CZ305120B6 - Způsob přípravy kolagenové houby - Google Patents

Abstract

Způsob přípravy kolagenové houby, který zahrnuje následující stupně: přípravu kolagenového gelu; vmíchání vzduchu do kolagenového gelu pro získání kolagenové pěny; vysušení kolagenové pěny pro získání suchého bloku kolagenové houby s trojrozměrnou strukturou s uspořádanými komůrkami, které jsou oddělené a v podstatě zcela obklopené stěnami kolagenového materiálu; a oddělení částí houby s průměrem komůrek větším než 0,75 mm a menším než 4 mm nebo středním průměrem nejvýše 3 mm z bloku kolagenové houby.

Description

Vynález se týká způsobu přípravy kolagenové houby. Kolagenová houba připravená podle tohoto vynálezu je zvláště vhodná v chirurgii, a to zejména k zástavě kapilárního krvácení. Lze ji použít také jako nosič určený k pokrytí kompozicí fibrinového lepidla. Popsáno je také zařízení pro oddělení části kolagenové houby a podlouhlá kolagenová houba primárně určená pro gastrointestinální použití.

Dosavadní stav techniky

Kolagen se jako hemostatické činidlo používá již od konce šedesátých let minulého století. Kolagen je u všech savců nejběžnějším strukturním proteinem. Monomemí protein s asi 300 kDa (tropokolagen) se v určitých místech kovalentně sesíťuje. Hotový protein je proto nerozpustný a vytváří charakteristická vlákénka s vysokou pevností v tahu. Byly popsány mnohé podtřídy kolagenu, přičemž nejběžnějším je kolagen typu 1, hlavní kolagenový typ v kůži, šlachách, kostech a rohovce. Kolagen je vláknitý protein sestávající v podstatě z trojšroubovice o délce asi 290 nm. Pět těchto trojšroubovic (tropokolagenových molekul) je uspořádáno do mikrovlákénka s průměrem asi 3,6 nm. Tato mikrovlákénka mají polární a nepolární segmenty, které jsou snadno dostupné pro specifické interfibrilámí a intrafibrilámí interakce. Mikrovlákénka jsou sbalena do tetragonální mřížky a tvoří subfibrily o průměru asi 30 nm. Tyto subfibrily se poté uspořádají do kolagenového vlákénka, čili základní jednotky pojivové tkáně, která má průměr několik stovek nanometrů a která je proto viditelná ve světle mikroskopu jako tenká čárka, viz odkaz 1. Kolagenový gel a kolagenová houba tak, jak se vyrobí v průběhu výrobního způsobu, obsahují tato vlákénka jako nejmenší jednotky, jak bylo dokázáno mikroskopií.

Kolagen lze použít jako materiál pro utěsnění poranění, eventuálně s potahem obsahujícím fibrinové lepidlo. Fibrinová lepidla, to jest kombinace fibrinogenu, trombinu a aprotininu, se úspěšně terapeuticky používají po mnoho let k lepení tkání a nervů a pro utěsnění povrchů, které slabě krvácejí. Jednou z nevýhod fibrinového lepidla je, že v případě většího krvácení se lepidlo obvykle odplaví již před tím, než dojde k dostatečné polymerizaci fibrinu. K překonání tohoto problému začali chirurgové manuálně aplikovat kapalná fibrinová lepidla na absorbující nosiče, jako je kolagenová pletenina.

Navzdory značnému úspěchu těchto kombinovaných aplikací nebyl tento způsob kvůli některým nevýhodám použit v širokém měřítku. Příprava je totiž relativně těžkopádná, způsob provedení vyžaduje zkušenost a zručný personál a přípravek není ve stavech nouze pohotově k dispozici a doba pro připravuje v rozmezí 10 až 15 minut. Tyto faktory stimulovaly vývoj zlepšeného výrobku, což vedlo k vývoji pevného kombinovaného prostředku kolagenového nosiče pokrytého potahem pevného fibrinogenu, pevného trombinu a pevného aprotininu, jak je popsáno v patentu EP 0 059 265. Výrobek popsaný v patentu EP 0 059 265, kteiý se prodává pod obchodním názvem TachoComb®, lze aplikovat přímo na poranění. Když se potah dostane do kontaktu s vodnými tekutinami jako je krev, dalšími tělesnými tekutinami nebo fyziologickým roztokem, jeho složky se rozpustí a vznikne fibrin. Výrobek se aplikuje na poranění s mírným přitlačením a kolagen se pevně naváže (přilepí) na poraněný povrch. Dojde k zástavě krvácení a poranění se uzavře.

