KR20130106381A - 심장 치료를 위한 골수 유래 ｃｄ271 전구 세포 - Google Patents

Abstract

CD271⁺ 줄기 세포 집단의 분리 방법은 심혈관 질환을 예방 또는 치료하고 심장 조직을 회복시키는데 중요하다. 상기 방법은 다양한 소스로부터 유래된 줄기 세포에 적용할 수 있으며, 이를 이용하여 유기체 체내에 도처에 존재하는 질환의 치료 또는 예방, 또는 조직의 회복을 제공할 수 있다.

Description

심장 치료를 위한 골수 유래 ＣＤ271 전구 세포 {BONE MARROW DERIVED CD271 PRECURSOR CELLS FOR CARDIAC REPAIR}

관련 출원에 대한 교차-참조

본 출원은 2010년 8월 27일자 미국 가출원 제 61/377,661에 대한 우선권을 주장하며, 상기 문헌은 전체 내용이 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.

본 발명의 구현예들은 간엽-전구 세포 유래 골수를 이용한 심혈관 질환의 치료 방법에 관한 것이다.

심부전은 미국 보건 시스템에서 직간접 비용으로 332억 달러를 차지하고 있으며 (1, 2), 진단받은 환자들 대부분은 선행된 MI로 인해 심근이 손상되어 있다. 좌심실의 기능은 심근 경색 (MI) 환자의 생존과 삶의 질을 좌우하는 가장 중요한 결정인자이다 (1, 3). 심근은 경색된 이후의 재생력이 매우 제한적이어서, 현 의학계에서의 주된 연구 분야는 세포-기반의 조직 재생 분야이다. 이에 대한 연구는 수많은 만성 질환의 치료제에 대한 변화 가능성을 담고 있다. 만성 허혈성 심근증 (미국인들 4백만명 이상이 앓고 있는 질환임)의 경우, 성공적인 세포-기반의 치료법은 환자의 이환율과 사망율에 엄청난 영향을 미치게 될 것이며, 이러한 질환에 대한 사회적 부담을 낮출 수 있을 것이다. 이 분야에 대한 진일보를 위해, 과거 5년간 성공적인 세포 치료법을 달성하고자 하는 상당한 시도들이 이루어졌으며, 골수 유래 세포를 사용하는 전략들이 초기 임상 실험으로 테스트되고 있다 (4, 5). 이러한 시도들이 다수 이루어져, 세포 전달 방법에 대한 이해가 진전되고, 안전성 프로파일이 검증되었지만, 이상적인 세포 소스에 대해서는 충분한 확립이 필요한 과제로 남아있다.

Lloyd-Jones D, Adams R, Carnethon M, De SG, Ferguson TB, Flegal K, Ford E, Furie K, Go A, Greenlund K, Haase N, Hailpern S, Ho M, Howard V, Kissela B, Kittner S, Lackland D, Lisabeth L, Marelli A, McDermott M, Meigs J, Mozaffarian D, Nichol G, O'Donnell C, Roger V, Rosamond W, Sacco R, Sorlie P, Stafford R, Steinberger J, Thom T, Wasserthiel-Smoller S, Wong N, Wylie-Rosett J, Hong Y. Heart disease and stroke statistics--2009 update: a report from the American Heart Association Statistics Committee and Stroke Statistics Subcommittee. Circulation 2009;119(3):480-486. PMID: 19171871 Fang J, Mensah GA, Croft JB, Keenan NL. Heart failure-related hospitalization in the U.S., 1979 to 2004. J Am Coll Cardiol 2008;52(6):428-434. PMID: 18672162 Verma A, Meris A, Skali H, Ghali JK, Arnold JM, Bourgoun M, Velazquez EJ, McMurray JJ, Kober L, Pfeffer MA, Califf RM, Solomon SD. 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Multimodality noninvasive imaging demonstrates in vivo cardiac regeneration after mesenchymal stem cell therapy. J Am Coll Cardiol 2006;48(10):2116-2124. PMID: 17113001 Schuleri KH, Amado LC, Boyle AJ, Centola M, Saliaris AP, Gutman MR, Hatzistergos KE, Oskouei BN, Zimmet JM, Young RG, Heldman AW, Lardo AC, Hare JM. Early improvement in cardiac tissue perfusion due to mesenchymal stem cells. Am J Physiol Heart Circ Physiol 2008;294(5):H2002-H2011. PMID: 18310523 Hare JM, Traverse JH, Henry TD, Dib N, Strumpf RK, Schulman SP, Gerstenblith G, DeMaria AN, Denktas AE, Gammon RS, Hermiller JB, Jr., Reisman MA, Schaer GL, Sherman W. A randomized, double-blind, placebo-controlled, dose-escalation study of intravenous adult human mesenchymal stem cells (prochymal) after acute myocardial infarction. J Am Coll Cardiol 2009;54(24):2277-2286. PMID: 19958962 Amado LC, Gerber BL, Gupta SN, Rettmann DW, Szarf G, Schock R, Nasir K, Kraitchman DL, Lima JA. Accurate and objective infarct sizing by contrast-enhanced magnetic resonance imaging in a canine myocardial infarction model. J Am Coll Cardiol 2004;44(12):2383-2389. PMID: 15607402 Schuleri KH, Centola M, George RT, Amado LC, Evers KS, Kitagawa K, Vavere AL, Evers R, Hare JM, Cox C, McVeigh ER, Lima JA, Lardo AC. Characterization of peri-infarct zone heterogeneity by contrast-enhanced multidetector computed tomography: a comparison with magnetic resonance imaging. J Am Coll Cardiol 2009;53(18):1699-1707. PMID: 19406346

본 요약은 본 발명의 특성과 본질을 간략하게 기술하는 발명의 개요를 제공하기 위한 것이다. 청구항의 범위나 의미를 해석하거나 제한하는 것으로 사용되지 않을 것이라는 공감 하에 이를 제공한다.

본 발명의 구현예는 성체 골수 유래의 간엽 줄기 세포 전구체를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 이 세포는 예를 들어 심장 등의 생체내로 투여되며, 심근을 재생한다.

바람직한 구현예에서, 심혈관 질환 또는 장애를 예방 또는 치료하는 방법은, 개체의 골수로부터 CD271⁺ 간엽 줄기 세포 전구체 (MSC)를 분리하는 단계; 분리한 CD271⁺ 간엽 줄기 세포 (MSC) 전구체를 치료학적 유효량으로 환자에게 투여하는 단계를 포함한다.

일 구현예에서, CD271⁺ MSC는 신경 성장 수용체 (NGFR; CD271)에 대해 친화성이 낮은 골수 세포로부터 분리한다. CD271⁺ 줄기 세포는 자가, 동종동형(syngeneic), 동종이형(allogeneic) 또는 이종(xenogeneic)을 포함하는 공여체 (또는 소스)로부터 분리한다. MSC 전구체 세포는 심근, 혈관 또는 내피 계통 등의 한가지 이상의 계통으로 분화한다.

다른 구현예에서, 분리된 간엽 줄기 세포 전구체는 환자에게 투여하기 전 생체 외에서 배양하여 증식시킨다. 일 구현예에서, 비-부착성 줄기 세포를 증폭시켜, 환자에게 투여한다. 다른 구현예에서, 간엽 줄기 세포 전구체는 선택적으로 소정 기간 동안 가변 농도로 환자에게 투여된다. 일 구현예에서, 간엽 줄기 세포 전구체는, 선택적으로, 심장 유래 기질 세포(heart derived stromal cell)에 의해 컨디셔닝된 배지에서 컨디셔닝된다.

다른 구현예에서, 하나 이상의 제제를 선택적으로 환자에게 투여하며, 상기 제제는 사이토카인, 주화성 인자, 성장 인자 또는 분화 인자들 중 하나 이상을 포함한다.

바람직한 구현예에서, 성체 줄기 세포는 CD271⁺ 표현형을 가진 세포로부터 유래된 골수 간엽 줄기 세포 (MSC) 전구체를 포함한다.

다른 측면들은 아래에서 설명한다.

도 1은 CD271⁺ 세포의 형태를 나타낸 것이다. 사이토스핀을 준비하여, 라이트 김자( Wright Giemsa)로 염색하였다.
도 2A - 2C는 CD271⁺ 세포 (도 2A; 170,000 세포/ T75 cm² 플라스크); BM MNC (도 2B; 15,000,000 세포/T75 cm² 플라스크) 및 C) CD271^- 세포 (도 2C; 17,000,000/T75 cm² 플라스크)로부터의 MSC 생성을 나타낸 것이다.
도 3은 배양 10일째 전형적인 CFU-F 콜로니를 나타낸 것이다.
도 4는 테플론 백 안에서 배양된 7, 14 및 21일째 CD271⁺ 세포를 나타낸 것이다.
도 5는 비-부착성 간엽 줄기 세포 (NA-MSC)에 대한 유세포 분석 결과를 나타낸 것이다. 동위원소 대조군 염색은 녹색 선이고, CD105-FITC 염색은 음영 부이다.
도 6A와 6B는 인간 골수 CD271⁺ 세포의 골성 및 지방 세포로의 분화를 나타낸 것이다. 골성 및 지방 세포 분화는 방법에 기술된 바와 같이 수행하였다. 골성 세포로의 분화 발생은 14일째에 FAST BCIP/NBT로 염색한 알칼리 포스파타제 (AP)의 발현으로 확인되었다 (도 6A; x/100). 지방 세포로의 분화는 11일째에 Oil Red O 염색으로 확인되었다 (도 6B; x/100).
도 7은 배양된 CD 271⁺ 세포에서의 심장 마커의 발현을 나타낸 것이다.
도 8은 처리군들 간의 초음파 심장 검사 결과를 비교하여 나타낸 것이다.
도 9A-9D는 CD271⁺ 세포가 주입된 NOD/SCID 마우스에서 취한 심장 조직 단편의 면역조직화학적 분석 결과를 나타낸 것이다. 심장 단편은 Alu 시퀀스로 염색하고, 심장 마커들로 공동-염색하였다 (αSA, 트로포닌 I (TnI), connexin 43 (Cx)(40X). 도 9A는 혈관 벽과 숙주 근 세포들 사이에 낀 양성 세포가 포함된 경계 구역의 슬라이스이다. 도 9B는 주입된 인간 세포가 여전히 확인되는 심장의 기저(base) 방향 쪽으로의 원위부(remote zone)를 나타낸 것이다. 도 9C는 원위부내 Alu 양성 세포를 가진 큰 혈관을 나타낸 것이다. 도 9D는 다수 양성 세포를 가진 다른 심장의 경계부를 나타낸 것이다.

줄기 세포는 다수의 여러가지 건강 및 의학 연구 분야들에서 잠재성을 가진다. 대부분의 심각한 의학적 증상들 중 일부 증상들은, 예를 들어, 암 및 선천성 기형은, 줄기 세포 분화 또는 유지 과정에서 다소 발생하는 문제로 인해 유발된다. 광의적으로는, 줄기 세포는 배아 줄기 세포와 성체 줄기 세포로 2종의 다른 타입이 존재한다. 배아 줄기 세포는 포배낭(blastocyst)에서 발견되며, 모든 특수화된 배아 조직으로 분화될 수 있는 능력을 가지고 있다. 성체 줄기 세포는 배아 발생 후 전신에서 발견되는 미분화 세포이다. 성체 줄기 세포는 분열하여 사멸 세포를 보충하고, 손상된 조직을 재생할 수 있다. 아울러, 성체 줄기 세포는 혈액, 피부 및 장 조직 등의 재생가능한 장기의 정상적인 턴오버를 유지시킬 수 있다. 성체 줄기 세포는 무한정 분열하여 자가 재생(self-renew) 할 수 있는 능력을 가지고 있으며, 기원하는 장기의 모든 세포 유형을 만들 수 있다.

줄기 세포는 여러가지 세포 타입으로 분화하는 능력에 따라 전능성 (totipotent), 만능성 (pluripotent), 다능성 (multipotent) 또는 단분화성 (unipotent)으로 분류할 수 있다. 전능성 줄기 세포는 생식체들(gamete)의 융합과 수정란의 초기 몇 차례의 분열에서 만들어진다. 이들 세포는 배아 및 배아외 세포 유형으로 분화될 수 있다. 만능성 줄기 세포는 임의의 삼배엽(three germ layer)으로부터 세포로 분화할 수 있다. 다능성 세포는 가장 비슷한 유형의 세포들만 만들 수 있다. 단분화성 세포는 오직 한가지 세포 타입만 만들 수 있지만, 이는 줄기 세포가 아닌 세포와 구분되는 자가 재생 특성을 가지고 있다. 대부분의 성체 줄기 세포는 계통 제한적인 다능성 줄기 세포로서, 이의 장기 조직을 들어 지칭된다. 다능성 성체 줄기 세포는 드문 편이며, 통상 그 수는 적지만, 제대혈 등의 다수 조직들에서 발견할 수 있다 (Ratajczak M. Z., et al., Leukemia 21(5): 860-867 (2007)). 성체 줄기 세포는 여러가지 유형들이 있는데, 그 예로는 지방 유래 줄기 세포 (Zuk, P. A., et al., Tissue Engineering 7:211-216) (2001)), 상피 줄기 세포, 조혈 줄기 세포, 유선 줄기 세포 (Shackleton, M., et al., Breast Cancer R E. 7:86-95 (2005)), 간엽 줄기 세포, 내피 줄기 세포, 신경 줄기 세포 (Alvarez-Bullta, A., et al., Brain Res. Bull. 57:751-758 (2002)), 후각 줄기 세포 (Murrel, W., et al., Dev. Dyn. 233:496-515 (2005)), 고환 줄기 세포, 치수(dental pulp) 유래 줄기 세포 및 제대혈 조혈 전구 세포가 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다.

성체 줄기 세포가 분열하면, 자신과 동일한 또다른 세포와 자신 보다 분화된 세포가 만들어진다. 이러한 비대칭적인 세포 분열로, 동일한 딸 세포 하나와 높은 증식력을 지닌 초기 일시-증폭성 세포 (초기 TA) 하나가 생겨난다. 일련의 세포 분열을 통해, 초기 TA 세포에서 후기 TA 세포가, 이로부터 다시 조직-특이적인 기원 세포(progenitor cell)가 되며, 궁극적으로 장기나 조직을 형성하는 분화된 벌크 세포가 된다 (Ribacka, C., et al. Ann. Med. epub ahead of print: 1-10 (2008)).

본 발명의 몇가지 측면들은 예시를 위한 실시예 이용을 참조하여 아래에서 설명된다. 다수의 구체적인 상세한 설명, 관련성 및 방법들은 본 발명에 대한 충분한 이해를 제공하기 위한 것으로 이해되어야 한다. 그러나, 당해 기술 분야의 당업자라면, 본 발명이 한가지 이상의 구체적인 상세한 설명 없이도 또는 기타 방법으로도 실시될 수 있음을, 쉽게 인지할 것이다. 본 발명은, 일부 행위들이 여러 순서로 및/또는 다른 행위나 현상과 동시에 행해질 수 있는 바와 같이, 예시된 순서의 행위나 현상으로만 제한되지 않는다. 아울러, 예시된 행위나 현상은 본 발명에 따른 방법을 구현하는데 반드시 필요한 것은 아니다.

본 발명의 구현예는 제시된 이론적인 측면 없이도 실시할 수 있다. 또한, 이론적인 측면들은 본 출원인이 제안한 이론으로 결부시키고자 하는 것은 아니라는 이해 하에 제공된다.

정의

본원에 사용되는 용어들은 구체적인 구현예를 기술하기 위한 목적일 뿐, 본 발명을 한정하는 것으로 이해되지 않는다. 본원에서, 단수형 "하나(a, an)" 및 "그것"은 문맥상 명확하게 지칭되지 않는 한 복수형도 물론 포괄하는 것으로 이해된다. 아울러, 용어 "포함하는", "포함한다", "가진", "가진다", "를 구비한" 또는 이의 변형 형태들이 상세한 설명 및/또는 청구항에서 사용되는 경우, 이들 용어들은 용어 "포함하는"과 유사한 방식으로 포괄적인 것으로 의도된다.

용어 "약" 또는 "대략"은 당해 기술 분야의 당업자에 의해 정해지는 특정 값에 대해 허용가능한 오차 범위내인 것을 의미하며, 이는 그 값이 측정 또는 결정되는 방식에 따라, 즉, 측정 시스템의 한계에 따라 일부 좌우된다. 예를 들어, "약"은 당해 분야의 실시 당 표준 편차 1 이상 이내인 것을 의미할 수 있다. 다른 예로, "약"은 해당 수치의 최대 20%, 바람직하게는 최대 10%, 더 바람직하게는 최대 5%, 더 바람직하게는 최대 1%의 범위를 의미할 수 있다. 다른 예로, 구체적으로, 생물 시스템 또는 공정에서, 용어는 수치의 10배, 바람직하게는 5배, 더 바람직하게는 2배 이내를 의미할 수 있다. 명세서와 청구항에 구체적인 수치가 기재된 경우, 달리 언급되지 않은 한, 구체적인 수치에 대한 허용가능한 오차 범위내를 의미하는 용어 "약"은 추정치이어야 한다.

"줄기 세포"는 본원에서 생체내 또는 시험관내에서 본질적으로 무한정 증식할 수 있으며, 다른 세포 타입으로 분화할 수 있는, 미분화된 세포이다. 이는, 이것이 분리된 조직에 존재하는 임의 분화된 세포 타입, 운명이 정해진(committed) 세포 타입, 미성숙한 세포 타입, 기원 세포 타입, 또는 성숙한 세포 타입이거나, 또는 상당히 분화된 세포 타입, 예컨대 공통 전구 세포로부터 유래된 적혈구 및 림프구일 수 있거나, 또는 줄기 세포가 수득된 조직과는 전혀 다른 조직의 임의 단계의 세포 유형일 수 있다. 예를 들어, 혈액 줄기 세포는 뇌 세포 또는 간 세포가 될 수도 있고, 신경 줄기 세포는 혈액 세포도 될 수 있으며, 줄기 세포는 만능성이어서 환경으로부터 적정 신호를 제공받아, 체내 임의 조직으로 분화할 수 있다.

"증식(Propagation)"은 예를 들어 세포 배양 시스템에서 50회 이상, 바람직하게는 100회 이상, 심지어 최대 200배 또는 그 이상 횟수로 세포 분열로 증식하는 분리된 줄기 세포의 능력에 의해 결정될 수 있다. 줄기 세포는 생식 세포에서와 같이 유기체의 모든 세포로 생장할 수 있다는 의미로 "전능성"일 수 있다. 또한, 줄기 세포는, 다수의 여러가지 세포 유형으로 생장할 수 있지만 유기체의 모든 세포로는 생장할 수 없는 의미로 "만능성"일 수 있다. 줄기 세포가 분화하는 경우, 줄기 세포는 통상적으로 더욱 성숙한 세포 타입이 되며, 기원 세포, 분화된 세포 또는 최종 분화된 세포 등의 부분적으로 분화된 세포일 수 있다.

줄기 세포의 "분리"는 조직으로부터 줄기 세포를 취하여 조직의 줄기 세포가 아닌 다른 세포로부터 분리하는 과정을 지칭한다. 분리된 줄기 세포는 통상적으로 다른 세포 타입에 의한 오염이 없는, 즉, "동질성(homogeneity)" 또는 "순수한" 것일 것이며, 분열 및 분화하여, 이것이 분리된 조직의 성숙 세포를 생산하는 역량을 통상 가질 것이다. 분리된 줄기 세포는, 다른 분화된 세포 타입들을 분석 또는 생산함에 있어 줄기 세포의 이용을 방해하지 않는 다른 세포 타입들이 일부 존재하는 형태로도 존재할 수 있다. 분리된 줄기 세포는 통상적으로 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 99.9%의 순도일 것이다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 분리된 줄기 세포는 98% 이상 또는 99% 이상의 순도일 것이다.

