit, FIk-1, e-Cadherina, factor de von Willebrand, CD45 y CD34.

En otro ejemplo, la Solicitud de Patente de Estados Unidos US 20080241111A1 divulga un método para preparar células derivadas de tejido cardíaco de mamífero preparadas a través de los pasos de: (i) tratar enzimáticamente un fragmento de tejido cardíaco de un mamífero para preparar una suspensión celular; (ii) separar un grupo de células derivadas de tejido cardíaco a partir de dicha suspensión celular mediante un método de gradiente de densidad; y (iii) cultivar en suspensión el grupo obtenido de células derivadas de tejido cardíaco en un medio de cultivo que contiene factor de crecimiento de fibroblastos y factor de crecimiento epidérmico, y luego seleccionar y separar las células que forman una esfera flotante.

En otro ejemplo, la Solicitud de Patente de Estados Unidos US 20080213231A1 divulga un grupo de células madre pluripotentes compuesto de células madre pluripotentes derivadas de un tejido de músculo esquelético humano o de ratón, las células madre pluripotentes siendo c-met-negativas, Pax-7-negativas, Myf-5-negativas, MyoD-negativas, Miogenina-negativas, M-cadherina-negativas, CD105-positivas, CD90-positivas, c-kit-negativas y cD45-negativas, las células madre siendo CD34-negativas en el caso de las células madre derivadas de humano y siendo CD-34-positivas en el caso de células madre derivadas de ratón, y el grupo de células madre pluripotentes siendo obtenido por proliferación de una única célula.

En otro ejemplo, Laugwitz et al. (Nature 433: 647 - 653 (2005) divulgan células progenitoras cardiacas isll- 1+ en miocardio posnatal de rata, ratón y humano.

En otro ejemplo, Messina at al (Circulation Research 95: 911 - 921, (2004)) divulgan el "aislamiento de células indiferenciadas que crecen como agrupaciones autoadherentes (que hemos denominado "cardiosferas") de subcultivos de especímenes de biopsias humanas auriculares o ventriculares postnatales y de corazones murinos. Estas células son clonogénicas, expresan antígenos/marcadores de células progenitoras madre y endoteliales, y parecen tener las propiedades de células madre cardiacas adultas". Messina et al afirman: "Las cardiosferas humanas y de ratón recién desarrolladas revelaron expresión de marcadores de endotelio (KDR (humano)/flk-1 [ratón], CD-31) y células madre (CD-34, c-kit, sca-1)".

En otro ejemplo, Smith et al (Circulation 115 (7): 896 - 908 (2007) afirman: "Las muestras de especímenes de biopsia endomiocárdica percutánea cultivadas en cultivo primario desarrollaron agrupaciones multicelulares conocidos como cardiosferas, que se distribuyeron en placas para producir células derivadas de de cardiosferas (CDC)".

En otro ejemplo, la Solicitud de Patente de Estados Unidos US20070020758 divulga un método para el aislamiento, expansión y preservación de células madre cardíacas de muestras de biopsias de tejidos humanos o animales para emplearlas en el trasplante celular y la reparación funcional del miocardio u otros órganos.

En otro ejemplo, Beltrami et al (Cell 114(6): 763 - 776 (2003)) divulgan "la existencia de células Lin-c- kitPOS con las propiedades de las células madre cardíacas. Son autorenovables, clonogénicas y multipotentes, dando lugar a miocitos, músculo liso y células endoteliales".

En otro ejemplo, la WO 2008054819 divulga células madre cardiovasculares positivas para marcadores isll+/Nkx 2.5+/flkl+ y células madre cardiovasculares que pueden diferenciarse a lo largo de líneas celulares del endotelio, músculo cardíaco y liso.

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En otro ejemplo, la WO 2008109839A1 divulga una población enriquecida de células madre que comprende un polipéptido CXCR4 y un polipéptido FIk-I, en donde dichas células madre son capaces de diferenciarse en células que expresan Mef2C, GAT A-4, Miocardina y polipéptidos Nkx2.5.

En otro ejemplo, la WO 2008081457A2 divulga un método para aislar células madre cardíacas, el método comprendiendo poner en contacto un tejido que comprende las células madre cardíacas con una composición que comprende dispasa Il bajo condiciones suficientes para inducir la disociación celular, aislando de este modo las células madre cardíacas.

En otro ejemplo, la WO 2008058273 A2 divulga un método para obtener células derivadas de miocitos (MDCs) similares a células madre de mamíferos a partir de tejido cardíaco auricular o ventricular, que comprende los pasos de: aislar células del tejido cardíaco auricular o ventricular para formar una suspensión celular; y cultivar las células en un medio que comprende un mitógeno formando de este modo una composición que comprende MDCs.

En otro ejemplo, la WO 2008054819A2 divulga un método para aislar células madre cardiovasculares, el método comprendiendo poner en contacto una población de células con agentes reactivos a Isletl, Nkx2.5 y flkl, y separar las células positivas reactivas de las células no reactivas.

En otro ejemplo, la Solicitud de Patente de Estados Unidos US 20070212423 A1 divulga un método para aislar una célula precursora de cardiomiocitos c-kit/c-met de origen muscular, que comprende separar células de menos de 40 pm de diámetro de una suspensión de células musculares; cultivar las células en un medio de cultivo de tejidos sobre un sustrato sólido; y aislar las células en suspensión en el medio; aislando de este modo la célula precursora de cardiomiocitos c-kit'c-met de origen muscular.

En otro ejemplo, la Solicitud de Patente de Estados Unidos US 20050058633 es una célula precursora de cardiomiocitos c-kit-c-met de mamífero aislada de origen muscular.

En otro ejemplo, la WO 2004019767 divulga una célula madre de cardiomiocitos de mamífero aislada que tiene c-kitneg/CD31+/CD38+ y que expresa transcriptasa inversa de telomerasa.

En otro ejemplo, la WO 2008083962A1 divulga células progenitoras de cardiomiocitos (CMPCs) que se caracterizan por Sca-1 o un epítopo similar a Sca-1 y CD31 en su superficie celular.

En otro ejemplo, la Solicitud de Patente de los Estados Unidos 20080213230A1 divulga un método de preparar una población celular aislada enriquecida en células madre o células progenitoras, que comprende: (a) cultivar una muestra de tejido, (b) obtener células que migran por encima de fibroblastos adherentes durante dicho cultivo, (c) clonar una o más células obtenidas en (b) para producir una o más poblaciones clonogénicas; (d) identificar una o más poblaciones clonogénicas que tienen un fenotipo deseado; (e) aislar células madre o células progenitoras de la una o más poblaciones clonogénicas identificadas en el paso (d) mediante clasificación celular usando uno o más marcadores de superficie celular o internos de células madre o células progenitoras; y (f) cultivar las células madre o células progenitoras aisladas en medios acondicionados en ausencia de células alimentadoras; obteniendo de este modo una población celular aislada enriquecida en células madre o células progenitoras.

Sin embargo, un obstáculo para el uso de células progenitoras cardíacas es la falta de un método eficiente para aislar o expandir las células. Por lo tanto, sigue existiendo la necesidad de un aislamiento y una expansión eficaces de las células progenitoras cardíacas para evaluar su eficacia como terapia de daños en el miocardio.

SUMARIO

La presente invención proporciona métodos para aislar y expandir células derivadas de tejido cardíaco humano. Las células aisladas y expandidas de acuerdo con los métodos de la presente invención no expresan telomerasa, y son útiles para tratar o reparar el miocardio dañado.

La presente invención proporciona una población purificada de células derivadas de tejido cardíaco humano que no expresan telomerasa de acuerdo con las reivindicaciones.

La presente invención proporciona un método para producir células derivadas de tejido cardíaco humano que no expresan telomerasa, que comprende los pasos de:

a. Obtener tejido cardíaco,

b. Disociar el tejido cardíaco,

c. Digerir el tejido cardíaco para liberar células,

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d. Eliminar los cardiomiocitos de las células liberadas, y

e. Cultivar las células restantes.

En una realización, la presente invención proporciona una población de células derivadas del tejido cardíaco de acuerdo con las reivindicaciones para su uso en un método para tratar o reparar un miocardio dañado en un paciente que comprende los pasos de:

a. Obtener una población de células derivadas de tejido cardíaco humano que no expresan telomerasa, y

b. Administrar la población de células derivadas de tejido cardíaco humano al paciente en una cantidad suficiente para tratar o reparar el miocardio dañado.

En una divulgación, las células derivadas de tejido cardíaco humano usadas para tratar al paciente han sido crioconservadas.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

La Figura 1 describe el procedimiento mediante el cual se aíslan las células de la presente invención. Los detalles del proceso para obtener las poblaciones celulares se describen en el Ejemplo 1.

La Figura 2 describe el aislamiento de las células derivadas de tejido cardíaco humano de la presente invención. Los detalles del proceso para obtener las poblaciones iniciales de células se describen en el Ejemplo 1.

La Figura 3 describe un método alternativo para aislar las células humanas derivadas de tejido cardiaco humano de la presente invención.

La Figura 4 muestra la morfología de las células derivadas de tejido cardíaco humano (hCTC) de la presente invención. Todas las imágenes que se muestran son una ampliación 1OOX, a menos que se indique lo contrario. El panel a: es una imagen que muestra una suspensión celular obtenida antes de la distribución en placas de las células obtenidas de la digestión inicial. La flecha negra muestra las células S no adherentes en fase brillante; Panel b: la flecha negra muestra un agrupamiento de células S en fase brillante. La flecha blanca muestra las células adherentes obtenidas de la distribución en placas inicial (la imagen mostrada muestra es una ampliación 200X); El panel c muestra células A2, derivadas de la redistribución en placas de cultivos de células S; El panel d muestra células S en fase brillantes redistribuidas en placas en un cultivo de células A2.

La Figura 5 muestra el efecto de la densidad de siembra sobre el potencial de crecimiento de hCTC. El eje x muestra los días en cultivo después de distribuir en placas una mezcla de células hCTC (A1) y hCTC (S) de viales congelados. El eje y muestra las duplicaciones de población totales acumulativas de las células hCTC (A3).

La Figura 6 muestra el efecto de niveles de oxígeno reducidos sobre el potencial de crecimiento de células hCTC (A3).

La Figura 7 muestra el potencial de crecimiento de células rCTCA2 derivadas de tejido cardíaco de rata (rCTC) (A2)). El eje x muestra los días en cultivo después de la redistribución en placas de las células rCTC (S) de viales congelados. El eje y muestra las duplicaciones acumulativa de población totales acumulativas de células rCTC (A2).

La Figura 8 muestra la recuperación y viabilidad de células hCTC (A3), después de la crioconservación y administración simulada con un dispositivo de administración potencial (que consiste en una aguja de calibre 30). El número de células viables recuperado se indica en el eje y izquierdo. La viabilidad celular se indica en el eje y derecho. Los diamantes rellenos representan la viabilidad celular; los cuadrados abiertos representan la recuperación celular. Los detalles se describen en el Ejemplo 6.

La Figura 9 muestra la recuperación y viabilidad de células rCTC (A2) después de la crioconservación y la administración simulada con un dispositivo de administración potencial (que consiste en una aguja de calibre 30). El número de células viables recuperado se indica en el eje y izquierdo. La viabilidad celular se indica en el eje y derecho. Los cuadrados rellenos representan la recuperación celular antes del pase de la aguja; los triángulos rellenos representan la viabilidad celular antes del pase de la aguja; los cuadrados abiertos representan la viabilidad celular después del pase de la aguja; el triángulo abierto representa la recuperación de la celda después del pase de la aguja. Los detalles se describen en el Ejemplo 6.

La Figura 10 muestra la expresión del marcador de superficie de células hCTC (A3) como se determina mediante citometría de flujo. En cada histograma, la línea punteada es el control del anticuerpo de isotipo. La

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línea continua es la tinción del antígeno. Los antígenos se mostraron en los paneles. El eje x es la intensidad de ficoeritrina (PE) en escala logarítmica. El eje y es el recuento de células.

La Figura 11 muestra la comparación de la expresión del marcador de superficie celular entre células hCTC (A3) (paneles superiores) y fibroblastos dérmicos humanos adultos-NHDF (número de catálogo: CC-2511, Lonza, paneles inferiores). En cada histograma, el eje x es la intensidad de PE en escala logarítmica. El eje y es el recuento celular. La línea punteada representa el control del isotipo de anticuerpos. La línea continua es la tinción del antígeno. La población positiva fue cerrada en base al 1% de población positiva en controles de isotipo. Los marcadores individuales están indicados en cada histograma.

La Figura 12 muestra la expresión del marcador de superficie de células rCTC (A2) como se determina por citometría de flujo. La línea punteada representa el control del isotipo. La línea continua es la tinción de antígeno para cD31 (panel izquierdo) y cD90 (panel derecho).

La Figura 13 muestra la expresión génica de genes específicos cardíacos en células hCTC (A3) como se determina mediante reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR). Los detalles se describen en el Ejemplo 8. El eje y muestra el porcentaje de GAPDH, y se divide en escalas inferior y superior. La escala inferior varía del 0 al 0,01%, y la escala superior varía del 0,05% a 0,15%. Los acrónimos tienen los siguientes significados: MHC significa cadena pesada de miosina; TF cardiaco significa factor de transcripción; NHDF significa fibroblastos dérmicos humanos neonatales; h-corazón significa corazón humano. Los datos se expresan como Media ± D.E (n = 3).

La Figura 14 muestra la expresión elevada de la cadena pesada de miosina específica de ratón (MHC) en un co-cultivo de células derivadas de tejido cardíaco de ratón (A2) (mCTC (A2)) con cardiomiocitos neonatales de rata (N° de Catálogo R357-6VV, Cell Application, Austin, TX). El nivel de expresión del gen MHC de ratón se presentó como el porcentaje de GAPDH de ratón en cada muestra. El eje y indica el porcentaje de GAPDH del mouse. Los acrónimos tienen los siguientes significados: mCTC significa células mCTC (A2) cultivadas en medio de diferenciación, como se describe en el Ejemplo 9; CM significa cardiomiocitos; mCTC+CM significa mCTC cocultivado con cardiomiocitos de rata CM en medio de diferenciación. Los datos se expresan como Media ± D.E (n = 3).

La Figura 15 muestra la curva de crecimiento observada para células derivadas de tejido cardíaco porcino (A3) (pCTC (A3)), cultivadas de acuerdo con los métodos descritos en el Ejemplo 10. El eje x muestra el tiempo en cultivo después de la distribución en placas. El eje y muestra las duplicaciones de población totales acumulativas.

La Figura 16 muestra la expresión del marcador de superficie de células pCTC (A3) como se detecta mediante citometría de flujo. La línea punteada representa el control del isotipo. La línea continua es la tinción de antígeno para CD90 (panel izquierdo superior), CD105 (panel derecho superior), marcador de células endoteliales de cerdo (panel izquierdo inferior), CD16 (panel central inferior), CD45 (panel derecho inferior).

La Figura 17 muestra una caricatura de la remodelación cardíaca después de un infarto agudo de miocardio. La caricatura fue reproducida de Pfeffer M. en Atlas of heart failure (Colucci W, editor, 1999).

La Figura 18 muestra el efecto de la administración de las células derivadas de tejido cardíaco de la presente invención sobre el acortamiento fraccional (FS) en animales en los que se han inducido infartos agudos de miocardio, como se mide mediante ecocardiografía. El acortamiento fraccional es el cambio porcentual (FS%) en la sístole de la diástole en cada ciclo cardíaco, y refleja la función global del corazón. Los datos que se muestran son el acortamiento fraccional registrado en un animal individual a los 5 (D5) o 28 días (D28) después de la inducción de IAM. Los animales se dosificaron con células rCTC (A2) o células hCTC (A3) a las dosis indicadas en el eje x.

La Figura 19 muestra el efecto de las células derivadas de tejido cardíaco de la presente invención en la puntuación de movimiento de la pared regional (RWMS) en animales en los que se han inducido infartos agudos de miocardio, como se mide mediante ecocardiografía. Cada panel separado por una línea continua vertical es un brazo experimental en el estudio. 5D y 28D reflejan 5 días y 28 días después de la inducción de IAM, respectivamente. El RWMS se midió en 5D como referencia y 28D como seguimiento. Los animales se dosificaron con células rCTC (A2) o hCTC (A3) a las dosis indicadas en el eje x.

La Figura 20 muestra el efecto de las células derivadas del tejido cardiaco de la presente invención sobre la dimensión diastólica final del ventrículo izquierdo (LVEDD) en animales en los que se han inducido infartos agudos de miocardio. La LVEDD es una medida de la dimensión de la cámara izquierda al final de la diástole. La LEVDD se midió a los 5 días (5D) y 28 días (28D) después de la inducción del infarto de miocardio. Los datos mostrados son el cambio relativo [(28D-5D)/5D] de animales individuales. Los animales se dosificaron con células rCTC (A2) o hCTC (A3) a las dosis indicadas en el eje x.

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La Figura 21 muestra el análisis estadístico, que compara el cambio relativo de LVEDD en cada grupo experimental. Se aplicó una prueba F a los datos usando el análisis de varianza de una vía (ANOVA). Grupo 1: vehículo; grupo 2: células rCTC (A2) 1 x 106 células (dosis objetivo); grupo 3: células hCTC (A3) 1 x 104 células (dosis objetivo); grupo 4: células hCTC (A3) 1 x 105 células (dosis objetivo); grupo5: células hCTC (A3) 1 x 106 células (dosis objetivo).

La Figura 22 muestra el efecto de la administración de células derivadas de tejido cardíaco humano sobre la dimensión sistólica final del ventrículo izquierdo (LVESD). La LVESD es una medida de la dimensión de la cámara al final de la sístole en cada ciclo cardíaco. Cada panel separado por línea continua vertical era un brazo experimental en el estudio. La LVESD se midió a los 5 días (5D) y 28 días (28D) después de la inducción del infarto de miocardio. Los datos mostrados son los registros de un único animal en cada punto temporal. Los animales se dosificaron con células rCTC (A2) o hCTC (A3) a las dosis indicadas en el eje x.

La Figura 23 muestra la función cardíaca en el día 5 y el día 28 después del infarto y la administración de células derivadas de tejido cardíaco humano, en animales individuales en cuatro parámetros (FS, RWMS, LVESD, LVEDD) medidos mediante ecocardiografía. Cada punto negro representa la función cardíaca del animal individual en el punto temporal indicado en el eje X. La línea continua negra muestra la tendencia de cambio del 5D al 28D en cada animal. Cada panel representa un parámetro medido mediante ecocardiografía.

La Figura 24 muestra la correlación entre el acortamiento fraccional y la dosis de células derivadas de tejido cardíaco. El eje Y es el cambio absoluto en el día 28 desde el día 5 después del infarto y la administración celular (28D-5D). El eje x es la dosis de hCTC (A3) en escala lineal. Los datos se expresan como Media ± D.E (n=35).

La Figura 25 muestra la correlación entre el cambio de LVEDD y la dosificación del tejido derivado cardiaco humano de la presente invención. El eje y representa el cambio absoluto en el día 28 desde el día 5 después del infarto y la administración celular (28D-5D). El eje x representa la dosis de células hCTC (A3) en una escala lineal. Los datos se expresan como Media ± D.E (n = 35).

La Figura 26 muestra la retención de células hCTC (A3) administradas al corazón de animales que tienen infartos de miocardio. La retención se estimó a partir del nivel de expresión de beta-microglobulina detectado en corazones de rata. El panel "a" muestra la retención de células hCTC (A3) a las 4 semanas después de la administración a las dosis indicadas en el eje x. El panel "b" muestra el curso temporal de la retención de células hCTC (A3) donde el eje x representa el número de días después de la administración celular en el corazón IM de rata, y el eje y muestra el porcentaje de la dosis objetivo. El panel "c" muestra la retención de células hCTC (A3) a lo largo del tiempo, utilizando un porcentaje medio de las células detectadas, estableciendo la cantidad de células humanas detectadas inmediatamente después de la administración celular al 100%. El eje x representa el número de días después de la administración celular en el corazón IM de rata.