Kromě určité stimulační aktivity při koagulaci krve je funkcí kolagenu v prostředku TachoComb® hlavně to, že tento nosič adsorbuje a dodává mechanickou stabilitu koagulačnímu přípravku, kterým je pokryt. Další výhody kolagenu, zvláště jeho houbovité formy, jsou jeho biodegradabílita, jeho relativní vysoká pevnost v tahu, dokonce i za mokra, jeho vysoká rezistence vůči průniku kapalin a vzduchu a jeho vysoká pružnost za mokra.

- 1 CZ 305120 B6

Způsob přípravy kolagenové houby

Oblast techniky

Vynález se týká způsobu přípravy kolagenové houby. Kolagenová houba připravená podle tohoto vynálezu je zvláště vhodná v chirurgii, a to zejména k zástavě kapilárního krvácení. Lze ji použít také jako nosič určený k pokrytí kompozicí fibrinového lepidla. Popsáno je také zařízení pro oddělení části kolagenové houby a podlouhlá kolagenová houba primárně určená pro gastrointestinální použití.

Dosavadní stav techniky

Kolagen se jako hemostatické činidlo používá již od konce šedesátých let minulého století. Kolagen je u všech savců nejběžnějším strukturním proteinem. Monomemí protein s asi 300 kDa (tropokolagen) se v určitých místech kovalentně sesíťuje. Hotový protein je proto nerozpustný a vytváří charakteristická vlákénka s vysokou pevností v tahu. Byly popsány mnohé podtřídy kolagenu, přičemž nej běžnějším je kolagen typu 1, hlavní kolagenový typ v kůži, šlachách, kostech a rohovce. Kolagen je vláknitý protein sestávající v podstatě z trojšroubovice o délce asi 290 nm. Pět těchto trojšroubovic (tropokolagenových molekul) je uspořádáno do mikrovlákénka s průměrem asi 3,6 nm. Tato mikrovlákénka mají polární a nepolární segmenty, které jsou snadno dostupné pro specifické interfibrilámí a intrafibrilámí interakce. Mikrovlákénka jsou sbalena do tetragonální mřížky a tvoří subfibrily o průměru asi 30 nm. Tyto subfibrily se poté uspořádají do kolagenového vlákénka, čili základní jednotky pojivové tkáně, která má průměr několik stovek nanometrů a která je proto viditelná ve světle mikroskopu jako tenká čárka, viz odkaz 1. Kolagenový gel a kolagenová houba tak, jak se vyrobí v průběhu výrobního způsobu, obsahují tato vlákénka jako nejmenší jednotky, jak bylo dokázáno mikroskopií.

Kolagen lze použít jako materiál pro utěsnění poranění, eventuálně s potahem obsahujícím fibrinové lepidlo. Fibrinová lepidla, to jest kombinace fibrinogenu, trombinu a aprotininu, se úspěšně terapeuticky používají po mnoho let k lepení tkání a nervů a pro utěsnění povrchů, které slabě krvácejí. Jednou z nevýhod fibrinového lepidla je, že v případě většího krvácení se lepidlo obvykle odplaví již před tím, než dojde k dostatečné polymerizaci fibrinu. K překonání tohoto problému začali chirurgové manuálně aplikovat kapalná fibrinová lepidla na absorbující nosiče, jako je kolagenová pletenina.