본원에서, "배양"은 소정 기간 동안 세포 생존 또는 증식을 뒷받침하는 환경 및 조건 하에 배양함으로써, 세포, 세포 수집물, 조직 또는 장기를 증식 또는 생장시키는 것을 의미한다. 배양은 본 발명에 따라 세포, 세포 수집물, 조직 또는 장기를 성장 및 증식시키는 한 단계 이상을 포함할 수 있다.

"골수 유래 기원 세포 (BMDC: Bone marrow derived progenitor cell)" 또는 "골수 유래 줄기 세포"는 자가 재생 장치(machinery for self-renewal)가 구성적으로(constitutively) 활성형인 원시 줄기 세포(primitive stem cell)를 지칭한다. 이 정의에는 전능성, 만능성 및 전구체인 줄기 세포가 포함된다. "전구 세포 (precursor cell)"는 보다 성숙한 세포로 분화할 수 있는 세포 분화 경로에 있는 모든 세포일 수 있다. 이와 같이, 용어 "전구 세포 집단"은 보다 성숙한 세포로 발생할 수 있는 세포 그룹을 지칭한다. 전구 세포 집단은 전능성 세포, 만능성 세포, 및 줄기 세포 계통이 한정된 세포 (즉, 모든 조혈 계통까지는 아닌 계통으로 또는 예컨대 적혈구 계통의 세포만 만들 수 있는 세포)를 포함할 수 있다.

본원에서, 용어 "자가"는 이후 재-도입되는 개체와 동일한 개체로부터 유래된 임의 물질을 지칭하는 것으로 의미한다.

용어 "이종 세포"는 이식 또는 백신 접종시 수여 동물 숙주가 되는 동물 종이 아닌 다른 동물 종으로부터 유래되는 세포를 지칭한다.

용어 "동종이형 세포"는 "수여 숙주"가 되는 동물과는 동일한 동물 종이지만 하나 이상의 유전자 좌가 유전자 측면에서 상이한 세포를 지칭한다. 이는 통상 한 동물에서는 종이 동일하지만 다른 비-상동 동물로부터 이식되는 세포에 대해 사용된다.

용어 "동종동형 세포"는 동일한 동물 종이며 이식 또는 백신 접종 과정에서 세포주의 수여 숙주가 되는 동물과 대부분의 유전자 마커와 표현형 마커가 동일한 유전자 조성을 가진 세포를 지칭한다. 이는 통상 일란성 쌍둥이로부터 이식되는 세포에 해당되거나, 또는 혈족 관계가 매우 가까운 동물들 간에 이식되는 세포도 해당될 수 있다.

본원에서, 용어 "안전하고 유효한 양" 또는 "치료량"은, 본 발명의 방식으로 사용하였을 때, 합리적인 효용/위험 비에 상응하는 과도한 부작용 (예, 독성, 자극 또는 알레르기 반응) 없이 원하는 치료학적 반응을 이룰 수 있을 만큼 충분한 구성 성분의 양을 지칭한다. "치료학적 유효량"은 원하는 치료학적 반응을 이루는데 유효한 본 발명의 화합물의 양을 의미한다. 구체적인 안전하고 유효한 양 또는 치료학적 유효량은 치료 중인 개별 증상, 환자의 신체 상태, 치료 중인 포유류 또는 동물의 유형, 치료 기간, (만일 있다면) 병용 요법의 특성, 및 사용되는 특정 제형 및 화합물 또는 그 유도체의 구조 등의 인자들에 따라 달라질 것이다.

"환자" 또는 "개체"는 포유류를 지칭하며, 인간과 수의학적 대상을 포함한다.

본원에서, "진단"이라는 표현은 질병이나 증상의 분류, 질병의 중증도 판단, 질병 진행의 모니터링, 질병의 결과 및/또는 회복 가능성 예측을 의미한다. 용어 "검출"은 또한 선택적으로 상술한 임의의 의미를 포괄할 수 있다. "개체로부터 수득되는 생물 샘플"은 또한 아래에서 보다 상세하게 기술되는 바와 같이, 개체로부터 물리적으로 취하지 않은 샘플을 선택적으로 포괄할 수 있다.

"치료"는 장애의 발생 예방 또는 장애의 병태나 증상의 변형을 의도하여 수행된 개입이다. 즉, "치료"는 치료학적 처치와 예방학적 또는 방지적 조치 모두를 의미한다. 본원에서, "완화" 또는 "치료"는 증상이 정상 수준 (예, 건강한 환자나 개체에서 수득되는 수준)에 도달하는 것을 지칭하며, 예를 들어 정상 수준에서의 50% 미만의 오차, 바람직하게는 정상 수준에서의 약 25% 미만의 오차, 더 바람직하게는 정상 수준에서의 10% 미만의 오차에 도달하는 것을 지칭하며, 보다 더 바람직하게는 일반적인 통계적인 검사를 이용하여 결정되는 표준화된 수치와 유의한 차이가 없는 것을 의미한다.

본원에서, 제제 또는 화합물, 세포 등의 "치료학적 유효량" (즉, 유효 용량)은 치료학적으로 (예, 임상적으로) 바람직한 결과를 얻기에 충분한 양을 의미한다. 조성물은 하루에 1회 이상 내지 2일에 1회를 비롯한 주당 1회 이상 투여할 수 있다. 당해 기술 분야의 당업자는, 특정 인자가 용량 및 개체를 효과적으로 치료하는데 필요한 타이밍에 영향을 미칠 수 있으며, 비제한적인 예로서 질병 또는 장애의 중증도, 선행 치료, 개체의 전반적인 건강 상태 및/또는 나이 및 앓고 있는 기타 질환을 포함한다. 아울러, 본 발명의 화합물을 치료학적 유효량으로 개체를 치료하는 것은, 1회 치료 또는 연속 치료를 포함할 수 있다. "예방학적 유효량"은 심장병 또는 장애, 예컨대 허혈증의 재발 또는 환자에서의 이의 발생을 예방하는데 충분한 간엽 줄기 세포의 전구체의 양을 지칭할 수 있으며, 상기 환자는 비제한적인 예로서 심장병 소인을 가진 개체, 예컨대 심장병, 발작 등의 유전적 소인을 가진 개체이다. 또한, 예방학적 유효량은 질병의 방지에 예방학적 효용을 제공하는 예방제의 양을 지칭할 수도 있다.

용어 "샘플"은 광의의 의미로 해석된다. "샘플"은 예컨대 개체로부터 또는 세포 배양 구성인자로부터 분리된 하나 이상의 세포, 조직 또는 유체 (비제한적으로, 혈장, 혈청, 전혈, 뇌척수액, 림프, 눈물, 뇨, 타액, 모유, 고름 및 조직 삼출물 및 분비물), 뿐만 아니라 예를 들어 실험 공정으로부터 수득되는 샘플 등의 생물 샘플을 지칭한다. 생물 샘플은 세포로부터 분리된 염색체 (예, 중기의 염색체로 확장), 세포, 전체 세포 또는 조직으로부터 분리된 기관 또는 막, 서든 분석에서와 같이 고체 지지체에 결합되거나 액상의 게놈 DNA 등의 핵산, 노든 분석에서와 같이 고체 지지체에 결합되거나 액상의 RNA, 고체 지지체에 결합되거나 액상의 cDNA, 고체 지지체에 결합되거나 액상의 올리고뉴클레오티드, 고체 지지체에 결합되거나 액상의 폴리펩타이드 또는 펩타이드, 조직, 조직 프린트(tissue print) 등을 포함할 수도 있다.

잘 공지되어 있는 다수의 조직 또는 유체 수집 방법들을 이용하여, 개체에서 대상 변이체의 DNA, RNA 및/또는 폴리펩타이드 수준을 결정하기 위해, 개체로부터 생물 샘플을 수집할 수 있다. 그 예로는, 미세 바늘 생검, 바늘 생검, 코어 바늘 생검 및 외과적 생검 (예, 뇌 생검) 및 세척액이 있으나, 이로 한정되지 않는다. 사용되는 공정과 무관하게, 생검/샘플을 수득하면, 변이체 수준을 측정할 수 있으며, 따라서 진단을 내릴 수 있다.

본원에서, "심장병 또는 심장 장애" 또는 "심혈관 질환 또는 장애"는, 심근증, 비대성 심근증, 확장성 심근증, 죽상경화증, 관상 동맥 질환, 허혈성 심장병, 심근염, 바이러스 감염증, 상처, 고혈압성 심장병, 판막 질환, 선천성 심장병, 심근 경색, 울혈성 심부전, 부정맥, 심장 리모델링이 이루어지는 질환, 심부전, 허혈증, 심근 경색, 이식, 고혈압, 재협착, 협심증, 류마티스성 심장병 또는 선천성 심혈관 결함 등의 임의 타입의 심장병 또는 심장 장애를 지칭한다. 심장병 또는 심장 장애는, 예를 들어 수축성 감소 등의 심장 조직의 손상과 같은 임의의 이유가 원인일 수 있다 (박출 계수(ejection fraction) 감소로 입증될 수 있음).

심장 기능 불량이 특징적인 심장 손상 또는 장애는 정상적인 심장 기능의 임의 손상 또는 부재, 또는 비정상적인 심장 기능의 존재를 포함한다. 비정상적인 심장 기능은 질환, 손상 및/또는 노화의 결과일 수 있다. 본원에서, 비정상적인 심장 기능은 심근 세포, 심근 세포 집단 또는 심장 자체의 형태적 및/또는 기능적 이상을 포괄한다. 형태적 및 기능적 이상에 대한 비제한적인 예로는, 심근 세포의 물리적 악화 및/또는 사멸, 심근 세포의 비정상적인 증식 패턴, 심근 세포들 간의 물리적 연결의 이상, 심근 세포에 의한 물질 또는 물질들의 과소-생산 또는 과다-생산, 심근 세포에서 정상적으로 생산되는 물질 또는 물질들에 대한 생산 불능, 및 비정상적인 패턴 또는 비정상적인 시기에 전기 자극의 전송을 포함한다. 보다 상당한 수준의 비정상은 운동이상, 박출 계수 감소, 심전도에서 관찰되는 변화 (예, 확장), EKG 변화, 운동 용인성 (exercise tolerance), 모세관 관류 감소 및 혈관조영술에서 관찰되는 변화를 포함한다. 비정상적인 심장 기능은 예를 들어 허혈성 심장병, 예컨대 협심증, 심근 경색, 만성 허혈성 심장병, 고혈압성 심장병, 폐 심장병 (폐심장증), 판막 심장병, 예컨대 류마티스성 열병, 승모판 탈출증, 승모판륜의 석회화, 카시노이드 심장병, 감염성 심내막염, 선천성 심장병, 심근 질환, 예컨대, 심근염, 확장성 심근증, 고혈압성 심근병증, 울혈성 심부전을 발생시키는 심장 장애 및 심장 종양, 예컨대 원발성 육종 및 이차 종양 등의 다수 장애에서 관찰된다. 심장 손상은 또한 예컨대 자상; 생물학적 (예, 바이러스성; 자가면역 질환) 또는 화학적 (예, 화학요법, 약물); 수술; 이식 등의 상처를 포함한다.

"심근 허혈증"은 심장으로의 산소 유입 부족으로 인한 심근 허혈성 손상을 지칭한다. 본원에서, 심근 허혈성 손상이라는 표현은 심근으로의 혈류 감소로 인한 손상을 포괄한다. 심근 허혈증 및 심근 허혈성 손상의 비제한적인 예로는, 대동맥 수축압 감소, 심실내 압력 증가 및 심근 수축, 관상 동맥 협착 (예, 관상 결찰, 고정된 관상 협착(fixed coronary stenosis), 급성 플라그 변화(acute plaque change) (예, 파열, 출혈), 관상 동맥 혈전증, 혈관수축, 대동맥 판막 협착 및 역류, 및 우심방 압력 증가를 포함한다. 심근 허혈증 및 심근 허혈성 손상에 따른 부작용에 대한 비제한적인 예로는, 근 세포 손상 (예, 근 세포의 세포 감소, 근 세포 비대증, 근 세포의 세포 과형성증), 협심증 (예, 안정형 협심증, 변형 협심증, 불안정 협심증, 심인성 급사(sudden cardiac death)), 심근 경색 및 울혈성 심부전을 포함한다. 심근 허혈증으로 인한 손상은 급성 또는 만성일 수 있으며, 그 결과로 병변 발생, 심장 리모델링, 심장 비대증, 벽의 얇아짐(wall thinning), 확장, 및 조합된 기능 변화를 포함할 수 있다. 급성 또는 만성 심근 손상 및/또는 심근 허혈증의 존재 및 병인은, 예를 들어 비침습적인 영상화 (예, MRI, 심전도), 혈관 조영술, 스트레스 검사, 심장 트로포닌 등의 심장 특이 단백질의 분석 및 임상 증상을 비롯하여 당해 기술 분야에 잘 알려져 있는 다양한 방법들과 기법들 중 임의 방법을 이용하여 진단할 수 있다. 이러한 방법들과 기법 뿐만 아니라 기타 적절한 기법들을 이용하여, 본원에 기술된 치료 방법에 적합한 후보를 판단할 수 있다.

골수 유래 CD271 ⁺ 세포

허혈성 심근병증은 개발도상국에서의 주된 심부전 원인으로서, 일단 경색 리모델링이 발생하면 심장 기능을 개선시키기 위한 치료법은 거의 없는 실정이며, 실제 심근 경색 (MI) 후 심장의 유해한 리모델링을 회복시키는 치료제는 부족한 실정이다. 성체 골수 유래 기원 세포를 심장에 투여하는 것은 심근 재생을 보장한다. 본 발명자들은 전임상 모델에서 (최초로 인간에 대한 예비 데이타에서) 수술 및 카테터 전달 시스템을 통해 심장으로 전달되는 골수 (BM) 유래 간엽 줄기 세포 (MSC)의 생착력, 회복 리모델링 지원 능력, 심장 기능 개선력 및 병변 크기 감소 능력을 입증하였다. MSC는 전망이 매우 좋은 것으로 입증되었지만, 이들 세포는 주입할 만큼 충분한 양을 수득하는데 4 내지 5주간의 배양이 요구된다. MSC의 전구체는 골수로부터 신경 성장 인자 수용체 (NGFR; CD271)에 대한 낮은 친화성을 토대로 분리할 수 있으며, CD271⁺ 세포는 치료학적 용도로 쉽게 이용가능한 세포원이다. 중요한 점은, 골수 유래 CD271⁺ 세포를 골수 천자(bone marrow aspiration)로 취하여 4-5시간 안에 충분한 양을 분리할 수 있어, 즉시 사용에 대한 물류적 이점을 제공하다는 것이다. 아울러, 이들 세포는 배양한 MSC에 비해 효능이 현격하게 우수하다. 본 연구의 목적은 설치류 및 돼지의 심근 경색 모델을 대상으로 BM-CD271⁺ 세포를 테스트하는 전임상 실험을 수행하여, 본 연구를 관상 동맥 우회술 시술 후 CD-271⁺ 세포의 직접 외과적 주입에 대한 임상 실험으로 진행시키고자 하는 것이다. 중심적인 이론은 이론으로 결부시키고자 하는 것은 아니나, 외과적 주입에 의해 전달된 BM-CD271⁺ 세포가 생착되어, 심장 기능을 개선시키고, 병변의 크기를 줄이게 된다는 것이다.

만성적인 허혈성 심근병증에 대한 세포 요법은 심부전을 일으킬 수 있는 추가적인 조직 손상을 예방할 수 있다는 가능성을 제공해준다. 본 발명자들은, 인간 CD271⁺ 세포가 MSC의 실제 전구체이며, 마우스 심근 경색 (MI) 모델에서 허혈성 조직을 회복시키는 잠재력을 가지고 있다는 것을 입증하였다. CD271⁺ 세포는 배양된 MSC 보다 효능이 우수하며 심근 세포로 분화되는 능력이 더 높다. 중요하게도, 적당 수의 CD271⁺ 세포를 4-5시간 안에 BM으로부터 분리할 수 있어, 자가 골수 유래 요법으로 환자를 즉시 치료하는 주요한 물류적 진보를 제공한다.

바람직한 구현예에서, 골수 (BM) 유래 간엽 줄기 전구체 CD271⁺ 세포는 심부전 환자에게서 허혈성 조직을 치료하는데 이용된다.

다른 바람직한 구현에에서, 심혈관 질환 또는 장애를 예방 또는 치료하는 방법은, 환자에게 유효량의 CD271⁺ 줄기 세포를 투여하는 단계를 포함한다. 바람직하게는, CD271⁺ 세포는 신경 성장 인자 수용체 (NGFR; CD271)에 대해 친화성이 낮은 골수 유래 세포로부터 분리한다.

다른 바람직한 구현예에서, CD271⁺ 줄기 세포는 자가, 동종이형, 동종동형, 이종 또는 이의 조합이다. 투여된 줄기 세포는 증식하여 손상된 조직, 예컨대 심장 조직을 회복시킨다. 이들 세포는 다양한 계통으로 분화하여 손상된 조직을 재생 및 회복시킨다.

다른 바람직한 구현예에서, 하나 이상의 제제가 선택적으로 환자에게 투여되며, 상기 제제는 사이토카인, 주화성 인자, 성장 인자 또는 분화 인자 중 하나 이상을 포함한다.

일 측면에서, 본 발명은 심장 또는 순환계 질환 또는 상해를 가진 환자에게 치료학적 세포 조성물을 투여하는 단계, 및 환자에서 심장 기능 개선을 평가하는 단계를 포함하며, 상기 세포 조성물이 본원에 기술된 CD271⁺을 포함하는 것인, 심장 질환 또는 상해를 가진 환자를 치료하는 방법을 제공한다. 일 구현예에서, 심장 질환은 심근병증이다. 구체적인 구현예들에서, 심근병증은 특발성 심근병증이거나 공지 원인으로 인한 심근병증이다. 다른 구현예에서, 심근병증은 허혈성이거나 본래 비-허혈성이다. 다른 구현예에서, 심장 질환 또는 순환계 질환은 혈관성형술, 동맥류, 협심증 (angina, angina pectoris), 대동맥 협착증, 대동맥염, 부정맥, 죽상경화증, 동맥염, 비대칭성 중격 비대증 (ASH), 죽상 경화증, 심방 세동 및 심방 조동, 세균성 심내막염, 바로 증후군 (승모판 탈출증), 서맥, 버거씨병 (폐색성 혈전혈관염), 심장비대, 심근증, 심장염, 경동맥 질환, 대동맥 축착, 선천성 심장 질환 (선천성 심장 결함), 울혈성 심부전 (심부전), 관상 동맥 질환, 아이젠멩거 증후군, 색전증, 심내막염, 피부퐁통증(erythromelalgia), 세동, 심유근 이형성증, 심장 차단, 심장 잡음, 고혈압, 저혈압, 특발성 유아 동맥 석회화, 가와사키병 (피부 점막의 림프절 증후군, 피부 점막 림프절 질환, 유아 다발동맥염), 대사 증후군, 미세혈관 협심증, 심근 경색 (심장 발작), 심근염, 발작성 심방 빈맥 (PAT), 결절성 동맥주위염 (다발동맥염, 결절성 다발동맥염), 심낭염, 말초 혈관 질환, 주요 사지 허혈증, 당뇨병성 혈관병증, 정맥염, 폐동맥 판막 협착증 (폐동맥 협착증), 레이노 증후군, 신장 동맥 협착증, 신혈관성 고혈압, 류마티스 심장병, 중격 결손, 무증상 허혈증(silent ischemia), X 증후군, 빈맥, 타카야수 동맥염, 팔로 사징(Tetralogy of Fallot), 대혈관 전위증, 삼첨판 폐쇄, 동맥간증, 판막 심장병, 정맥류성 궤양, 하지 정맥류, 혈관염, 심실 중격 결손, 울프-파킨슨-화이트 증후군 또는 심내막 융기 결손 중 하나 이상을 포함한다.