La Figura 27 muestra la correlación entre la retención de hCTC (A3) y la prevención de la remodelación en IM de rata. El panel izquierdo muestra el gráfico de correlación. El eje x representa el número de células en escala logarítmica; el eje y representa los cambios de remodelación (delta LVEDD, 28D-5D). El número de células de cada animal a las 4 semanas después de la administración y la delta LVEDD correspondiente se representaron en el gráfico. El panel derecho muestra el análisis estadístico de la regresión lineal.

La Figura 28 muestra la localización del NuMA (Antígeno de la Matriz Nuclear) humano en el miocardio de ratas tratadas con células HCTC (A3) (una dosis dirigida de 1 x 106 células). El panel izquierdo muestra la tinción de NuMA humana positiva observada para la dosis objetivo de miocardio de rata tratado con 1 x 106 hCTC amplificado 400 veces. El panel derecho muestra la tinción en un animal de control del vehículo.

La Figura 29 muestra la localización del NuMA humano en otro animal que recibe una dosis dirigida de 1 x 106 células hCTC (A3). El panel superior izquierdo muestra una imagen de baja potencia (amplificación de 100 veces) que muestra dos agrupaciones de células NuMA positivas. El panel superior derecho es una imagen de alta amplificación (amplificación de 400 veces), de agrupaciones de células NuMA positivas. El panel inferior izquierdo es una imagen de alta amplificación de la agrupación de células NuMA positivas. El panel inferior derecho es una imagen de alta amplificación que muestra núcleos de células NuMA positivas con morfología similar a los miocitos.

La Figura 30 muestra la tinción de controles de anticuerpos para NuMA observada en miocardio humano y de rata. Las dos imágenes superiores muestran tinción NuMA positiva (panel izquierdo) con alta especificidad nuclear (sin tinción con control de isotipo, panel derecho) en el corazón humano. Las dos imágenes inferiores muestran controles cardíacos de rata que demuestran la especificidad del anticuerpo NuMA para células

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humanas.

La Figura 31 muestra la evaluación de puntuación de la hipertrofia miocárdica en grupos tratados con hCTC (A3) o tratados con vehículo. La dosis objetivo se indica en el eje y. Los animales que recibieron células hCTC (A3) recibieron una dosis objetivo de o 1 x 104, 1 x 105 o 1 x 106 células. El área gris claro muestra la proporción de secciones no hipertróficas en corazón completo. El área gris oscuro muestra la proporción de secciones hipertróficas en el corazón completo.

La Figura 32 muestra la evaluación del tamaño del infarto. El panel izquierdo muestra el tamaño del infarto relativo(porcentaje de área de infarto en el área ventricular izquierda total); el panel derecho muestra el área de infarto absoluta. Los puntos negros representan cada animal individual. El tamaño medio del infarto del grupo se mostró como una línea negra continua.

La Figura 33 muestra la tinción de la densidad capilar en grupos tratados con células hCTC (A3), o tratados con vehículo. Los animales que recibieron células hCTC (A3) recibieron una dosis objetivo de 1 x 104, 1 x 105, o 1 x 106 células. El panel "a" muestra la densidad capilar en la zona del borde del infarto en el miocardio, como se detecta con tinción de isolectina-B4. El panel "b" muestra la densidad capilar en la zona del borde, como se detecta mediante la tinción con CD31.

La Figura 34 muestra la densidad de miocitos en el área no infartada. El panel "a" muestra imágenes representativas de la tinción H&E del miocardio de animales tratados con vehículo (panel izquierdo) y animales tratados con 1 x 105 células hCTC (A3) (panel derecho). El panel "b" muestra la densidad de miocitos observada en áreas no infartadas del corazón, expresada como número de miocitos por mm2. Los datos se muestran como Media ± DE (n=6); El panel c muestra la proliferación de miocitos que se observaron mediante tinción doble de Ki-67 y cadena pesada de miosina. Los datos se expresan como Media ± DE (n=6).

La Figura 35 muestra genes expresados diferencialmente en miocardio de rata en respuesta a tratamiento con células hCTC (A3) en todas las dosis objetivo.

La Figura 36 muestra la cuantificación del efecto de la administración de células hCTC y hMSC en el tejido cardíaco en ratas que padecen un IM agudo. El panel "a" muestra la proporción de área de infarto frente a tejido sano en la pared libre ventricular izquierda. El panel "b" muestra la clasificación de la dilatación observada en corazones de animales en todos los grupos. El panel "c" muestra un miocardio viable.

La Figura 37 muestra los efectos de la administración de célula hCTC (A3) y de la célula madre mesenquimal humana (N° de Cat. PT-2501, Lonza, Walkersville, MD) en el tejido cardíaco en ratas que padecen un IM agudo. Dos secciones se muestran una al lado de cada animal: una tomada desde la línea media entre el músculo papilar y el nivel auricular y otra tomada desde el músculo papilar. Las dos columnas de la izquierda son del grupo tratado con el vehículo; las dos columnas del medio eran del grupo tratado con hMSC (dosis objetivo 1 x 106); las dos columnas de la derecha eran del grupo tratado con células hCTC (A3) (dosis objetivo 1 x 10 5).

La Figura 38 muestra el efecto de la administración de células hCTC (A3) sobre la función cardíaca en ratas que padecen un IM agudo, en el día 28 después del infarto y la administración celular. Se midieron tres parámetros (FS, LVESD, LVEDD) mediante ecocardiografía. Se presenta un cambio relativo desde el valor de referencia (día 7 después del infarto y la administración celular) en el día 28 después de la administración celular y el infarto. Se muestran tres lotes de células hCTC (A3) de diferentes donantes, fibroblastos dérmicos humanos y células pCTC (A3).

La Figura 39 muestra el efecto de la administración de células hCTC (A3) sobre la función cardíaca en ratas que padecen un IM agudo, en el día 84 después del infarto y la administración celular. Se midieron tres parámetros (FS, LVESD, LVEDD) mediante ecocardiografía. Se presenta un cambio relativo desde el valor de referencia (día 7 después del infarto y la administración celular) en el día 84 después de la administración de la célula y el infarto. Se examinaron fibroblastos dérmicos humanos y tres lotes diferentes de células hCTC (A3) que se prepararon a partir de diferentes donantes.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

Para claridad de la divulgación, y no a modo de limitación, la descripción detallada de la invención se divide en las siguientes subsecciones que describen o ilustran ciertas características, realizaciones o aplicaciones de la presente invención.

Definiciones

Como se usa en la presente, el término "miocardio dañado" se refiere a células de miocardio que han sido

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expuestas a condiciones isquémicas. Estas afecciones isquémicas pueden ser provocadas por un infarto de miocardio u otra enfermedad cardiovascular o dolencia relacionada.

"Infarto de miocardio agudo" como se usa en la presente se refiere a la afección comúnmente conocida como "ataque al corazón", en donde cuando el suministro sanguíneo a una parte del corazón se interrumpe se provoca que algunas células del corazón mueren. Esto es debido más comúnmente a la oclusión (bloqueo) de una arteria coronaria después de la ruptura de una placa aterosclerótica vulnerable, que es una colección inestable de lípidos (como colesterol) y glóbulos blancos (especialmente macrófagos) en la pared de una arteria. La isquemia resultante (restricción en el suministro sanguíneo) y la escasez de oxígeno, si no se tratan durante un período suficiente, pueden provocar daño y/o muerte del tejido del músculo cardíaco (miocardio).

El término "población de hCTC (S)" o "hCTC (S)" como se usa en la presente se refiere a una población no adherente de células derivadas de tejido cardíaco humano que se obtiene después del cultivo inicial de células después de que el tejido cardíaco humano se ha disociado, digerido enzimáticamente, y filtrado de acuerdo con los métodos de la presente invención.

El término "población de hCTC (A1)" o "células hCTC (A1)" como se usa en la presente se refiere a una población adherente de células derivadas de tejido cardíaco humano que se obtiene después del cultivo inicial de células después de que el tejido cardíaco humano se ha disociado, digerido enzimáticamente, y filtrado de acuerdo con los métodos de la presente invención.

El término "población de hCTC (A2)" o "células hCTC (A2)" como se usa en la presente se refiere a una población de células adherentes que son el resultado del cultivo in vitro de células hCTC (S).

El término "población de hCTC (A3)" o "células hCTC (A3)" como se usa en la presente se refiere a una población de células adherentes que son el resultado del cultivo in vitro de una mezcla de células hCTC (S) y hCTC (A1).

Métodos para Derivar las Células de la Presente Invención

La presente invención proporciona un método para producir células derivadas de tejido cardíaco humano de acuerdo con las realizaciones, que no expresan telomerasa, que comprende los pasos de:

a. Obtener tejido cardíaco,

b. Disociar el tejido cardíaco,

c. Digerir el tejido cardíaco para liberar células,

d. Eliminar los cardiomiocitos de las células liberadas y

e. Cultivar las células restantes.

El tejido cardíaco puede disociarse manualmente. Alternativamente, el tejido cardíaco puede disociarse mecánicamente.

Los cardiomiocitos pueden eliminarse de las células liberadas mediante cualquier método adecuado. Por ejemplo, los cardiomiocitos pueden eliminarse mediante filtración, centrifugación o mediante FACS.

Las células liberadas de la digestión del tejido cardíaco se filtran para eliminar los cardiomiocitos. El propósito del paso de filtración es excluir las células que son de mayor tamaño que las células derivadas de tejido cardíaco humano de la presente invención. Las células derivadas de tejido cardíaco humano de la presente invención pueden ser de aproximadamente 5 micras a aproximadamente 50 micras de diámetro, y se elige un filtro de un tamaño de poro de 50 micras para permitir que las células derivadas de tejido cardíaco humano de la presente invención pasen a través del filtro.

Las células derivadas de tejido cardíaco humano que pasan a través del filtro pueden cultivarse in vitro. Las células derivadas de tejido cardíaco humano que se cultivan in vitro después del paso de filtración pueden ser una mezcla de células no adherentes y células adherentes.

Las células derivadas de tejido cardíaco humano de la presente invención pueden adherirse a cualquier sustrato sólido. El sustrato sólido puede ser policarbonato. Alternativamente, el sustrato sólido puede ser poliestireno. Alternativamente, el sustrato sólido puede ser vidrio. El sustrato sólido también puede recubrirse con una capa adsorbente que comprende una proteína de la matriz extracelular, como, por ejemplo, colágeno o laminina, y similares.

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Las células adherentes que se obtienen después del paso de cultivo inicial son referidas en la presente población de células derivadas de tejido cardíaco humano (A1) o células hCTC (A1). Las células no adherentes que se obtienen después del paso de cultivo inicial son referidas en la presente población de células derivadas de tejido cardiaco humano (S) o células hCTC (S).

En una divulgación, las células hCTC (A1) se expanden en cultivo. Las células hCTC (A1) pueden cultivarse en cualquier medio de cultivo de tejidos adecuado. Por ejemplo, en una realización, las células derivadas de tejido cardíaco se pueden cultivar en DMEM, complementado con 1.000 g/l de D-glucosa, 584 mg/l de L-glutamina y 110 mg/l de piruvato de sodio y 10% de FBS. Se pueden añadir antibióticos como, por ejemplo, penicilina 50 U/ml y estreptomicina 50 pg/ml al medio de cultivo. Alternativamente, se pueden añadir antibióticos a la suspensión de células obtenida después de la disociación y la digestión enzimática del tejido cardíaco. Las células hCTC (A1) pueden distribuirse en placas a una densidad de siembra de aproximadamente 1.000 a aproximadamente 10.000 células viables/cm2 en sustratos de cultivo de tejidos. Las células hCTC (A1) pueden incubarse bajo 5-20% v/v de oxígeno atmosférico.

En una divulgación, las células hCTC (A1) se someten a pases una vez que las células alcanzan aproximadamente el 80% de confluencia. Alternativamente, las células hCTC (A1) se someten a pases una vez que las células alcanzan aproximadamente el 90% de confluencia. Alternativamente, las células hCTC (A1) se someten a pases cada uno a siete días.

En una divulgación, las células hCTC (S) se expanden en cultivo. En una divulgación, las células hCTC (S) pueden cultivarse en cualquier medio de cultivo de tejidos adecuado. Por ejemplo, las células derivadas de tejido cardíaco pueden cultivarse en DMEM, complementado con 1.000 g/l de D-glucosa, 584 mg/l de L-glutamina, y 110 mg/l de piruvato de sodio, y 10% de FBS. Se pueden añadir antibióticos como, por ejemplo, penicilina 50 U/ml y estreptomicina 50 pg/ml al medio de cultivo. Alternativamente, se pueden añadir antibióticos a la suspensión de células obtenidas después de la disociación y la digestión enzimática del tejido cardíaco. Las células hCTC (S) pueden incubarse bajo 5-20% v/v de oxígeno atmosférico. En una divulgación, el medio de cultivo de tejidos se reemplaza cada tres días.

En una divulgación, las células hCTC (S) se vuelven adherentes con el tiempo en cultivo. El tiempo en cultivo en el que las células hCTC (S) se vuelven adherentes es de aproximadamente 1 día a aproximadamente 7 días. La población de células adherentes que resultan de que las células hCTC (S) se vuelven adherentes es referido en la presente como población de células derivadas de tejido cardíaco humano (A2) o células hCTC (A2).

En una divulgación, las células hCTC (A2) se expanden en cultivo. Las células hCTC (A2) pueden cultivarse en cualquier medio de cultivo de tejidos adecuado. Por ejemplo, las células derivadas de tejido cardíaco pueden cultivarse en DMEM, suplementado con 1.000 g/l de D-glucosa, 584 mg/l de L-glutamina, y 110 mg/l de piruvato de sodio, y 10% de FBS. Se pueden añadir antibióticos como, por ejemplo, penicilina 50 U/ml y estreptomicina 50 pg/ml al medio de cultivo. Alternativamente, pueden añadirse antibióticos a la suspensión de células obtenida después de la disociación y la digestión enzimática del tejido cardíaco. Las células hCTC (A2) pueden distribuirse en placas a una densidad de siembra de aproximadamente 1.000 a aproximadamente 10.000 células viables/cm2 en sustratos de cultivo de tejidos. Las células hCTC (A2) pueden incubarse bajo 5-20% v/v de oxígeno atmosférico.

En una divulgación, las células hCTC (A2) se someten a pases una vez que las células alcanzan aproximadamente el 80% de confluencia. Alternativamente, las células hCTC (A2) se someten a pases una vez que las células alcanzan aproximadamente el 90% de confluencia. Alternativamente, las células hCTC (A2) se someten a pases cada uno a siete días.

En una divulgación, una mezcla de células hCTC (A1) y células hCTC (S) se expande en cultivo. En una divulgación, la mezcla de células hCTC (A1) y células hCTC (S) forma una población de células adherentes con tiempo en cultivo. El tiempo en cultivo en el que las células hCTC (S) se vuelven adherentes es de aproximadamente 2 días a aproximadamente 14 días. La población de células adherentes que resulta de la mezcla de células hCTC (A1) y células hCTC (S) que se vuelven adherentes es referida en la presente como población de células derivadas de tejido cardiaco humano (A3) o células hCTC (A3).

En una divulgación, las células hCTC (A3) se expanden en cultivo. Las células hCTC (A3) pueden cultivarse en cualquier medio de cultivo de tejidos adecuado. Por ejemplo, las células derivadas de tejido cardíaco pueden cultivarse en DMEM, suplementado con 1.000 g/l de D-glucosa, 584 mg/l de L-glutamina y 110 mg/l de piruvato de sodio, y 10% de FBS. Pueden añadirse antibióticos como, por ejemplo, penicilina 50 U/ml y estreptomicina 50 pg/ml al medio de cultivo. Alternativamente, pueden añadirse antibióticos a la suspensión de células obtenida después de la disociación y la digestión enzimática del tejido cardíaco. Las células hCTC (A3) pueden distribuirse en placas a una densidad de siembra de aproximadamente 1.000 a aproximadamente 10.000 células viables/cm2 en sustratos de cultivo de tejidos. Las células hCTC (A3) pueden incubarse bajo 5-20% v/v de oxígeno atmosférico.

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En una divulgación, las células hCTC (A3) se someten a pases una vez que las células alcanzan aproximadamente el 80% de confluencia. Alternativamente, las células hCTC (A3) se someten a pases una vez que las células alcanzan aproximadamente el 90% de confluencia. Alternativamente, las células hCTC (A3) se someten a pases cada uno a siete días.

Un método para obtener las células derivadas de tejido cardíaco humano de la presente invención se resume en la Figura 1. Un método alternativo mediante el cual obtener las células derivadas de tejido cardíaco humano de la presente invención se resume en la Figura 2. Un método alternativo mediante el cual obtener las células derivadas de tejido cardíaco humano de la presente invención se resume en la Figura 3.

Las células de la presente invención pueden derivarse de la disociación del corazón completo y, posteriormente, digerir el tejido disociado. Alternativamente, las células de la presente invención pueden derivarse de porciones disociadoras de tejido cardíaco, y posteriormente digerir el tejido disociado. Las porciones pueden obtenerse de cualquier parte del corazón como, por ejemplo, las aurículas o los ventrículos, el ápice del corazón, o cualquier lado del corazón.

El tejido cardíaco disociado puede digerirse usando enzimas como, por ejemplo, colagenasa y dispasa Las enzimas pueden usarse por separado o alternativamente en combinación. El tejido cardíaco disociado puede digerirse usando una mezcla de colagenasa y dispasa.

La colagenasa puede usarse a una concentración de aproximadamente 0,1 U/ml a aproximadamente 10 U/ml. Alternativamente, la colagenasa puede usarse a una concentración de aproximadamente 0,1 U/ml a aproximadamente 5 U/ml. Alternativamente, la colagenasa puede usarse a una concentración de aproximadamente 5 U/ml. Alternativamente, la colagenasa puede usarse a una concentración de aproximadamente 1 U/ml.

La dispasa puede usarse a una concentración de aproximadamente 0,5 U/ml a aproximadamente 50 U/ml. Alternativamente, la colagenasa puede usarse a una concentración de aproximadamente 0,5 U/ml a aproximadamente 10 U/ml. Alternativamente, la colagenasa puede usarse a una concentración de aproximadamente 10 U/ml. Alternativamente, la colagenasa puede usarse a una concentración de aproximadamente 5 U/ml.

El tejido disociado puede tratarse con enzimas durante aproximadamente de 5 minutos a aproximadamente 5 horas. Alternativamente, el tejido disociado puede tratarse con enzimas durante aproximadamente de 30 minutos a aproximadamente 5 horas. Alternativamente, el tejido disociado puede tratarse con enzimas durante aproximadamente de 30 minutos a aproximadamente 4 horas. Alternativamente, el tejido disociado puede tratarse con enzimas durante aproximadamente de 30 minutos a aproximadamente 3 horas. Alternativamente, el tejido disociado puede tratarse con enzimas durante aproximadamente de 30 minutos a aproximadamente 2 horas. Alternativamente, el tejido disociado puede tratarse con enzimas durante aproximadamente de 30 minutos a aproximadamente 1 hora. El tejido disociado puede tratarse con enzimas durante aproximadamente 2,5 horas.

Si es deseable, las células derivadas de tejido cardiaco de la presente invención pueden exponerse, por ejemplo, a un agente (como un anticuerpo) que reconoce específicamente un marcador de proteína expresado por las células derivadas de tejido cardíaco, para identificar y seleccionar células derivadas de tejido cardíaco, obteniendo de este modo una población sustancialmente pura de células derivadas de tejido cardíaco.

Las Células de la Presente Invención

La presente invención proporciona una población celular derivada de tejido cardíaco humano que no expresa telomerasa, de acuerdo con las reivindicaciones, que puede mantenerse y expandirse en cultivo, y es útil en el tratamiento y la reparación de miocardio dañado. Las propiedades de las células derivadas de tejido cardiaco de la presente invención se resumen en la Tabla 1.

En una realización, de acuerdo con las reivindicaciones, las células derivadas de tejido cardíaco humano de la presente invención que no expresan telomerasa, expresan por lo menos uno de los siguientes marcadores: CD49e, CD105, CD59, CD54, CD90, CD34 y CD117.

En una realización, de acuerdo con las reivindicaciones, las células derivadas de tejido cardíaco humano de la presente invención que no expresan telomerasa no expresan por lo menos uno de los siguientes marcadores: MDR, CD19, CD16, CD31, CD45 e IsI-1.