Navzdoiy značnému úspěchu těchto kombinovaných aplikací nebyl tento způsob kvůli někteiým nevýhodám použit v širokém měřítku. Příprava je totiž relativně těžkopádná, způsob provedení vyžaduje zkušenost a zručný personál a přípravek není ve stavech nouze pohotově k dispozici a doba pro připravuje v rozmezí 10 až 15 minut. Tyto faktory stimulovaly vývoj zlepšeného výrobku, což vedlo k vývoji pevného kombinovaného prostředku kolagenového nosiče pokrytého potahem pevného fibrinogenu, pevného trombinu a pevného aprotininu, jak je popsáno v patentu EP 0 059 265. Výrobek popsaný v patentu EP 0 059 265, který se prodává pod obchodním názvem TachoComb®, lze aplikovat přímo na poranění. Když se potah dostane do kontaktu s vodnými tekutinami jako je krev, dalšími tělesnými tekutinami nebo fyziologickým roztokem, jeho složky se rozpustí a vznikne fibrin. Výrobek se aplikuje na poranění s mírným přitlačením a kolagen se pevně naváže (přilepí) na poraněný povrch. Dojde k zástavě krvácení a poranění se uzavře.

Kromě určité stimulační aktivity při koagulaci krve je funkcí kolagenu v prostředku TachoComb® hlavně to, že tento nosič adsorbuje a dodává mechanickou stabilitu koagulačnímu přípravku, kterým je pokryt. Další výhody kolagenu, zvláště jeho houbovité formy, jsou jeho biodegradabilita, jeho relativní vysoká pevnost v tahu, dokonce i za mokra, jeho vysoká rezistence vůči průniku kapalin a vzduchu a jeho vysoká pružnost za mokra.

-1 CZ 305120 B6

Předložený vynález se primárně týká výroby kolagenové houby, kterou lze použít jako nosič pro fíbrinogen, trombin a/nebo aprotinin, například jako u prostředku TachoComb®. Kolagenovou houbu lze také použít přímo, to jest bez pokrytí, a to jako bandáž na místní poranění, jako podporu při zástavě krvácení, jako prevenci obnovení krvácení, na slabá, difuzní krvácení z parenchymových orgánů, pro aplikaci na popáleniny, kožní štěpy, proleženiny nebo kožní defekty nebo jako bandáž na místní poranění.

V předchozích dílech v oboru bylo navrženo množství způsobů přípravy kolagenového nosiče. Patentová přihláška WO 86/05 811 popisuje plnivovou mikrohoubu pro imobilizaci bioaktivních materiálů v pohyblivých systémech bioreaktoru, kde tato mikrohouba obsahuje vysoce sesíťovanou kolagenovou matrici. Vysoce sesíťovaná kolagenová matrice se připraví rozemletím zdroje kolagenu typu I, II nebo III za zisku vláken o průměru řádu 1 až 50 pm a délce do 200 pm. Rozemletý kolagen se zpracuje na rozpustný kolagen, který je rozpustný v rozpouštědle nebo na nerozpustný kolagen, který se disperguje v rozpouštědle smícháním s tímto rozpouštědlem, jako je octová kyselina, mléčná kyselina, propionová kyselina nebo máselná kyselina. Při dispergování kolagenu se míchání provede míchačkou pomocí vysokorychlostního míchání tak, aby se získala mikrovlákna kolagenu. Dále se s kolagenovou kapalnou směsí smíchá zvážené aditivum a tato kompoziční směs se zpracuje na malé kapičky a zmrazením se zpevní. Pro výrobu malých částic je popsáno množství technik. Zmrazená kompozitní směs se vymrazí za sníženého tlaku, kde kombinace zmrazení a sušení se odkazuje jako lyofilizace. Na lyofílizovaný kolagenový matricový kompozic se působí takovým způsobem, aby se kolagen sesíťoval. Kolagen lze sesíťovat použitím buď chemických síťovacích činidel, hloubkou dehydratací za zvýšené teploty nebo kombinací obou těchto metod. Kolagenová matrice má být rezistentní vůči kolagenáze a jiné enzymatické degradaci, čímž dělá tyto materiály zvláště vhodnými ke kultivaci mikroorganismů. Po promytí sesíťované kolagenové matrice lze mikrohouby sterilizovat a asepticky zabalit.