다른 구현예에서, 심장병 또는 순환계 질환은 하나 이상의 급성 류미티스 열, 급성 류마티스성 심낭염, 급성 류마티스성 신내막염, 급성 류마티스성 심근염, 만성 류마티스성 심장병, 승모판 질환, 승모판 협착증, 류마티스성 승모판 폐쇄부전증, 동맥 판막 질환, 기타 심내막 구조 질환, 허혈성 심장병 (급성 및 아급성), 협심증, 폐 순환 질환 (급성 폐 심장 질환, 폐색전, 만성 폐 심장 질환), 척추후측만곡성 심장 질환, 심근염, 심내막염, 심근내막 섬유증, 심내막 섬유탄력증, 방실 차단, 심장 부정맥, 심근 퇴행, 뇌혈관 질환, 뇌전동맥의 폐색 및 협착, 뇌동맥 폐색, 동맥 질환, 소동맥 질환 및 모세관 질환 (죽상 경화증, 동맥류)등의 순환계 질환, 또는 정맥 질환 및 림프관 질환 중 하나 이상을 포함한다.

일 구현예에서, 치료는, 다른 타입의 세포와 함께 또는 다른 타입의 세포 없이, 심근병증 환자에게 CD271⁺ 세포를 포함하는 치료학적 세포 조성물의 처치를 포함한다. 다른 바람직한 구현예에서, 환자는 치료로부터 효과를 경험하게 되며, 예를 들어 심장에 존재하는 줄기 세포 또는 기원 세포 등의 다른 세포의 생장을 지지하는 세포의 능력, 조직 내방성장(tissue ingrowth) 또는 조직의 혈관화, 유리한 세포 인자, 케모카인, 사이토카인 등의 존재에 대한 효과를 경험하게 된다.

본 발명의 CD271⁺ 세포 또는 치료학적 조성물을 투여받은, 순환계 질환 또는 장애를 가진 개체에서의 향상은, 순환계 질환 또는 장애의 한가지 이상의 증상에 대한 검출가능한 개선으로 평가 또는 입증할 수 있다.

다른 구현예에서, 본 발명의 CD271⁺ 세포 또는 치료학적 조성물을 투여받은, 순환계 질환 또는 장애를 가진 개체에서의 향상은, CD271⁺ 세포 투여하기 전의 개체와 비교하여, 하나 이상의 심장 기능에 대한 지표의 검출가능한 수준으로의 향상, 예컨대 한가지 이상의 가슴 심박출 (chest cardiac output, CO), 심장 지수 (CI), 폐 동맥 쐐기압(PAWP), 및 심장 지수 (CI), 분획 단축율(fractional shortening) %, 박출 계수 (EF), 좌심실 박출 계수 (LVEF); 좌심실 이완기말 내경 (LVEDD), 좌심실 수축기말 내경 (LVESD), 수축성 (예, dP/dt), 압력-용적 곡선(pressure-volume loop), 심장 작동 측정치, 심방 및 심실의 기능성 증가; 펌핑 효율 증가, 펌핑 효율 저하율 감소, 혈행역학적 기능 소실 감소; 및 심근병증과 관련된 합병증 감소에 대한 검출가능한 수준의 향상을 입증함으로써, 평가 또는 입증될 수 있다.

또한, 본 발명의 치료학적 조성물을 투여받는 개체에서의 향상은 주관적인 기준, 예컨대 투여 후 건강 상태에 대한 개체의 자가-판단으로 평가할 수도 있다.

특정 구현예들에서, 본 발명의 치료 방법은 치료학적 CD271⁺ 세포를 간엽 계통으로, 예컨대 심근형성, 혈관형성 또는 맥관형성 표현형으로, 또는 근 세포, 심근 세포, 내피 세포, 심근 세포, 심외막 세포, 혈관 내피 세포, 평활근 세포 (예, 혈관 평활근 세포)로의 분화를 유도하는 단계를 포함한다.

CD271⁺ 세포 또는 상기 세포를 포함하는 치료 조성물을 이를 필요로 하는 개체에게 투여하는 것은, 예컨대, 이식 (transplantation, implantation) (예, 세포 자체의 이식 또는 매트릭스-세포 조합의 일부로서의 세포의 이식), 주사 (예, 질환 또는 병태 주위로 직접, 예컨대 심근 경색에 걸린 적 있는 개체의 심장내 허혈성 부위에 직접 주사), 주입, 카테터를 통한 전달, 또는 세포 치료법을 제공하기 위한 당해 기술 분야에 공지된 임의의 기타 수단에 의해 달성할 수 있다.

일 구현예에서, 치료학적 세포 조성물은, 예컨대 개체의 한 곳 이상에 주입함으로써 이를 필요로하는 개체에게 제공된다. 특정 구현예에서, 치료학적 세포 조성물은 심장내 주입에 의해, 예를 들어 심장내 허혈성 부위로 제공된다. 다른 구체적인 구현예에서, 세포는 심장의 표면 상으로, 인접 부위로, 또는 심지어 보다 먼 부위로 주입된다. 바람직한 구현예에서, 세포는 질환이 발생하거나 손상된 부위로 회귀할 수 있다.

관상 또는 혈관계 질환 또는 병태를 가진 개체는 세포가 치료학적으로 유익한 임의 시점에 CD271⁺ 세포를 투여받을 수 있다. 특정 구현예에서, 예컨대, 본 발명의 세포 또는 치료 조성물은, 심근 경색 발생 후 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 또는 24시간 이내에, 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30일 이내에 투여된다. 심근 경색 발병과 가까운 시기에 투여하는 것이, 예컨대 1-3일 또는 1-7일 이내에 투여하는 것이, 심근 경색 발병 후 장기간 경과 후, 예를 들어 3일 또는 7일 이후에 투여하는 것 보다 바람직하다. 다른 구현예들에서, 본 발명의 세포 또는 치료 조성물은 질환 또는 병태의 1차 진단 후 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 또는 24시간 이내, 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29일 또는 30일 이내에 투여된다.

또한, 본 발명은 심근 경색 치료에 사용하기 위한 키트를 제공한다. 상기 키트는 예컨대 약제학적으로 허용가능한 담체와 혼합함으로써 약제학적으로 허용가능한 형태로 제조할 수 있는 치료학적 세포 조성물과 어플리케이터를, 사용 설명서와 함께 제공한다. 이상적으로는, 키트는 현장에서, 예컨대 병원에서 또는 응급 관리자에 의해 사용되며, 심근 경색 또는 유사한 심장 병태를 가진 것으로 진단받았던 환자에게 제공될 수 있다.

본원에 제공되는 치료 방법의 일부 측면들에서, CD271⁺ 세포는 CD271⁺ 세포가 아닌 줄기 세포, 근모 세포, 근 세포, 심근모 세포, 심근 세포, 근모 세포의 기원 세포, 근 세포의 기원 세포, 심근모 세포의 기원 세포 및/또는 심근 세포의 기원 세포와 함께 투여된다.

특정 구현예에서, 본 발명에 제공되는 치료 방법은 CD271⁺ 세포, 예컨대 상기 세포를 포함하는 치료 조성물을 심장 질환 또는 순환계 질환을 가진 환자에게 투여하는 단계, 및 환자에서 심장 기능의 개선을 평가하는 단계를 포함하며, 상기 치료학적 세포 조성물은 매트릭스-세포 복합체로서 투여된다. 특정 구현예에서, 상기 매트릭스는 적어도 상기 세포를 포함하는 스캐폴드, 바람직하게는 생분해성이다.

일부 구현예들에서, CD271⁺ 세포 집단은 심장형성(cardiogenic), 혈관신생(angiogenic), 혈관형성(hemangiogenic) 또는 혈관성(vasculogenic) 경로를 따라 줄기 세포 또는 기원 세포의 분화를 자극하는 하나 이상의 인자의 존재 하에 배양 또는 투여한다. 이러한 인자들은 당해 기술 분야에 공지되어 있으며; 분화에 적합한 조건 결정은 일반적인 실험으로 달성할 수 있다. 이러한 인자로는 성장 인자, 케모카인, 사이토카인, 세포 생성물, 탈메틸화제, 및 예컨대 줄기 세포를 심장형성, 혈관신생, 혈관형성 또는 혈관성 경로 또는 계통으로의 분화를 자극하는 현재 공지되거나 이후 정해질 기타 자극 등의 인자들을 포함하나, 이로 한정되지 않는다. 예를 들어, CD271⁺ 세포는 탈메틸화제, BMP, FGF, Wnt 인자 단백질, Hedgehog, 및/또는 항-Wnt 인자 중 하나 이상을 포함하는 인자의 존재 하에 세포를 배양함으로써, 심장형성, 혈관신생, 혈관형성 또는 혈관성 경로 또는 계통으로 분화시킬 수 있다.

탈메틸화제의 포함은, 간엽 계통을 따라 심근형성 경로 쪽으로 세포가 분화되게 하는 경향이 있다. 분화는, 예를 들어 카디오미오신, 골격 미오신 또는 GATA4 중 하나 이상의 발현에 의해; 또는 박동성 리듬, 자발성 또는 유도성 획득에 의해; 또는 적어도 부분적으로 부정맥을 유도하지 않으면서 환자의 심장 근육으로 통합하는 능력에 의해, 확인할 수 있다. 이러한 분화를 개시하기 위해 사용할 수 있는 탈메틸화제로는, 5-아자시티딘, 5-아자-2'-데옥시시티딘, 디메틸설폭사이드, 켈에리트린 클로라이드(chelerythrine chloride), 레티노익 산 또는 이의 염, 2-아미노-4-(에틸티오)부티르산, 프로타인아미드 및 프로카인이 있으나, 이로 한정되지 않는다.

본원의 특정 구현예에서, 세포는 심장형성, 혈관신생, 혈관형성 또는 혈관성 세포 또는 기원 세포가 된다. 바람직하게는, 세포는 비제한적인 예로서 심장 근육, 심장의 혈관과 기타 구조물, 심장 혈관 또는 말초 혈관 등을 비롯하여 수여체의 심혈관 시스템에 통합된다. 특정 다른 구현예들에서, CD271⁺ 세포는 심근형성 세포 또는 이의 기원 세포의 표지 2 이상을 획득한 세포로 분화하여, 수여체의 심장 또는 혈관 구조에 통합될 수 있다. 특정 구현예에서, 개체에게 투여된 세포는 부정맥, 심장 결함, 혈관 결함 또는 개체의 순환계이나 건강상의 다른 기형을 증가시키지 않는다. 특정 구현예에서, CD271⁺ 세포는 환자의 심장 근육, 혈관, 혈액 등에 본래 존재하는 줄기 세포가, 스스로, 예를 들어 심근 세포로 또는 적어도 심장형성, 혈관신생, 혈관형성 또는 혈관성 계통을 따라 분화하도록 촉구하는 작용을 한다.

CD271⁺ 세포 및 이 세포 집단은 개체에게, 예컨대 심장 또는 순환계 질환, 장애 또는 병태를 가지고 있거나 앓고 있는 개체에게 치료학적으로 또는 예방학적으로 제공될 수 있다. 이러한 질환, 장애 또는 병태는 죽상경화증, 심근병증 또는 심장 상해, 예컨대 심근 경색 또는 (급성 또는 만성) 상처와 같은 허혈성 상해로 인한 울혈성 심부전을 포함할 수 있다.

CD271⁺ 세포는 세포와, 인슐린 유사 성장 인자 (IGF), 혈소판 유래 성장 인자 (PDGF), 상피 성장 인자 (EGF), 섬유모 세포 성장 인자 (FGF), 혈관 내피 성장 인자 (VEGF), 간세포 성장 인자 (HFF), IL-8, 항혈전제 (예, 헤파린, 헤파린 유도체, 유로키나제 및 PPack (덱스트로페닐알라닌 프롤린 아르기닌 클로로메틸케톤); 항혈전 화합물, 혈소판 수용체 길항제, 항혈전 항체, 항혈소판 수용체 항체, 아스피린, 디피리다몰, 프로타민, 히루딘, 프로스타글란딘 저해제 및/또는 혈소한 저해제), 항세포자살제 (예, EPO, EPO 유도체 및 유사체, 및 이의 염, TPO, IGF-I, IGF-II, 간세포 성장 인자 (HGF) 또는 카스파제 저해제), 항염증제 (예, P38 MAP 키나제 저해제, 스타틴, IL-6 및 IL-1 저해제, 페미롤라스트, 프라닐라스트, 레미카드, 시롤리무스, 비스테로이드계 항염증 화합물, 예컨대 아세틸살리실산, 이부프로펜, 데폭살린, 톨메틴 또는 슈프로펜), 면역억제제 및 면역조절제 (예, 칼시뉴린 저해제, 예컨대 사이클로스포린, 타크롤리무스, mTOR 저해제, 예로, 시롤리무스 또는 에베롤리무스; 항증식제, 예컨대 아자티오프린 및 미코페놀레이트 모페틸; 코르티코스테로이드, 예컨대, 프레드니솔론 또는 하이드로코르티손; 항체, 예컨대 항-IL-2Rα 수용체 단일클론 항체, 바실릭시맵, 다클리주마, 항-T-세포 다클론 항체, 예로, 항-흉선세포 글로불린 (ATG), 항-림프구 글로불린 (ALG), 및 항-T 세포 단일클론 항체 OKT3, 및/또는 항산화제 (예, 프로부콜; 비타민 A, C 및 E, 코엔자임 Q-10, 글루타티온, L 시스테인, N-아세틸시스테인, 또는 항산화제 유도체, 유사체 또는 전술한 물질의 염) 등의 다른 치료제를 포함하는, 치료 조성물의 형태로 개체에게 투여할 수 있다. 특정 구현예에서, CD271⁺ 세포를 포함하는 치료 조성물은 하나 이상의 추가적인 세포 유형들, 예컨대 성체 세포 (예, 섬유모 세포 또는 내배엽 세포), 또는 줄기 세포 또는 기원 세포를 더 포함한다. 이들 치료제 및/또는 하나 이상의 추가적인 세포는 각각 또는 이들 화합물 또는 제제 2 이상을 조합하여 이를 필요로 하는 개체에게 투여할 수 있다.

특정 구현예에서, 치료받을 개체는 포유류이다. 특정 구현예에서, 치료받을 개체는 인간이다. 특정 구현예에서, 치료받을 개체는 가축 동물 또는 사육 동물이다. 다른 특정 구현예에서, 치료받을 개체는 말, 양, 소, 비육우용 거세 숫소, 돼지, 개 또는 고양이이다.

다른 바람직한 구현예에서, 줄기 세포 집단은 심장 조직으로부터 분리된 세포의 대조군 샘플 대비 적어도 약 80% 순도이며, 바람직하게는, 줄기 세포 집단은 대조군 세포 샘플 대비 약 90%의 순도이며, 바람직하게는, 줄기 세포 집단은 대조군 세포 샘플 대비 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.9%의 순도이다.

다른 바람직한 구현예에서, 분리된 CD271⁺ 줄기 세포 집단은, 최종 사용자가 원하는 임의 분석에, 예를 들어, 비-천연 분자, 외래 분자, 세포에서 활성화되거나 활성화되지 않을 수 있는 천연 분자를 발현하는데 사용될 수 있다. 이러한 분자의 예로는 성장 인자, 수용체, 리간드, 치료제 등일 수 있다. 상기 분자는 최종 사용자의 요구에 따라 분리된 줄기 세포에서 발현되도록 하기 위해 최종 사용자에 의해 선택될 수 있다. 분자는, 예를 들어, 폴리펩타이드, 펩타이드, 올리고뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드, 유기 분자 또는 무기 분자를 포함한다.

다른 바람직한 구현예에서, 줄기 세포는 배아 줄기 세포, 성체 줄기 세포, 제대혈 줄기 세포, 체세포 줄기 세포 또는 암 줄기 세포일 수 있다. 바람직한 구현예에서, 줄기 세포는 성체 줄기 세포, 바람직하게는 심장 줄기 세포이다.

추가적으로, 본 발명의 줄기 세포는 조혈 줄기 세포 또는 간엽 줄기 세포일 수 있다. 본 발명의 줄기 세포는 전능성, 만능성, 다능성 또는 단분화성 줄기 세포일 수 있다. 본 발명에 따른 줄기 세포는, 비제한적인 예로서, CD133, CD34, CD38, CD117/c-kit, OCT3/4, Nanog, RUNX2, SOX9, 인테그린, SPARC, 오스테오칼신, 엔도글린 및 STRO-1 등의 하나 이상의 줄기 세포 마커의 존재에 의해 선별할 수 있다.

본 발명의 줄기 세포는 일차 줄기 세포(primary stem cell)이거나, 또는 확립된 줄기 세포주, 전암성(premalignant) 줄기 세포주, 암 세포주 또는 임의의 줄기 세포 마커를 생산하는 임의 세포주로부터 유래될 수 있다. 일차 줄기 세포는 암 환자나 건강한 환자로부터 유래될 수 있다.

투여: CD271⁺ 줄기 세포 집단의 분리는, 다양한 종류의 용도에, 예컨대 손상된 심근과 같은 심장 질환 또는 장애를 치료하기 위해 심장 또는 다른 기관에 이식하는데 유용하다. 본원에서, "손상된 심근"은 허혈성 증상에 노출된 바 있는 심근 세포를 지칭한다. 이들 허혈성 병태는 심근 경색 또는 기타 심혈관 질환 또는 관련 합병증에 의해 유발될 수 있다. 산소 결핍은 주변 세포의 사멸을 유발하여, 경색시키고 궁극적으로 병변을 만든다. 본원에서, "노화성 심근병증"은 유기체가 노화됨에 따른 고유 기전의 결과로서의 심근 손상을 지칭한다.

바람직한 구현예에서, 줄기 세포는, 손상된 심근 부위에 분리된 줄기 세포를 투여함으로써, 손상된 심근 또는 노화성 심근병증을 이를 필요로하는 개체에서 회복 및/또는 재생하는 방법에 사용되며, 투여되는 줄기 세포는 근 세포, 내피 세포 또는 평활근 세포 중 하나 이상으로 분화된다. 분화된 세포는 증식하여, 심장에서의 적절한 기능에 필수적인 모든 구조물, 즉, 관상 동맥, 소동맥, 모세관 및 심근 등의 다양한 심장 구조를 형성할 수 있다. 기능성 완전성 및 구조적 완전성 모두를 복원하는 능력도 본 발명의 또다른 측면이다. 바람직한 구현예에서, 줄기 세포는 성체 심장 줄기 세포이다. 다른 구현예에서, 성체 심장 줄기 세포는 심장 또는 혈관 병태 중 한가지에 대해 치료학적 처치가 필요한 개체로부터 회수한 심장 조직으로부터 분리되며, 개체에게 다시 이식된다.

다른 바람직한 구현예에서, 분리된 CD271⁺ 줄기 세포는 줄기 세포를 환자에게 투여하기 전에 생체외에서 배양 및 증식시킨다. 세포는, 예를 들어, 자가, 동종동형, 동종이형, 이종 또는 이의 임의 조합일 수 있다. 연속적인 투여가 필요한 경우, 동일한 줄기 세포 소스를 사용해야 하는 것은 아니다.

따라서, 바람직한 구현예에서, 본 발명은 치료학적 유효 용량 또는 유효량의 줄기 세포를 심장에 투여하는 단계를 포함한다. 유효 용량은 유익하거나 바람직한 임상적인 결과를 달성하는데 충분한 양이다. 용량은 1회 이상의 투여로 투여할 수 있다. 유효 용량으로 간주할 수 있는지에 대한 정확한 결정은 환자의 신체 크기, 연령, 심근 손상 면적 및 손상 후 경과 시간 등의 각 환자에 개별적인 인자를 기반으로 할 수 있다. 당해 기술 분야의 당업자, 구체적으로 의사 또는 심장학자는 과도한 실험없이도 유효량을 구성하는 줄기세포의 수를 정할 수 있을 것이다.