En una realización, de acuerdo con las reivindicaciones, las células derivadas de tejido cardíaco humano de la presente invención que no expresan telomerasa, expresan los siguientes marcadores: CD49e, CD105, CD59, CD54, CD90, CD34 y CD117.

En una realización, de acuerdo con las reivindicaciones, las células derivadas de tejido cardíaco humano de la presente invención que no expresan telomerasa no expresan los siguientes marcadores: MDR, CD19, CD16,

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CD31, CD45 e IsI-1.

En una realización, las células derivadas de tejido cardíaco humano de la presente invención se diferencian adicionalmente en cardiomiocitos. Esta diferenciación puede ser antes de, o alternativamente después, la administración al paciente. La diferenciación se refiere al acto de aumentar la extensión de la adquisición o posesión de una o más características o funciones, que difieren de la de la célula original (es decir, especialización celular). Esto puede detectarse, por ejemplo, examinando un cambio en el fenotipo de la célula (es decir, identificando cambios morfológicos en la célula y/o marcadores de superficie en la célula). Puede usarse cualquier método capaz de diferenciar las células derivadas de tejido cardiaco de la presente invención en cardiomiocitos.

Por ejemplo, las células derivadas de tejido cardiaco de la presente invención pueden diferenciarse adicionalmente en cardiomiocitos de acuerdo con los métodos divulgados en la Solicitud de Patente de Estados Unidos US20040126879.

En otro ejemplo, las células derivadas de tejido cardiaco de la presente invención pueden diferenciarse adicionalmente en cardiomiocitos de acuerdo con los métodos divulgados en la WO2004019767.

Métodos para Tratar o Reparar Miocardio Dañado

El miocardio dañado es el resultado de una variedad de enfermedades cardíacas, como, por ejemplo, infarto de miocardio agudo, infarto de miocardio crónico, insuficiencia cardíaca congestiva, y similares. Las células derivadas de tejido cardíaco de la presente invención pueden usarse una terapia para reparar miocardio dañado. En una realización, las células derivadas de tejido cardíaco de la presente invención se usan como una terapia para reparar miocardio que se daña como resultado de un infarto de miocardio agudo.

En una realización, la presente invención proporciona una población de células derivadas de tejido cardiaco de acuerdo con las reivindicaciones para su uso en un método para tratar miocardio dañado en un paciente que comprende los pasos de:

a. Obtener una población de células derivadas de tejido cardíaco humano que no expresan telomerasa, y

b. Administrar la población de células derivadas de tejido cardíaco humano al paciente en una cantidad suficiente para tratar el miocardio dañado.

En una realización, la presente invención proporciona una población de células derivadas de tejido cardiaco de acuerdo con las reivindicaciones para su uso en un método para reparar miocardio dañado en un paciente que comprende los pasos de:

a. Obtener una población de células derivadas de tejido cardíaco humano que no expresan telomerasa, y

b. Administrar la población de células derivadas de tejido cardíaco humano al paciente en una cantidad suficiente para reparar el miocardio dañado.

En una realización, la población de células derivadas de tejido cardíaco humano se prepara y administra al paciente sin cultivar las células. En una realización alternativa, la población de células derivadas de tejido cardíaco se prepara y se cultiva in vitro, antes de administrarla al paciente.

En el caso en el que la población de células derivadas de tejido cardíaco humano se cultiva y expande in

vitro, la población de células que se cultiva y expande puede ser una población de células hCTC

(A1). Alternativamente, la población de células que se cultiva y expande puede ser una población de células hCTC

(A2). Alternativamente, la población de células que se cultiva y expande puede ser una población de células hCTC

(A3).

Las células derivadas de tejido cardíaco humano de la presente invención pueden administrarse a un paciente que padece miocardio dañado por cualquier método adecuado en la técnica. Tales métodos se seleccionan fácilmente por un experto en la técnica.

Por ejemplo, la administración de las células derivadas de tejido cardíaco humano de la presente invención al miocardio dañado puede ser mediante inyección directa del miocardio dañado. Alternativamente, las células derivadas de tejido cardíaco humano de la presente invención pueden administrarse sistémicamente. Cuando las células derivadas de tejido cardíaco humano de la presente invención se administran sistémicamente, puede mejorarse la eficacia de la administración de las células al miocardio dañado, por ejemplo, tratando al paciente con por lo menos otro agente, o mediante otro método capaz de mejorar la administración de células al miocardio dañado.

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Por ejemplo, las células derivadas de tejido cardíaco humano de la presente invención pueden administrarse junto con otro agente seleccionado del grupo que consiste de: factor de células madre (SCF), factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF), factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos (GM- CSF), factor-1 derivado de células estromales, factor steel, factor de crecimiento endotelial vascular, factor estimulante de colonias de macrófagos, factor estimulante de granulocitos-macrófagos, e interleucina-3.

En una realización, las células derivadas de tejido cardíaco humano de la presente invención se administran junto con otro agente de acuerdo con los métodos divulgados en la Solicitud de Patente de Estados Unidos US20020061587.

En una realización, las células derivadas de tejido cardíaco humano de la presente invención se administran junto con otro agente de acuerdo con los métodos divulgados en la Solicitud de Patente de Estados Unidos US2002162796.

Por ejemplo, la administración de células al miocardio dañado puede mejorarse aislando la circulación cardíaca del paciente de la circulación sistémica del paciente y perfundiendo una solución que comprende células en el circuito cardíaco. Un ejemplo de este método se divulga en la WO2007067502.

En una realización, las células derivadas de tejido cardíaco humano de la presente invención se administran al paciente de acuerdo con los métodos descritos por Iwasaki, Kawamoto et al. (Circulation 113: 13111325, 2006).

En una realización alternativa, las células derivadas de tejido cardíaco humano de la presente invención se administran al paciente usando un catéter que puede insertarse en la arteria coronaria de acuerdo con los métodos divulgados por Sherman, Martens et al. (Nature Clinical Practice Cardiovascular Medicine 3, suppl 1: S57-64; 2006).

En una realización alternativa, las células derivadas de tejido cardíaco humano de la presente invención se administran al paciente usando un catéter que es capaz de mapear la actividad eléctrica del miocardio. En una realización, las células derivadas de tejido cardíaco de la presente invención se administran al paciente usando un catéter que es capaz de mapear la actividad eléctrica del miocardio de acuerdo con los métodos descritos por Perin, Dohmann et al. (Circulation 107: 2294-2302, 2003); y Perin, Silva et al. (Journal of Molecular and Cellular Cardiology 44: 486-495, 2008). En una realización alternativa, las células derivadas de tejido cardíaco de la presente invención se administran al paciente de acuerdo con los métodos descritos por Sherman, Martens et al. (Nature Clinical Practice Cardiovascular Medicine 3, suppl 1: S57-64; 2006).

En una realización alternativa, las células derivadas de tejido cardíaco humano de la presente invención se administran al paciente usando un catéter que es capaz de inyección intra-miocardio de acuerdo con los métodos divulgados por Hashemi, Ghods et al. (European Heart Journal 29: 251-259; 2008).

La presente invención se ilustra adicionalmente, pero no está limitada por, los ejemplos siguientes.

Ejemplo 1

Aislamiento de Células Derivadas de Tejido Cardíaco Humano

Materiales y métodos - Preparación de cóctel de enzimas de digestión: El cóctel de enzimas de digestión usado en la presente invención para aislar células derivadas de tejido cardíaco de corazón humano se preparó como soluciones madre de cóctel 2X en solución salina tamponada con fosfato (PBS, Gibco, Invitrogen, Carlsbad, CA). Las concentraciones son de 0,2 U/ml o 2 U/ml de colagenasa (Serva Electrophoresis GmbH, Heidelberg, Alemania) y 10 U/ml de Dispasa II (Roche Applied Science, Indianapolis, Indiana). Estas soluciones madre de cóctel de enzimas se almacenaron a --40° C. Antes de la digestión, el cóctel de enzimas se filtró a través de un sistema de filtro al vacío de 0,22 pm (Corning Incorporated, Acton, MA). Para la digestión del corazón humano, se usaron 2U/ml de solución madre de colagenasa en el procedimiento de digestión. Las concentraciones finales de las enzimas de digestión son 1 U/ml de colagenasa y 5 U/ml de dispasa. El proceso de digestión del corazón humano completo y el aislamiento de las células derivadas del tejido cardíaco humano (hCTC) se resume en la Figura 1.

Material y métodos - corazón humano: se obtuvieron corazones completos descartados para trasplante de los National Development and Research Institutes (NDRI, Nueva York, NY). El tiempo de adquisición de los corazones descartados para trasplantes fue de 40-98 horas. El órgano completo fue sumergido en medio de crecimiento (DMEM + 10% de suero bovino fetal) y se almacenó a 4° C hasta ser procesadas para aislamiento celular.

Materiales y métodos - procesamiento de tejido cardíaco humano: el tejido cardíaco completo se transfirió a un armario de bioseguridad y se colocó en un plato de bioensayo cuadrado (Corning Inc., Acton, MA). El exceso de tejido graso se eliminó usando bisturíes estériles (Bard Parker, Becton Dickinson, Hancock, NY). El primer corazón

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completo se cortó en trozos pequeños (2-3 cm )Tres cuartas partes de las piezas de tejido pequeñas se picaron manualmente para obtener piezas finas (1-2 mm3 de tamaño). Llevó dos horas completar este proceso. Una cuarta parte de las piezas se transfirieron a la cámara homogeneizadora PRO250 (Pro Scientific, Oxford, CT). La tapa se colocó en la cámara y el generador PRO250 se unió con la velocidad del generador a 3. Las piezas de tejido se homogeneizaron durante 10 segundos a temperatura ambiente sin adición de ningún tampón y el tejido se inspeccionó visualmente. La homogeneización se completó cuando el tejido se trituró finamente (dando como resultado fragmentos de menos de 1 mm3 de tamaño).

Materiales y métodos - digestión de tejido humano: las piezas de tejido, tanto manualmente procesadas como homogeneizadas, se transfirieron a tubos cónicos de 250 ml separados (Corning Inc., Corning, NY). El tejido en cada tubo se lavó tres veces añadiendo 100 ml de PBS a temperatura ambiente e invirtiendo el tubo cinco veces. El tubo se colocó en posición vertical y se dejó que el tejido sedimentase. El sobrenadante se aspiró usando una pipeta de aspiración de 2 ml (BD Falcon, BD Biosciences, San Jose, CA). La solución madre de cóctel de enzimas de digestión (2X) se añadió al tubo de 250 ml a una proporción de enzima a tejido de 1:1. La concentración final de enzimas fue de 1 U/ml de colagenasa y 5 U/ml de Dispasa II. Los tubos que contenían el tejido y las enzimas se transfirieron a un agitador orbital a 37° C ajustado para 225 rpm (Barnstead Lab, Melrose Park, IL) y se incubaron durante 2,5 horas. Después de la incubación, el tubo se transfirió de vuelta al armario de bioseguridad. La suspensión celular se diluyó llenando los tubos con PBS a temperatura ambiente. Para eliminar cualquier tejido no digerido restante, la suspensión celular se filtró a través de un tamiz de prueba estándar de 250 pm de 8 pulgadas de diámetro (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) y en un vaso de precipitados de vidrio de 500 ml. Después de este paso, la suspensión celular en el vaso de precipitados de vidrio se filtró adicionalmente a través de filtros de células de 100 pm (BD Falcon) y en múltiples tubos cónicos de 50 ml (BD Falcon). La suspensión celular se lavó luego mediante centrifugación a 338 x g durante 5 minutos a temperatura ambiente usando una centrífuga Sorvall Legend T (Thermo Fisher Scientific, Inc, Waltham, MA) para sedimentar las células. El sobrenadante se aspiró y los sedimentos celulares se resuspendieron en PBS y se juntaron en tubos separados de 50 ml, uno para cada uno del procesos de picado manual y el proceso de homogeneización. La suspensión celular se lavó tres veces más con 40 ml de PBS a temperatura ambiente. Después del lavado, el sedimento se resuspendió en 20 ml de tampón de lisis ACK (Lonza, Walkersville, MD) y se incubó durante 10 minutos a temperatura ambiente para lisar cualquier glóbulo rojo restante. Después de la incubación, la suspensión celular se lavó dos veces más con 40 ml de PBS a temperatura ambiente.

Después de la centrifugación final, el sedimento se resuspendió en 20 ml de medio de crecimiento a temperatura ambiente (DMEM, 1.000 mg/l de D-glucosa, L-glutamina y 110 mg/l de piruvato de sodio, 10% de suero bovino fetal, penicilina 50U/ml, Streptomycin 50ug/ml) y se contó.

Materiales y métodos - Recuento celular: La densidad de células viables total y el análisis de viabilidad se realizaron usando el Vi-Cell™ XR (Beckman Coulter, Fullerton, CA). El analizador de viabilidad celular Vi-Cell™ automatiza el método de exclusión de colorante azul de tripano para la evaluación de viabilidad celular usando tecnología de captura de video y análisis de imágenes de hasta 100 imágenes de células en un flujo celular. El Vi- Cell tiene una precisión de recuento de ±6%. Las muestras se prepararon y analizaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Manual de referencia PN 383674 Rev.A). Brevemente, una alícuota de 500 pl de la suspensión celular final obtenida después de la lisis de RBC se transfirió a un vial de muestra Vi-Cell™ de 4 ml y se analizó usando un Analizador de Viabilidad Celular Vi-Cell™ XR. Se usó el perfil de tipo celular predeterminado:

Brillo de la célula

85%

Nitidez de la célula

100

Brillo de mancha celular viable

75%

Área de mancha celular viable

5%

Circularidad mínima

0

Gradiente de Decluster

Medio

Diámetro mínimo

5 micras

Diámetro máximo

50 micras

Imágenes

50

Ciclos de aspiración

1

Ciclos de mezclado de azul de tripano

3

Resultados - Rendimiento celular obtenido a partir de una digestión del corazón completo: a partir del primer corazón completo, después de la digestión, el rendimiento del proceso de picado manual produjo 43 millones de células viables después de la disociación y la digestión enzimática. La viabilidad fue del 65%. El procedimiento de homogenización mecánica produjo 12 millones de células viables y la viabilidad fue del 63%. Dado que se sometieron 3 veces más de tejido al procedimiento manual, no hubo diferencias en el rendimiento y la viabilidad entre los 2 procedimientos. En base a los resultados, se procesaron corazones humanos posteriores usando homogeneización mecánica. Después de la digestión, el rendimiento total fue típicamente de 34-64 millones de células viables por corazón. La viabilidad fue del 55-81%, como se muestra en la Tabla 2.

Ejemplo 2

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Selección y Cultivo In Vitro de Células Derivadas de Tejido Cardíaco Humano de la Presente Invención

La suspensión celular obtenida después de la disociación y la digestión enzimática de un corazón humano se expandió para un posterior análisis experimental.

La distribución en placas inicial de las células obtenidas a partir de disociación y digestión enzimática de un corazón humano: La suspensión celular obtenida de la disociación y digestión enzimática de un corazón humano, de acuerdo con los métodos descritos en el Ejemplo 1, se añadió a matraces de cultivo de tejido T225 (Corning Inc., Corning, NY). Se añadieron 10 ml de la suspensión celular a cada matraz, que contenía 50 ml de medio de crecimiento (DMEM, 1.000 mg/l de D-glucosa, 584 mg/l de L-glutamina, y 110 mg/l de piruvato de sodio, 10% de suero bovino fetal , Penicilina 50 U/ml, estreptomicina 50 pg/ml, Invitrogen, Calsbald, CA). El volumen final del cultivo inicial fue de 60 ml. Las células se incubaron a 37° C en una atmósfera que comprendía 20% de O2 y 5% de CO2, durante 2 días. Después de este tiempo, se observó un cultivo celular heterogéneo. Se observaron células brillantes de fase no adherentes (referidas en la presente como células hCTC (S)), y se observaron células adherentes (referidas en la presente células hCTC (A1)). Ver la Figura 4.

Las células hCTC (S) obtenidas después del paso de cultivo inicial tenían una morfología similar a las células descritas como células madre cardiacas por Anversa (Beltrami, Barlucchi et al., 2003; Cell 114(6): 76376). Ver Figura 4a. Además, se observaron agrupaciones celulares, similares a las descritos por Messina et al (Messina, De Angelis et al. 2004, Circulation Research 95(9): 911-21), mostradas en la Figura 4b.

Expansión de la población de hCTC (S): En un estudio, las células hCTC (S) se eliminaron de los matraces de cultivo después del período de cultivo de dos días inicial. Las células hCTC (S) se transfirieron a tubos cónicos de 50 ml. Las células hCTC (S) se centrifugaron a 338 x g durante 5 minutos a temperatura ambiente. Se descartó el sobrenadante y el sedimento celular se resuspendió en 20 ml de medio de crecimiento nuevo. Las células hCTC (S) se contaron después de la resuspensión. El número total de células hCTC (S) obtenidas del paso de cultivo inicial fue de aproximadamente 10-14 millones de células totales. Una fracción de las células HCTC (S) se crioconservaron en medio de conservación en 1-1, millones/ml y se almacenaron a -140° C. El resto se expandieron en cultivo. Las células hCTC (S) se redistribuyeron en matraces a una densidad de siembra de 5.000 células/cm2. Después de 2 días en cultivo, las células hCTC (S) se volvieron adherentes, y formaron una población celular adherente homogénea, referida en la presente como población hCTC (A2), o células hCTC (A2). Una vez que las células hCTC (A2) de la presente invención alcanzaron el 80% de confluencia a aproximadamente 10-14 días después de la distribución en placas de hCTC (S), las células se tripsinizaron aspirando el medio de crecimiento, se lavaron con 60 ml de PBS a temperatura ambiente y luego se añadieron 4 ml de Tripsina-EDTA (Invitrogen, Carlsbad, CA) a cada matraz. Las células hCTC (A2) se incubaron durante aproximadamente 5 minutos a temperatura ambiente hasta que las células se despegaron. A cada matraz, se añadieron 6 ml de medio de crecimiento y la suspensión celular se transfirió a un tubo cónico de 50 ml nuevo (BD Falcon, BD Biosciences, San Jose, CA). Se retiró una alícuota de 500 pl y se transfirió a una cubeta de muestras celulares Vi para recuento usando el Analizador de Viabilidad Celular Vi-Cell™ como se describe en el Ejemplo 1. Estas células se redistribuyeron en placas a 5.000 células/cm2 o 3.000 células/cm2.

También se realizó la expansión celular de hCTC (S) usando células crioconservadas. Un vial congelado de Células S se descongeló a 37° C y se lavó con PBS una vez. Luego se contaron las células y se distribuyeron en placas 5.000 células/cm2 en medio de crecimiento en matraces de cultivo. La expansión celular y la confluencia se observaron todos los días.

Mediante observación visual, las células hCTC (S) no adherentes se redujeron significativamente después de 2 días en cultivo y el número de hCTC (S) no adherentes no aumentó en cultivo durante un período de 10-14 días. Las células hCTC (S) en cultivo comenzaron a unirse al matraz después de 2 días en cultivo y crecieron como células adherentes. Alcanzaron el 80% de confluencia a los 10-14 días después de la siembra de las células hCTC (S). Aunque en cultivo todavía se observaron algunas células hCTC (S), el número de esta población no adherente no aumentó en el cultivo. Esto se debió posiblemente al cambio en la morfología de las hCTC (S) no adherentes a hCTC (A2) adherentes en cultivo. Como las células hCTC (S) se unieron al matraz después de 2 días, el número de células no adherentes llegó a ser muy bajo y no se contó.

Por el contrario, las células hCTC (A2) adherentes que se derivaron de las células hCTC (S) demostraron algún potencial de crecimiento, hasta 10 PDL mostrado en la Figura 5a. La velocidad de crecimiento de esta población estaba entre 1-3 PDL/pase hasta que alcanzó la meseta a 9-10 PDL, cuando las células hCTC (A2) se sembraron a 5.000 células/cm2 o a 3.000 células/cm2. Sin embargo, el cálculo de PDL se basa en el número de células inicial distribuidas en placas en el cultivo (es decir, el número de células hCTC (S)), la estimación de PDL puede no ser del todo precisa.