V plnivové mikrohoubě je kolagenová matrice svou pórovou strukturou otevřená vůči povrchu a má střední velikost póru v rozmezí 1 až 150 pm, přičemž póry matrice tvoří 70 až 98 % objemu mikrohouby. Mikrohouba má dále střední velikost částice 100 až 1000 pm a specifickou hmotnost 1,05. Plnivem může být kov nebo slitiny kovu, kovové oxidy a keramika.

Patent US 5 660 857 popisuje způsob přípravy kompozitu obsahujícího nerozpustnou proteinovou matrici a olejovitý materiál, jež jsou vhodné jako materiál pro chirurgické obvazy a biomedicinální implantáty a jako kosmetický materiál pro aplikaci na kůži. Způsob patentu US 5 660 857 obsahuje kroky smíchání proteinu, olejovitého materiálu a vody za vzniku emulze olejovitého materiálu ve vodné disperzi proteinu a následně sušení nebo lyofilizací emulze za vzniku filmu nebo houby. Nerozpustný vláknitý protein je převážně tvořen nerozpustným kolagenem, který lze vhodně získat z hovězí kůže. V jednom provedení může být kolagen před použitím nabobtnán v mléčné kyselině.

Patentová přihláška WO 99/13 902 popisuje způsob výroby růstové matrice pro meningeální tkáň a obsahuje krok přípravy fyziologicky kompatibilního kolagenu, který je v podstatě bez aktivních virů a prionů. Kolagen se vytvaruje do formy filmu, houby, netkaného kolagenu nebo plsti. Kolagen se získá způsobem obsahujícím vyčištění kůže, šlach, vazů nebo kostního tuku. Materiál se poté podrobí působení enzymu, čímž kolagenový materiál nabobtná. Kolagenový materiál se poté dále bobtná v kyselém roztoku. Poté se kolagenová směs zhomogenizuje. Získaný výrobek může být matricí ve formě kolagenové houby, netkané matrice, plsti nebo filmu nebo kompozitu dvou nebo více v předchozím textu uvedených forem. Kolagenovou houbu lze získat úpravou způsobů tvorby kolagenových hub, které jsou popsány v patentu US 5 019 087. Houbu lze připravit lyofilizací kolagenové disperze připravené podle patentové přihlášky WO 99/13 902. Dosažená hustota houby je 0,1 až 120 mg/cm³. Podle popisu patentové přihlášky WO 99/13 902 je velikost póru v rozmezí 10 až 500 pm. Popsány jsou laminátový typ kolagenové houby a kolagenový film.

-2CZ 305120 B6

Patent US 5618551 se týká nesesíťovaného a potenciálně sesíťovatelného, pepsinem zpracovaného kolagenového nebo želatinového prášku modifikovaného oxidativním štěpením ve vodném roztoku, kde tento prášek je rozpustný v kyselém pH a stabilní je alespoň jeden měsíc za skladování při teplotě pod 0 °C. Patent se dále týká způsobu přípravy prášku, který obsahuje přípravu kyselého roztoku pepsinem zpracovaného kolagenu, dále podrobení kyselého vodného roztoku kontrolované oxidaci za laboratorní teploty, vysrážení oxidovaného, nesesíťovaného, pepsinem zpracovaného kolagenu v kyselém pH a oddělení, zakoncentrování a dehydrataci nesesíťovaného, pepsinem zpracovaného kolagenu tak, aby se získal ve formě reaktivního kyselého prášku, a zmrazení a skladování získaného reaktivního kyselého prášku při teplotě pod 0 °C.