본 발명의 일부 구현예에서, 분리된 세포는 개체에게 투여하기 전에 활성화된다. 줄기 세포의 활성화는 분리된 줄기 세포를 간세포 성장 인자 (HGF), 인슐린-유사 성장 인자-1 (IGF-1) 또는 이의 변이체 등의 하나 이상의 사이토카인에 노출시켜 달성할 수 있다. HGF는 c-Met 수용체의 활성화를 통한 줄기 세포의 이동과 회귀에 긍정적으로 작용한다 (Kollet et al. (2003) J. Clin. Invest. 112: 160-169; Linke et al. (2005) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 8966-8971; Rosu-Myles et al. (2005) J. Cell. Sci. 118: 4343-4352; Urbanek et al. (2005) Circ. Res. 97: 663-673). 마찬가지로, IGF-1과 이의 해당 수용체 (IGF-1R)는 심장 줄기 세포의 분열을 유도하고, 텔로머라제의 활성을 상향 조절하고, 증식 노화(replicative senescence)를 방해하며, 심장에서 기능적으로 적합한(competent) 심장 줄기 세포의 풀을 보존한다 (Kajstura et al. (2001) Diabetes 50: 1414-1424; Torella et al. (2004) Circ. Res. 94: 514-524; Davis et al. (2006) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103: 8155-8160). 바람직한 구현예에서, 분리된 줄기 세포는 간세포 성장 인자 (HGF) 및/또는 인슐린 유사 성장 인자-1 (IGF-1)과 접촉된다.

분리된 줄기 세포의 활성화에 적합한 사이토카인에 대한 일부 다른 비제한적인 예로는, Kanemura et al. (2005) Cell Transplant. 14:673-682; Kaplan et al. (2005) Nature 438:750-751; Xu et al. (2005) Methods Mol. Med. 121:189-202; Quinn et al. (2005) Methods Mol. Med. 121:125-148; Almeida et al. (2005) J Biol. Chem. 280:41342-41351; Bamabe-Heider et al (2005) Neuron 48:253-265; Madlambayan et al. (2005) Exp Hematol 33: 1229-1239; Kamanga-Sollo et al. (2005) Exp Cell Res 311:167-176; Heese et al. (2005) Neuro-oncol. 7:476-484; He et al. (2005) Am J. Physiol. 289:H968-H972; Beattie et al. (2005) Stem Cells 23:489-495; Sekiya et al. (2005) Cell Tissue Res 320:269-276; Weidt (2004) Stem Cells 22:890-896; Encabo et al (2004) Stem Cells 22:725-740; 및 Buytaeri-Hoefen et al. (2004) Stem Cells 22:669-674에 기술된 바와 같이, 액티빈 A, 골 형성 단백질 2, 골 형성 단백질 4, 골 형성 단백질 6, 카디오트로핀-1, 섬유모 세포 성장 인자 1, 섬유모 세포 성장 인자 4, Flt3 리간드, 신경교-유래 신경영양성 인자, 헤파린, 인슐린 유사 성장 인자 II, 인슐린 유사 성장 인자 결합 단백질-3, 인슐린 유사 성장 인자 결합 단백질-5, 인터루킨-3, 인터루킨-6, 인터루킨-8, 백혈병 저해 인자, 미드카인, 혈소판 유래 성장 인자 AA, 혈소판 유래 성장 인자 BB, 프로게스테론, 푸트레신, 줄기 세포 인자, 기질-유래 인자-1, 트로보포이에틴, 형질전환 성장 인자-α, 형질전환 성장 인자-β1, 형질전환 성장 인자-P2, 형질전환 성장 인자-β2, 혈관 내피세포 성장 인자, Wnt1, Wnt3a 및 Wnt5를 포함하며, 상기 문헌들은 전체 내용이 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.

또한, 전술한 사이토카인의 기능성 변이체들도 본 발명에 이용할 수 있다. 기능성 사이토카인 변이체는 대응되는 수용체에 결합하여 활성화하는 능력을 보유할 것이다. 변이체는 아미노산 치환, 삽입, 결손, 대안적인 스플라이스 변이체 또는 천연 단백질의 단편을 포함할 수 있다. 예컨대, NK1 및 NK2는 c-MET 수용체에 결합할 수 있는 HGF의 천연 스플라이스 변이체들이다. 이들 선천적으로 형성되는 스플라이스 변이체들 유형은 물론 기능을 보유한 사이토카인 단백질의 조작된 변이체도 본 발명으로 간주된다.

일부 구현예에서, 줄기 세포를 이를 필요로하는 개체에 투여하는 것은 심장에 하나 이상의 사이토카인을 투여함으로써 달성된다. 사이토카인은 줄기 세포 인자 (SCF), 과립구-콜로니 자극 인자 (G-CSF), 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자 (GM-CSF), 기질 세포-유래 인자-1, steel 인자, 혈관 내피 세포 성장 인자, 대식세포 콜로니 자극 인자, 과립구-대식세포 자극 인자, 간세포 성장 인자 (HGF), 인슐린 유사 성장 인자-1 (IGF-1), 인터루킨-3 또는 줄기 세포를 자극 및/또는 가동화할 수 있는 임의의 사이토카인으로 이루어진 군으로부터 선택할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 사이토카인은 HGF, IGF-1, HGF 또는 IGF-1의 기능성 변이체, 또는 이의 조합으로부터 선택된다. 사이토카인은 줄기 세포의 CD271⁺ 집단과 동시에 전달할 수 있다. 다른 예로, 사이토카인의 투여는 지정된 시기로 줄기 세포의 투여 전에 선행되거나 또는 투여 이후에 이루어질 수 있다. 시기는 약 15분, 약 30분, 약 1시간, 약 3시간, 약 6시간, 약 12시간, 약 24시간, 약 36시간, 약 1주일, 약 2주일 약 1달 또는 약 6달일 수 있다.

사이토카인은 1회 이상의 투여에 의해 심장에 전달할 수 있다. 일 구현예에서, 사이토카인은 단회 투여에 의해 전달된다. 다른 구현예에서, 사이토카인은 동일 용량으로 여러번 투여로 심장에 전달된다. 본 발명의 바람직한 구현예는 주화성 농도 구배가 형성되도록 심장에 사이토카인을 여러번 투약하는 투여를 포함한다. 심방 및/또는 심장의 정점(apex)으로부터 좌심실의 중간부로 이어지는 주화성 농도 구배는 사이토카인의 농도를 증가시키면서 다회 투약함으로써 달성할 수 있다. 다른 예로, 주화성 농도 구배는 줄기 세포의 이식부에서 좌심실의 중앙부 또는 경색된 심근의 접경부까지 형성될 수 있다.

일 구현예에서, 2 이상의 사이토카인이 주화성 농도 구배 형성에 사용된다. 다른 구현예에서, 제1 사이토카인의 농도는 일정하게 유지되는 반면, 제2 사이토카인의 농도는 가변적이며, 주화성 농도 구배를 형성한다.

바람직한 구현예에서, 주화성 농도 구배는 IGF-1 및 HGF의 다회 투여에 의해 형성되며, 이때 IGF-1의 농도는 일정하게 유지되고 HGF 농도는 가변적이다. 일부 구현예에서, HGF의 가변적인 농도는 약 0.1 내지 약 400 ng/ml의 범위일 수 있다. 다른 구현예에서, IGF-1의 농도는 약 0.1 내지 약 500 ng/ml일 수 있다.

분리된 줄기 세포의 CD271⁺ 집단과 사이토카인은 주입에 의해 심장으로 투여될 수 있다. 주입은 바람직하게는 심근내이다. 당해 기술 분야의 당업자가 인지하는 바와 같이, 심장은 기능성 근육이므로, 이러한 방법은 줄기 세포 및/또는 사이토카인을 전달하는 바람직한 방법이다. 이러한 경로에 의한 주입은, 주입된 물질이 심장의 수축 운동으로 인해 유실되지 않는다는 것을 보증한다.

본 발명의 다른 측면에 있어서, 줄기 세포 및/또는 사이토카인은 경심내막(transendocardial) 또는 경심외막적 (trans-epicardial 주입에 의해 투여된다. 이러한 바람직한 구현예는 사이토카인이 심근내로 주입되는 구현예에 필수적인 주변 보호 막을 통과하도록 할 수 있다. 본 발명의 다른 바람직한 구현예는 경심내적 주입을 전달하기 위한 카테터를 이용한 방식으로의 사용을 포함한다. 카테터의 사용은 흉강의 개방이 필연적일 수 있는 보다 침습적인 전달 방법을 방지한다. 당해 기술 분야의 당업자들에게 이해되는 바와 같이, 최적의 회복 시간은 침습적인 절차를 보다 최소화함으로써 가능할 것이다. 카테터 방식은 NOGA 카테터 또는 유사 시스템으로서 그러한 기법의 사용을 포함한다. NOGA 카테터 시스템은 대상 영역에 대한 전기기계식 맵핑과, 목표 주입물을 전달하거나 또는 타겟 부위를 치료제로 젖시는데 사용할 수 있는 접이식 바늘(retractable needle)을 제공함으로써, 가이드 투여를 용이하게 한다. 본 발명의 임의 구현예는 주입물을 전달하거나 또는 치료제를 제공하기 위한 상기한 시스템을 사용하여 투여할 수 있다. 당해 기술 분야의 당업자는, 본 발명과 함께 사용할 수 있는 영상화 및 카테터 전달 시스템을 통합하여 타겟화된 치료를 제공할 수 있는 대안 시스템을 알 것이다. NOGA 및 유사 시스템의 사용에 대한 정보는, 예를 들어, Sherman (2003) Basic Appl. Myol. 13: 11-14; Patel et al (2005) The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery 130:1631-38; 및 Perrin et al. (2003) Circulation 107: 2294-2302에서 확인할 수 있으며, 각 문헌의 전체 내용은 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. 다른 구현예에서, 분리된 심장 줄기 세포는 관상내 투여 경로에 의해 투여한다. 당해 기술 분야의 당업자는, Dawn et al. (2005) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102, 3766-3771에 기술된 방법을 비롯하여, 본 발명과 함께 이용할 수 있는 다른 유용한 전달 또는 이식 방법을 인지할 것이며, 상기 문헌은 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.

본 발명의 방법은, 비제한적인 예로서, 죽상경화증, 허혈증, 고혈압, 협착증, 협심증, 류마티스 심장병, 선천성 심혈관 결함, 노화성 심근병증, 및 동맥 염증 등의 심혈관 질환, 및 동맥, 소정맥 및 모세관의 기타 질환을 치료하는데 유용하다. 구체적으로, 본 발명의 방법은 상기 열거된 질환들 중 한가지, 또는 노화로 인한 심근 세포의 일반적인 감퇴로 인해 손상된 심근의 회복 및/또는 재생을 제공한다.

또한, 본 발명은 성체 심장 줄기 세포의 분리된 CD271⁺ 집단을 개체의 심장에 투여하는 단계 및 안지오텐신 II 수용체 길항제를 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 심부전을 예방 또는 치료하는 방법을 포함한다. 일 구현예에서, 성체 심장 줄기 세포의 CD271⁺ 집단은 본원에 기술된 바와 같이 하나 이상의 사이토카인에 노출됨으로써 투여하기 전에 활성화한다. 다른 구현예에서, 하나 이상의 사이토카인은 심장에 투여되여 주화성 농도 구배를 형성함으로써, 투여된 성체 심장 줄기 세포가 심근 손상부로 이동하게 한다. 다른 구현예에서, 상기 하나 이상의 사이토카인은 HGF, IGF-1 또는 이의 변이체이다. 레닌-안지오텐신 시스템 (RAS)은 체내 혈압과 세포외 체적 조절을 촉진시키는 호르몬 시스템이다. 신장 관류가 감소되면, 신장내 세포가 레닌이라는 효소를 분비한다. 레닌은 간에서 분비되는 불활성의 전구체 펩타이드인 안지오텐시노겐을 안지오텐신 I으로 자른다. 안지오텐신 I은 이후 폐에서 주로 발견되는 안지오텐신 변환 효소 (ACE)에 의해 안지오텐신 II (Ang II)로 변환된다. Ang II는 AT1 수용체의 활성화를 통해 혈관수축과 알도스테론 및 바소프레신의 방출을 비롯하여 여러가지 작용을 유발한다. Ang II는 심장내 노화-의존적인 산화적 손상 축적과 관련있으며 (Fiordaliso et al. (2001) Diabetes 50: 2363-2375; Kajstura et al. (2001) Diabetes 50: 1414-1424), 노화를 유도하며 내피 기원 세포의 수와 기능을 떨어뜨리는 것으로 보고된 바 있다 (Kobayashi et al. (2006) Hypertens. Res. 29: 449-455). 아울러, Ang II는 근 세포의 세포자살을 촉발하며 (Leri et al. (1998) J. Clin. Invest. 101: 1326-1342), 심부전 진행에 기여할 수 있다 (McMurray et al. (2003) Lancet 362: 767-771). 실제, AT1 수용체를 저해하면, 만성 심부전 환자의 임상적인 경과가 개선되고 인간의 수명이 길어지는 것으로 입증된 바 있다 (McMurray et al. (2003) Lancet 362: 767-771).

본 발명은, Ang II 수용체 길항제를, 성체 심장 줄기 세포를 개체의 심장에 투여하는 단계와 병용하여 투여함으로써, 개체에서 심부전을 예방 및/또는 만성 심부전을 치료하는 방법을 제공한다. 바람직하게는, Ang II 수용체 길항제는 AT1 수용체의 길항제이다. 본 발명에 포함될 수 있는 Ang II 수용체 길항제에 대한 일부 비제한적인 예로는, 발사르탄 (Valsartan), 텔미사르탄 (Telmisartan), 로사르탄 (Losartan), 이르베사르탄 (Irbesartan), 올메사르탄 (Olmesartan), 칸데사르탄 (Candesartan) 및 에포로사르탄(Eprosartan)이 있다.

또한, 안지오텐신 변화 효소 (ACE)의 저해제도 Ang II 수용체 길항제와 함께 또는 대신 투여할 수 있다. 전술한 바와 같이, ACE는 안지오텐신 I을 안지오텐신 II로 변환한다. 이 효소가 저해되면, Ang II의 농도가 감소하게 되고, 따라서, 심장 줄기 세포에 대한 Ang II의 유해한 작용들이 줄어들게 된다. 본 발명의 방법에 사용할 수 있는 ACE 저해제로는, 베나제프릴 (Benazepril), 에날라프릴 (Enalapril), 리시노프릴 (Lisinopril), 캅토프릴 (Captopril), 포시노프릴 (Fosinopril), 라미프릴 (Ramipril), 페린도프릴 (Perindopril), 퀴나프릴 (Quinapril), 모엑시프릴 (Moexipril) 및 트란돌라프릴 (Trandolapril)이 있으나, 이들로 한정되지 않는다.

Ang II 수용체 길항제 또는 ACE 저해제는 성체 심장 줄기 세포를 투여한 후 다회 투약으로 개체에게 투여할 수 있다. 길항제 또는 저해제는 시간 세트 동안 일반적인 일정으로 섭취할 수 있다. 예를 들어, 저해제는 성체 심장 줄기 세포를 투여한 후 약 1달, 약 2달, 약 3달, 약 6달, 약 12달 또는 약 24달 동안 매일 1회 섭취할 수 있다. 다른 투약 일정도 적용할 수 있다. 당해 기술 분야의 당업자, 특히 의사 또는 심장학자라면, ACE 저해제 또는 Ang II 수용체 길항제의 투여에 대한 적절한 용량과 일정을 결정할 수 있을 것이다. 바람직하게는, 한가지 이상의 심부전 증상은, 심장 줄기 세포와 안지오텐신 II 수용체 길항제 및/또는 ACE 저해제 투여 후 감소되거나 완화된다. 심부전 증상으로는, 피곤, 허약, 빠르거나 불규칙적인 심박동, 호흡곤란, 계속적인 기침 또는 쌕쌕거림, 다리와 발의 부종, 및 복부 팽창이 있으나, 이로 한정되지 않는다.

또한, 본 발명은, 성체 줄기 세포 및/또는 한가지 이상의 사이토카인을 포함하는, 예컨대, 심혈관 질환, 심부전 또는 기타 심장 병태를 치료하기 위해 본 방법에 사용하기 위한, 약학 조성물 등의 조성물을 제조하는 방법을 포괄한다. 일 구현예에서, 약학 조성물은 분리된 인간 심장 줄기 세포와 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함한다. 바람직한 측면에서, 상기 방법 및/또는 약학 조성물을 비롯한 조성물은 유효량의 성체 심장 줄기 세포 또는 2 이상의 사이토카인을 심장 및/또는 혈관 병태를 치료하는데 유효한 적정 약학 제제와 조합하여 포함한다.

추가적으로 바람직한 측면에서, 본 발명의 약학 조성물은 주입에 의해 전달된다. 이러한 투여 (전달) 경로는, 피하 또는 정맥내, 동맥내 (예, 관상 동맥내), 근육내, 복막내, 심근내, 경심내막으로, 경심외막으로, 비강내 투여 뿐만 아니라 경막내(intrathecal) 등의 비경구, 및 주입 기법을 포함하나, 이로 한정되지 않는다. 따라서, 약학 조성물은 바람직하게는 주입에 적합한 형태이다. 본 발명의 치료제를 비경구로 투여하는 경우, 이는 단위 투약의 주사용 형태 (용액, 현탁액, 에멀젼)으로 일반적으로 제형화될 것이다. 주입에 적합한 약학 제형은 무균 수성 용액 또는 분산액 및 무균 주사 용액 또는 분산액으로 재구축하기 위한 무균 분말을 포함한다. 담체는 예로 물, 에탄올, 폴리올 (예, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 액체 등), 이의 적정 혼합물 및 식물성 오일을 포함하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다.

적절한 유동성은, 예를 들어, 레시틴과 같은 코팅제를 사용함으로써, 분산물의 경우 필수 입자 크기를 유지함으로써, 그리고 계면활성제를 사용함으로써, 유지시킬 수 있다. 면실유, 참깨 오일, 올리브유, 콩유, 옥수수유, 해바라기유 또는 땅콩유와 같은 비수계 비히클 및 이소프로필 미리스테이트 등의 에스테르를 화합물 조성물의 용매 시스템으로 사용할 수 있다. 부가적으로, 항균 보존제, 항산화제, 킬레이트제 및 완충제를 비롯하여, 조성물의 안정성, 멸균성 및 등장성을 강화하는 다양함 첨가제들을 첨가할 수 있다. 미생물 작용 방지는 다양한 항세균제와 항진균제, 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산 등으로 보장할 수 있다. 다수의 경우에, 등장성 제제, 예컨대 당, 소듐 클로라이드 등을 포함하는 것이 바람직할 것이다. 주사용 약학 형태의 흡수 연장은 흡수 지연제, 예컨대 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 사용함으로써 달성할 수 있다. 그러나, 본 발명에 있어서, 사용되는 임의의 비히클, 희석제 또는 첨가제는 화합물과 혼화가능하여야 할 것이다. 무균 주사 용액은, 필요에 따라 다른 성분들을 다양한 양으로 사용하여, 본 발명의 실시에 이용되는 화합물을, 필수량의 적정 용매에 혼합함으로써, 제조할 수 있다.

본 발명의 약학 조성물, 예컨대 CD271⁺ 줄기 세포를 치료 용량으로 포함하는 조성물을 다양한 비히클, 보강제, 첨가제 및 희석제 등의 임의의 혼화가능한 담체를 포함하는 주사 제형 중에 개체에게 투여하거나; 또는 본 발명에서 사용되는 화합물을 단일클론 항체, 이온도입, 폴리머 매트릭스, 리포좀 및 미소구 등의 서방성 피하 임플란트 또는 타겟화된 전달 시스템 형태로 개체에게 복막내 투여할 수 있다. 본 발명에 사용되는 약학 조성물은 개체에게 경구 투여할 수 있다. 화합물을 정제, 현탁제, 용액제, 에멀젼제, 캡슐제, 산제, 시럽제 등으로 투여하는 통상의 방법을 사용할 수 있다. 화합물을 경구 또는 정맥내 전달하며, 생물 활성을 유지하는 공지 기법들이 바람직하다.