Expansión de la población de hCTC (A1): después de que se retirase el medio que contiene las células hCTC (S) de los matraces que contenían las células de la distribución en placas de dos días inicial, se añadieron 60

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ml de medio de crecimiento fresco a las células adherentes restantes presentes en los matraces . Las células hCTC (A1) se cultivaron hasta que las células alcanzaron el 80% de confluencia. Después de este tiempo, las células se tripsinizaron aspirando el medio de crecimiento, se lavaron con 60 ml de PBS a temperatura ambiente y se añadieron 4 ml de tripsina-EDTA (Invitrogen, Carlsbad, CA). Las células se incubaron durante aproximadamente 5 minutos a temperatura ambiente hasta que las células se despegaron. A cada matraz, se añadieron 6 ml de medio de crecimiento y la suspensión celular se transfirió a un tubo cónico de 50 ml nuevo (BD Falcon, BD Biosciences, San Jose, CA). Se retiró una alícuota de 500 pl y se transfirió a una cubeta de muestras de células Vi para recuento usando un Analizador de Viabilidad Celular Vi-Cell™. Una porción de las células se resuspendió luego con medio de crioconservación (90% de FBS y 10% de DMSO) y se guardaron a 1-1,5 millones de células/ml y se almacenaron a - 140° C. Las células restantes se expandieron redistribuyendo en placas las células en viales congelados a 3.000 células/cm2. El medio usado se reemplazó tres días después de la redistribución en placas y las células se sometieron a pases el día 7. Estas células se sometieron a pases cada 7 días con un reemplazo de medio en el día 3, usando tripsinización.

Expansión de la población de hCTC (A3): se lavó un vial de células hCTC (A1) y un vial de células hCTC (S) y luego se combinaron en un tubo cónico de 50 ml (BD Falcon, BD Biosciences, San Jose, CA). Se añadió o una mezcla de 5.000 células/cm2 o 3.000 células/cm2 de la suspensión celular combinada en matraces T225 separados. Cada matraz se llenó con medio de crecimiento nuevos a 60 ml por matraz, y las células se incubaron a 37° C, 20% O2 atmosférico, durante 2 días. Después de este tiempo, la mayoría de las células formaron una población celular adherente, referida en la presente comopoblación hCTC (A3), o células hCTC (A3). Una vez que las células alcanzaron el 80% de confluencia, las células se sometieron a pases por tripsinización y se redistribuyeron en placas a una densidad de siembra de o 5.000 células/cm2 o 3,000 células/cm2 para identificar la densidad de siembra apropiada y se incubaron a 37° C, 20% de atmósfera de O2. Las células hCTC (A3) alcanzaron típicamente el 80% de confluencia a los 7 días después de la siembra. Las células hCTC (S) no adherentes se observaron visualmente a diario, y se redujeron significativamente después de 2 días en cultivo, de tal manera que las células hCTC (A3) se volvieron una población homogénea de células. De media, esto llevó alrededor de 2 días. La población de hCTC (A3) fue capaz de expandirse a una velocidad de 1-3 PDL por pase. Cuando las células hCTC (A3) se sembraron a una densidad de 5.000 células/cm2, las hCTC (A3) fueron capaces de alcanzar 9-10 PDL antes de alcanzar la senescencia. Por el contrario, cuando las células hCTC (A3) se sembraron a una densidad de

3.000 células/cm2, las hCTC (A3) fueron capaces de alcanzar 24 PDL antes de alcanzar la senescencia. Ver la Figura 5b.

Caracterización de las células derivadas de tejido cardíaco humano de la presente invención: Las células hCTC (A2) y hCTC (A3) demostraron una tasa de crecimiento similar de 1-3 PDL en cada pase. Ambas requirieron aproximadamente 7 días para que las células alcanzaran el 80-90% de confluencia para los pases. Las diferencias en el PDL total observado entre las dos poblaciones de células pueden deberse posiblemente al PDL subestimado inicial en células hCTC (A2) cuando se derivaron de la población de células hCTC (S).

No se observaron diferencias en la expresión de los marcadores o genes de la superficie celular en todas las poblaciones de células derivadas de tejido cardíaco humano aisladas mediante los métodos de la presente invención. Las células hCTC (A1), hCTC (S), hCTC (A2) y hCTC (A3) no expresaban telomerasa. Ver la Tabla 1 para una lista de genes expresados en las células derivadas de tejido cardíaco humano de la presente invención, y las células progenitoras cardiacas en la técnica. Todas las poblaciones celulares aisladas de acuerdo con los métodos de la presente invención demostraron una expresión génica positiva de GATA4 y Nkx2.5. No se observó expresión de cadena pesada de miosina. Se detectó el marcador de células madre c-kit mediante expresión génica en todas las poblaciones celulares de la presente invención. Ver la Tabla 8. Mediante citometría de flujo, las células derivadas de tejido cardíaco humano de la presente invención eran positivas para CD105 y CD90. Las células de la presente invención no expresaban CD31, CD45 y CD16. Ver Tabla 8.

No se observaron diferencias significativas en las características de las poblaciones de células derivadas de tejido cardíaco humano de la presente invención. La población de hCTC (A3) se seleccionó para una caracterización adicional.

Ejemplo 3

Cultivo Celular in vitro de Células Derivadas de Tejido Cardíaco Humano

La densidad celular y la hipoxia tienen un impacto en el crecimiento celular (Tavaluc R et al, Cell Cycle 6:20, 2554-2562, 15 de octubre de 2007). El contacto célula-célula puede reducir el potencial de crecimiento celular y la densidad de siembra baja reduce la oportunidad de contacto celular y aumenta el potencial de crecimiento. La hipoxia, o tensión de O2 baja ha demostrado que reduce la inhibición por contacto del crecimiento celular (Nonomura Y. et al; The Journal of Rheumatology, 1 de abril de 2009 vol. 36 no 4 698-705.). En la presente invención, la densidad de siembra a 3.000 células/cm2 demostró más potencial de crecimiento en comparación con

5.000 células/cm2.

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ara comparar el efecto de los niveles de O2 sobre el crecimiento celular, se sembraron células HCTC (A3) a

3.000 células/cm2 después de cada pase en matraces T225. Las células se incubaron en una atmósfera de o 20% de O2 o 5% de O2. En el día 3, el medio agotado se reemplazó con 60 ml de medio de crecimiento nuevo. En el día 7, las células hCTC (A3) se recogieron de acuerdo con los métodos descritos en el Ejemplo 2. La cinética de crecimiento se determinó examinando el PDL total acumulativo hasta que se observó la senescencia. La duración total del experimento fue superior a 100 días, durante los cuales, las células se sometieron a pases de 16 a 17 veces. Las células hCTC (A3) se cultivaron en condiciones de oxígeno normales (20% de O2), la curva de crecimiento alcanzó una meseta en PDL 24. Sin embargo, cuando las células hCTC (A3) en PDL 12 se cultivaron en condiciones de oxígeno bajo (5% de O2), la curva de crecimiento alcanzó una meseta en PDL 28, como se muestra en la Figura 6

Ejemplo 4

Aislamiento de Células Derivadas de Tejido Cardíaco de Rata

Una rata Sprague-Dawley de 8-12 semanas de edad se anestesió isofluorano, y se abrió la cavidad abdominal. Los intestinos se desplazaron y se seccionó la aorta. Se insertó una aguja de calibre 27 en la vena cava torácica y se perfundió el corazón con 10 ml de PBS, que contenía 5 U/ml de heparina. Se realizó luego la perfusión retrógrada del corazón inyectando 10 ml de PBS, que contenía 5 U/ml de heparina a través de la aorta torácica. Se tuvo cuidado de asegurar que el corazón permaneciese latiendo a lo largo de este procedimiento. Luego, se extrajo el corazón completo de la cavidad torácica y se colocó en tampón de Hank enfriado en hielo. Se combinaron juntos cinco corazones de rata aislados para la disociación y la digestión enzimática.

Los corazones de rata aislados se lavaron luego dos veces con 20 ml de PBS a temperatura ambiente, y se descartó el sobrenadante. Los corazones se picaron manualmente con escalpelos quirúrgicos a temperatura ambiente y el tejido picado se transfirió a tres tubos de 50 ml. El tejido picado se lavó tres veces con 25 ml de PBS y se dio la vuelta al tubo cinco veces.

Las piezas de tejido se transfirieron a tubos cónicos separados de 50 ml (Corning Inc., Corning, NY). El tejido en cada tubo se lavó tres veces añadiendo 30 ml de PBS a temperatura ambiente y se dio la vuelta al tubo cinco veces. El tubo se colocó en posición vertical y se dejó sedimentar el tejido. El sobrenadante se aspiró usando una pipeta de aspiración de 2 ml (Bd falcon, BD Biosciences, San José, CA). Se añadió solución madre de cóctel de enzimas de digestión (2X) al tubo de 50 ml a una proporción de enzima a tejido de 1:1. La concentración final de las enzimas mezcladas fue de 1 U/ml de colagenasa y 5 U/ml de Dispasa II. Los tubos que contenían el tejido y las enzimas se transfirieron a un agitador orbital a 37° C ajustado a 225 rpm (Barnstead Lab, Melrose Park, IL) y se incubaron durante 2,5 horas. Después de la incubación, el tubo se transfirió de vuelta al armario de bioseguridad. La suspensión celular se diluyó llenando los tubos con PBS a temperatura ambiente. Para eliminar cualquier tejido no digerido restante, la suspensión celular se filtró a través de un filtro de células de 100 pm de 8 pulgadas de diámetro (BD Falcon) y luego un filtro de células de 40 pm (BD Falcon) y en seis tubos cónicos de 50 ml (BD Falcon) El tamaño del filtro para CTC de rata fue menor que los usados para células humanas debido a la diferencia de tamaño de miocitos entre ratas y humanos. La suspensión celular se lavó luego mediante centrifugación a 338 x g durante 5 minutos a temperatura ambiente usando una centrífuga Sorvall Legend T (Thermo Fisher Scientific, Inc, Waltham, MA) para sedimentar las células. El sobrenadante se aspiró y los sedimentos celulares se resuspendieron en medio de crecimiento y se agruparon en un tubo de 50 ml en 20 ml de medio de crecimiento, y se retiró una muestra para determinar el rendimiento celular. Los rendimientos típicos obtenidos fueron de 10 millones de células por corazón, con una viabilidad del 70%.

En la preparación de las células derivadas de tejido cardíaco de rata, se usaron soluciones madre de colagenasa de 0.1U/ml o 1U/ml para digerir el tejido cardíaco. Después de 3 horas de incubación, se añadieron 20 ml de medio de crecimiento a cada uno de los tubos, como se describe en el Ejemplo 1. Sin embargo, el tejido cardíaco de rata digerido con 0,1 U/ml de colagenasa no produjo ninguna célula.

La suspensión celular obtenida de la disociación y la digestión enzimática del tejido cardíaco se sembró en matraces de cultivo de tejidos T225 (Corning Inc., Corning, NY), transfiriendo 10 ml a cada matraz. A cada matraz, se le añadieron 35 ml de medio de crecimiento (DMEM, 1.000 mg/l de D-glucosa, 584 mg/l de L-glutamina, y 110 mg/l de piruvato sódico, 10% de suero bovino fetal, Penicilina 50 U/mI, Estreptomicina 50 pg/ml, Invitrogen, Calsbald, CA), llevando el volumen final dentro de cada matraz a 45 ml. El cultivo celular inicial fue durante dos días a 37° C en una atmósfera de 20% de O2 y 5% de CO2. Después del cultivo inicial de dos días, las células rCTC (S) no adherentes se retiraron y se transfirieron a tubos cónicos de 50 ml, y se centrifugaron a 338 x g durante 5 minutos a temperatura ambiente. Se descarta el sobrenadante se descarta y el sedimento celular se resuspende en 20 ml de medio de crecimiento. Se contaron las células y se volvieron a sembrar en matraces T225 a una densidad de siembra de 5.000 células/cm2. Las células rCTC (S) se cultivaron en medio de crecimiento. Después de dos días adicionales en cultivo, se observó que las células rCTC (s) se volvieron adherentes. La población de células adherentes que se formó a partir de las células rCTC (S) que se volvieron adherentes se denominó población de células rCTC (A2) o células rCTC (A2).

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Se recogieron células RCTC (A2) y se sometieron a pases en el día 7 mediante tripsinización, de acuerdo con los métodos descritos en el Ejemplo 2. Las células RCTC (A2) se sembraron a una densidad de 5.000 células/cm2, en matraces T225, con 45 ml de medio de crecimiento en cada matraz. Las células se sometieron a pases cuando las células alcanzaron aproximadamente el 80%. La curva de crecimiento de las células rCTC (A2) observada se muestra en la Figura 7.

Ejemplo 5

Aislamiento de Células Derivadas de Tejido Cardíaco de Ratón que Expresan GFP

Se anestesiaron cinco ratones FVB.Cg-Tg(ACTB-EGFP)B5Nagy/J (ratones GFP, Jackson Lab, Bar Harbor, Maine) a las 8-12 semanas de edad con isofluorano y se abrió la cavidad abdominal. Los intestinos se desplazaron y se seccionó la aorta. Se insertó una aguja de calibre 27 en la vena cava torácica y se perfundió el corazón con 10 ml de PBS, que contenía 5 U/ml de heparina. La perfusión retrógrada del corazón se realizó inyectando 10 ml de PBS, que contenía 5 U/ml de heparina a través de la aorta torácica. Se tuvo cuidado de asegurar que el corazón permaneciese latiendo a lo largo de este procedimiento. Luego, se extrajo el corazón completo de la cavidad torácica y se colocó en tampón de Hank enfriado en hielo.

Se combinaron cinco corazones de ratón GFP aislados para la disociación y la digestión enzimática. Los corazones de ratón aislados se lavaron luego dos veces con 20 ml de PBS a temperatura ambiente, y se descartó el sobrenadante. Los corazones se picaron luego manualmente con escalpelos quirúrgicos a temperatura ambiente y el tejido picado se transfirió a tres tubos de 50 ml. El tejido picado se lavó luego tres veces con 25 ml de PBS y se dio la vuelta al tubo cinco veces. Las piezas de tejido se transfirieron a tubos cónicos de 50 ml separados (Corning Inc., Corning, NY). El tejido en cada tubo se lavó tres veces añadiendo 30 ml de PBS a temperatura ambiente y se dio la vuelta al tubo cinco veces. El tubo se colocó luego en posición vertical y se permitió que el tejido sedimentase. El sobrenadante se aspiró usando una pipeta de aspiración de 2 ml (BD falcon, BD Biosciences, San Jose, CA). Se añadió la solución madre de cóctel de enzimas de digestión (2X) al tubo de 50 ml a una proporción de enzima a tejido de 1:1. La concentración final de las enzimas mezcladas fue de 1 U/ml de Colagenasa y 5 U/ml de Dispasa II. Los tubos que contenían el tejido y las enzimas se transfirieron a un agitador orbital a 37° C ajustado a 225 rpm (Barnstead Lab, Melrose Park, iL) y se incubaron durante 2,5 horas. Después de la incubación, el tubo se transfirió nuevamente al armario bioseguridad. La suspensión celular se diluyó llenando los tubos con PBS a temperatura ambiente. Para eliminar cualquier tejido no digerido restante, la suspensión celular se filtró a través de un filtro de células de 100 pm de 8 pulgadas de diámetro (BD Falcon) y luego un filtro de células de 40 pm (BD Falcon) y 6 tubos cónicos de 50 ml (BD Halcón). El tamaño del filtro para CTC de rata fue menor que los usados para células humanas debido a la diferencia de tamaño de miocitos entre ratas y humanos. La suspensión celular se lavó luego mediante centrifugación a 338 x g durante 5 minutos a temperatura ambiente usando una centrífuga Sorvall Legend T (Thermo Fisher Scientific, Inc, Waltham, MA) para sedimentar las células. Se aspiró el sobrenadante y los sedimentos celulares se resuspendieron en medio de crecimiento y se agruparon en un tubo de 50 ml en 20 ml de medio de crecimiento, y se retiró una muestra para determinar el rendimiento celular. Los rendimientos típicos obtenidos fueron de 10 millones de células por corazón, con una viabilidad del 70%.

Después de la incubación de 3 horas, se añadieron 20 ml de medio de crecimiento como se describe en el Ejemplo a cada uno de los tubos. Para eliminar cualquier tejido no digerido restante, la suspensión celular se filtró a través de un filtro de células de 100 pm de 8 pulgadas de diámetro (BD Falcon) y luego un filtro de células de 40 pm (BD Falcon) y a seis tubos cónicos de 50 ml (BD Falcon) La suspensión celular se lavó centrifugando a 338 x g durante 5 minutos a temperatura ambiente usando una centrífuga Sorvall Legend T (Thermo Fisher Scientific, Inc, Waltham, MA) para sedimentar las células. Se aspiró el sobrenadante y los sedimentos celulares se resuspendieron en medio de crecimiento y se agruparon en un tubo de 50 ml en 20 ml de medio de crecimiento, y se retiró una muestra para determinar el rendimiento celular. Los rendimientos típicos obtenidos fueron de 10 millones de células por corazón con una viabilidad del 70%, en base a 2 aislamientos. La población de mCTC (A2) se usó en estudios posteriores. Las células se expandieron durante dos pases antes del estudio.

Ejemplo 6

Crioconservación Celular, Viabilidad y Recuperación

Se prepararon células derivadas de tejido cardíaco de rata y humano de la presente invención para la crioconservación. Brevemente, las poblaciones de células o hCTC (A3) o rCTC (A2) se obtuvieron expandiendo las células crioconservadas hCTC (A3) y rCTC (A2) en pases anteriores. Las células se sembraron a 3.000 células/cm2, se incubaron a 37° C, bajo 20% de O2 atmosférico , y se sometieron a pases 7 días después en cultivo con medio de reemplazo en el día 3 en cultivo. Fueron recogidas a 12-14 PDL.

Las células se tripsinizaron y resuspendieron para crioconservación en CRYOSTOR D-LITE™ (Biolife Solutions, Inc, Bothell, WA), que contenía 2% de DMSO, se crioconservaron en Nalgene, polipropileno de 2 ml,

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estéril, rosca interna con Crioviales de tapa de rosca (Nalgne Nunc, Rochester, NY), usando un congelador programare Integra 750 Plus (Planer, Middlesex, Reino Unido) con software DeltaT. Las células y las soluciones estaban a temperatura ambiente antes de cargarlas en el congelador programable, que se mantuvo a 15° C. Una sonda de temperatura de muestra se colocó en un vial de tampón de congelación. Se usó el siguiente programa para la crioconservación:

Paso N°

Velocidad (°C/min) Temperatura Final Activador

1

-1 -6 Muestra

2

-25 -65 Cámara

3

+10 -19 Cámara

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+2.16 -14 Cámara

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-10 -140 Cámara

Cuando la temperatura alcanzó -140° C, las muestras se transfirieron a un tanque de nitrógeno líquido para su almacenamiento.

Viabilidad y recuperación de las células derivadas de tejido cardíaco humano de la presente invención después de la crioconservación: Después de un mes de almacenamiento en un tanque de nitrógeno líquido (140° C), se descongeló un vial de células hCTC (A3) en CRYOSTOR D- LITE™ a 1 millón de células/vial a temperatura ambiente. El vial se transfirió luego al armario de bioseguridad. Se transfirió una muestra de 50 pl (que contenía 0,5 millones de células) a un tubo de microcentrífuga de 1,8 ml que contenía 50 pl de solución de azul de tripano. Se tomaron recuentos duplicados de esta preparación de células transfiriendo 10 pl a un hemacitómetro y se contaron. Estos recuentos determinaron la recuperación y viabilidad anteriores a la aguja. Para determinar la viabilidad y recuperación celular después del pase de la aguja sin incubación a temperatura ambiente (para después de la aguja), se extrajeron 100 pl de suspensión celular en una jeringuilla de tuberculina de 1 ml (BD N° cat. 309602) mediante una aguja de calibre 30 (BD N° cat. 305106) . La muestra se pasó luego de nuevo a través de la aguja y a un tubo de microcentrífuga de 1,8 ml. A este tubo, se añadieron 100 pl de azul de tripano y se realizaron recuentos duplicados como se ha descrito anteriormente. Este procedimiento se realizó después de tiempos de incubación de 10 minutos, 20 minutos, 30 minutos a temperatura ambiente, y también a los 30 minutos sin pase a través de la aguja.