I

Patent GB 1 292 326 popisuje způsob a zařízení pro přípravu kolagenových disperzí s ohledem na jejich aplikace, kde se připraví suspenze kolagenových vláken a následně se vnese do reakčního prostoru s míchacím zařízením. V reakčním prostoru je podtlak, při kterém se suspenze za míchání a kontrolovaného okyselování prostřednictvím minerální nebo organické kyseliny převede na disperzi. Podle popisu patentu GB 1 292 326 může být příprava houbovitých kolagenových výrobků realizována z disperze nebo gelů kolagenu. V tomto kontextu dokument odkazuje na lyofilizaci a na disperzi nebo gely, které jsou velmi bohaté na vzduchové bublinky. Patent GB 1 292 326 dále zmiňuje problém uspokojivého způsobu kontroly zavádění nebo eliminace vzduchových bublinek. Dokument ve dvou příkladech popisuje kolagenovou disperzi neobsahující vzduchové bublinky, která má obsah kolagenu 2,5 % a provzdušněnou disperzi kolagenu s koncentrací kolagenu 2,5 %.

Chemical Abstracts, Columbus Ohio, USA, svazek 98, 13. červen 1983, č. 24, zmiňují kolagen získaný z živočišných tkání jako je kůže nebo šlacha z kostí, který byl vystaven působení kyseliny. Kolagen se dialýzou přeskupí, přičemž během tohoto procesu se vytvoří síť vysoce dvojlomných krystalických vláken. Kolagen lze vytvarovat do 0,5mm až 2cm proužků nebo smíchat se vzduchem za vzniku hub nebo dispergovat jako krém.

Podstata vynálezu

Bylo zjištěno, že úspěšné pokrytí kolagenové houby přípravkem fibrinového lepidla závisí na struktuře kolagenové houby. Předmět předloženého vynálezu se tak týká způsobu výroby kolagenové houby s určitou strukturou, konkrétním cílem je vyrobení kolagenové houby vhodné pro pokrytí přípravkem fibrinového lepidla tak, aby se získal materiál pro hojení a uzavírání poranění. Dalším předmětem tohoto vynálezu je způsob výroby kolagenové houby mající ve vztahu k houbám z předchozích děl v oboru zlepšené fyzikální vlastnosti, a to ve smyslu zlepšené vlhkosti, pružnosti, hustoty a modulu pružnosti. Další předmět vynálezu se týká způsobu přípravy kolagenové houby, která je vzduchotěsná a kapalinotěsná vtom smyslu, že když se kolagenová houba aplikuje na poranění, nedovolí vzduchu nebo kapalině prosakovat kolagenovou houbou. Ještě další předmět vynálezu se týká materiálu pro uzavírání poranění, který lze použít v gastrointestinálních traktech nebo na průdušnici.

Předmětem vynálezu v hlavním povedení i) je způsob přípravy kolagenové houby, který zahrnuje následující stupně:

- příprava kolagenového gelu,

- vmíchání vzduchu do kolagenového gelu pro získání kolagenové pěny,

- v ysušení kolagenové pěny pro získání suchého bloku kolagenové houby s trojrozměrnou strukturou s uspořádanými komůrkami, které jsou oddělené a v podstatě zcela obklopené stěnami kolagenového materiálu a

-3 CZ 305120 B6

- oddělení částí houby s průměrem komůrek větším než 0,75 mm a menším než 4 mm nebo středním průměrem nejvýše 3 mm z bloku kolagenové houby.

Přednostní provedení způsobu podle vynálezu zahrnují zejména ii) způsob podle provedení i), při němž je obsah kolagenu v oddělených částech houby 50 až 100%;

iii) způsob podle provedení i) nebo ii), při němž kolagenový gel obsahuje kolagenový materiál různých typů z alespoň jednoho zdroje zvoleného ze savčího, transgenního nebo rekombinantního zdroje;

iv) způsob podle provedení iii), při němž kolagen zahrnuje materiál ze šlach vybraných ze skupiny sestávající z koňských šlach a hovězích šlach;

v) způsob podle provedení iii) nebo iv), při němž stupeň přípravy kolagenového gelu zahrnuje následující stupně:

- uložení šlach při teplotě -10 až -30 °C a jejich sloupnutí,

- odstranění cizího proteinu ze šlach,

- snížení obsahu choroboplodných zárodků ve šlachách,

- nabobtnání šlach a

- homogenizaci nabobtnaných šlach;

vi) způsob podle provedení v), při němž stupeň snížení obsahu choroboplodných zárodků zahrnuje přidání kyseliny a organického rozpouštědla ke šlachám;

vii) způsob podle provedení vi), při němž kyselinou je organická kyselina, jako kyselina mléčná;

viii) způsob podle provedení vi) nebo vii), při němž je organickým rozpouštědlem alkohol, jako ethanol;

ix) způsob podle kteréhokoliv z provedení v) až viii), při němž stupeň nabobtnání šlach zahrnuje přidání kyseliny mléčné ke šlachám;

x) způsoby podle kteréhokoliv z provedení v) až ix), při němž kyselina má hodnotu pH v rozmezí 1 až 4, přednostně 1,5 až 3,5 a zvláště přednostně 2,5 až 3,0;

xi) způsob podle kteréhokoliv z provedení v) až x), při němž kyselinou mléčnou je 0,45% kyselina mléčná;

xii) způsob podle kteréhokoliv z provedení v) až x), při němž stupeň bobtnání šlach zahrnuje uložení šlach při teplotě 4 až 25 °C po dobu 48 až 200 hodin;

xiii) způsob podle provedení xii), při němž se šlachy uloží na dobu 100 až 120 hodin;

xiv) způsob podle kteréhokoliv z provedení v) až xiii), při němž ve stupni homogenizace nabobtnaných šlach se získává hmota obsahující částice šlach, kde tyto částice mají délku nebo průměr 0,8 až 1,2 cm;

xv) způsob podle kteréhokoliv z předchozích provedení při němž stupeň vmíchání vzduchu do kolagenového gelu zahrnuje následující stupně:

-4CZ 305120 B6

- vmíchání okolního vzduchu do gelu prostřednictvím za použití mixéru pro vznik kolagenové pěny,

- uvedení namíchané gelové pěny do frakcionačního kanálku a

- oddělení kolagenového gelu a kolagenové pěny obsažené ve frakcionačním kanálku;

xiv) způsob podle provedení xv), při němž alespoň část kolagenového gelu odděleného od kolagenové pěny ve frakcionačním kanálku se odvádí zpět do mixéru;

xvii) způsob podle provedení xvi), při němž poměr mezi množstvím kolagenového gelu, který se vede zpět do mixéru z frakcionačního kanálku a množstvím čerstvého kolagenového gelu vedeného do mixéru je v rozmezí od 0,1 do 0,5;

xviii) způsob podle kteréhokoliv z provedení xv) až xvii), při němž stupeň oddělení kolagenového gelu a kolagenové pěny zahrnuje následující stupně:

- oddělení vybrané části kolagenové pěny obsažené ve frakcionačním kanálku a

- odvedení této vybrané části kolagenové pěny ven z frakcionačního kanálku k jejímu vysušení;

xix) způsob podle kteréhokoliv z provedení xv) až xviii), při němž ve frakcionačním kanálku se udržuje teplota 15 až 40 °C;

xx) způsob podle kteréhokoliv z předchozích provedení, při němž po vmíchání vzduchu do kolagenového gelu se kolagenová pěna dále homogenizuje po dobu 2 až 4 minut;

xxi) způsob podle kteréhokoliv z předchozích provedení, při němž před stupněm vysušením kolagenové pěny a po stupni vmíchání vzduchu do kolagenového gelu se do kolagenové pěny přidá neutralizační činidlo a kolagenová pěna se neutralizuje, aby se dosáhlo hodnoty pH kolagenové pěny v rozmezí 6,5 až 8,5;

xxii) způsob podle provedení xxi), při němž se použije neutralizační činidlo obsahující roztok amoniaku;

xxiii) způsob podle provedení xxi) nebo xxii), při němž se kolagenová pěna neutralizuje po dobu 5 až 30 hodin;