일 구현예에서, 본 발명의 조성물을 먼저 투여한 후, 추가적인 투여를 유지시킬 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 조성물을 한가지 타입의 조성물로 투여한 다음, 다른 또는 동일한 타입의 조성물을 추가적으로 투여할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 조성물을 정맥내 주입으로 투여하여 혈중 수준을 적정 수준으로 만들 수 있다. 그런 후, 개체의 증상에 따라 다른 투약 형태도 사용할 수 있지만, 개체의 수준은 경구 투약 형태에 의해 유지된다. 투여할 약학 조성물의 양은 치료 중인 개체에 따라 달라질 것이다. 바람직한 구현예에서, 성체 심장 줄기 세포 2 x 10⁴ 내지 약 1 x 10⁵ 및 선택적으로, 사이토카인 또는 상기 사이토카인의 변이체 1일 당 50-500 ㎍/kg이, 개체에게 투여된다. 그러나, 유효 용량으로 간주되는지에 대한 정확한 판단은 신체 사이즈, 연령, 손상된 심근의 면적 및 손상 후 경과 시간을 비롯하여, 각 개체에 따른 개별 인자를 기반으로 할 것이다. 따라서, 당해 기술 분야의 당업자는, 본 발명의 방법으로 투여할 조성물내, 화합물과 선택 첨가제, 비히클 및/또는 담체의 용량과 양을 쉽게 결정할 수 있다. 전형적으로, (활성 줄기 세포(들) 및/또는 사이토카인(들) 외에도) 임의의 첨가제는 포스페이트 완충화된 염수내에 0.001 내지 50 wt% 용액의 양으로 존재하며, 활성 성분은 약 0.0001 내지 약 5 wt %, 바람직하게는 약 0.0001 내지 약 1 wt %, 가장 바람직하게는 약 0.0001 내지 약 0.05 wt % 또는 약 0.001 내지 약 20 wt %, 바람직하게는 약 0.01 내지 약 10 wt %, 및 가장 바람직하게는 약 0.05 내지 약 5 wt % 등과 같이, ㎍ 내지 mg의 수준으로 존재한다. 물론, 동물 또는 인간에게 투여할 임의의 조성물, 및 임의의 개별 투여 방법에 있어서, 따라서, 적정 동물 모델, 예컨대 마우스 등의 설치류에서 치사량 (LD) 및 LD₅₀을 결정함으로써와 같이, 독성; 적합한 반응을 도출하는, 조성물(들)의 용량, 조성물내 성분의 농도 및 조성물(들)의 투여 타이밍을 결정하는 것이 바람직하다. 이러한 결정인자들은 당해 기술 분야의 지식, 본원에 언급된 개시물과 문헌들로부터 결정되며 과도한 실험을 요하지 않는다. 순차적인 투여 시기는 과도한 실험없이도 알 수 있다. 본 발명의 치료제를 포함하는 조성물의 예로는 오리피스(orifice)용, 예컨대 입, 코, 항문, 질, 경구, 위내, 점막 (예, 설하, 치조(alveolar), 잇몸, 후각 또는 호흡기 점막)용 등, 현탁제, 시럽제 또는 엘릭서제와 같은 투여용 액체 조제물; 및 복막내, 피하, 진피내, 근육내 또는 정맥내 투여 (예, 주사 투여)용 조제물, 예컨대 무균 현탁제 또는 에멀젼제를 포함한다. 이들 조성물은 멸균수, 생리 식염수, 글루코스 등과 같은 적정 담체, 희석제 또는 부형제와 혼합하여 사용할 수 있다. 또한, 조성물은 동결 건조될 수 있다. 본 조성물은 습윤제, 유화제, pH 완충제, 젤제 또는 점성 강화용 첨가제, 보존제, 향제, 착색제 등과 같은 보조 물질들을 투여 경로와 원하는 조제에 따라 포함할 수 있다. "REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCE", 17th edition, 1985 등의 표준 교재를 참조하여, 과도한 실험없이도 안정적인 조제물을 제조할 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 편리하게는 액체 조제물로서, 예컨대 선정한 pH로 완충화될 수 있는 등장성 수계 용액, 현탁제, 에멀젼제 또는 점성 조성물로서 제공된다.

명백하게는, 적정 담체 및 기타 첨가제에 대한 선택은, 실제 투여 경로와 특정 투약 형태, 예컨대 액체 투약 형태 (예, 조성물이 용액, 현탁액, 겔 또는 다른 액체 형태로 제형화되던 간에), 또는 고체 투약 형태 (예, 조성물이 환제, 정제, 캡슐제, 당의정, 타임 방출 형태(time release form) 또는 액체-충진된 형태로 제형화되던 간에)의 특성에 따라 결정될 것이다. 용액제, 현탁제 및 젤제는 정상적으로 활성 화합물 외에도 물 (바람직하게는, 정제수)을 다량으로 포함한다. pH 조절제 (예, NaOH 등의 염기), 유화제, 분산화제, 완충제, 보존제, 습윤제, 젤화제 (예, 메틸셀룰로스), 착색제 및/또는 향제 등의 다른 성분도 소량 존재할 수도 있다. 본 조성물은 등장성일 수 있으며, 즉 이는 혈액 및 누액과 동일한 삼투압을 가질 수 있다. 본 발명의 조성물의 바람직한 등장성은 소듐 클로라이드나 또는 덱스트로스, 붕소산, 소듐 타르트레이트, 프로필렌 글리콜, 기타 무기 용질 또는 무기 용질 등의 기타 약제학적으로 허용가능한 제제를 이용하여 달성할 수 있다. 소듐 클로라이드가 소듐 이온을 포함하는 완충제로서 특히 바람직하다.

조성물의 점도는 약제학적으로 허용가능한 증점제를 이용하여 선정한 수준으로 유지시킬 수 있다. 메틸셀룰로스는 쉽고 경제적으로 이용할 수 있으며 작업하기 용이하기 때문에, 메틸셀룰로스가 바람직하다. 기타 적합한 증점제로는, 예를 들어, 잔탄검, 카르복시메틸 셀룰로스, 하이드록시프로필 셀룰로스, 카보머 등을 포함한다. 조성물의 저장 수명을 늘이기 위해 약제학적으로 허용가능한 보존제를 사용할 수 있다. 예를 들어, 파라벤, 티메로살, 클로로부탄올 또는 벤즈알코늄 클로라이드 등의 다양한 보존제들도 이용할 수 있지만, 벤젠 알코올이 적합할 수 있다. 보존제의 적정 농도는 선택 제제에 따라 상당한 편차가 있을 수 있지만, 총 중량 기준으로 0.02% 내지 2%일 것이다. 당해 기술 분야의 당업자는 본 조성물의 성분이 활성 화합물에 대해 화학적으로 무활성이도록 선택되어야 함을 알 것이다. 이는, 당해 기술 분야의 당업자에게 화학적 및 약학적 원칙상 문제가 되지 않거나, 또는 문제들은 표준 교재를 참조하거나 또는 간단한 실험으로 (과도한 실험없이) 본원에 인용된 내용과 문헌을 통해 쉽게 피할 수 있다.

조성물은, 개별 개체의 연령, 성별, 체중 및 상태와 같은 인자와 투여용으로 사용되는 조성물 형태 (예, 고체 대 액체)를 고려하여, 투여량으로, 그리고 의학 및 수의학 분야의 당업자들에게 잘 알려져 있는 기법으로 투여할 수 있다. 인간 또는 기타 포유류에서의 투여량은 이러한 개시내용, 본원에 기술된 문헌 및 당해 기술 분야의 지식으로부터 당업자는 과도한 실험없이도 결정할 수 있다. 일차 투여 및 추가적인 투약에 적합한 요법 또는 순차적인 투여에 적합한 요법은 또한 가변적일 수 있으며, 일차 투여 후 후속적인 투여를 포함할 수 있으나; 그럼에도 불구하고, 본 개시 내용, 본원에 인용된 문헌과 당해 기술 분야의 지식으로부터 당해 기술 분야의 당업자가 알 수 있을 것이다.

본 발명의 약학 조성물을 이용하여, 비제한적인 예로서, 죽상경화증, 허혈증, 고혈압, 협착증, 협심증, 류마티스 심장병, 선천성 심혈관 결함 및 동맥 염증, 및 동맥, 소동맥 및 모세관에서의 기타 질환, 또는 관련 합병증을 비롯하여, 심부전 및 심혈관 질환을 치료한다. 이에, 본 발명은, 이들 병태들 또는 심장 질환이나 장애가 관련된 기타 병태들 중 임의의 한가지 이상의 병태를 치료 또는 예방하기 위해, 본원에 기술된 성체 줄기 세포의 단독 또는 하나 이상의 사이토카인 또는 상기 사이토카인의 변이체와의 조합한 투여를 포함한다. 유리한 투여 경로는, 비제한적인 예로서, 피하, 또는 정맥내, 동맥내, 근육내, 복막내, 심근내, 경심내막으로, 경심외막으로, 비강내 투여 뿐만 아니라 경막내 등의 비경구, 및 주입 기법을 통해서와 같이, 이들 병태를 치료하는데 가장 적합한 경로를 포함한다.

본 발명의 다양한 구현예들이 상기에 기술되어 있지만, 이들 구현예들은 단순히 예시하기 위한 것일 뿐 제한하고자 하는 것은 아니다. 본 발명의 사상이나 범위로부터 이탈되지 않으면서, 본원의 내용에 따라 개시된 구현예들에 대한 다수의 변형을 가할 수 있다. 따라서, 본 발명의 범위와 범주는 전술한 어떠한 구현예들로도 제한되지 않아야 한다.

본원에 언급된 모든 문헌들은 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. 본 명세서에서 인용된 모든 간행물들과 특허 문헌들은, 각 개별 간행물 또는 특허 문헌들이 개별적으로 원용된 바와 같이 동일한 수준으로 원용에 의해 모든 목적으로 포함된다. 본 문헌에서 다양한 참조문헌을 인용하는 것은, 출원인이, 임의의 개개 원용이 발명의 "종래 기술"임을 용인하는 것으로 해석되진 않는다. 본 발명의 조성물과 방법에 대한 구현예들은 아래 실시예에서 예시된다.

실시예

아래 비제한적인 실시예들은 본 발명에서 선택된 구현예들을 예시하기 위해 제공된다. 구성 성분들의 비율 편차와 인자들의 대안책들은 당해 기술 분야의 당업자들에게 자명할 것이며, 본 발명의 구현예들 범위에 포함된다.

재료 및 방법

비-표준적인 약어와 두문자: 골수 (BM); 콜로니 형성 단위 섬유모 세포 (CFU-F); 관상 동맥 우회 그래프팅 (CABG); 박출 계수 (EF); 말기 확장기 용량 (EDV); 말기 수축기 용량 (ESV); 간엽 줄기 세포 (MSC); 단핵구 세포 (MNC); 마우스 심장 기질 세포 조건화된 배지 (MsHrtStr CM); 심근 경색 (MI); 비부착성 MSC (NA-MSC); 재조합 인간 염기성 섬유모 세포 성장 인자 (rhbFGF).

마우스: 좌측 관상 동맥 결찰을 수행하고 심근 경색 (MI)을 유도한 NOD/SCID 마우스에, 인간 세포를 이식하였다. 2월령의 수컷 마우스만 테스트에 사용하였다. 코호트는 다음과 같다: 1) 인간 MSC를 주입한 마우스 10마리; 2) 인간 BM CD271⁺ 세포를 주입한 마우스 10마리.

좌측 관상 동맥의 결찰 방법: 마취 유도용으로 5% 이소플루란을 주입한 후 에토미데이트 20 mg/kg을 i.p.로 주사하여, 마우스를 마취시켰다. 기관내 삽관법을 수행한 다음, 마우스를 심장 모니터에 위치시키고, 기계 호흡을 실시하였다. 좌측 측면 개흉술 부위의 피부를 취하고, 포비돈-아이오다인 10% 용액을 이용하여 무균 상태로 걸쳐두었다. 발열 패드를 사용하여 시술 중에 마우스를 따뜻하게 유지시켜, 열 소실을 방지하였다. 외과용의 무균성의 비-의료용 안 연고를 수술 전에 눈에 적용하여, 각막 건조를 방지하였다.

충분한 진정 상태가 형성되면, 좌측면 개흉술로 가슴을 열었다. 좌측 관상 동맥을 노출시켜 결찰하여, anterior MI를 유도하였다. 폐쇄 후 10분 후에 에리트로포이에틴 (2-6 ㎍/kg)을 내경정맥(internal jugular) 카테터를 통해 주입하였다. 가슴을 0 및 (근육의 경우) 3.0 흡수성 봉합사로 층들을 연결하여 닫고, 부프레노르핀 (0.05-0.1 mg/kg s.c.)을 수술 후 통증을 방지하기 위해 투여하였다. 마우스에 붕대를 둘러, 격리된 표준 무균 하우징에 넣어, 수술 후 3-4일간 회복시켰다. 통증 제어는 부프레노르핀 0.05-0.1 mg/kg을 s.c.로 q12 h x 6 방식으로 투여하여 달성하였다. 수술 후 기간 동안 통증과 감염에 대해 동물을 밀착 모니터닝(매일 4회)하고, 식욕부진, 털 손질 실패(failure to groom), 공격성 및 고통스러운 숨결 등의 징후를 살폈다. 마비, 아물지 않는 상처, 고통스러운 호흡 또는 움직임 주저함을 보이는 동물은 실험에서 제외시켜, 안락사시켰다.

모든 시술을 수행하였지만, 관상 동맥 결찰은 수행하지 않은 모의 수술한 마우스를 대조군으로 사용한다. 모의 수술군에서는 수술 전후 사망율이 낮았으며 (<15%), 경색이 발병한 코호트군에서는 약간 높았다. 나머지 마우스들 중, 약 75%가 MI 후 2달 이상 생존하였다. 마우스는 전형적으로 수술 후 4주간 조사하였다.

줄기 세포는 30 게이지 바늘을 이용한 심근내 직접 주사에 의해 투여하였다. 경색 시술 당일, MI 유도를 위해 가슴을 열어, 세포를 심근에 직접 주사하였다. 3회 100 ㎕ 주사액을 전달하였다.

혈행역학적 측정 방법: 무손상 심장 혈행역학적 분석은 소형 컨덕턴스 마노메터(miniaturized conductance micromanometry)로 수행하였다. 동물은 다음과 같이 마취하였다: 이소플루란 가스 -> 에토미데이트 12 mg/kg i.p., 우레탄 600 mg/kg i.p. 및 몰핀 1 mg/kg i.p. 기관내 삽관을 수행한 다음, 마우스를 심장 모니터에 위치시키고, 기계적으로 호흡시켰다. 좌측 내경정맥을 노출시고, 약물 투여를 위해 30 게이지 바늘로 캐뉼러를 삽입하였다. 4-전극 압력-용적 카테터 (SPR-839, Millar Instruments Inc)를 우측 경동맥으로 삽입하여, 좌심실로 전진시켰다. 베이스라인에서와 이소프로테레놀 주입 (1 - 100 ng/min) 후에, 압력 용적 곡선을 측정하였다. 마지막으로, 흉부 절개를 통해 하대정맥을 클램핑함으로써, 예압(preload)을 낮추었다. 마취 정도는 흉벽 움직임, 심박, 혈압, 근육 긴장 및 자극 지각을를 관찰함으로써 모니터링하였다. 실험 종료시, (상기와 같이 깊게 마취된) 동물을 안락사시키고, 이후 분자 생물학적 실험들과 면역조직화학실험을 위해 심장을 적출하였다.

만성 허혈성 심근병증 모델: 괴팅겐 미니 돼지 (25-30kg, 암컷, 10-12월령)를 사용하였고, 허혈성 심부전의 대형 동물 모델로 사용하였다. 만성 허혈성 심근병증의 전임상 모델을 만들기 위해, 마취를 유도하기 위해 미니 돼지에 케타민을 제공하였고, 기관내 삽관을 수행하였으며, 전신 마취를 유지시키기 위해 이소플루란을 투여하였다. 돼지는 비침습적인 BP, 심박, 체온, 맥박 산소 측정(pulse oximetery) 및 카프노그라피(capnography)를 계속 모니터링하였다. 목 중앙을 종 절개하여, 우측 총 경동맥과 내경정맥을 노출시켰다. 혈관 곡선을 이용한 근위 및 원위 컨트롤을 수득한 다음, 7 Fr 혈관 어세스 시트(vascular access sheath)를 우측 총경동맥과 우측 내경정맥 둘다에 장착하였다. IVC 폐쇄하여 압력 용적 곡선을 MI 전과 후에 입수하였다. 놔측 및 우측 관상 동맥 조영술을 JR 4 카테터로 수행하였다. 그 후, 미니 돼지에 제1 대각지 원위부에 인접한 좌하행(LAD) 관상 동맥을 2.5시간 풍선 폐색함으로써 전벽 경색 실험을 실시하였다. 돼지에서 부정맥을 모니터링하고, 필요한 경우 전문 심장 처치를 시작하였다. 풍선 혈관성형술을 완료한 후, 경동맥을 6-0 프롤렌 봉합사로 치료하고, 내경정맥을 결찰하였다. 목 절개는 3층으로 봉합하고; 근막, 피하 조직 및 피부를 3-0 폴리소브로 봉합하였다. 그 후, 미니 돼지를 회복시켰고, 상처, 전형적으로 좌심실의 약 20%를 차지하며 전중격(anteroseptal wall)에 위치한 경벽성 경색증을 심장이 리모델링 과정을 거쳐 3달간 치유되게 두었다.

인간 BM-MSC 또는 인간 BM-CD271 ⁺ 세포의 전달: MI 시술 후 3달째에, 미니돼지에 케타민을 투여하여 마취시키고, 수술대 위에 반듯이 눕힌 다음, 마스트를 통해 이소플루란을 투여하고, 기관내 삽관을 수행하였으며, 전신 마취를 유지하기 위해 이소플루란을 계속 투여하였다. 좌측 총경동맥과 내경정맥의 혈관 접근로를 전술한 바와 같이 확립하여, 압력-용적 곡선으로 혈행역학적 평가를 수행하였다. 10번 외과용 메스로 5-6번째 갈비 사이 공간에 좌 전-측 개흉술 절개를 만들고; 연조직을 전기 소각기로 잘라, 출혈을 방제하고; 벽측흉막(parietal pleura)을 파악하고; 메젠바움 수술 가위를 사용하여, 폐 유조직을 다치게 하지 않도록 주의를 기울이면서 벽측흉막을 열어 좌측 흉막강(pleural cavity)으로 파고들어간 다음; 늑골 견인기(rib retractor)를 사용하여 늑골을 벌렸다. 심막을 확인하고, 메젠바움 수술 가위를 사용하여 종 절개를 행하였고, 이때 횡격막 신경의 앞쪽에서 유지되도록 하고 심근을 손상시키지 않도록 주의하였다. 심장을 노출시키고, 손상 부위와 경계 영역에 0.5cc의 MSC 또는 CD271⁺ 세포로 충전된 주사기를 사용하여 10회 주사를 실시하였다. 총 주사 부피는 5 cc였다. 출혈 부위들은 모두 면살사 봉합사(pledgeted suture)로 조치하였다. 개흉술 절개를 절개부의 측면에 위치된 수중 흡입관까지의 18 Fr 흉관과 2-0 폴리소르브 봉합사를 이용하여 3층으로 봉합하였다. 그 후, 돼지에서 호흡장치를 제거하고, 회복시켰다. 다음날 흉관을 제거하였다. 코호트는 다음과 같다: 1) MI 시술 후 3달째에 MSC 2억개 주사 (n=6); 2) MI 시술 후 3달째에 CD271⁺ 세포 2백만개 주사 (n=6).