Después de un mes de almacenamiento, se determinó que la viabilidad de las células hCTC (A3) era del 94% después de la descongelación. La recuperación de las células fue de 0,54 millones, similar al número de células original antes de la crioconservación, como se muestra en la Tabla 3 y la Figura 8.

La viabilidad de las células derivadas de tejido cardíaco humano probadas después de pasar a través de una aguja de administración de aguja de calibre 30 era superior al 90% después de 30 minutos de incubación a temperatura ambiente, que es el tiempo requerido para la administración celular durante el procedimiento de infarto de rata. La recuperación fue similar al número de células antes del pase de la aguja, como se muestra en la Tabla 3 y en la Figura 8.

Las células hCTC (A3) se expandieron a PDL 12 y se acumularon para futuros estudios in vivo. Las muestras de las células almacenadas se examinaron para cualquier anormalidad de cariotipo. Los resultados se resumen en la Tabla 4.

Biocompatibilidad de CTC de rata: Se descongeló un vial de células rCTC (A2) en CRYOSTOR D-LITE™ a 2 millones de células/vial como se ha descrito anteriormente. El vial se transfirió luego al armario de bioseguridad. Se transfirió una muestra de 50 pl a un tubo de microcentrífuga de 1,8 ml que contenía 50 pl de solución de azul de tripano. Se tomaron recuentos por triplicado de esta preparación de células transfiriendo 10 pl a un hemacitómetro y se contaron. Para determinar el valor de referencia para el rendimiento y la viabilidad celulares después de la aguja, se realizaron recuentos celulares tanto antes del pase de la aguja como después del pase de la aguja, con un tiempo de incubación de 0, 10, 20, 30 minutos. En cada punto temporal, se extrajeron 100 pl de suspensión celular en una jeringuilla de tuberculina de 1 ml (BD N° cat. 309602) a través de una aguja de calibre 30 (BD N° cat. 305106). La muestra se pasó de nuevo a través de la aguja y a un tubo de microcentrífuga de 1,8 ml. A este tubo, se añadieron 100 pl de azul de tripano y se realizaron recuentos por triplicado como se ha descrito anteriormente. Este procedimiento se realizó después de tiempos de incubación de 10 minutos, 20 minutos y 30 minutos a temperatura ambiente para simular el procedimiento potencial de administración celular en el modelo de infarto agudo de miocardio de rata.

Después de un mes de almacenamiento en nitrógeno líquido, la viabilidad de las células rCTC (A2) después de la descongelación fue del 94%. La recuperación de células fue de 1,4 millones/ml, alrededor del 70% de la

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concentración de células original (2 millones/ml). La viabilidad de las células rCTC (A2) después de pases a través de la aguja de inyección fue superior al 90% después de 30 minutos de incubación a temperatura ambiente, que es el marco temporal requerido para la inyección durante el procedimiento de infarto de rata. La recuperación fue similar a la anterior de pases de aguja, como se muestra en la Tabla 5 y la Figura 9.

Ejemplo 7

Caracterización de las Células Derivadas de Tejido Cardíaco de la Presente Invención

Se determinó la expresión de proteínas de la superficie celular en poblaciones de células derivadas de tejido cardíaco, obtenidas mediante los procedimientos de la presente invención de tejido cardíaco de rata y humano. Los marcadores de superficie celular probados se muestran en la Tabla 6. Las poblaciones de fibroblastos dérmicos humanos se incluyeron como un control.

Más del 90% de la población de células hCTC (A3) expresaron CD59, CD105, CD54 y CD90 (analizados por separado). Aproximadamente el 30% de la población de células hCTC (A3) expresaron CD34, un marcador de células madre para células progenitoras endoteliales. Además, aproximadamente el 30% de las hCTC (A3) mostró positividad para c-Kit. Por el contrario, menos del 5% de la población de células hCTC (A3) expresaron CD31, CD45 o CD 16. Ver las Figuras 10, 11 y la Tabla 7. Las poblaciones de células hCTC (A1), hCTC (A1) y hCTC (S) también mostraron una expresión de marcadores de superficie celular similar. Ver la Tabla 8. Además, se observaron resultados similares en una población de células rCTC (A3). Ver la Figura 12. LA CD54, Molécula de Adherencia Intercelular-1 (ICAM), se une a las integrinas en los leucocitos y media la transmigración de los leucocitos a través de la barrera vascular hacia los tejidos (Yang L et al, Blood 106(2): 584-92, julio de 2005). Por tanto, la expresión de superficie celular de esta molécula puede facilitar la translocación de hCTC (A3) desde al vasculatura al miocardio, cuando se administra en la arteria coronaria.

Ejemplo 8

Análisis de Expresión Génica de Células Derivadas de Tejido Cardíaco

Se recogieron muestras de ARN de las siguientes poblaciones de células derivadas de tejido cardiaco: hCTC (Al 1, hCTC (A2), hCTC (A3), rCTC (A2) y mCTC (A2) (se recogió ARN de un millón de células de cada población de células).

Se determinó la expresión de un panel de genes mediante PCR en tiempo real en las muestras recogidas. La reacción de PCR en tiempo real se inició de acuerdo con la mezcla de reacción definida en la Tabla 9, y los cebadores para los genes probados se muestran en la Tabla 10. Se examinaron dos categorías de genes: genes específicos cardiacos y genes de células madre. Los genes específicos cardíacos se separaron adicionalmente en marcadores diferenciados como la cadena pesada de miosina (MyHC) y marcadores cardíacos indiferenciados como GATA-4 y Nkx2.5. Los genes de células madre se categorizaron adicionalmente como el marcador de células madre, c-kit; marcador cardíaco embrionario islote-1 y marcador de división celular, telomerasa. Se utilizó un gen constitutivo - Gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) como punto de referencia para normalizar los niveles de expresión en cada muestra.

Se descubrió que la expresión de los genes probados era similar en poblaciones de hCTC (A1), hCTC (A2) y hCTC (A3). Ver Tabla 10. El marcador de células madre c-kit se expresó (Ct: 27-29), mientras que la expresión de telomerasa e islote-1 no fue detectable en las poblaciones de hCTC (A1), hCTC (A2) y hCTC (A3) : No se detectó ningún mensaje para los genes con un valor de Ct de 40. Los marcadores cardíacos GATA 4 y Nkx2.5 se expresaron a un valor de CT de 25 y 32-34 respectivamente, en las poblaciones de hCTC (A1), hCTC (A2), y hCTC (A3), mientras que no se observó ni la expresión de la cadena pesada de la miosina ni de actina cardíaca en ninguna de las poblaciones de hCTC (A1), hCTC (A2) y hCTC (A3). Ver Tabla 10.

Estos datos sugieren que las células derivadas de tejido cardiaco de la presente invención son "similares a progenitoras", concretamente, que la proporción de marcador de célula progenitora frente a expresión de marcador de células diferenciada era mayor de 50.000 en las poblaciones de hCTC (A1), hCTC (A2), y hCTC (A3), en comparación con cardiomiocitos (1%) y células de fibroblastos humanos (12%). Ver Tabla 10, Tabla 11 y Figura 13.

Las células rCTC (A2) también expresaron genes del linaje cardíaco como GATA-4 (Ct: 28) y Nkx2.5 (Ct: 27). Sin embargo, a diferencia de las células derivadas de tejido cardíaco humano, la expresión de Nkx2.5 fue a un nivel más alto en células derivadas de tejido cardíaco de rata que la observada en células derivadas de tejido cardíaco humano. Los marcadores c-kit, islote-1 y telomerasa también se expresaron en células rCTC (A2). Ver Tabla 12. Células derivadas de tejido cardiaco similares obtenidas de corazón de rata, células derivadas de tejido cardíaco de ratón también expresaron Nkx2.5, c-kit, Islote-1 y telomerasa. Ver Tabla 13.

Ejemplo 9

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Las Células Derivadas de Tejido Cardíaco pueden Diferenciarse en Cardiomiocitos

Se cultivaron primero células mCTC (A2) (200K) obtenidas de acuerdo con los métodos descritos en el Ejemplo 5 en medio de crecimiento durante 2 días y luego se recogieron mediante tripsinización y se contaron antes de mezclarlas con miocitos cardíacos de rata (1 millón, N° de Cat. R357, Cell Application, Inc. Austin TX), en una proporción de 1:5. Los miocitos cardíacos de rata estuvieron en cultivo durante 5 días antes de ser tripsinizados y contados, luego se mezclaron con células mCTC (A2). La mezcla de células se distribuyó en placas en una placa de 6 pocillos tratada con laminina (N° de Cat. 354595 BD Biosciences, NJ) durante 5 días. Se probó la capacidad de las células mCTC (A2) para diferenciarse incubando la mezcla de células en un medio de cultivo de tejidos que comprendía DMEM-F12(1:1) + 10% de suero de caballo (Sigma), referido en lo sucesivo como medio de diferenciación. Las células se incubaron en medio de diferenciación durante 5 días en una atmósfera de 20% de O2, a 37° C. Después de este tiempo, se recogieron las células, y se extrajo el ARN. Se probó el ARN total de cocultivos de células mCTC (A2) y cardiomiocitos de rata y de cultivos paralelos de células mCTC (A2) para la expresión génica de la cadena pesada de miosina murina. Se usaron los siguientes cebadores de la cadena pesada de miosina murina:

Tipo

Cebador Directo Cebador Inverso

Nombre

MHC-ratón-F

MHC-ratón-R

Sonda

MHC-ratón-P

Secuencia

GAAACACCTGAAGAATTCTCAAGCT

TTGGCATGGACAGCATCATC

ACTTGAAGGACACCCAGC

El cocultivo de células mCTC (A2) con cardiomiocitos de rata dio como resultado un aumento de 9 veces en la expresión de la cadena pesada de miosina murina, en comparación con cultivos paralelos de células mCTC (A2) solas. Ver la Figura 14. Estos datos sugieren que las células derivadas cardiacas de la presente invención son capaces de diferenciarse en cardiomiocitos, y el cocultivo de las células de la presente invención con cardiomiocitos puede potenciar la diferenciación.

Ejemplo 10

Aislamiento, Expansión y Caracterización de Células Derivadas de Tejido Cardíaco Porcino

Se obtuvo un único corazón de un mini cerdo Gottingen de 8-12 semanas de edad en cada aislamiento de Marshall Bioresources (North Rose, NY). El corazón se perfundió para agotar la sangre antes de la recogida y el órgano completo se sumergió en DMEM + 10% de FBS en hielo durante el envío. El tiempo desde la obtención hasta la digestión del tejido fue de entre 48-96 horas. Se realizaron cuatro aislamientos separados de acuerdo con los procedimientos descritos a continuación.

Los corazones se cortaron en trozos pequeños (aproximadamente de 2 a 3 cm3 de tamaño). Estos trozos de tejido se homogeneizaron mediante homogeneización mecánica, como se describe en el Ejemplo 1 para producir fragmentos de tejido cardíaco de menos de 1 mm3 de tamaño, y luego se transfirieron a un tubo cónico de 250 ml (Corning Inc., Corning, NY) y se lavaron tres veces. La solución madre de cóctel de enzimas de digestión (2X) se añadió al tubo de 250 ml a una proporción de enzima a tejido de 1:1. La concentración final de enzimas fue de 1U/ml de Colagenasa y 5 U/ml de Dispasa II. Los tubos que contenían el tejido y las enzimas se transfirieron a un agitador orbital a 37° C ajustado a 225 rpm (Barnstead Lab, Melrose Park, IL) y se incubaron durante 2,5 horas. Después de la incubación, para eliminar cualquier de tejido no digerido restante, la suspensión celular se filtró a través de un tamiz de prueba estándar de 250 pm de 8 pulgadas de diámetro para eliminar el tejido conectivo no digerido y el tejido adiposo (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) y luego se filtró adicionalmente a través de filtros de células de 100 pm para eliminar los cardiomiocitos (BD Falcon). El medio, que contenía las células que pasaron a través del filtro se transfirió a múltiples tubos cónicos de 50 ml (BD Falcon). Luego se lavó la suspensión celular. Después del lavado, el sedimento se resuspendió en 20 ml de tampón de lisis ACK (Lonza, Walkersville, MD) y se incubó durante 10 minutos a temperatura ambiente para lisar cualquier glóbulo rojo restante. Después de la incubación, la suspensión celular se lavó dos veces más con 40 ml de PBS a temperatura ambiente. Después de la centrifugación final, el sedimento se resuspendió en 20 ml de medio de crecimiento a temperatura ambiente y se contó. Después de la disociación y la digestión enzimática, el rendimiento de las células fue típicamente de 27 millones de células, en un volumen de 20 ml. La viabilidad era típicamente del 80%.

La suspensión celular obtenida de la disociación y la digestión enzimática se añadió a matraces de cultivo de tejidos de T225 (Corning Inc, Corning, NY). Se añadieron 10 ml de suspensión celular a cada matraz, que contenía 50 ml de medio de crecimiento (DMEM, 1.000 mg/l de D-glucosa, 584 mg/l de L-glutamina y 110 mg/l de piruvato de sodio, 10% de suero bovino fetal, Penicilina 50U/ml, estreptomicina 50 pg/ml, Invitrogen, Calsbald, CA). El volumen final del cultivo inicial fue de 60 ml. Las células se incubaron a 37° C en una atmósfera que comprendía 20% de O2 y 5% de CO2, durante 2 días. Después de este tiempo, se observó un cultivo celular heterogéneo. Se observaron células de fase brillante no adherentes (referidas en la presente como células pCTC

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(S)), y se observaron células adherentes (referidas en la presente como células pCTC (A1)).

La disociación y la digestión enzimática del corazón porcino de acuerdo con los métodos de la presente invención, y la posterior expansión de las células dieron como resultado las siguientes poblaciones celulares: células pCTC (S), pCTC (A1), pCTC (A2) y pCTC (A3). La morfología de las células derivadas de tejido cardíaco porcino de la presente invención fue similar a las células derivadas de tejido cardíaco humano de la presente invención. La población de pCTC (A3) se seleccionó para una caracterización adicional y posteriores estudios in vivo.

Las células pCTC (S) y las células pCTC (A1) se expandieron inicialmente en cultivo como una mezcla en matraces T225. Cada matraz se llenó con medio de crecimiento nuevo a 60 ml por matraz, y las células se incubaron a 37° C, 20% de O2, durante 2 días. Después de este tiempo, la mayoría de las células formaron una población de células adherentes, referida en la presente como población pCTC (A3), o células pCTC (A3). Después de 2 días en cultivo, mediante observación visual, el número de células no adherentes disminuyó, de tal manera que las células pCTC (A3) se volvieron una población homogénea de células. De media, esto llevó 2 días. Las células pCTC (A3) se sometieron a pases una vez que las células alcanzaron el 90-100% de confluencia y se volvieron a sembrar a 3000 células/cm2. La expansión de las células pCTC (A3) en cultivo excedió el crecimiento de las células derivadas de tejido cardíaco humano. Las células pCTC (A3) crecieron a una confluencia superior al 90% en 3-4 días. Ver la Figura 15 para la curva de crecimiento observada para las células pCTC (A3) de la presente invención.

Las células pCTC (A3) no expresaron la cadena pesada de telomerasa o miosina, como se determinó mediante PCR en tiempo real. Sin embargo, las células pCTC (A3) expresaron GATA-4. La expresión de Nkx2.5 no se examinó en las células derivadas de tejido cardíaco porcino de la presente invención. La tinción individual de marcadores de superficie celular demostró que más del 90% de la población de células pCTC (A3) era positiva para la expresión de CDl05 y CD90. Menos del 5% de las células pCTC (A3) expresaron CD45, CD16 o marcador celular endotelial porcino (N° de Cat. MCA1752, Serotec). Este marcador es una molécula de clase II de complejo de histocompatibilidad, que se ha identificado en el endotelio capilar en una amplia gama de tejidos, mostrado por Wilson et al. (Immunology, mayo de 1996; 88(1):98-103). Ver la Figura 16 y la Tabla 14. No se examinaron otras poblaciones de células, como las células pCTC (A1) o pCTC (A2).

Ejemplo 11

Tratamiento de Infarto Agudo de Miocardio con las Células Derivadas de Tejido Cardíaco de la Presente Invención

Modelo de Infarto de Miocardio Agudo de Rata: El modelo de infarto de miocardio de rata se ha usado con éxito para probar la eficacia de agentes como ACEI y betabloqueantes como terapias para IAM humano. En todas las etapas del experimento, los animales fueron tratados de acuerdo con las directrices institucionales locales.

El modelo de infarto de miocardio de rata está bien establecido para simular la fisiopatología humana después de un infarto de miocardio y el deterioro adicional de la función cardíaca después del infarto (Pfeffer M. A. et al, Circ Res 1979; 44: 503-12; Litwin S. E. et al, Circulation 1994; 89: 345-54; Hodsman G. P. et al Circulation 1988; 78: 376-81).

Se anestesiaron ratas desnudas hembra (peso, 250 a 300 g; Shizuoka Agricultural Cooperation Association, Shizuoka, Japón) con ketamina y xilazina (60 y 10 mg/kg IP, respectivamente), y se aplicó respiración a presión positiva a través de un tubo endotraqueal. El tórax se abrió en el cuarto espacio intercostal izquierdo, se exteriorizó el corazón y se perforó el pericardio. Posteriormente, se sostuvo el corazón con fórceps, y se anudo una sutura 6-0 Proline debajo de la arteria coronaria descendente anterior izquierda, aproximadamente a 2 mm de su origen. Se indujo IAM en el corazón tirando de la ligadura, ocluyendo la arteria permanentemente. La decoloración del miocardio infartado se observó visualmente. Se inyectó una suspensión de células derivadas de tejido cardíaco, o vehículo en la zona del borde del área descolorida aproximadamente 20 minutos después de inducir el infarto, como se describe a continuación en administración celular. Después de la inyección, se cerró el tórax, y se devolvieron las ratas a sus jaulas. En cada momento especificado después de la cirugía, las ratas se sacrificaron por extirpación del corazón bajo anestesia.

Se descongelaron en hielo poblaciones crioconservadas de células hCTC (A3) y rCTC (A2) que estaban almacenadas a -80° C, y se determinó su viabilidad antes de la administración a los animales de prueba. La viabilidad celular fue superior al 95% en todas las poblaciones celulares empleadas en esta investigación.

Las células se administraron a los animales de prueba 20 minutos después de la ligadura de la arteria coronaria descendente anterior izquierda. Se inyectaron poblaciones crioconservadas de células hCTC (A3) en la zona del borde del área decolorada. Los animales de prueba recibieron una de las siguientes dosis objetivo en 120 |jl de Cryostor D-lite (15 animales por dosis objetivo): 1x104 células (dosis baja), células 1x105 (dosis media) o 1x106 células (dosis alta). En paralelo, se inyectaron poblaciones crioconservadas de células rCTC (A2) en la zona del borde del área decolorada. Los animales de prueba recibieron una de las siguientes dosis objetivo en 120 jl de

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Cryostor D-lite (15 animales por dosis objetivo): 1x106 células.

En todos los animales de prueba, las células crioconservadas estaban en un volumen total de 120 jl de medio de crioconservación. Las células de una dosis objetivo se inyectaron en cinco sitios separados alrededor del área decolorada del corazón. También se incluyó en el estudio un grupo de control, que recibió una inyección de medio de crioconservación (120jl).

Se realizó una ecocardiografía transtorácica (SONOS 5500, Philips Medical Systems) para evaluar la función del ventrículo izquierdo (VI) a los 5 y 28 días después de la inducción del IAM. Las ratas se anestesiaron con ketamina y xilazina mientras se realizaba una ecocardiografía. Se midieron las dimensiones del VI telediastólico y telesistólico (LVEDD y LVESD, respectivamente) y el acortamiento fraccional (FS) en el nivel medio del músculo papilar. El FS refleja el efecto de bombeo del corazón midiendo la diferencia porcentual entre el diámetro sistólico (final de la contracción) y el diámetro diastólico (final del llenado). La puntuación de movimiento de la pared regional (RWMS) se evaluó según los criterios publicados: Puntuación 1: movimiento de la pared y engrosamiento normales; Puntuación 2: movimiento de la pared y engrosamiento reducidos; Puntuación 3: ausencia de movimiento de la pared y engrosamiento; Puntuación 4: movimiento hacia afuera o abultamiento. (Ver por ejemplo, Schiller, Shah et al. (Journal of American Society of Echocardiography vol 2: 358-367; 1989)).