xxiv) způsob podle provedení xxiii), při němž se kolagenová pěna neutralizuje po dobu 20 až 30 hodin;

xxv) způsob podle kteréhokoliv z předchozích provedení, při němž se stupeň sušení zahrnuje sušení při teplotě 15 až 60 °C po dobu 48 až 200 hodin tak, že se získá vysušená kolagenová houba;

xxvi) způsob podle provedení xxv), při němž stupeň sušení se provádí při tlaku 70 až 90 kPa;

xxvii) způsob podle kteréhokoliv z předchozích provedení, při němž stupeň sušení zahrnuje sušení při teplotě 15 až 40 °C po dobu 100 až 200 hodin;

xxviii) způsob podle kteréhokoliv z provedení xxv) až xxvii), při němž stupeň sušení se provádí v takovém rozsahu, aby kolagenová houba měla obsah vody do 20 %;

-5 CZ 305120 B6 xxix) způsob podle kteréhokoliv z předchozích provedení, při němž stupeň oddělení částí kolagenové houby zahrnuje rozdělení kolagenové houby do více částí krájením;

xxx) způsob přípravy kolagenové houby podle kteréhokoliv z předchozích provedení, který zahrnuje následující stupně:

- přípravu kolagenového gelu,

- vmíchání vzduchu do kolagenového gelu pro získání kolagenové pěny,

- vysušení kolagenové pěny pro získání suchého bloku kolagenové houby s trojrozměrnou strukturou s uspořádanými komůrkami, které jsou oddělení a v podstatě zcela obklopené stěnami kolagenového materiálu a

- oddělení z bloku kolagenové houby částí houby s následujícími vlastnostmi:

- modul pružnosti v rozmezí 0,05 až 1 MPa,

- hustotu v rozmezí 1 až 10 mg/cm³,

- průměr komůrky větší než 0,75 mm a menší než 4 mm nebo střední průměr komůrky maximálně 3 mm.

V dalším popisuje vynález objasňován v širším kontextu, než odpovídá rozsahu, který je skutečně předmětem tohoto vynálezu. Výslovně se proto uvádí, že do rozsahu vynálezu spadají jen aspekty explicitně uvedené výše, a jen ty jsou také předmětem připojených patentových nároků. Následující popis má jen ilustrativní význam. Komůrky v houbě jsou dále označovány také jako dutiny.

Prvý předmět tohoto vynálezu se týká způsobu přípravy kolagenové houby, který obsahuje přípravu kolagenového gelu, vmíchání vzduchu do kolagenového gelu tak, aby se získala kolagenová pěna, vysušení kolagenové pěny tak, aby se získal suchý blok kolagenové houby mající uvnitř dutiny, oddělení částí houby z bloku kolagenové houby s průměrem dutiny větším než 0,75 mm a menším než 4 mm nebo se středním průměrem dutiny maximálně 3 mm.

Termínu průměr dutiny by v tomto kontextu mělo být porozuměno jako největší přímé vzdálenosti od stěny ke stěně dutiny, to jest největší diagonální přímé vzdálenosti v dutině. Dutiny mohou mít polygonální tvar, jako je oktogonální tvar.

Bylo zjištěno, že průměr dutiny větší než 0,75 mm a menší než 4 mm nebo střední průměr dutiny maximálně 3 mm, dává kolagenovou houbu zvláště vhodnou k pokrytí přípravkem fibrinového lepidla. Kolagenový gel má s výhodou hmotnost sušiny v rozmezí 2 až 20 mg sušiny na 1 g gelu, jako je 4 až 18 mg, jako je 5 až 13 mg, jako je 6 až 11 mg na 1 g gelu. Dynamická viskozita kolagenového gelu je s výhodou 2 až 20 N.cm, jako je 6 až 8 N.cm. Kolagenová houba má s výhodou takový obsah vody, který není větší než 20 %, jako je 10 až 15 %, jako je 18 %. Modul pružnosti kolagenové houby je s výhodou v rozmezí 0,05 až 1 MPa, jako je 0,1 až 0,5 MPa a hustota houby je s výhodou 1 až 10 mg/cm³, jako je 2 až 7 mg/cm³.