심장 기능 평가: 이식한 CD271⁺ 세포와 MSC의 효과를 좌심실 압력 용적 곡선과 연속 심장 MR을 이용하여 평가하였다. 좌심실 (LV) 혈행 역학은 급선 MI 전과 후, 주사시, 및 사망시, 심장 카테터 삽입 시술시 LV로 장착시킨 밀러 압력-용적 트랜스듀서 카테터를 이용하여 평가하였다. 동시적인 비-침습적인 심장 기능 데이타는 시멘스 1.5T MRI 스캐너를 사용하여 입수하였다. 심장 MR는 전반적인 기능, 국소 기능, 상해 크기 및 관류 파라미터를 평가하는데 광범위하게 사용되며 매우 정확한 영상 방식이다. 대부분 심장 MR는 여러가지 심장 파라미터들을 한가지 실험으로 평가할 수 있어 심장 영상화를 위한 원-스톱-샵으로 여겨지고 있다. 심장 MR 프로토콜은 ECG-gated cine 이미지, 일차-통과 가돌리늄 관류 이미지, 테깅된 MTI 이미지, 및 지연 조영강화 이미지를 포함한다. 전형적인 MR 스캔에서는 광범위한 시술 후 분석이 필요한 심장에 대해 약 1,200장의 이미지가 수득된다. 이미지는 모두 Miami WebPax 시스템 대학에서 보관하였고, 각 실험실에서 Dell Precision 690 워크스테이션으로 내려받았다. 2종의 FDA 승인받은 소프트웨어 프로그램인 Segment (Medviso AB and Lund University, Lund, Sweden) 및 Diagnosoft (Cary, NC)를 본 분석에 사용하였다. cine 이미지와 지연 강화 이미지들은 Segment 소프트웨어로 분석하였다. 테깅된 이미지와 일차-통과 관류 이미지는 Diagnosoft 프로그램으로 분석하여, 피크 eularian circumferential 염색과 심근 업슬로프(myocardial upslope) 및 곡선하 면적을 각각 구하였다.

사망 및 조직학: 세포 주사 후 3개월째에, 각 동물을 전술한 바와 같이 깊은 마취하에 사망시켰다. 심장을 이완기에 정지시키는 포타슘 클로라이드 40mEq를 센트럴 주입(central infusion)에 의해 정지시켰다. 돼지의 심장을 회수하여, 포름알데하이드 중에 보존시켰다. 각각의 심장을 단축으로 절편화하고, 생착 및 분화를 확인하기 위해 경색부, 경계부 및 원위부에 대한 생검을 공초점 현미경으로 분석하였다. 또한, 돼지에 대한 신체 전체의 검시를 실시하여, 이소성 조직 형성을 조사하였다.

마우스: NOD-SCID 마우스는 면역성이 결핍되어 있으며 인간 줄기 세포에 대한 적합한 수여체이므로, 이를 사용하였다. MI가 발생된 마우스의 심장 기능은 수술 후 4주이내에는 모의-수술한 마우스 보다 약하였다. 계산에 근거하면,파워(power) 0.90 및 α = 0.05를 달성하기 위해서는, 각 코호트에 마우스 8마리를 포함시켜야 한다. 그러나, 야생형 마우스의 MI 후 사망율이 수술 후 첫번째 6주 동안 약 25%에 달하였다. 따라서, MI 연구를 수행하기 위해, 각 코호트에 마우스 10마리 이상을 사용하였다.

돼지: 괴팅겐 미니 돼지는 인간과 관상동맥 해부 구조가 비슷하고, 약 12-15월령째에, 심장의 혼동성 증식을 최소화하면서 장기간 생존 연구으로 추적할 수 있는 안정적인 생장 곡선을 나타내므로, 이를 전임상 실험에 사용하였다. 계산상으로는, 파워(power) 0.90 및 α = 0.05를 달성하기 위해서는, 각 코호트에 돼지 6마리를 포함시켜야 했다.

마우스 수술: 마우스 수술은 통증과 불편함을 예방하는데 주의하면서 수행하였다. 전술한 바와 같이, 모든 수술 시술 중에는 마취 및 무통각을 제공하기 위한 적정 제제들을 사용하였다. 관상 동맥 결찰을 위해, 마우스를 5% 이소플루란으로 마취 유도한 다음, 에토미데이트 20 mg/kg으로 i.p.로 마취하였다. 통증 방지는 부프레노르핀 0.05-0.1 mg/kg을 s.c.로 투여하여 달성하였다. 또한, 마우스 체온은 보온용 담요나 램프를 사용하여 유지시켰다. 일부 마우스에서는 여러가지 외과적 시술로 인해 심장 비대증과 심부전이 발생하였지만, 과다 체중 감소, 호흡 곤란, 청색증 및 무반응성을 보인 마우스를 조사하였고, 필요에 따라 조기 안락사하였다.

돼지 수술: 돼지에 대한 모든 시술은 통증과 고통을 예방하는데 주의하면서 수행하였다. 전술한 바와 같이, 모든 시술시에는 전신 마취하에 수행하였다. 수술 후 통증은 부프레노핀 0.05-0.1mg/kg을 수술 후 피하 주사하여 조치하였고, 펜타닐 25mcg 패치를 72시간 동안 돼지 등에 올려두었다. 실험 수행 중 임의 시기에 돼지에 문제가 생기면, 수의사와 조사팀이 검사하였다. 대부분의 문제의 원인은 상처나 폐 감염으로서, 이는 경구 또는 근육내 항생제 투여로 조치할 수 있다.

안락사: 이 방법은 2007년 안락사에 대한 미국 수의학회 지침 권고안에 따른다.

돼지와 마우스는 모두 2가지 중 한가지 증상시 안락사하였다: 1) 진통제, 항생제 및 기타 조처로도 완화되지 않는 현저한 수술 후 통증 또는 고통이 나타남; 2) 생리학적 연구에서 지정된 시간이 종료된 경우. 마우스는 케타민 (150mg/kg)과 자일라진(10mg/kg)을 과량 복용시킨 후, 경부 탈골에 의해 안락사하였다. 돼지는 전술한 바와 같이 깊게 마취시킨 다음, 포타슘 클로라이드 40mEq을 투여하여 심장을 정지시켰다.

실시예 1: 마우스 심근 경색 모델 (NOD/SCID)에서의 인간 BM-MSC 및 BM-CD271 ⁺ 세포 비교.

이를 조사하기 위해, NOD/SCID 마우스에서 좌전 후행 (LAD) 관상 동맥을 일시적으로 개흉 결찰함으로써 확립시킨 심근 경색 마우스 모델을 사용하였다. 허혈증 발생 1시간 후, LAD에서 봉합사에 의한 결찰을 제거하여, 완전한 관류가 이루어지도록 하였다. 그 후, 마우스를 인간 BM-MSC 또는 BM-271⁺ 세포에 대해 1:1 비율로 랜덤화하였다. 적절한 대조군과 비교군을 설정하기 위해 추가적인 동물 그룹도 사용하였다. 이러한 것으로는 CD34⁺ 및 CD133⁺ 골수 유래 세포가 포함되며, 이들 세포는 조혈 줄기/기원 세포 및 내피세포 전구체를 포함한다. 재관류 후, 세포를 직접 보면서 손상 부위와 경계부에 총 주사 부피 10 ㎕로 주사하였다. 그 후, 마우스를 8주간 연속적인 초음파 심장 검사로 추적하여, 세포 치료법의 효능을 평가하였다. 주사 후 8주째에, 마우스를 대상으로 상세한 혈행역학 평가를 수행하고, 사망시킨 후, 심장을 회수하여 주입한 세포의 생착 및 분화를 확인하기 위한 면역조직화학적 분석을 수행하였다.

조직병리학: 실험 종료시 혈행역학적 평가를 수행한 후, 면역조직화학 검사를 위해 마우스 심장에 포타슘 클로라이드와 고정액을 관류시켰다. 전신, 심장, 폐 및 간의 무게와 경골 길이를 측정하여, 비-경색성 심실 조직의 비대성을 확인하였다. 일반 검사를 위해 심장 조직 단편을 헤마톡실린과 에오신으로 염색하였다. 메이슨에 의해 블루로 염색된 횡단 절편에서 좌심실의 원주 부분은 경색 크기 측정값으로 사용한다.

분화된 줄기 세포는 면역염색으로 추적하였다. 인간 세포는 Alu 염색으로 마우스 심장에서 검출하였다. 트로포닌 I, α-근절 액틴, 심장 근 세포, 데스민, α-심장 액티닌, connexin-43, GATA-4, Nkx-2.5 및 MEF2에 대한 염색은 근 세포를 표시해준다. CD31 및 비멘틴 염색을 수행하여 내피 세포를 동정하고, α-평활근 액틴 및 SMA22를 사용하여 평활근 세포를 동정하였다. 이로써, 인간 CD271⁺ 또는 MSC 주사로 인해 생기는 세포들과 이들 세포의 여러가지 계통으로 재생되는 잠재력을 파악할 수 있다.

심장 재생에 대한 세세한 설명에는 또한 전체 근 세포의 세포 수와 크기 측정이 포함된다. 좌심실 당 근 세포의 수는 Bruel 및 Nyengaard 방법을 이용하여 핵 수를 측정함으로써 추산하였다. 근 세포 횡단면적을 측정하기 위해, 슬라이드를 플루오레세인-접합된 밀 맥아 어글루티닌 (Invitrogen)과 Hoechst 33258로 염색하였다. 근 세포 용적은 Cavalieri 지침과 해부 지침을 조합 참조하여 계산하였다. 또한, 각각의 근 세포는 형태계측 소프트웨어를 이용하여 신속 해리 후 공초점 현미경으로 측정할 수 있다. 병리학적 리모델링과 관련된 섬유증을 검출하기 위해, 조직 단편을 시리우스 레드 (콜라겐) 및 패스트 그린 (세포)으로 염색하였다. 결과들은 메이슨의 3색으로 확인하였다. 진행 중인 리모델링과 관련 가능성이 있는 모든 세포자살성 근 세포를 검출하기 위해, 파라핀으로 포매한 조직 단편을 간접 TUNEL 방법을 기반으로 한 Apoptag Red In Situ Apoptosis Detection Kit (Millipore)를 이용하여 염색하였다. 그외 분석으로는 절단된 카스파제-3에 특이적인 항체를 이용한 면역조직화학법, 카스파제-의존적인 PKCδ 절단에 대한 웨스턴 블롯팅에 의한 검출 및 DNA 래더링(laddering)이 있다.

마우스 실험: 실험에 의해 MI 야기한 후 NOD/SCID 마우스 심장으로 주입한 인간 BM-CD271 세포는 박출 계수 (EF)를 향상시키며, 분획 단축율(fractional shortening)은 위약 및 간엽 줄기 세포에서의 결과와 비슷하였다. 중요한 점은, CD271 세포는 효능이 매우 우수하여, EF를 개선시키고 심장 챔버 크기를 배양한 훨씬 많은 수의 MSC 보다 크게 증대되는 것을 완화시켰다. 또한, CD271 세포 주입은, 말기 수축기 압력 용적 곡선의 기울기 증가 및 좌측으로의 이동으로 확인되는 바와 같이, 위약 대비 심근의 수축성을 개선시켰다. 조직학적으로 평가하였을 때, CD271 세포는 생장율이 높았으며, 근 세포로의 분화 증거가 확인되어, 심장 회복은 손상된 심근으로의 세포 생착이 이유일 것이라는 생각을 뒷받침해준다. 이들 실험에서는 CD271 MSC 전구 세포들이 근 세포 및 혈관 분화될 수 있으며, 손상된 심장을 배양한 MSC 보다 높은 수준으로 회복시킬 수 있다는 가설을 확실하게 입증하였다.

실시예 2: 돼지 심근 경색 모델에서의 인간 BM-MSC와 BM-CD271 ⁺ 세포의 비교

만성 허혈성 심근병증에 대한 대형 동물 모델을 사용하였고, 세포가 근 세포, 내피 세포 및 혈관 평활근 세포로 생착 및 분화하는지를 테스트하기 위해 본 실험실에서 잘 확립하였다 (7, 8). 또한, 심장 MR를 이용하여, 심장 기능, 병변 크기 및 심근 관류에 대한 CD271⁺ 세포의 효과를 테스트하였다. 본 발명자들은 다양한 돼지 품종에서 허혈성 심근병증 모델 제조에 관한 상당한 경험을 가지고 있다 (8, 9). 이 실험을 위해, 괴팅겐 미니 돼지 성체 10마리에게 실험적으로 좌전 후행 관상 동맥에 2.5시간 동안 풍선 혈관성형술을 수행하여, 좌심실 심근의 약 20%에 해당되는 전-중격의 경벽병 경색을 발생시킨 후, 풍선에서 공기를 빼어 완전히 재관류되도록 하였다. 그 후, 동물을 회복시키고, 심장이 광범위한 리모델링 과정을 겪음에 따라 시리즈 심장 MR로 추적하였다. MI 발병 후 3개월째에, 돼지를 인간 BM-MSC 또는 BM-271⁺ 세포에 대해 1:1 비율로 랜덤화하였다. 그런 후, 골수 유래 CD271⁺ 세포 또는 MSC를 22게이지 바늘로 직접 보면서 주입하는 좌측 미니-개흉술을 동물에 실시하였다. 출혈 부위들은 봉합사로 결찰하였다. 그 후, 가슴을 닫고, 심장 MR로 동물을 계속 추적하였다. 모든 미니 돼지는 돼지 심장으로 인간 세포를 이종 이식함으로 인한 면역 거부 반응이 발생되지 않도록 경구 사이클로스포린 A (CsA)를 사용하여, 면역억제시켰다 (10, 11).

CD271⁺ 세포의 효능은 시리지 심장 자기 공명 이미징 (MRI)로 확인하였다. 이 이미징 방식은 전반적인 신장 기능, HARP를 이용한 국소 심장 기능, 지연 과-강화 이미징을 이용한 병변 크기, 및 심근 관류 업슬로프 및 가돌리늄의 일차 통과 관류에 의한 곡선하 면적에 대한 상세한 표현형 분석이 가능하였다. 주사 후 3달깨에, CD271⁺ 세포의 생착 및 분화를 확인하기 위한 면역조직화학적 분석을 위해, 동물을 희생시켜 심장을 적출하였다. 각 동물을 대상으로 전신 부검하여, 이소성 조직 형성을 조사하였다.

구체적인 안전성 및 효능 평가는 기술된 바와 같은 동물 실험을 이용하여 수행하였다 (7-9). 전체 목표는 신생 또는 이소성 조직 형성 없음을 포함한 장기간의 안전성을 확립하고, 고장난 심장으로 외과적으로 신속하게 세포를 전달하는 것이 안전한지에 대한 데이타 수가 늘어나고 있는 데이타베이스에 덧붙이기 위한 것이었다. 아울러, 이와 병행하여, CD271⁺ 세포 주사가 만성적인 허혈성 심근병증에 회복 리모델링을 창출하는데 매우 효과적이며, 이러한 작용 기전이 세포 생착 및 분화가 적어도 부분적으로 원인이라는 가설을 확인하기 위해, 영상화, 혈행역학적 평가 및 면역조직화학을 이용한 구체적인 역학적 실험을 수행하였다.

자가 간엽 줄기 세포는 만성 허혈성 심근병증에서 회복 리모델링을 구축한다: 심근 경색 후 병변이 완전히 치유된 큰 동물 모델에 대한 본 실험실 연구를 통해, MSC 투여가 좌심실 구조 및 기능적 지표들을 현저하게 향상시킬 수 있는 것으로 입증되었다. 영상화 기법으로 수득한 이러한 결과들을 이용함으로써, MSC 이식으로 촉발되는 표현형 측면에서의 개선은 만성적인 허혈성 심근병증에 대한 돼지 모델에서 확인되었으며, 이러한 변화를 형태계측학적으로 정량하였다. MI를 돼지에 발생시키고, 12주 후, 경색 부위가 흐릿하게 나타났으며, 경벽 병변이 생겼다. 자가 MSC를 각 동물로부터 취하여 증식시킨 후, 이들 세포나 위약을 경색부와 주변 경계부에 동시 전달하였다. 다시 12주간의 추적 기간내에, 심장 MRI에서, MSC의 심근내 주입이 병변 크기 (LV의 무게)를 21.8+3.9% (p<0.05 대 위약, 12주 대 24주)로 줄일 뿐만 아니라, 국소 수축성, 전반적인 LV 기능, 박출 계수 및 심근 혈류를 상당히 개선시키는 것으로 확인되었다. 중요하게도, 본 치료법이 회복 리모델링을 야기하고, 경색 병변의 원주 크기를 감소시킨다는 것이다. 이러한 여러가지 효과들은 허혈성 심근병증에 대한 매우 효과적인 치료임을 입증해준다.

동종이형 간엽 줄기 세포는 3가지 계통(Trilineage)으로의 분화 능력을 통해 만성적인 허혈성 심근병증에서 심장 기능을 회복시킨다: MSC 기반의 심장 회복이 장기간의 생착을 포함하는 기전과 심근 및 혈관 요소로의 분화에 의한 심장 재생에 의한 것인지에 대한 가설을 조사하였다. 동종이형 MSC를 수컷 돼지 공여체로부터 준비하여, MI 후 12주된 암컷 돼지에 경심내막 주사에 의해 성별을 매치시키지 않은 세포를 투여하였다. 동물을 연속적인 MRI로 추적하고, 12주 후 면역조직학적 검사를 위해 심장을 적출하였다. 수컷 공여 세포의 운명은 심장, 혈관 및 내피 세포 계통에 대한 마커의 Y-염색체(Y^pos) 세포의 공동-위치화를 통해 결정되었다. MSC는 경색부 및 경계부에 생착하여, GATA-4, Nkx2.5 및 α-근절 액틴 마커의 공동-위치화에 의해 확인되는 바와 같이, 심근 세포로 분화되었다. 아울러, Y^pos MSC는 혈관 평활근 및 내피 세포로 분화된 것으로 나타나, 큰 혈관과 소형 혈관의 형성에 기여하였다. 생착되는 세포의 수는 나타내는 기능적 변화와 관련있었다. 만성적으로 손상된 심근에 이식한 후에는, 장기간의 MSC 생존, 생착 및 심근, 혈관 및 내피 세포 계통으로의 분화가 확인되었다. 이들 세포의 심근형성 및 혈관형성 능력은 모두 이들의 만성적으로 손상된 심근을 회복시키는 능력에 기여할 것임에 틀림없다.

실시예 3: 우회술을 시술받은 MI 환자를 대상으로 한 임상 실험과 우회술을 시술받은 환자를 대상으로 한 임상 실험에서의 CD271 ⁺ 세포 검사

I/II 상 임상 실험 ["심장 수술을 받은 환자에서의 CD271⁺ 세포 치료법에 대한 유망한 무작위 실험"(PROMETHEUS-II)으로 지칭됨]으로 실시된다. 이 실험은 우회술을 시술받은 15명의 환자를 대상으로 하는 이중 맹검의, 무작위, 위약-대조 실험으로, CD271⁺ 세포와 위약을 비교한다. 본 실험의 평가 항목은 안전성과 효능이다. 효능 평가 항목은 심근 경색의 크기, 국소 및 전체 좌심실 (LV) 기능 및 심근 관류를 평가하기 위한 심장 자기 공명 영상화 (MRI)를 활용한다. 생체저장소(biorepository)인 환자 골수와 순환하는 혈액 샘플도 수집하여, 치료법에 대한 성공적인 반응을 예측할 수 있는 바이오마커를 확인하였다. 본 실험에 사용한 CD271⁺ 세포 산물은 마이애미 대학의 세포 제조 프로그램 시설에서 분리하였다. 본 실험에 사용한 CD271⁺ 세포는 MSC에 전구 세포인 골수 유래 성체 줄기 세포이다.

예비 임상 실험 데이타: 허혈성 심부전 실험에서의 경심내막 자가 세포 (TAC-HFT): TAC-HFT는 2009년 식의약 등록청으로부터 승인받은 I/II상의 무작위 이중 맹검 실험이다. 본 실험에는 만성적인 허혈성 좌심실 기능부전(EF 20-50%) 으로 인한 심근 경색을 앓고 있는 환자 60명이 참여하였다. 나선 주입 카테터 (BioCardia, San Jose, CA)를 사용하여, MSC, 전체 골수 또는 위약을 심장 카테터 장착시 경심내막적인 주입을 통해 전달한다.