Brevemente, se obtuvieron diecisiete imágenes seccionales en serie de un ecocardiograma y cada sección recibió una puntuación de movimiento de la pared en base a las definiciones en la Tabla 15. Se usó una suma de la puntuación de los 17 segmentos como indicación de la contractilidad de la pared. La RWMS es una medida directa de la contracción. Una reducción en la RWMS indica una mejora en la contracción y refleja una función mejorada del músculo cardíaco. La Tabla 15 describe los criterios para cada puntuación.

La tasa de mortalidad observada fue del 16% en el estudio. No hubo diferencias significativas para la mortalidad entre los grupos como se muestra en la Tabla 16.

Resultados

La Figura 17 se reproduce del Atlas of Heart Failure by Pffeffer et al (1999), demuestra los cambios patológicos observados en el corazón, después del infarto. El modelo de infarto agudo de miocardio de rata se ha establecido para simular IAM e insuficiencia cardíaca crónica en pacientes humanos. Después del infarto, como en humanos, el ventrículo sufre una serie de alteraciones fisiopatológicas, comenzando con el reemplazo del miocardio por tejido fibrótico en el área del infarto. La contracción y la presión en el ventrículo provocan la extensión del infarto, gradualmente la expansión de la cámara ventricular y, finalmente da como resultado la remodelación del ventrículo izquierdo, demostrado por el cambio de geometría de la cámara de cambios elípticos a globulares, y celulares como hipertrofia de miocitos.

Las poblaciones crioconservadas de células hCTC (A3) mejoraron la función cardíaca global y la contractilidad cardíaca, como se mide por acortamiento fraccional (FS) y puntuación del movimiento de la pared regional (RWMS), respectivamente. Se observaron mejoras en la función cardíaca global y la contractilidad cardíaca en todas las dosis objetivo de células hCTC (A3). Ver las Figuras 18 y 19.

Cinco días después de la administración, los animales dosificados con células rCTC (A2), o la dosis objetivo de 1x106 células hCTC (A3) demostraron un FS del 3,3% (hCTC (A3)) y 3,8% (rCTC (A2)) menos que los animales tratados con vehículo. Cuatro semanas después de la administración celular, se mejoró el valor absoluto del acortamiento fraccional (calculado restando el valor de FS observado el día cinco del valor de FS observado el día 28). Ver la Figura 18 y las Tablas 17 y 18. El valor absoluto de FS en animales tratados con 1 x 104 células hCTC (A3) fue de 9,687 ± 1,329% (n = 12, P menor que 0,001). El valor absoluto de FS en animales tratados con 1 x

105 células hCTC (A3) fue de 10,9 ± 1,6% (n = 11, P <0,001). El valor absoluto de FS en animales tratados con 1 x

106 células hCTC (A3) fue de 12,9 ± 1,8% (n = 10, P menor que 0.001). Varias razones posibles pueden explicar la ineficacia de las células rCTC en el modelo experimental usado en la presente invención. Aunque las ratas desnudas están inmunodeprimidas, no se eliminó completamente su rechazo a las células extrañas. En el estudio actual, la rCTC puede ser más susceptible a rechazo inmune por ratas desnudas que las células humanas. Su retención en el miocardio se comprometió debido al rechazo inmune y, por tanto, su efecto sobre el miocardio puede verse afectado.

También se observó una reducción de la RWMS en animales tratados con células hCTC (A3), cuatro semanas después de la administración celular. La puntuación RWMS en animales tratados con 1 x 104 células hCTC (A3) fue de 24,42 ± 1,4 a los 5 días después del infarto y la administración celular, pero se redujo a 21,08 ± 1,7 (n = 12, P menor de 0,001) a las 4 semanas después del infarto y administración celular. La puntuación RWMS en animales tratados con 1 x 105 células hCTC (A3) fue de 25,58 ± 1,4 a los 5 días después del infarto y la administración celular, y se redujo a 21,08 ± 1,9 (n = 11, P menor de 0.001). La puntuación RWMS en animales tratados con 1 x 106 células hCTC (A3) fue de 25,91 ± 1,6 a los 5 días después del infarto y la administración celular, y se redujo a 20 ± 1,7 (n = 10, P menor de 0,001) a las 4 semanas después del infarto y la administración celular. Aunque el tratamiento con rCTC (A2) no pareció reducir el acortamiento fraccional, se observó una ligera

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reducción de la RWMS. La puntuación RWMS en animales tratados con 1 x 106 células rCTC (A2) fue de 25,29 ± 1,9 a los 5 días después del infarto y la administración celular, y se redujo a 23,86 ± 2,3 (n=12, P=0,09) a las cuatro semanas después de la administración celular. Vea la Figura 19 y las Tablas 17 y 19. Los datos observados en animales tratados con rCTC (A2) sugieren que aunque las células rCTC (A2) no mejoraron la función global, mejoraron la contractilidad cardíaca, como se muestra por la RWMS.

Por otro lado, los datos observados en animales tratados con células hCTC (A3) sugieren que las células derivadas de tejido cardíaco humano mejoraron la función cardíaca global y la contractilidad cardíaca.

También se previno la remodelación cardíaca en animales que recibieron células hCTC (A3). La remodelación cardíaca se refiere a los cambios en el tamaño, forma y función del corazón que se observan después de lesiones isquémicas como, por ejemplo, infarto de miocardio. Los cambios observados incluyen la muerte celular del miocardio y un adelgazamiento desproporcionado de la pared de la cámara en la zona del infarto. La pared delgada de la cámara no puede soportar la presión y la carga de volumen en el corazón. Como resultado, hay dilatación de la cámara queque surge de la región del infarto, esparciéndose hacia el músculo cardíaco no infartado que compensa. Con el tiempo, a medida que el corazón experimenta una dilatación continua, el ventrículo aumenta de tamaño y se vuelve menos elíptico y de forma más esférica como lo demuestra la dimensión aumentada en la ecocardiografía. Los aumentos en la masa y el volumen ventricular afectan adversamente la función cardíaca incluso más. El aumento en el volumen al final de la diástole eventualmente se ve deteriora con la capacidad del corazón para relajarse entre contracciones, lo que da como resultado una disminución adicional de la función. La gravedad del agrandamiento del ventrículo determina el pronóstico de los pacientes. La ampliación de la cámara se correlacionó con esperanza de vida acortada en pacientes con insuficiencia cardíaca.

El grado de remodelado cardíaco en el ventrículo izquierdo de animales después de la inducción de un infarto agudo de miocardio se determinó midiendo la dimensión del ventrículo izquierdo al final de la diástole (dimensión diastólica final del ventrículo izquierdo, LVEDD) y sístole (dimensión sistólica final del ventrículo izquierdo, LVESD) mediante ecocardiografía. Un aumento de LVEDD y LVESD denota un aumento en la gravedad de la remodelación cardíaca. Por el contrario, una reducción en los valores observados de LVEDD y LVESD denota una reversión de la remodelación cardíaca, o una mejora en la función cardíaca.

En animales tratados con vehículo, el LVEDD aumentó de 0,74 ± 0,020 mm cinco días después de la administración celular a 0,83 ± 0,019 mm a las 4 semanas después de la administración celular. Esto correspondió a un aumento relativo del 12% [100% (D28-D5)/D5] en el ventrículo izquierdo. En animales tratados con células rCTC (A2), la LVEDD aumentó de 0,69 ± 0,022 mm cinco días después de la administración celular a 0,80 ± 0,018 mm a las 4 semanas después de la administración celular. En animales tratados con 1 x 104 células hCTC (A3), la LVEDD aumentó de 0,70 ± 0,012 mm a los cinco días después de la administración celular a 0,77 ± 0,022 mm a las 4 semanas después de la administración celular.

En animales tratados con 1 x 105 células hCTC (A3), la LVEDD no pareció cambiar significativamente, en donde la LVEDD fue de 0,73 ± 0,012 mm cinco días después de la administración de la célula, y 0,74 ± 0,023 mm a las 4 semanas después de la administración celular, un cambio relativo del 1,4% (p menor de 0,01, en comparación con el grupo de vehículo). De manera similar, los animales tratados con 1 x 106 células hCTC (A3), la LVEDD tampoco pareció cambiar significativamente, en donde la LVEDD fue de 0,76 ± 0,011 mm cinco días después de la administración celular, y de 0,71 ± 0,028 mm a las 4 semanas después de la administración celular un cambio relativo reducido del 6,6%desde cinco días después de la administración celular (p menor de 0,001, en comparación con el grupo de vehículo). Estos datos sugieren que la dosis de 1 x 105 hCTC (A3) y de 1 x 106 de hCTC (A3) evitaron la remodelación cardíaca. Ver la Figura 23, la Tabla 17 y la Tabla 20. El cambio relativo en LVEDD (100% (28D-5D)/5D) se muestra en la Tabla 21 y en las Figuras 20-21.

En animales tratados con 1 x 104 células hCTC (A3), la LVEDD fue de 0,71 ± 0,045 mm el día 5 y de 0,78 ± 0,079 mm el día 28. En animales tratados con 1 x 106 células rCTC (A2), la LVEDD fue de 0,70 ± 0,083 mm en el día 5 y de 0,80 ± 0,071 mm en el día 28. No hubo una diferencia significativa de los animales tratados con vehículo en la LVEDD, lo que sugiere que no hubo mejora en la remodelación en comparación con el grupo de vehículo. Ver la Tabla 17 y la Figura 23.

Los animales tratados con células derivadas de tejido cardíaco humano también demostraron una reducción en la dimensión sistólica final del ventrículo izquierdo (LVESD). La LVESD mide el tamaño del ventrículo al final de la contracción. Este parámetro no solo representa la remodelación, sino que también indica la contractilidad del músculo cardíaco. Una reducción en la LVESD corresponde a un aumento en la fuerza de la contracción.

La LVESD aumento del día 5 al día 28 en los animales tratados con vehículo. La LVESD se mantuvo al mismo nivel en animales tratados con 1 x 104 células hCTC (A3) (0,56 ± 0,05 cm en el día 5 y 0,54 ± 0,08 cm en el día 28). La LVESD se redujo en animales tratados con 1 x 105 (0,58 ± 0,04 cm en el día 5 y 0,51 ± 0,08 cm en el día 28) y en 1 x 106 células hCTC (A3) 0,62 ± 0,05 cm en el día 5 y 0,48 ± 0,09 cm en el día 28). Ver la Figura 22 y la Tabla 22. Los datos funcionales de los cuatro parámetros medidos mediante ecocardiografía de cada animal en

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cada punto temporal se muestran en la Figura 23. Los cambios de tendencia entre el día 5 y el día 28 son consistentes dentro de cada grupo.

El análisis de la dosis objetivo de la administración de células hCTC (A3) y la función cardíaca, como se determina por la función global medida por el acortamiento fraccional (FS) demostró una correlación (p=0,001, n=35) entre la dosis celular y la mejora funcional. Ver la Figura 24.

De manera similar, se observó el análisis de la dosis objetivo de la administración de células hCTC (A3) y remodelación cardíaca, como se determina por el cambio absoluto de LVEDD del día 5 al día 28 (28D-5D) (p=0,0002, n=35). Ver la Figura 25. Se estableció una correlación y parece ser exponencial, en lugar de lineal.

Ejemplo 12

Retención de las Células Derivadas de Tejido Cardíaco Humano en el Modelo de Rata de Infarto de Miocardio Agudo

Para comprender mejor los mecanismos y los beneficios biológicos de las células derivadas de tejido cardiaco humano como una terapia para miocardio dañado, se tomaron muestras de tejido de los corazones de los animales tratados con células cardíacas humanas en el ejemplo anterior, para determinar la retención de células derivadas de tejido cardíaco humano en animales cuatro semanas después de la administración.

Se retiraron los corazones de los animales tratados con células derivadas de tejido cardíaco humano en el ejemplo anterior se recogieron cuatro semanas después de la administración celular. La retención celular se determinó mediante histología (n=6 por dosis de células) y PCR cuantitativa en tiempo real (n=4 por dosis de células).

Para establecer los valores de retención celular de referencia, se administraron células hCTC (A3) a animales de prueba 20 minutos después de la ligadura de la arteria coronaria descendente anterior izquierda. Se inyectaron poblaciones crioconservadas de células hCTC (A3) en la zona del borde del área decolorada en cinco sitios de inyección separados por animal. Se administró a los animales dosis objetivo de 1 x 104, 1 x 105, o 1 x 106 células. Los animales se sacrificaron a los 0, 1, 3 y 7 días, y los corazones se retiraron para análisis de retención celular mediante PCR cuantitativa en tiempo real (n=3 por grupo de tratamiento).

En los casos en que se tomaron muestras para la PCR cuantitativa en tiempo real, se procesaron los tejidos del corazón para obtener el ARN total. Se estimó la retención de células humanas, en base a la cantidad de ARN humano detectado en las muestras de corazón.

Se detectó ARN de células derivadas de tejido cardíaco humano a las 4 semanas después de la administración celular en animales tratados con células hCTC (A3). La retención celular parecía ser dependiente de la dosis, con los animales que recibieron 1 x 106 células HCTC (A3) demostrando más retención celular que los animales que recibieron 1 x 105 células HCTC (A3). En animales que recibieron 1 x 104 células hCTC (A3), se estimó que la retención celular estaba en niveles de fondo, en base a la cantidad de ARN humano detectado en las muestras.

Se detectó ARN humano en corazones de animales sacrificados a los 0, 1 día, 3 días y 7 días después de la administración celular. La retención celular cayó rápidamente inmediatamente después de la administración, y disminuyó aún más a las 24 horas después de la administración celular. Como se muestra en la Figura 26, paneles c y d, inmediatamente después de la administración celular, solo quedaba aproximadamente el 8% de la dosis objetivo, como se estima por la cantidad de ARN humano detectado en las muestras de corazón. Utilizando el punto temporal 0 como el valor de referencia, el nivel de retención celular disminuyó aún más, cuando se determinó a las 24 horas posteriores a la administración celular, hasta aproximadamente el 10% del punto temporal 0. El nivel de retención celular permaneció en el mismo nivel el día 7 después de la administración celular.

Se observó una correlación entre la retención de células derivadas de tejido cardíaco humano y la prevención de la remodelación cardíaca. En animales que recibieron células derivadas de tejido cardíaco humano, el cambio en la LVEDD (D28-D5) se correlacionó con la retención de células derivadas de tejido cardíaco humano. Como se puede ver en la Figura 27, la tendencia de la correlación es significativa con un valor de p de 0,023 y un valor de r2 del 41%. En un estudio farmacológico clínico (Lilian Murray et al en Br J Clin Pharmacol. 1998; 45(6): 559-566) de Enalapril, un medicamento bien recetado para la hipertensión, se observó una correlación significativa del Enalapril y la reducción de la presión arterial en el estudio (p menor de 0.01). Sin embargo, "el poder predictivo del modelo aumentó (r2 = 23,6%, p menor de 0,01) pero dejó la mayoría de la variabilidad en respuesta sin explicación".

En los casos en que se tomaron muestras para inmunohistoquímica, los corazones se embebieron en medios OCT y se congelaron rápidamente en nitrógeno líquido (n=6 por grupo). Las secciones se cortaron en el

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nivel basal, medio y ápice del corazón. Los tejidos congelados embebidos se enviaron a QualTek Technology (Santa Barbara, CA) para evaluación histológica adicional. Los tejidos se descongelaron a temperatura ambiente y se volvieron a fijar en formalina y se embebieron en parafina y se seccionaron en secciones de 5 |jm. Las secciones se tiñeron con un anticuerpo contra el Antígeno de Matriz Nuclear humano (hu NuMA) con el propósitos de discernir las células derivadas de tejido cardíaco humano dentro del miocardio de rata.

Los resultados de inmunohistoquímica fueron consistentes con los resultados de qPCR. Se identificó tinción de NuMA humano positiva en el miocardio de los animales que recibieron la dosis objetivo de 1 x 106 células HCTC (A3). Ver la Figura 28, panel a, y la Figura 29. Las células positivas para NuMA que se tiñeron de color marrón oscuro y tienen características de tinción similares a las observadas con controles de tejido humano se muestran en la presente en los dos círculos ovalados y sin tinción de fondo presente. La estimación del número de células fue de aproximadamente 100 células humanas/sección. Bajo aumento alto, las células humanas similares a miocitos también se identificaron como se muestra en la Figura 29, panel d. No se observó tinción para NuMA humana en animales tratados con vehículo. Ver la Figura 28, paneles a y b, la Figura 29 y la Figura 30.

Ejemplo 13

Las Células Derivadas de Tejido Cardíaco Humano Redujeron la Hipertrofia en un Modelo Animal de Infarto Agudo de Miocardio

Para comprender adicionalmente los mecanismos y los beneficios biológicos de las células derivadas de tejido cardiaco humano como una terapia para el miocardio dañado, se tomaron muestras de tejido de los corazones de los animales tratados con células cardíacas humanas en el Ejemplo 11, para determinar el efecto de la administración de células derivadas de tejido cardíaco humano sobre la patología general de tamaño de infarto del corazón.

La histopatología se evaluó por un patólogo en QualTek (Santa Barbara, CA). El patólogo desconocía el tratamiento del estudio. Los tejidos del corazón estaban embebidos en bloques de parafina. Las secciones se obtuvieron a cada 5pm a través del órgano completo y se evaluó la patología general. La evaluación de la hipertrofia se realizó mediante un sistema de puntuación. En el miocardio hipertrófico (puntuación 1), es decir, se encontraron comúnmente células miocárdicas con citoplasma agrandado y núcleos extraños. De lo contrario, el miocardio se puntuó 0. Se contó el número de secciones con hipertrofia y sin hipertrofia y se presentó en la Figura 31 como una proporción de secciones totales para representar la proporción de hipertrofia en el corazón completo.

Se observó hipertrofia miocárdica en los corazones de animales tratados con vehículo, en donde aproximadamente el 70% del miocardio mostró hipertrofia (puntuación 1). Ver la Figura 31. El tratamiento con células derivadas de tejido cardíaco humano redujo significativamente la hipertrofia observada en los corazones, en comparación con los animales tratados con vehículo. En los corazones que recibieron células hCTC (A3) en dosis objetivo de 1 x 104, 1 x 105, o 1 x 106, el miocardio hipertrófico se redujo al 30%-50%. Ver la Figura 31.

Para dilucidar la gravedad del infarto de miocardio, se realizó tinción con tricrómico de Masson en secciones a nivel del músculo papilar de cada corazón. El tamaño del infarto se determinó mediante la medición directa del área del infarto y el área no infartada. El tamaño relativo del infarto se estimó en un 100% [área del infarto/(área del infarto + área no infartada)]. Todos los estudios morfométricos se realizaron de acuerdo con los métodos descritos en Iwasaki et al en Circulation. 2006; 113:1311-1325.

Se observó una tendencia hacia la reducción en el tamaño del infarto relativo en animales que recibieron o 1 x 105 (16,5 ± 7,3%, p=0,02), o 1 x 106 (14,8 ± 8,6%, p=0.,1) células hCTC (A3), en comparación con el grupo de vehículo (24,1 ± 2,9%). Ver la Figura 32, panel a. De manera similar, también se observó una tendencia a la reducción del tamaño del infarto por el área del infarto real en animales que recibieron 1 x 105 (557 ± 221, p = 0,09) o 1 x 106(537 ± 261, p=0,08) células hCTC (A3), en comparación con el grupo tratado con vehículo (748 ± 191). Ver la Figura 32, panel b.

Se observó hipertrofia miocárdica en los corazones de animales tratados con vehículo, en donde aproximadamente el 70% del miocardio mostró hipertrofia (puntuación 1). Ver la Figura 31. El tratamiento con células derivadas de tejido cardíaco humano redujo significativamente la hipertrofia observada en los corazones, en comparación con los animales tratados con vehículo. En corazones que reciben células hCTC (A3) en dosis objetivo de 1 x 104, 1 x 105, o 1 x 106, el miocardio hipertrófico se redujo al 30%-50%. Ver la Figura 31. La reducción de la hipertrofia lograda por hCTC puede atribuirse directamente a través de efectos tróficos o paracrinos, es decir, citoquinas secretadas por hCTC, como se muestra en la Tabla 24 y/o debido a un efecto secundario de generación de miocitos de nueva aparición aumentada como se analiza en el Ejemplo 14 a continuación.