TAC-HFT 실험은 환자 60명을 이중 맹검의 무작위 추출하기 전에 예비 안전성 데이타를 확립하기 위해 개방형 실험(open-label)으로서 환자 8명을 기록하도록 고안되었다. 이들 첫 8명의 환자에게 개방된 방식으로 전체 골수 (n=4) 또는 골수 유래 간엽 줄기 세포 (n=4)를 투여하였다. 환자 8명 모두 줄기 세포 주입에 대해 허용성을 나타내었고, 어떠한 주된 부작용이 없어, 이후 환자들을 이중 맹검 실험에 참여시킬 수 있었다. 처음 8명의 환자들 모두 세포 주입물을 투여받은 후, 심장 MR 사진을 분석하였다. Cine 사진과 지연 강화 사진을 Segment 소프트웨어 (Medviso AB and Lund University, Lund, Sweden)를 이용하여 분석하고, 테깅된 심장 이미지는 HARP 소프트웨어 (Diagnosoft, Inc.)로 분석하였다. 이들 환자에 대한 예비실험 데이타를 통해, 줄기 세포 주입 후 6달째에, 전체적인 기능 개선이 말기 확장기 용적의 11.2±3.4% (p<0.05) 감소, 말기 수축기 용적의 13.5±4.2% (p<0.01) 감소 및 박출 계수의 평균 4.9±6.7% 증가로 입증되었다. 지연 강화 이미지에서는, 병변의 크기가 좌심방 크기에 대한 퍼센트로서 평균 13.3±7.2% (p=0.06) 감소하였다. 테깅된 MR 이미지에서는 Eulerian Circumferential 염색으로 입증되는 바와 같이, 경색부와 경계부에서의 국소 수축성 개선이 확인되었다. 이들 데이타는, MSC가 안전하며, 심장 기능을 개선시키고, 회복 리모델링을 뒷받침하며, 병변 크기를 줄인다는 것을, 입증해준다.

다른 치료 전략으로는 심근 병변을 실제 줄임으로써 수반되는 이러한 수준의 회복 리모델링을 달성하지 못하므로, 상기한 데이타는 선례가 된다. 이러한 흥미로운 결과는 본 당해 분야에서의 임상적인 연구 진행을 촉구하는 매우 중요한 토대가 된다.

급성 심근 경색 발생 후 정맥내 성체 인간 간엽 줄기 세포 (Prochymal)를 이용한 무작위, 이중 맹검, 위약-대조군을 이용한, 용량-상향식 실험: 등록 환자 53명으로 이루어진 I상 실험에서의 안전성 및 효능 데이타가 최근 Journal of the American College of Cardiology (18)에 공개되었는데, 이 문헌에는 동종이형의 MSC에 대한 매우 중요한 안전성 데이타가 구비되어 있다. 본 실험에서는, 재관류시킨 급성 MI 환자를, 위약 또는 수용체와 인간-적혈구-항원-매치되지 않은 비-혈연성 공여체 1명으로부터 수득한 골수 천자 샘플로부터 분리한 인간 MSC를 1회 정맥내 주입 받는 그룹들로 임의 추출하였다. 부작용 발생율은 hMSC 처리군 (5.3건/환자)과 위약 처리군 (7.0건/환자)이 비슷하였다. 외래 ECG 기록에서는 hMSC 처리 환자가 위약 환자에 비해 심실 빈맥 발생 건수가 줄어든 것으로 확인되었다. anterior MI 환자에 대한 초음파 심장 검사에서는 hMSC 처리 환자에서 박출 계수 향상이 확인되었다. 무엇보다도, 이러한 실험은 허혈성 심장병에 동종이형의 MSC를 사용하는 경우에 대한 중요한 안전성 데이타를 제공해주었다.

본 발명자의 실험실에서는 추가적인 전임상 안전성 및 효능 데이타를 급성 및 만성 MI를 가진 다양한 품종의 돼지 모델들에서 입수하였다 (7, 8, 15). 카테터를 통해 경색된 조직으로 MSC 주입시, 심근 경색 크기가 줄어들고, 전체적인 그리고 국소적인 LV 기능이 개선되고, 심장 활력(cardiac energetics)이 정상화되고, 조직 관류가 복원된다 (7, 8, 16).

정상적인 인간 BM으로부터 CD271 ⁺ 세포의 분리: 골수 천자 샘플은 환자의 장골릉으로부터 수면 마취(conscious sedation) 및 국소 마취 하에 전문 혈액학자/종양학자에 의해 채집되었다. BM 단핵구 세포를 밀도 구배 원심분리를 이용하여 분리한 다음, 세포를 CD271 항체가 부착된 미세비드로 표지하여, CliniMACS 임상 디바이스 (Miltenyi Biotech, Cologne, Germany)에서 CD271⁺ 세포를 분리하였다. 이 세포를 헹군 다음, 주입용으로 준비하였다. 이 과정은 약 4 - 5시간 소요된다. CD271⁺ 세포(1-5 M)는 모두 환자에게 주입하는 용도로 사용하였다.

본 실험실에서 행한 기존 연구를 통해, CD271⁺ 세포의 분리 가능성이 입증된 바 있다. CD271⁺ 세포는 항-CD271-APC 및 항-APC 미세비드로 세포를 간접 표지하는 과정을 이용하여 정상적인 공여체의 골수 세포로부터 분리하였다. BM MNC 출발 물질의 세포 수 중앙값은 1.4 x 10⁸개의 유핵 세포 (2.9 x 10⁷ 내지 3.3 x 10⁸, N=7)였으며, 선택 후의 중앙값은 4.2 x 10⁵ CD271⁺ 세포였다 (3.9 x 10⁴ 내지 9.4 x 10⁵). 이는, BM MNC 산물내 CD271⁺ 세포의 발생 빈도가 0.3%임을 의미한다. 분리한 CD271⁺ 세포는 세포질 : 핵 비율이 낮은 원시 형태(primitive morphology)를 나타내었다. 이를 액체 배양하면, CD271⁺ 세포는 7일이내에 MSC를 생성하였지만, 전체 BM MNC는 MSC를 거의 생성하지 않았다. CD271⁺ 세포로부터의 MSC 생성율을 CD271^- 세포와 비교하였는데, 170,000개의 CD271⁺ 세포는 T162 cm² 플라스크에서의 7일 배양 후 상당량의 MSC를 생성하였으며, 그 수준은 7일 배양시 상당량의 MSC를 생성하지 못한 CD271^- 세포 (1.7 x 10⁷ 세포, T162 cm² 플라스크)의 약 100배였다. CD271^- 세포 배양시 일부 부착성 세포가 있었지만, 이들은 MSC가 아닌 내피 세포인 것으로 확인되었다. CD271⁺ 세포는 CFU-F가 농화되어 있었는데, CD271⁺ 세포 222개 중 1개가 CFU-F를 생성하는데 반해 BM MNC는 12,500개 중 1개가 그러하였다. 또한, CD271^- 분획에는 CFU-F의 수가 1/100,000 미만으로 매우 적었다.

세포 전달: 관상 동맥 우회술을 완료한 후, 심장 외과의가 직접 직시하면서 심외막을 통해 병변부와 경계부로 자가 BM-CD271⁺ 세포나 위약을 주입하였다. 모든 출혈부는 면사실 봉합사로 조처하였다.

심장 MRI: 본 연구 그룹은 비-침습적인 영상화 기법인 커팅 에지(cutting-edge) (17, 19, 20)를 이용하여 심장 구조와 기능을 파악하는데 상당한 경험을 가지고 있다. 심장 MR을 이용하여 세포 치료법의 효능을 평가하였다. 심근 기능, 조직 관류 및 경색 크기에 대한 비침습적인 판단은 고조파 위상(Harmonic Phase) (HARP) 조직 테깅, 가돌리늄 흡수 카이네틱스 및 지연성 대조-강화 MRI 프로토콜 각각에 의해 수행하였다. 환자를 자기 테이블 위에 반듯이 눕히고, 12-15번의 박동하는 동안 내쉰 숨에서 호흡을 정지한 상태, 평균 10-15초간 정지한 상태로 이미지를 촬영하였고, 숨을 참는 과정 (10-15 초) 사이에 적당한 휴식기를 가졌다. 영상 촬영 프로토콜에는 먼저 심장의 위치를 파악하기 위한 세로, 축 및 사선의 스카우트 이미지 촬영이 포함되었다. 각 MRI 촬영 시간은 최종 45-60분으로 추산된다. 심근 기능을 확인하기 위해, 조직 테깅 프로토콜을 전술한 바와 같이 수행하였다. 프로토콜은 심근의 6mm-테깅 분리를 야기하는 ECG 유도성 고속 경사 에코 펄스 시퀀스를 기반으로 하였다. 이 방법을 통해, 개입 후 여러가지 시간 대에 비교하기 위해 개체에 사용할 수 있는 국소 단위의 양적 운동 및 긴장(strain) 파라미터들을 구하였으며, 이는 LV의 연속적 및 양적 기능을 평가하기 위한 신속하고 재현가능한 방법을 제공해준다. 다음으로, 환자에게 갈돌리늄-DPTA 0.2 mmol/kg을 볼루스 정맥내 주사로 투여하였다. 게이트형 고속 경사 에코 시퀀스 (gated fast gradient echo sequence)로 처리한 반전 기법(inversion-recovery)을 이용하여 LV의 8개 내지 10개의 단-축 횡단면을 고해상도의 지연형-강화 이미지로 수득하였다. 이러한 방법으로 입수한 과-강화된 확인된 영역들은, 트리페닐-테트라졸륨 클로라이드 (TTC) 염색에 의해 사후 측정한 경색 크기의 10% 이내인 것으로 확인되었으므로, 이 방법이 경색부의 크기를 결정하는 매우 정확한 방법이라는 것을 의미한다 (19).

실시예 4: 골수 CD271 ⁺ MSC 전구 세포의 심장에 대한 효능

방법

CD271 ⁺ 세포 분리: 적법한 사전 동의와 IRB의 승인 하에 AllCells LLC (Emeryville, CA)를 통해 골수 흡인 샘플 (25 내지 50 ml)을 입수하였다. 골수 (BM) 세포를 PBS + 1% FCS로 1:1로 희석하고, 피콜 위에 적층하여, 저밀도 단핵구 세포 분획 (MNC)을 분리하였다. 다음으로, MNC를 CD271 미세비드 (Miltenyi Biotech, Cologne, Germany)로 표지하고, CD271⁺ 세포를 Miltenyi MACS 세포 선별 디바이스 (VarioMACS)를 제조사의 추천 공정에 따라 사용하여 분리하였다. CD271⁺ 세포의 수를 측정하고, 형태 분석을 위해 사이토스틴(cytospin)을 준비하였다.

간엽 줄기 세포 (MSC)의 분리 및 증식: BM MNC를 전술한 바와 같이 분리하고, 세포를 20% FBS + 1% 글루타민, 페니실린 및 스트렙토마이신이 포함된 α MEM 1 ml 당 MNC 1 내지 3백만개의 밀도로 T162 cm² 배양 플레이트에서 배양하였다. 배지는 비-부착성 세포는 버리면서 3-4일마다 교체하였다. MSC는 플라스크의 표면에 부착 세포 형태로 자라며, 배양은 트립신 처리를 이용하여 컨플루언트가 될 때까지 계대 배양하였다. 4 또는 5 계대 배양째에 MSC를 회수하여, 액체 질소에서 동결시켰다. 세포는 주입하기 전에 해동 및 세척하였다.

CFU-F 분석: BM MNC, 즉 CD271⁺ 및 CD271^- 세포의 집락형성 잠재력을 콜로니 형성 유닛-섬유모 세포 (CFU-F) 분석을 이용하여 평가하였다. 세포를 35 mm 디쉬에 간엽 줄기 세포 자극 배지 + 첨가물 (Stem Cell technologies, Vancouver, Canada) 중에 접종하였다. 세포를 플레이트 당 10,000개 내지 최대 세포 백만개의 여러가지 세포 밀도로 접종하였다. 배양물은 10일간 37℃, 5% CO₂에서 인큐베이션하였고, 김자 염료로 염색하고, 해부 현미경을 이용하여 스코어를 매겼다. 통상, CFU-F 콜로니는 직경이 1 내지 8 mm이며, 현미경으로 수를 측정할 수 있다.

지방 세포와 골성 분화 가능성 유도 및 평가: CD271⁺ 세포를 테플론 백 안에서 비-부착 상태로 배양하고, 세포를 회수하여, 분화 분석을 위해 6웰 세포 배양 디쉬 (Nunc, Roskilde, Denmark)에 접종하였다. 이 세포를 NH AdipoDiff 배지 (Miltenyi Biotec Inc., Auburn, CA, USA)에 5 x 10⁴ 농도로 2주간 배양하여, 지방 세포로의 분화를 유도하였다. 그런 후, Oil Red O (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)를 이용한 지방 소적(lipid droplet) 염색에 세포를 사용하였다. 골로의 분화는 세포를 NH OsteoDiff 배지 (Miltenyi Biotec Inc.)에 3 x 10⁴ 세포/ml의 농도로 3주간 배양하여 유도하였다. 그런 후, 세포를 SIGMA FAST BCIP/NBT 완충화된 기질 정제 (Sigma)로 염색하여, 골 기질 석회화(bone matrix mineralization)에 관여하는 효소인 매트릭스 알칼리 포스파타제 (AP)의 발현을 검출하였다. 이 때 α-MEM 배지에서 배양한 세포를 대조군으로 사용하였다.

동물 모델, 심근 경색 및 세포 이식. 살아있는 동물을 대상으로 한 모든 실험들은 마이애미 대학의 동물 관리 및 이용 프로그램에 의해 승인된 프로토콜에 따라 수행하였다. 동물은 기관내 삽관을 통해 이소플루란을 흡입(1-2%)시켜 동물을 마취시키고, 마취 수준을 체온과 심박동으로 조절하였다. 통증을 방제하기 위해 수술(Q6 시간) 전과 후에 부프레노르핀(0.3mg/kg, SQ 주입)을 사용하였다. 좌전부 개흉술(left anterior thoracotomy)을 이용하여, 8-10주령의 NOD/SCID 암컷 마우스(NOD/SCID; Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME)의 심장을 노출시키고, 7-0 프롤렌 봉합사로 LAD 동맥을 영구적으로 결찰하였다. 경색은 심전도 (ECG)에서 ST 세그먼트 상승과 원위부에서 결찰부까지의 가시적인 비공간으로 확인하였다. 1차 추적 후, 실험의 기록 표준으로서 수술 후 48시간째에 ECG를 사용하였으며, 동물들 모두 MI 크기가 동일하였다. 대조군으로서 포스페이트 완충화된 염수 (PBS)를 주사하는 동물을 비롯하여, 4가지의 실험군, 즉 CD271⁺ 세포 (1.2x10⁵ 세포), 2가지 용량, 즉 1.2x10⁵ (저용량) 또는 1x10⁶ 세포 (고용량)의 인간 BM MSC 실험군을 설정하였다. 경색 발생 후 즉시, 각 동물에 경색 발생 부분의 경계부와 가운데 부위로 30 게이지 바늘을 이용하여 PBS 또는 세포를 3번 주사 (10㎕/주사)하였다. 수술 사망율은 11.5%였으며, 세포 주사 후 처음 48시간 동안의 사망율은 5%였다 (수술 전, 수술 중 및 수술 후의 전체 시간의 사망율은 16.5%임). 이식 후 8주 후에, 동물을 희생시켜, 면역조직학적 분석을 위해 심장을 준비하였다.

초음파 심장 검사: 심장 기능은 Vevo 770 이미징 시스템 (VisualSonic Inc., Toronto, Canada)으로 수술 전 베이스라인에서, 경색 발생 후와 세포 주입 후 48시간, 1주, 2주, 4주 및 8주 후에, 모니터링하였다. 심박동 400bpm 이상, 체온 (37±10℃)에서 이소플루란 흡입 (1-2%)을 통한 마취 하에, 이미지를 기록하였다. 말기 확장기 용적 (EDV), 말기 수축기 용적 (ESV) 및 박출 계수 (EF) 등의 심장 구조와 해부 구조에 대한 소노그래프 파라미터들을 2차원 이미지를 이용하여 계산하였다.

압력 용적 곡선 분석: 세포 주입 후 8주째에, 우측 경동맥을 이용하여, Millar 컨덕턴스 마노메트리 카테터 (SPR 839) (Millar Instruments, TX)를 접근시켜 좌심실에 접근하였다. 시술하는 동안, 6.25% 알부민 희석 용액을 경정맥으로 유속 5 ㎕/분으로 주입하였고, 기관내 삽관을 통해 1-2% 이소플루란을 흡입시켜 마취하였다. 압력 용적 데이타는 베이스라인과 하대정맥 (IVC) 폐쇄 후 MPVS 울트라 시스템 (Millar Instruments, TX)을 사용하여 수득하였다. 용적 보정(volume calibration)은 큐벳 방법와 고장식염수 주입(hypertonic saline infusion)으로 행하였다.

조직 준비 및 조직병리학: PV 곡선을 기록한 후, 심장을 회수하여, 10분간 포타슘 클로라이드 20 μM 용액과 10% 포르말린을 1ml/분의 유속으로 대동맥 캐뉼러 삽관을 통해 관류시켜, 심장을 이완 상태로 고정하였다. 심장을 잘라, 조직 절편을 메이슨 3색 (TM) 및 H&E으로 염색하거나, 면역조직화학에 사용하였다.

인간 특이적인 DNA 프로브 (Human Alu Probe, BioGenex, CA)를 사용하였고, 마우스 조직에 주입한 인간 세포를 추적하기 위해 플루오레센스 인 시츄 혼성화 (FISH) 방법(AntiFluorescein-HRP Conjugate, Perkin Elmer, Boston, MA)을 사용하였다. 인간 태아 심장 샘플과 PBS 주입한 마우스의 샘플을 각각 양성 대조군 및 음성 대조군으로 사용하였다. Alu 염색한 슬라이드를 차이스 형광 레이저 스캐너로 스캐닝하고, 이미지를 미락스 뷰어 소프트웨어로 20 X 배율에서 분석하였다. 이미지는 각각 취하여, CS3 아도브 포토샵으로 겹치고, 양성 세포는 동일 컷의 2곳의 별개 부위에서 수를 측정하였다.

면역조직화학: 샘플을 심장 특이 항체들, 즉 α 근절 액틴(α-SA) (Sigma, St. Louis, MO), 트로포닌 I (TnI) (Abcam, Cambridge, MA), 및 connexin 43 (Cx43) (Santa Cruz, CA)으로 염색하였다. 세포의 윤곽을 표시하기 위해 라미닌 (Abcam) 염색을 사용하였다. 염색된 샘플은 먼저 면역형광 현미경으로 검사한 다음, 공초점 Zeiss LSM710으로 검사하여, 이미지를 포착하였다.

통계 분석: Graph Pad Prism 소프트웨어를 이용하여 데이타를 분석하고, 그 값을 평균 ± 표준 편차 (SEM)로 표시하였다. 편차 분석은 반복 측정치를 이용하였다 (이원식 ANOVA + 본페로니 사후 검증으로 에코 데이타를 분석하고, 일원식 ANOVA로 최종 혈행역학 데이타를 Newman-Keuls의 다중 비교 사후 검사와 비교함).

결과

정상 인간 BM으로부터 CD271+ 세포의 분리: 세포를 항-CD271-APC 및 항-APC 마이크로비드로 간접 표지하는 방식을 이용하여 정상적인 공여 BM 세포로부터 CD271⁺ 세포를 분리하였다. 시작시의 BM MNC 세포수 중앙값은 유핵 세포 1.4 x 10⁸개 (2.9 x 10⁷ 내지 3.3 x 10⁸, N=7)였으며, 선별 후에는 CD271⁺ 세포 수 중앙값은 4.2 x 10⁵개였다 (3.9 x 10⁴ 내지 9.4 x 10⁵). 이는, BM MNC 산물내 CD271⁺ 세포 발생율 0.3%임을 의미한다. 분리한 CD271⁺ 세포는 세포질 : 핵 비율이 낮은 원시 형태인 것으로 확인되었다(도 1).

세포를 액체 배양하면, CD271⁺ 세포는 7일이내에 MSC를 생성하였지만 (도 2A), 전체 BM MNC는 MSC를 거의 생성하지 않았다 (도 2B). CD271⁺ 세포로부터의 MSC 생성율을 CD271^- 세포와 비교하였는데, 170,000개의 CD271⁺ 세포는 T162 cm² 플라스크에서의 7일 배양 후 상당량의 MSC를 생성하였으며, 그 수준은 7일 배양시 상당량의 MSC를 생성하지 못한 CD271^- 세포 (1.7 x 10⁷ 세포, T162 cm² 플라스크)의 약 100배였다. 도 2C에 나타낸 바와 같이, CD271^- 세포 배양시 일부 부착성 세포가 있었지만, 이들은 MSC가 아닌 내피 세포인 것으로 확인되었다.

CD271⁺ 세포는 CFU-F에 대해 농화되어 있었는데 (도 3), CD271⁺ 세포 250개 중 1개가 CFU-F를 생성하는데 반해 BM MNC는 12,500개 중 1개가 그러하였다. 또한, CD271^- 분획에는 CFU-F의 수가 1/100,000 미만으로 매우 적었다.

CD271 ⁺ 세포의 비-부착 조건에서의 시험관내 배양: CD271⁺ 세포를 테플론 백 안에서 비-부착 상태로 1-3달간 배양하였으며, 생장 초기 단계를 도 4에 나타낸다. 이들 배양물의 배지는 20ng/ml의 재조합 인간 염기성 섬유모 세포 성장 인자(rhbFGF)와 20% FCS가 첨가된 alpha-MEM이다. 첫째주에, 세포 클러스터를 볼 수 있었으며, 일부 세포는 플라스틱에 부착하는 MSC와 비슷한 형태로 테플론 백 표면 위에 형성되었다. 이 백을 문질러 부착된 세포를 탈착시키고, 배지를 매주 교체하였다. 세포 클러스터는 계속 증식하여, 도 4에 나타낸 바와 같이 구를 형성하였으며, 21일까지 거대 구가 만들어졌다. 이들 세포는 배양 4주 후 유세포 측정으로 분석하였으며, 이들 세포 대부분이 MSC 대표 마커인 CD105를 발현한다는 것을 도 5에 도시하였다.

비-부착 상태로 배양한 CD271⁺ 세포의 지방 세포 및 골성 분화 가능성을 조사하였다. 배양 백으로부터 세포를 회수하고, 분화 분석을 위해 6웰 세포 배양 디쉬 (Nunc, Roskilde, Denmark)에 접종하였다. 도 6에 나타낸 바와 같이, 배양한 CD271⁺ 세포는 지방 세포와 골모 세포 둘다로 분화하였다.

또한, 세포를 전형적인 MSC 배양 조건으로, 즉 α MEM 배지 + 20% FCS를 이용하여 조직 배양 플라스크에서 배양하였다. 도 4에 도시한 구는 플라스크의 플라스틱 표면에 부착하였고, 구에서 전형적인 MSC들이 생장하여 1-2주 후에 컨플루언트 배양물을 형성하였다.

이러한 결과는, 비-부착 조건에서 배양한 CD271⁺ 세포가 CD105⁺인 세포 구를 형성하며, 이들 세포는 지방 세포 및 골모 세포로의 분화 가능성을 가지고 있으며, MSC 특성과 일치되는 플라스틱에 부착하는 MSC 유사 세포를 형성한다는 것을 입증해준다.

심장 조직으로부터 유래된 마우스 기질 세포 (MsHtStr CM)에 의해 조건 조성된 배지를 이용하여, 2주간 비-부착 상태로 배양한 CD271⁺ 세포의 심장 분화 가능성을 조사하였다. 비-부착성 MSC (NA-MSC)는 α-근절 액티닌, Nkx2.5, Connexin-43, GAT-4 및 N-Cadherin을 발현하였다 (도 7). 이들 결과는, CD271⁺ 세포가 심장 세포 뿐만 아니라 지방 세포 및 골모 세포로 분화할 수 있는 잠재력을 가지고 있음을 입증해주며, CD271⁺ 세포가 플라스틱 부착형 세포와 같이 생장한 MSC에 비해 더 높은 분화 잠재력을 가지고 있다는 것을 확인시켜준다. CD271은 신경 수용체이므로, 이들 세포가 또한 신경 분화 잠재력을 가지고 있을 수 있다는 것이 시사되었으며, 현재 이 점을 조사하기 위한 실험이 진행 중에 있다.

BM-CD271 ⁺ 세포의 생체내 가능성: BM CD271⁺ 세포의 생체내 심장 잠재력을 평가하기 위해, 분리된 인간 CD271⁺ 세포를 NOD/SCID 마우스의 경색이 발생된 심장에 주입하였다. MI 손상은 시간 의존적인 방식으로 심실 이완과 기능부전을 야기하였다 (도 8). 모든 그룹들에서 처음 경색에 대한 효과는 동일하였다. 말기 이완기 (EDV) 심실 용적 비교 (도 8)에서, CD271⁺ 세포 처리 마우스 (112.8±13.6㎕)에서는, 대조군 (128.1±15.7㎕)(P=0.02) 과 비교하여, 현저한 회복 리모델링이 확인되었다. 또한, CD271 처리군은 MSC 동일 용량(저용량; 145.5±14.9㎕) (p=0.0001) 처리 동물에 비해 현저하게 양호하였고, 고용량 MSC (116.5±14.5㎕) 처리 동물과는 비슷하였다. 용량 반응은 MSC 처리 동물에서 확인되었는데, 고용량 처리군에 비해 MSC 저용량 처리 동물들에서 현저한 차이가 나타났다 (p=0.0001). 동일한 경항은 말기 수축기 용적 (ESV)에서도 확인되었으며, - CD271 처리 동물 (81.5±12.4㎕)의 경우 대조군 동물 (119.7±17.8㎕, p<0.0001) 및 저용량 MSC 처리 동물 (117.1±13.4㎕, p<0.0001)에 비해 ESV가 현저하게 낮았으며, 고용량 MSC 처리 동물 (91.2±12.6㎕)에 비해서는 그렇지 않았다. CD271 처리 동물 (32.3±3.7%)에서는, 8주 말기에, 대조군 처리 동물 (17.6±4.1%, p<0.0001) 및 저용량 MSC 처리 동물 (19.7±3.1%, p=0.0005)에 비해 박출 계수(EF)가 높게 나타났지만, 고용량 MSC 처리 동물 (24.7±2.9%)에 비해서는 그렇지 않았다.

압력 용적 곡선 분석: 주사 후 8주 경과 후, 처리군의 심장과 대조군의 심장에 대한 혈행역학 분석을 수행하였다. 컨턱턴스 마노미트리를 경동맥 경유 방식(transcarotid approach)으로 사용하였다. 동맥 탄성도 (Da: Arterial elastance)를 계산하였으며, CD271 처리 마우스는 Ea가 (3.0±0.2 mmHg/㎕)으로 대조군 동물 (4.7±0.2 mmHg/㎕, p<0.05)에 비해 낮았지만, MSC 저용량 또는 고용량 처리 마우스(각각 4.3±0.6 및 3.5±0.4 mmHg/㎕)과 유의한 차이는 없었다. 등용적 이완 상수 (constant of isovolumic relaxation) (Tau_ Weiss)는 대조군 (15.2±1.0msec, p<0.05) 보다 CD271 처리군 심장(12.3±0.8msec)에서 이완성이 개선된 것으로 나타났다.

면역조직화학: CD271⁺ 세포, MSC 및 위약 처리한 동물로부터 입수한 심장 조직 단편을 주입 8주후 인간 특이 Alu 프로브로 염색하였다. 도 9A-9D에 나타낸 바와 같이, CD271⁺ 세포를 주입한 동물에서는 심장 원위부 뿐만 아니라 경계부 모두에서 인간 세포가 존재하는 것으로 확인되었다. 혈관벽 또는 숙주 세포 사이에 끼여 있는 더 많은 수의 인간 세포들이 검출되었다. 또한, 일부 심근 세포는 Alu에 양성이었으며, Alu 양성 세포는 트로포닌 I (도 9B)과 α 평활근 액티닌 (도 9D)을 발현하였다. 이는, CD271⁺ 세포의 일부 심장 분화 잠재력을 입증해준다. 또한, 인간 세포는 고용량의 MSC를 주사한 동물의 심장에서도 검출되었으며, 이들 세포 역시 혈관 벽 또는 숙주 심근 세포 사이에 끼여 있었다. 고용량 MSC를 주사한 동물의 심장에서는, Alu 염색 심근 세포는 검출되지 않거나, 또는 Alu 양성 세포 세포내 심장 마커의 발현은 검출되지 않았다.

고찰

CD271⁺ 세포는 BM 세포에 낮은 빈도로 존재하며, BM MNC 집단의 약 0.3%를 차지한다. Miltenyi MACS 선택 시약 및 장치를 이용하여, 고도로 정제된 CD271⁺ 세포 집단이 분리되었으며, 순도는 90% 이상이며, 25 cc BM 천자 샘플에서의 평균 회수율은 세포 4.2 x 10⁵개이다. CD271⁺ 세포의 형태는 세포질 : 핵 비율이 낮은 단일 형태의 원시 모 세포(blast cells) 표현형으로 확인되었다. 데이타에 따르면, CD271⁺ 집단내 MSC 형성 세포의 농화가 검증되었으며, CD271⁺ 세포내 CFU-F의 수준은 BM MNC에 비해 60배 이상 높았다. 아울러, CD217^- 집단에서의 CFU-F 빈도는, BM MNC 집단에서의 12,500주 중 1주와 비교하여, 세포 100,000주 중 1주로 크게 낮았으며, CD271⁺ 집단에 500배 미만이었다. 플라스틱 플라스크 부착에 의해 CD271⁺ 세포로부터 생성된 MSC는, CD105⁺를 발현하는 BM MNC로부터 생성된 MSC와 동일한 시험관내 특성을 나타내었으며, 시험관내에서 지방 세포 및 골모 세포를 형성할 수 있었다. 기존 실험들에서는, CD271⁺CD45^- 세포 집단에 MSC 잠재성이 존재한다는 것이 입증된 바 있다. 아울러, 표현형 분석에서는, CD271⁺ 세포가 CD105 및 CD90을 비롯한 전형적인 MSC 마커에 음성이었지만, 배양 후에는 고전적인 MSC 마커들, 즉 CD105, CD90 및 CD73을 발현하는 것으로 확인되었다. 또한, CD271 발현은 골형성, 지방형성, 연골형성 및 근형성 계통으로의 분화를 저해한다. 본원에 기술된 데이타는 문헌의 내용과 부합되며, CD271⁺ 세포가 MSC의 전구체인 줄기 세포 집단이며, CD271⁺ 세포의 플라스틱 부착성 MSC로의 분화시 지방형성, 연골형성 및 골형성 계통으로 운명이 결정된다는 의견을 뒷받침한다.

비-부착성 배양 조건에서 MSC를 제작하는 방법을 평가하기 위해 추가적인 실험을 시험관내에서 수행하였다. 심장 회복에 대한 실험적인 주안점을 감안하여, 플라스틱 부착 세포로서 만들어진 MSC가 심장 재생에 최적이 아닐 수 있다는 가설이 제안되었다. BM에서 MSC는 부착성 세포 생장의 기질로서 작용하기 위한 골 표면을 가지지만, 심장 조직에는 등가의 기질이 존재하지 않는다. 이에, 비-부착 상태에서 MSC(NA-MSC)를 증식시키기 위한 배양 조건을 개발하였다. CD271⁺ 세포를 세포의 부착성을 최소화하는 테플론 백에서 배양하고, 세포를 현탁 상태로 유지하고 있는 백을 주기적으로 만져주었다. 결과 항목에 나타낸 바와 같이, 백 안에서 증식된 MSC는 MSC 특성을 가진 세포로 구성된 구를 형성하며, 표준 플라스틱 플라스크에 넣어 배양하였을 때에는 고전적인 부착성 MSC와 유사한 세포를 형성하며, CD105를 발현한다. 또한, NA-MSC는 적합한 배양 조건에서는 지방 세포 및 연골세포로 분화되었다. NA-MSC의 골형성력은 현재 평가 중에 있다. 또한, CD271⁺ 세포를 뮤라인 심장 유래의 기질 세포에 의해 조성된 배지 존재 하에 배양하는 경우 심장 특이적인 유전자를 발현하도록 유도될 수 있다는 것이 본원에서 입증되었다. 또한, 인간 태아 심장 조직으로부터 유래된 기질 세포에 의해 조성된 배지는 또한 심장 유전자의 발현도 자극한다. 이들 데이타는, 동일 조건에서 배양하였을 때 심장 유전자를 발현하지 못한 플라스틱에 부착되어 형성된 MSC에 비해, CD271⁺ 세포가 분화력이 더 높을 수 있음을 입증해준다.

인간 CD271⁺ 세포의 생체내 잠재력은 심근 경색 유도 후 면역불능의 NOD/SCID 마우스에서 평가하였다. 비교를 위해, 분리하여 플라스틱 플라스크에서의 표준 부착 기법으로 증식시킨 인간 MSC를 주입하였고, 대조군 동물에는 위약을 주입하였다. CD271⁺ 세포 120,000개를 주입한 결과, 동일한 갯수의 MSC를 주입한 마우스 및 대조군 동물에 비해 심장 기능이 개선되었으며, 박출 계수가 증가되었다. 동일한 결과는 MSC를 고용량으로 주입한 동물에서도 확인되었다. 이들 데이타는, 동일한 세포 용량에서는 CD271⁺ 세포의 잠재력이 MSC 보다 높다는 것을 입증해준다. 아울러, 심장 마커의 발현은 CD271⁺ 세포를 주입한 동물내 인간 세포에서 검출되었지만, MSC를 주입한 동물에서는 검출되지 않았는데, 이는 MSC에서는 아닌 CD271⁺ 세포의 심장 잠재력을 입증하는 시험관내 데이타와 일치한다.

여러 그룹들에서는 단핵구 세포, CD34⁺ 세포, CD133⁺ 세포 및 MSC를 비롯하여 여러가지 골수 유래 집단의 잠재력을 평가한 바 있다. 본 연구에서는, BM 유래 MSC 잠재성을 전임상의 대형 동물 실험에서 평가하였고, MSC가 만성적인 경색 병변에 생착 및 부착하여, 병변 크기의 실질적인 감소, 손상된 심장의 회복 리모델링 및 심근 수축성과 조질 관류 양자의 증가 등의 현저한 심근 회복을 자극할 수 있다는 것을 입증하였다. 이러한 전임상 실험은 마이애미 대학에서 MSC 임상 실험의 진행으로까지 이어지게 되었다. 이러한 실험들 중 한가지는 만성적인 허혈성 좌심실 기능부전에 따른 심근 경색을 앓고 있으며, 관상 동맥 우회 이식 (CABG)을 위한 심장 수술을 시술받을 환자를 대상 수행되었다. 이러한 실험 참여는 환자가 우회술을 시술받아야하는 위급성으로 인해 제한적이었으며, 소수의 환자들만 자가 MSC를 만드는데 소요되는 5 내지 6주를 대기할 수 있다. 이들 BM 유래 CD271⁺ 세포는 이들 환자의 이상적인 자가 세포원이다. BM 천자 샘플로부터 CD271⁺CD271⁺ 세포를 4 내지 5시간 이내에 분리함으로써, 응급 수술이 필요한 CABG 환자를 치료하기 위한 쉽고 유용한 세포 집단을 제공할 수 있다. 이들 실험은, BM-유래 CD271⁺ 세포가 심장 회복 실험을 위한 고유한 세포 집단을 제공한다는 증거를 제공한다. 플라스틱 부착을 통해 분리한 MSC에 비해, CD271⁺ 세포는 시험관내 심장 분화 잠재력이 우수하며, MI 발병 후 마우스 치료시 심장 기능을 상당히 개선시킨다. CD271⁺ 세포는 자기 세포 선별법을 이용하여 쉽게 분리할 수 있으며, 따라서 우회술이 요구되는 환자를 위한 잠재적인 세포원이 될 수 있다.

본 발명은 한가지 이상의 구현예를 들어 예시되고 기술되어 있지만, 당해 기술 분야의 당업자라면 본 명세서와 첨부된 도면을 읽고 이해하여, 등가의 변형과 수정을 가할 수 있을 것이다. 아울러, 본 발명의 개별 특징은 여러가지 구현 방식들 중 오직 한가지에 대해서만 기술되어 있을 수 있지만, 이러한 특징은 임의의 주어진 또는 특정 용도에 바람직하거나 유리할 수 있는, 다른 구현 방식들 중 한가지 이상의 다른 특징들과 조합될 수 있다.

본 개시 내용의 요약서는 독자가 기술 내용에 대한 특성을 신속하게 파악할 수 있게 해줄 것이다. 요약서는 첨부된 청구항의 범위나 의미를 해석하거나 제한하는 것으로 사용되지 않는다는 이해 하에 이를 제출한다.

Claims (14)

1. 심혈관 질환 또는 장애의 예방 또는 치료 방법으로서,
   개체의 골수에서 CD271⁺ 간엽 줄기 세포 (MSC) 전구체를 분리하는 단계;
   분리한 CD271⁺ 간엽 줄기 세포 (MSC) 전구체를 환자에게 치료학적 유효량으로 투여하는 단계; 및
   심혈관 질환 또는 장애를 예방 또는 치료하는 단계
   를 포함하는 것을 특징으로 하는 심혈관 질환 또는 장애의 예방 또는 치료 방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 CD271⁺ MSC는 신경 성장 수용체 (NGFR; CD271)에 대해 친화성이 낮은 골수 세포로부터 분리되는 것을 특징으로 하는 방법.
3. 제1항에 있어서, 상기 CD271⁺ 줄기 세포는 자가(autologous), 동종동형(syngeneic), 동종이형(allogeneic) 또는 이종(xenogeneic) 공여체로 이루어진 공여체로부터 분리된 것을 특징으로 하는 방법.
4. 제1항에 있어서, 상기 MSC 전구체 세포는 심근 세포 계통, 혈관 세포 계통 또는 내피 세포 계통을 포함하는 한가지 이상의 계통으로 분화하는 것을 특징으로 하는 방법.
5. 제1항에 있어서, 상기 MSC 전구체 세포는 심근 세포 계통, 혈관 세포 계통 또는 내피 세포 계통을 포함하는 계통들로 분화하는 것을 특징으로 하는 방법.
6. 제4항에 있어서, 상기 심근 세포는 GATA-4, Nkx2.5 또는 α-근절 액틴 (sarcomeric actin)을 포함하는 마커에 의해 식별되는 것을 특징으로 하는 방법.
7. 제4항에 있어서, 상기 혈관 세포는 α-평활근 액틴 또는 SMA22를 포함하는 마커에 의해 식별되는 것을 특징으로 하는 방법.
8. 제4항에 있어서, 상기 내피 세포는 CD31 또는 비멘틴(vimentin)을 포함하는 마커에 의해 식별되는 것을 특징으로 하는 방법.
9. 제1항에 있어서,
   하나 이상의 제제가 상기 환자에게 선택적으로 투여되며,
   상기 제제는 사이토카인, 주화성 인자(chemotactic factor), 성장 인자 또는 분화 인자 중 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
10. 제1항에 있어서, 상기 심혈관 질환 또는 장애가 심부전, 죽상경화증, 허혈증, 심근 경색, 이식, 고혈압, 협착증, 협심증, 류마티스성 심장병 또는 선천적인 심혈관 결함을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
11. 제1항에 있어서, 상기 간엽 줄기 세포 전구체는 선택적으로 소정 기간 동안 가변 농도로 환자에게 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
12. 제1항에 있어서, 상기 간엽 줄기 세포 전구체는 심장내 경색부와 경계부에서 생체내 생착되는 것을 특징으로 하는 방법.
13. 제1항에 있어서, 상기 간엽 줄기 세포 전구체는 선택적으로 심장 유래 기질 세포(stromal cell)에 의해 컨디셔닝된 배지에 의해 컨대셔닝되는 것을 특징으로 하는 방법.
14. 제1항에 있어서, 상기 간엽 줄기 세포 전구체를, 선택적으로, 생체외에서 배양하고, 비-부착형 간엽 줄기 세포 전구체 (NA-MSC)를 분리 및 증식시킨 후, 환자에게 투여하는 것을 특징으로 하는 방법.

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