Ejemplo 14

Las Células Derivadas de Tejido Cardíaco Humano Aumentaron la Densidad Capilar en un Modelo Animal de

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Infarto Agudo de Miocardio

Para comprender mejor los mecanismos y los beneficios biológicos de las células derivadas de tejido cardíaco humano como una terapia para el miocardio dañado, se tomaron muestras de tejido de los corazones de animales tratados con células cardíacas humanas en el Ejemplo 11, para determinar el efecto de la administración de células derivadas de tejido cardíaco humano en la densidad capilar en la zona del borde del área infartada.

Se seleccionaron aleatoriamente cinco secciones de tejido de los ventrículos izquierdos de cada corazón, tomadas en la zona del borde del área infartada y se evaluó morfométricamente la densidad capilar mediante examen histológico, en donde los capilares se visualizaron usando un anticuerpo para isolectina B4 (Vector Laboratories, Burlingame, CA) o CD31. La isolectina B4 es específica para residuos de azúcar en la superficie de células endoteliales y se ha documentado que reconoce las células endoteliales en muchos entornos como se describe por Vasudevan et al. en Nature Neuroscience 11: 429-439 (2008) y por Schmidt et al en Development 134, 2913-2923. (2007). La CD31, también conocida como molécula de adhesión celular endotelial a plaquetas (PECAM) se ha aplicado extensivamente para identificar células endoteliales y, por tanto, vasculatura en varios tejidos, incluyendo el corazón (Tabibiazar y Rockson Eur Heart J 2001vol 22; 903-918).

La visualización de capilares o mediante isolectina B4 o CD31, demostró que la administración de células derivadas de tejido cardíaco humano aumentó la densidad capilar en la zona del borde del área infartada. La administración de células hCTC (A3) en todas las dosis dio como resultado el aumento de la densidad capilar, en comparación con los grupos tratados con vehículo, cuatro semanas después de la administración celular. Ver la Figura 33, paneles a y b. (p=0,0068 para la tinción de Isolectina-B4 y p=0,0005 para la tinción de CD31).

El aumento en la densidad capilar puede deberse, en parte, a la secreción de factores de las células derivadas de tejido cardiaco humano de la presente invención. Estos factores tróficos pueden actuar, por ejemplo, de manera paracrina en las células cardiacas. Los factores tróficos pueden afectar, ya sea directa o indirectamente, a la formación de vasos sanguíneos, la función y hemodinámica de los vasos sanguíneos, la remodelación y función del músculo cardíaco, la proliferación de miocitos (como la miogénesis), la hipertrofia de miocitos, la fibrosis o la supervivencia celular cardíaca aumentada . Los factores tróficos también pueden regular la respuesta inmune del receptor. Para determinar si las células derivadas de tejido cardíaco humano segregan factores tróficos, se recogió medio de cultivo de poblaciones de células hCTC (A3) que se habían cultivado in vitro durante siete días. Las muestras de los medios se almacenaron a -80° C, antes de analizar la presencia de citoquinas secretadas.

Las citoquinas secretadas por las células hCTC (A3) incluían factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) y angiopoyetina 2 (ANG2). Ver la Tabla 24. Estas citoquinas desempeñan un papel significativo en la angiogénesis. Más importante, la combinación de VEGF y ANG2 puede iniciar y mejorar de manera sinérgica el proceso de rebrote capilar, como ha sido documentado por Maisonpierre et al en Science 277:55-60 (1997) y revisado por Ramsauer et al en Journal of Clinical Investigation 110:1615 -1617 (2002).

Ejemplo 15

Las Células Derivadas de Tejido Cardíaco Humano Aumentaron la Densidad de Miocitos en el Área No Infartada en Animales que Recibieron Células Derivadas de Tejido Cardíaco Humano de la Presente Invención

Para comprender mejor los mecanismos y los beneficios biológicos de las células derivadas de tejido cardiaco humano como una terapia para miocardio dañado, se tomaron muestras de tejido de los corazones de los animales tratados con células cardíacas humanas en el Ejemplo 11, para determinar el efecto de la administración de células derivadas de tejido cardíaco humano sobre la proliferación de miocitos de rata en la zona del borde del área infartada, y la densidad de los miocitos en regiones no infartadas del corazón.

Se seccionaron a 4 pm muestras de tejido embebidas en parafina, fijadas con formalina. Se seleccionó un portaobjetos en aproximadamente la 17a sección de cada animal. Las secciones se incubaron con un anticuerpo para Ki-67 (MIB-5) durante 60 minutos a temperatura ambiente, se lavaron en PBS y se incubaron con un anticuerpo secundario de IgG de ratón de afinidad marcado con micropolímero. Los portaobjetos se lavaron en PBS y luego se desarrollaron con un sustrato de Vector SG que produce un producto de reacción azul marino/gris. Los portaobjetos enjuagados en PBS se contratiñeron usando DAPl (KPL Gaithersburg, Maryland). Se incluyeron controles positivos y negativos en cada protocolo de tinción.

Se incubaron secciones fijadas en formalina paralelas con un anticuerpo para miosina cardíaca durante 45 minutos a temperatura ambiente, se lavaron en PBS, y se incubaron con un anticuerpo secundario de IgG de ratón biotinilado. Después de que se completase la incubación secundaria, se aplicó reactivo Vectastain ABC-AP (Vectastain Universal ABC-AP Kit, Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA) durante 30 minutos. Los portaobjetos se lavaron en PBS y luego se desarrollaron usando Liquid Permanent Red Chromogen (Dako, Carpinteria, CA) que produce un producto de la reacción de color rosa oscuro a rojo. Los portaobjetos enjuagados en PBS se

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contratiñeron usando DAPI (KPL Gaithersburg, Maryland). Se incluyeron controles positivos y negativos en cada protocolo de tinción.

Se midieron los miocitos proliferantes mediante doble tinción de Ki-67 y cadena pesada de miosina (MHC). Se contaron los miocitos totales, reconocidos por tinción de MHC. El número total de miocitos en un campo de alta potencia fue similar entre el vehículo y los grupos tratados con células en todas las dosis. La proporción de miocitos en proliferación entre miocitos totales fue mayor en los animales que recibieron o 1 x 104 (3,8 ± 0,02%) o 1 x 105(3,7 ± 0,02%) células hCTC (A3), en comparación con los animales tratados con vehículo (2,3 ± 0,01%) animales o animales que recibieron 1 x 106 (1,2 ± 0,01%) células. Ver la Tabla 25 y la Figura 34.

Una posible explicación para la proporción más baja de miocitos en proliferación entre los miocitos totales en animales que recibieron 1 x 106 células pueden deberse a que los miocitos entran en G0 en respuesta al tratamiento con hCTC (A3). El Ki-67 es un marcador de la proliferación celular, presente en todas las fases durante el ciclo celular. Sin embargo, cuando las células en el ciclo salen en la fase G0, ya no hay Ki-67. Ver, por ejemplo, (Thomas Scholzen 2000, Journal of Cellular Physiology; 182 (3), 311-322).

Tinción de H&E: los portaobjetos se desparafinaron con 2 cambios de xileno, 10 minutos por portaobjetos, luego se rehidrataron en 2 cambios de alcohol absoluto, 5 minutos cada uno, luego 95% de alcohol durante 2 minutos y 70% de alcohol durante 2 minutos. Los portaobjetos se lavaron brevemente en agua destilada, luego se tiñeron en solución de hematoxilina durante 8 minutos, se lavaron con agua corriente de grifo durante 5 minutos, se diferenciaron en 1% de alcohol ácido durante 30 segundos, se lavaron con agua corriente del grifo durante 1 minuto y se tiñeron con 0,2% de agua amoniacal durante de 30 segundos a 1 minuto. Luego los portaobjetos se lavaron con agua corriente del grifo durante 5 minutos, se enjuagaron en alcohol al 95% (10 inmersiones) y luego se contratiñeron en solución de eosina-floxina B durante 30 segundos a 1 minuto, se deshidrataron con alcohol al 95%, 2 cambios de alcohol absoluto, 5 minutos cada uno, se lavaron en 2 cambios de xileno, 5 minutos cada uno, y se montaron con medio de montaje a base de xileno.

Para portaobjetos teñidos con H&E, se muestreo un nivel en cada animal. En cada nivel, se eligieron cinco campos de 400X (67.500 pm2 por campo) que contenían miofibrillas cortadas transversalmente con capilares mayormente de sección transversal en la pared del ventrículo izquierdo alejada del infarto. Se informó de la densidad de miocitos para cada nivel como la media de cinco campos y se expresó en mm2. Para cada grupo de tratamiento se calcularon la media, la desviación estándar y el error estándar de la media.

Los miocitos individuales fueron generalmente visibles en el tejido teñido con hematoxilina y eosina (H&E) con una ampliación de 400X. La Figura 35 muestra imágenes representativas obtenidas de muestras de corazones que recibieron 1 x 105 células hCTC (A3), junto con muestras obtenidas de animales tratados con vehículo. En la Tabla 26, la media para el grupo de vehículo (1813 ± 84/mm2) fue menor que la media para cualquier grupo de tratamiento (1 x 104 células hCTC (A3): 2210 ± 227,1 x 105 células hCTC (A3): 2220 ± 186,1 x 106 células hCTC (A3): 2113 ± 186). La densidad de miocitos aumentada puede atribuirse a los miocitos en proliferación aumentados (miogénesis) y/o a la hipertrofia de miocitos reducida, como la descrita en el Ejemplo 13.

Ejemplo 16

El tratamiento de Células Derivadas de Tejido Cardíaco Humano Indujo la Expresión Génica Diferencial en Miocardio de Rata

Para comprender las alteraciones moleculares inducidas por la administración de células derivadas de tejido cardíaco humano, se realizó un estudio de perfil de genes para comparar los niveles de expresión génica en grupos tratados con vehículo y con células derivadas de tejido cardíaco humano. Se recogieron corazones de rata de animales que habían recibido 1 x 104, 1 x 105, 1 x 106 células hCTC (A3), o vehículo, cuatro semanas después de la administración celular, de animales usados en el estudio descrito en el Ejemplo 11. Se recogió el ARN total de las muestras.

Se usó el chip del gen HG-U133_Plus_2 de Affymetrix se utilizó para realizar el análisis de la expresión génica en las muestras. Usando Spotfire DecisionSite, el conjunto de datos de la micromatriz se normalizó a través de los chips de micromatrices mediante la función "Normalizar por media". Los chips individuales se organizaron en grupos para comparación (dosis objetivo de 1 X104, 1 X105 y 1 X106 hCTC (A3), y vehículo). Usando Spotfire DecisionSite, se establecieron los valores p y las veces de cambio entre los grupos. Se filtraron los genes que no tenían una P en la columna Present Call de los datos en por lo menos 3 columnas, tenían un valor p de comparación de grupo menor o igual a 0,05 en por lo menos 2 columnas, y cualquier gen que no tenía unas veces de cambio mayores o iguales a 2,0 o menor que o igual a 0,5 en por lo menos 2 columnas. El conjunto filtrado comprendía 45 genes de interés. Los 45 genes se introdujeron luego en el programa Principle Component Analysis (PCA) de Spotfire DecisionSite para mostrar visualmente la separación de grupos usando este subconjunto de genes. Ver la Tabla 27, en donde se identificaron y enumeraron los genes expresados diferencialmente.

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Entre los genes identificados, el receptor beta del factor de crecimiento transformante (TGFpR) se reguló por disminución en animales que recibieron células hCTC (A3), a cualquier dosis. Ver la Figura 35. La vía de TGFpR se ha implicado anteriormente para una hipertrofia aumentada (ver, por ejemplo, Watkins, Jonker et al. Cardiovasc Res. 2006 1 de febrero; 69 (2):432-9) y la remodelación después del infarto en el miocardio (Ellmers, Scott et al. Endocrinology. Nov. 2008; 149(11):5828-34). Se ha informado que el bloqueo de TGFp y TGFpR reduce la remodelación y la fibrosis después de la hipertrofia (ver, por ejemplo, Ellmers, Scott et al., Endocrinology, Nov. 2008; 149(11):5828-34). Además, se ha informado que la activación de la vía de TGFp y TGFpR después del infarto aumenta los miocitos y la hipertrofia y la remodelación ventriculares (ver, por ejemplo, Matsumoto-Ida, Takimoto et al. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2006 Feb; 290(2): H709-15).

Otro gen que se identificó mediante análisis de expresión génica diferencial fue la óxido nítrico sintasa neuronal (NOS1). Después del infarto, aumentó la expresión de NOS 1 en el corazón. Se ha informado que la sobreexpresión de NOS1 reduce la contractilidad del miocardio (ver, por ejemplo, (Burkard, Rokita et al., Circ Res. 2007 Feb. 16; 100 (3): e32-44). En un corazón humano que falla , se ha informado que la expresión de NOS1 a nivel de ARNm y proteína aumenta significativamente, indicando un papel de NOS 1 en la patogénesis de la disfunción cardíaca (ver, por ejemplo, Damy, Ratajczak et al. Lancet. 2004 Abr. 24; 363 (9418):1365-7). En el miocardio tratado con células hCTC (A3), en todas las dosis, la expresión de NOS1 se redujo en comparación con el miocardio tratado con vehículo, en más de 10 veces.

Ejemplo 17

El Tratamiento de Células Derivadas de Tejido Cardíaco Humano Redujo el Tamaño del infarto y Previno la Hipertrofia en un Modelo de Rata de Infarto Agudo de Miocardio

Se comparó la eficacia de las células derivadas de tejido cardíaco humano para tratar miocardio dañado con células madre mesenquimales derivadas de la médula ósea, en un modelo de roedor de infarto agudo de miocardio. Se usaron 96 ratas desnudas hembra (Charles River Laboratories) de 8-10 semanas de edad para este estudio. Se llevaron a cabo procedimientos quirúrgicos como se describe en el Ejemplo 11. Se administraron 1 x

105 células hCTC (A3) (Lote 1) a un volumen de 100 pl de CryoStor D-lite. Paralelamente, se administraron 1 x 106 células madre mesenquimales humanas (N° de Cat. PT-2501, Lonza) a un volumen de 100 pl de Cryostor D-lite. Se usó un procedimiento similar al descrito en el Ejemplo 11 con las siguientes modificaciones en base a las preferencias del cirujano: las células se inyectaron en dos sitios con 50 pl cada una en la zona del borde del infarto, usando una jeringuilla de insulina de 0,3 ml equipada con una aguja de calibre 29, aproximadamente 10 minutos después de la ligadura LAD cuando se observó claramente la decoloración del área del infarto. Los animales se sacrificaron a los 28 días después de la administración celular y los corazones se retiraron para análisis posterior.

Se recortaron las aurículas y los ventrículos se lavaron con solución salina. Los corazones se sumergieron en 10% de formalina tamponada neutra (NBF) durante 24 h antes de cortarlos en cuatro cortes de 2 mm. Cada corte se procesó para examen microscópico, se embebió en parafina, se seccionó a 5 pm, y se tiñó con hematoxilina y eosina (H&E) y/o Tricromo de Masson. Dos secciones se muestran lada a lado de cada animal: una tomada desde la línea media entre el músculo papilar y el nivel basal y una tomada desde el músculo papilar.

Se cegaron las secciones de tejido de todos los grupos y puntos temporales y se colocaron en orden de clasificación de acuerdo con la gravedad de la enfermedad (descompensación/dilatación e hipertrofia) de peor a menor. A cada ordinal se le asignó un número, con el número más alto correspondiendo a la mayor gravedad de enfermedad. Se deshizo luego el ciego y se compilaron todos los valores de clasificación de cada grupo.

Todas las imágenes se recogieron a lo largo de la pared libre del ventrículo izquierdo, que incluía el infarto. Se recogieron imágenes de baja amplificación (2X) de 2 cortes de tejido teñidos con tricromo de cada animal y se analizaron para determinar el tamaño del infarto. El software Image-Pro Plus v 5.1 (Media Cybernetics, Inc., Bethesda, MD) se usó para realizar el análisis morfométrico automático del tamaño del infarto en las imágenes recogidas. Se trazó el perímetro de la pared libre del ventrículo izquierdo y se designó como el área de interés (AOI). El porcentaje ocupado por tinción azul, que representa el infarto, y el porcentaje por tinción roja, que representa el miocardio funcional, fueron las dos mediciones recogidas de cada imagen.

Se examinaron secciones de tejido de corazón teñido con H&E y/o Tricromo de Masson 28 días después del infarto. Los animales tratados con 1 x 105 células hCTC (A3), así como los animales tratados con 1 x 106 células madre mesenquimales humanas mostraron una zona de infarto reducida, en comparación con los animales tratados con vehículo. También se observó una reducción en la dilatación de tanto el ventrículo izquierdo como el derecho. Ver la Figura 36, paneles a y b. Además, hubo preservación de miocardio funcional en la pared libre ventricular izquierda en animales que habían recibido 1 x 105 células hCTC (A3), así como animales tratados con 1 x

106 células madre mesenquimales humanas. Ver la Figura 36, panel c.

Curiosamente, las células hCTC (A3) y las células madre mesenquimales humanas demostraron efectos diferenciales en el tabique interventricular (SIV), con hMSC mostrando agrandamiento hipertrófico de SIV, mientras

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que no se observó dicho cambio en animales que recibieron células hCTC (A3). Ver la Figura 37. La evidencia de cambios hipertróficos de los cardiomiocitos estaba presente en los tabique de ambos grupos, pero fue más pronunciada en los animales que recibieron hMSC. Los miocitos hipertróficos y el SIV contribuyen a la remodelación eventual en el corazón, sugiriendo que las células derivadas de tejido cardíaco humano de la presente invención pueden tener más efectos beneficiosos sobre la función cardíaca que las células madre mesenquimales humanas.

Ejemplo 18

Lotes múltiples y Eficacia a Largo Plazo de las Células Derivadas de Tejido Cardíaco Humano de la Presente Invención en un Modelo Animal de Infarto Agudo de Miocardio

Se prepararon múltiples lotes de células derivadas de tejido cardíaco humano a partir de tres donantes. La información del donante se describe en la Tabla 28. Brevemente, el lote 1 es de un órgano cardíaco de grado trasplante; el lote 2 de un corazón sano pero el donante falló los criterios de edad para el trasplante; el lote 3 de un donante diagnosticado con cardiomiopatía dilatada, una afección de fallo del corazón.

Se anestesiaron ratas desnudas hembra (peso, 250 a 300 g) con ketamina y xilazina (60 y 10 mg/kg IP, respectivamente). El tórax se abrió en el cuarto espacio intercostal izquierdo, el corazón se exteriorizó y se cortó el pericardio. Posteriormente, el corazón se sostuvo con fórceps, y se anudó una sutura 6-0 Proline debajo de la arteria coronaria descendente anterior izquierda, aproximadamente a 2 mm de su origen. El IAM se indujo en el corazón tirando de la ligadura, ocluyendo la arteria. La decoloración del miocardio infringido se observó visualmente.

Veinte minutos después de la inducción del infarto de miocardio, las ratas recibieron un trasplante intramiocárdico de 1x106 células hCTC (A3) del lote 1, 2, ó 3 de hCTC (A3). Paralelamente, los animales recibieron 1x106 de las células pCTC (A3) o células de fibroblastos dérmicos neonatales humanos (N° de Cat. CC-2509, Lonza) o vehículo. Todas las poblaciones celulares se habían crioconservado antes de la administración y se inyectaron en el corazón a un volumen final de 120 pl en CryoStor Dlite. Las células se administraron en 2 sitios, se i 50 pl de suspensión celular o CryoStor Dlite en cada sitio. Después de que se completase la inyección, se cerró el tórax. Se inscribieron 10 animales en cada grupo. La tasa de mortalidad observada fue del 32% en el estudio. No hubo diferencia significativa para la mortalidad entre los grupos, como se muestra en la Tabla 29. Los valores absolutos de la función cardíaca se muestran en la Tabla 30.

Se realizó una ecocardiografía transtorácica (SONOS 5500, Philips Medical Systems) para evaluar la función del LV a las 1, 4 y 12 semanas después de la administración celular. Se midieron los siguientes parámetros: dimensión telediastólica del ventrículo izquierdo (LV) (LVEDD), dimensión telesistólica del LV (LVESD), acortamiento fraccional (FS), puntuación de movimiento de la pared regional (RWMS).

La administración de células hCTC (A3) del lote 1 mejoró la función cardíaca en todos los parámetros probados, a los 28 días y a los 84 días después de la administración celular. Ver las Figuras 38 y 39. La administración de células hCTC (A3) del Lote 2 fue capaz de mejorar la contractilidad cardíaca y la función cardíaca global a los 84 días después del infarto, como se mide por la puntuación de movimiento de la pared regional RWMS y FS.

El FS a los 7 días después de la administración celular fue similar entre el vehículo y los grupos tratados con células. Sin embargo, 84 días después de la administración celular, la función cardíaca medida por FS mejoró en 9,5 ± 6,0% (n=8, p<0.01), 8,9 ± 4,1% (n=8, p<0.001) en grupos tratados con células hCTC (A3) del Lote 2 y células hCTC (A3) del 1, respectivamente. Ver la Figura 39 y la Tabla 30. Se observó un cambio de FS mínimo o nulo en los grupos tratados con vehículo (-1,0 ± 3,3%), hCTC lote 3 (-0,4 ± 3,0%) y fibroblastos humanos (4,1 ± 2,1%). Ver la Figura 39 y la Tabla 30. En consonancia con la función global, la RWMS también se redujo en animales que recibieron o células hCTC (A3) del lote 1 de 24,83 ± 1,64 en el día 7 a 22,13 ± 1,5 (N=8, p menor de 0,05) o del lote 2 25,44 ± 1,0 a 23,13 ± 2,2 (N=8, p menor de 0.05), en comparación con los animales tratados con vehículo. Ver la Tabla 30.

En el estudio actual, las células hCTC (A3) de o el lote 1 o el lote 2 impidieron la remodelación a los 28 y 84 días después del infarto, demostrado por LVESD. A los 28 días después de la administración celular, se redujo la LVESD en animales que habían recibido células hCTC (A3) del lote 1 (-8,9 ± 4,1%). El LVESD en animales que habían recibido células hCTC (A3) del lote 2 se mantuvo al inicio (-0,5 + 4,3%). Por el contrario, en animales tratados con vehículo, a los 28 días después de la administración celular, la LVESD aumentó en 16,4 ± 5,2%. En animales que habían recibido células hCTC (A3) del lote 3, o fibroblastos humanos, la LVESD aumentó en 9,1 ± 2,3% y 5,4 ± 3,6%, respectivamente. Ver la Figura 38 y la Tabla 30.

A los 84 días después de la administración celular, en el grupo de vehículo, la LVESD aumentó en 16,3 ± 2,8%. De manera similar, los animales que habían recibido células hCTC (A3) del lote 3, o animales tratados con fibroblastos humanos también mostraron agrandamiento del ventrículo izquierdo a los 84 días. La LVESD aumentó en 12,5 ± 3,7% y 7,6 ± 3,7%, respectivamente. Por el contrario, la remodelación cardíaca no tuvo lugar en animales

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que habían recibido células hCTC (A3) del lote 1 (-3,9 ± 5,2%) o en animales que habían recibido células hCTC (A3) del lote 2 (-1,8 ± 4,2%) . Ver la Figura 39 y la Tabla 30.

El aumento en la dilatación del ventrículo izquierdo, medido por LVEDD, al final de la diástole se evitó en animales que habían recibido células hCTC (A3) del lote 1 (7 días: 0,80 ± 0,10 cm 84 días: 0,84± 0,07 cm, incremento del 5%) y en animales que habían recibido células hCTC (A3) del lote 2 (7 días: 0,74 ± 0,07 cm 84 días: 0,82 ± 0,06 cm, incremento del 6,7%). Por el contrario, la LVEDD aumentó en animales tratados con vehículo (7 días: 0,75 ± 0,03 cm, 84 días: 0,86 ± 0,06 cm, incremento del 14,6%) y animales que habían recibido fibroblastos humanos (7 días: 0,73 ± 0,034 cm; 84 días: 0,83 ± 0,06 cm, incremento del 13,7%). Los animales que habían recibido células hCTC (A3) del lote 3 también mostraron un aumento en la LVEDD (7 días: 0,73 ± 0,04 cm, 84 días: 0,82 ± 0,06 cm, incremento del 12,3%). Ver la Figura 39 y la Tabla 30.

Ejemplo 19

Tamaño de la Células Derivadas de Tejido Cardíaco

Métodos y Materiales: Se analizaron el tamaño celular de las células derivadas de tejido cardíaco, obtenidas de corazones humanos, de ratón, de cerdo y de rata, de acuerdo con los métodos de la presente invención durante el recuento celular. El recuento de células viables totales se realizó después de la digestión y antes de redistribuir en placas las poblaciones celulares usando Vi-Cell™ XR (Beckman Coulter, Fullerton, CA). El analizador de viabilidad celular Vi-Cell™ automatiza el método de exclusión de colorante azul de tripano para la evaluación de la viabilidad celular usando tecnología de captura de video y análisis de imágenes de hasta 100 imágenes de células en un flujo de células.

Las muestras se prepararon y analizaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Manual de referencia PN 383674 Rev. A). Brevemente, se transfirió una alícuota de 500 pl de la suspensión celular final obtenida después de la lisis de RBC a un vial de muestra de Vi-Cell™ de 4 ml y se analizó usando un Analizador de Viabilidad Celular Vi-Cell™ XR. El tamaño de la célula se determinó por el diámetro de la media de las células contadas.

La media del diámetro de las células hCTC (A3) fue de 16,7 ± 2,13 pm. El diámetro de las células rCTC (A2) fue de 18,4 ± 1,02 pm y el diámetro de las células pCTC (A3) fue de 17,2 ± 0,42 pm. En base a estos datos, el tamaño de filtro mayor que o igual a 20 pm permitiría que las células derivadas de tejido cardiaco de la presente invención pasen a través del filtro para ser recogidas y se excluyan otros tipos de células.

Ejemplo 20

Crioconservación de las Células Derivadas de Tejido Cardíaco de la Presente Invención

Es ventajoso generar un producto que pueda administrarse directamente sin procesamiento adicional en las clínicas. Para generar dicho producto, se probó la crioconservación de células derivadas de tejido cardíaco humano usando una solución de crioconservación clínicamente aprobada. Además, también se probó la toxicidad de la solución de crioconservación en el miocardio.

Para la crioconservación, se recogieron células hCTC (A3) de matraces mediante tripsinización. Los bancos de células se crioconservaron en CryoStor Dlite™ (BioLife Solutions, Inc. Bothell, WA) que contenía 2% v/v de DMSO. El CryoStor Dlite es una crioconservación libre de origen animal diseñada para preparar y conservar células en ambientes de temperaturas ultra bajas (-80o0 C a -196° C) de acuerdo con los principios descritos en Advances in Biopreservation editados porJ.G. Baust y J.M. Baust. También pueden usarse otras soluciones que proporcionan, por ejemplo, las condiciones necesarias de electrolito, osmóticas y de tamponamiento para el almacenamiento hipotérmico.

Las suspensiones celulares se crioconservaron en 2 ml de polipropileno Nalgene, rosca interna con crioviales de tapa a rosca (Nalgne Nunc, Rochester, NY) usando un congelador programable Integra 750 Plus (Planer, Middlesex, Reino Unido) con software DeltaT. Las células y soluciones estaban a temperatura ambiente antes de cargarlas en el congelador programable, que se mantuvo a 15° C. Una sonda de temperatura de muestra se colocó en un vial de tampón de congelación. Se usó el siguiente programa se usó para crioconservar las células:

Paso N°

Velocidad (°C/min) Temperatura Final (°C) Activador

1

-1 -6 Muestra

2

-25 -65 Cámara

3

+10 -19 Cámara

4

+2.16 -14 Cámara

5

-1 -100 Cámara

6

-10 -140 Cámara

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Cuando la temperatura alcanzó -140° C, las muestras se transfirieron a un tanque de nitrógeno líquido para su almacenamiento.

Claims (23)

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   REIVINDICACIONES

   1. Una población purificada de células derivadas de tejido cardíaco humano que no expresan telomerasa, y:

   a. expresan CD90, CD105, CD117, GATA4 y Nkx2.5; y

   b. no expresan CD16, CD31, CD45 y cadena pesada de miosina; y preferiblemente

   c. se pueden obtener mediante los pasos de:

   i. disociar tejido disociador cardiaco obtenido del corazón,

   ii. digerir el tejido cardíaco para liberar células tratando el tejido cardíaco con por lo menos una enzima, en donde la por lo menos una enzima comprende dispasa,

   iii. eliminar cardiomiocitos de las células liberadas, y

   iv. cultivar las células restantes.
2. 2. La población purificada de células derivadas de tejido cardíaco humano de la reivindicación 1, en la que las células derivadas de tejido cardiaco que no expresan telomerasa expresan además CD49e, CD59 y/o CD34.
3. 3. La población purificada de células derivadas de tejido cardíaco humano de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en la que las células derivadas de tejido cardíaco que no expresan telomerasa no expresan además MDR y/o Isl-1.
4. 4. Un método para producir células derivadas de tejido cardiaco que no expresan telomerasa, que comprende los pasos de:

   i. disociar tejido cardiaco obtenido del corazón,

   ii. digerir el tejido cardíaco para liberar células tratando el tejido cardíaco con por lo menos una enzima, en donde la por lo menos una enzima comprende dispasa,

   iii. eliminar cardiomiocitos de las células liberadas, y

   iv. cultivar las células restantes.
5. 5. El método de la reivindicación 4, en el que el tejido cardíaco se disocia manualmente.
6. 6. El método de la reivindicación 4, en el que el tejido cardíaco se disocia mecánicamente.
7. 7. El método de la reivindicación 4, en el que la por lo menos una enzima comprende además colagenasa.
8. 8. El método de la reivindicación 4, en el que se usa un corazón completo como fuente para el tejido cardíaco.
9. 9. Una población de células derivadas de tejido cardíaco de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, para su uso en el tratamiento o reparación de miocardio dañado en un paciente, en donde el tratamiento o reparación comprende administrar la población de células derivadas de tejido cardíaco al paciente en una cantidad suficiente para tratar el miocardio dañado.
10. 10. La población de células para su uso de acuerdo con la reivindicación 9, en donde la administración de las células derivadas de tejido cardíaco es a través de inyección directa en el miocardio dañado.
11. 11. La población de células para su uso de acuerdo con la reivindicación 9, en donde la administración de las células derivadas de tejido cardíaco es a través de inyección directa en el área del corazón inmediatamente colindante al miocardio dañado.
12. 12. La población de células para su uso de acuerdo con la reivindicación 9, en donde las células se administran sistémicamente, opcionalmente usando un catéter.
13. 13. La población de células para su uso de acuerdo con la reivindicación 9, en donde las células se administran junto con otro agente seleccionado del grupo que consiste de: factor de células madre (SCF), factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF), factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF), factor-1 derivado de células estromales, factor de steel, factor de crecimiento endotelial vascular, factor estimulante de colonias de macrófagos, factor estimulante de granulocitos-macrófagos, e interleucina-3.
14. 14. La población de células para su uso de acuerdo con la reivindicación 9, en la que las células se diferencian adicionalmente en cardiomiocitos antes, o después, de la administración de las células a un paciente.

    Figura 1

    imagen1

    Figura 2

    | Suspensión celular de la digestión ¡

    | Separación pre-distribución ¡ | en placas 2 días \

    ..........................!........................................................

    ........................................................1.........................

    | Células adherentes | ¡ no adherentes ! I (A1) ! I (S) ¡

    Adherentes + no adherentes j (A1 + S) |

    Redistribución |n placas Redistribución ;* | Cultivo I | Cultivo duré f (A1) | | S se volvier | | | adherenl

    n placas inte 2 días j on células \ es (A2) j Redistribución jn placas Cultivo durante 2 días ¡ A1+S se volvieron adherentes! (A3) I

    E107978 18-07-2C

    Figura 3

    en

    co

    Corazón Completo

    Tiempo desde la adquisición: 48-96 lirs

    imagen2

    Expansión hasta crecimiento de meseta

    Figura 4

    en

    4^

    imagen3

    3888Rt

    Día O (ÍOOX)

    imagen4

    Día 14 (IOOX)

    imagen5

    Células fase brillante 200X

    imagen6

    Redistribución en placas del día 14 (IOOX)

    PDL Total

    Figura 5

    en

    en

    a.

    Crecimiento hCTC (A2)

    Curvas de Crecimiento de hCTC (A3)

    imagen7

    Tiempo después de la redistribución en placas (días)

    Figura 6

    Curva de Crecimiento de hCTC

    imagen8

    Figura 7

    Crecimiento de CTC de rata

    imagen9

    Figura 8

    en

    oo

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    Recuperación

    Viabilidad

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    Figura 9

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    Estabilidad de rCTC

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    o.

    imagen14

    Células Totales (pre) -¿«-Viabilidad (pre)

    -■a- Células Totales (post) -e- Viabilidad (post)

    CD

    O

    Figura 10

    O o O

    imagen15

    imagen16

    imagen17

    o o

    imagen18

    imagen19

    imagen20

    imagen21

    Figura 11

    hCTC

    imagen22

    imagen23

    imagen24

    hFibroblasto

    imagen25

    imagen26

    imagen27

    Figura 12

    imagen28

    imagen29

    Figura 13

    Oí

    oo

    MHC
15. 0.15-1

    X

    Q

    Q.

    <

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    hCPC NHDF h-corazón

    GATA4

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    x

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    o

    imagen31

    hCPC NHDF

    TF/proteína sarcomérica

    imagen32

    NHDF

    h-corazón

    h-corazón

    Figura 14

    Oí

    4^

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    2-I ■

    mCTC

    imagen33

    mCTC+CM

    Figura 15

    imagen34

    5 10 15 20 25 30 35 40 45 50

    Tiempo (días)

    Recuentos

    Figura 16

    imagen35

    imagen36

    imagen37

    imagen38

    imagen39

    Figura 17

    imagen40

    Infarto

    de Miocardio

    imagen41

    Extensión

    Remodelación

    Geometría de la cámara Fenotipo celular Espacio extracelular Vasculatura

    Figura 18

    Acortamiento Fraccional

    imagen42

    Figura 19

    Puntuación de movimiento de la pared

    imagen43

    5D 28D Vehículo

    5D 28D

    rCPC

    1e6

    5D 28D 5D 28D

    hCPC hCPC

    1e4 1e5

    5D 28D

    hCPC

    1e6

    • •

    Cambio relativo de LVEDD (%)

    Figura 20

    Cambio relativo de LVEDD

    75-.

    50- 25- 0- -25- -50«

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    ó

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    Figura 21

    Comparaciones usando análisis Resistente/Robusto porcentaje de cambio de LVEDD

    : vs, 1

    vs. 1

    4vs. 1

    5 vs. 1

    imagen45
16. -0.25
17. -0.15 -0.1 -0.05 -O.ot 1S

    0

    No cruzamiento con línea de referencia 0 jndica diferencias estadísticamente significativas al nivel de significancia del 5%

    IJS Feb 2008 15:57:12 Fri EST

    Diferencia Simple en Porcentaje de Cambio en LVEDD

    Figura 22

    LVESD

    tn

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    Figura 23

    w

    Acortamiento Fracciona

    imagen46

    5D 28D 5D 28D

    Vehículo 'l0!0

    imagen47

    ------1---------------1---------------1-------1

    5D 28D 5D 28D 5D 28D

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    1e4 1e5 1e6

    Puntuación de movimiento de la pared

    imagen48

    LVESD
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    LVEDD

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23. 0.20-I-------1-------------1-------------1--------------1-------------1------

    5D 28D 5D 28D 5D 28D 5D 28D 5D 28D

    Vehículo rCTC hCTC hCTC hCTC

    1e6 1e4 1e5 1e6

    Figura 24

    imagen51

    Dosis

    Figura 25

    imagen52

    Dosis

    Figura 26

    CD

    a.

    Retención de hCTC a las 4 semanas después del IM

    (A

    re

    = 5100-

    >0) o a>

    T3

    d>

    E

    >3

    100-L

    100-r

    50-

    m »

    —I—

    1e4

    —I—

    1e5

    1e6

    Dosis de hCTC

    b. Porcentaje de retención de hCTC del material inyectado

    12- 11. —. 1(J.

    10 X

    <u 9-

    S- 8-

    7- 6- 5- 4- 3- 2- 1- 0-

    're*

    c

    <u

    o

    L_

    o

    a.

    ••

    Inmediata día 1

    día 3

    día 7

    Porcentaje de hCTC de referencia

    150-

    •

    100-

    50-

    •

    40-i

    30-

    20-

    10-

    o-l

    +

    Inmediata día 1 día 3 díá 7 días después de la administración

    Figura 27

    Correlación de retención y remodelación inversa

    imagen53

    Número de células log.

    Conjunto de Datos A

    Valores de mejor ajuste

    Pendiente

    -0.07939 ± 0.02962

    intercepta Y cuando X=0.0

    0.2065 ± 0.07525

    intercepta X cuando Y=0.0

    2.601

    1/pendiente

    -12.60

    Intervalos de Confianza del 95%

    Pendiente

    -0.1454 a -0.01340

    Intercepta Y cuando X=0.0

    0.03887 a 0.3742

    Intercepata X cuando Y=0.0

    1.575 a. 4.740

    Bondad del Ajuste

    r2

    0.4181

    Sy.x

    0.09844

    ^Es la pendiente significativamente no cero?

    F

    7.185

    | valor P

    0.0231 |

    ¿Desviación de cero?

    Significativa

    Datos

    Número de valores de X

    12

    Número máximo de replicados de Y

    1

    Número total de valores

    12

    Número de valores desaparecidos

    0

    Figura 28

    00

    a.

    imagen54

    b.

    .. • >\v. . • -

    • V\W . ■■.-■■■■ 0.- • . . - ^

    imagen55

    Figura 29

    imagen56

    Figura 30

    00

    o

    Hu NuM A

    Control de isotipo

    Corazón

    humano

    imagen57

    imagen58

    Corazón de rata

    imagen59

    imagen60

    AdlH

    Figura 31

    imagen61

    LOO Ó,? 5 O-SO 0,25 0,00

    vehículo hCTC 104 hCTC 105 hCTC 106 Categoría

    Normal Hipertrofia

    Figura 32

    a.

    Tamaño del Infarto

    imagen62

    Area del Infarto (absoluta)

    30'

    o

    ■e

    £

    c

    o

    ■O

    o

    t£

    (0

    E

    re

    20

    10'

    • •

    p=0.08

    p=0.06

    imagen63

    0'

    Vehículo 1e4 hCTC 1e5hCTC 1e6hCTC

    imagen64

    Infarto Relativo

    100% [área de infarto/(área de infarto +área no de infarto)]

    Figura 33

    oo

    oo

    a.

    Densidad capilar por isolectina-B4

    imagen65

    Densidad capilar por CD31

    imagen66

    imagen67

    00

    4^

    Figura 34

    a.

    imagen68

    Vehículo (100X)

    imagen69

    Densidad de Miocitos(mm2)

    imagen70

    Miocitos en proliferación (Ki-67)

    imagen71

    Figura 35

    oo

    en

    imagen72

    Tgfpr

    imagen73

    1 e4 1 e5 1 e6

    Figura 36

    00 o>

    Area de infarto/área de pared libre LV

    imagen74

    C.

    imagen75

    Tratamiento

    Miocardio Funcional en Pared Libre Ventricular Izquierda

    imagen76

    Figura 37

    imagen77

    Figura 38

    Cambio relativo de FS

    00

    00

    imagen78

    imagen79

    Cambio relativo de LVEDD

    m

    imagen80

    C. =5- Cambio relativo de LVESD

    in

    imagen81

    00

    CD

    Figura 39

    í\. Cambio relativo de FS (84d)

    imagen82

    b.

    Cambio relativo de LVEDD (84d)

    imagen83

    r»

    ^ Cambio relativo de LVESD (84d)

    imagen84