Bylo zjištěno, že kolagenová houba připravená způsobem podle tohoto vynálezu je vzduchotěsná a kapalinotěsná v tom smyslu, že když se kolagenová houba aplikuje na poranění, tak nedovolí vzduchu nebo kapalině projít kolagenovou houbou. Kapaliny se absorbují do houby. Tohoto efektu se primárně dosáhne v důsledku té skutečnosti, že krok vmíchání vzduchu do kolagenového gelu poskytne kolagenovou houbu, která má trojrozměrnou strukturu s uspořádanými oddělenými dutinami a v podstatě zcela uzavřenými stěnami kolagenového materiálu, a to v protikladu ke známým kolagenovým houbám, které mají vláknitou strukturu.

-6CZ 305120 B6

Kolagenový gel může obsahovat materiál různých typů, jako je kolagen typu I, II nebo III ze savčích, transgenních nebo rekombinantních zdrojů, ale lze použít i všechny další typy kolagenu. Kolagen může obsahovat materiál ze šlach vybraných ze skupiny sestávající z koňských šlach a hovězích šlach. Kolagenový gel může dále nebo alternativně obsahovat rekombinantní kolagenový materiál.

Obsah kolagenu oddělených částí houby je ve vztahu k sušině houby s výhodou 50 až 100%, jako 75 až 100 %, jako 80 až 100 %, jako 85 až 100 %, jako 90 až 100 %, jako 92 až 100 %, jako 92 až 98 %, jako 93 až 97 %, jako 94 až 96 %.

Krok přípravy kolagenového gelu s výhodou obsahuje kroky skladování šlach při teplotě -10 až -30 °C a sloupnutí šlach, odstranění cizího proteinu ze šlach, snížení obsahu choroboplodných zárodků ve šlachách, nabobtnání šlach, homogenizaci nabobtnaných šlach.

Kroky skladování, sloupnutí, odstranění proteinu, snížení obsahu choroboplodných zárodků a bobtnání mají za cíl přečistit surový materiál, zatímco krok homogenizace má za cíl získání kolagenu ve formě gelu.

Krok snížení obsahu choroboplodných zárodků s výhodou obsahuje přidání kyseliny ke šlachám, a to kyseliny jako je organická kyselina, jako je mléčná kyselina. Ke šlachám se navíc s výhodou přidá organické rozpouštědlo, jako je alkohol, jako je ethanol. Krok nabobtnání šlach dále s výhodou obsahuje přidání mléčné kyseliny ke šlachám. Použitá mléčná kyselina může být 0,40 až 0,50% mléčná kyselina, jako je 0,45% mléčná kyselina.

Krok bobtnání šlach může obsahovat udržování šlach při teplotě 4 až 25 °C, jako při teplotě 10 až 20 °C po dobu 48 až 200 hodin, jako po dobu 100 až 200 hodin.

Krok homogenizace nabobtnaných šlach se s výhodou provede tak, aby se získala velikost částice fragmentů kolagenového gelu, to jest kuliček vláken, o průměru 0,8 až 1,2 cm, jako je 1 cm. Fyzikální vlastnosti kolagenového gelu jsou navíc s výhodou takové, jak je uvedeno výše. Vhodných vlastností může být například dosaženo provedením kroku homogenizace nabobtnaných šlach prostřednictvím ozubeného kotoučového mlýnku nebo odpovídajícího homogenizačního zařízení.

Krok vmíchání vzduchu do kolagenového gelu s výhodou obsahuje kroky vmíchání okolního vzduchu do gelu prostřednictvím mixéru tak, aby vznikla kolagenová pěna, vedení namíchané gelové pěny do frakcionačního kanálku, oddělení kolagenového gelu a kolagenové pěny ve frakcionačním kanálku.

Alespoň část kolagenového gelu oddělené od kolagenové pěny ve frakcionačním kanálku se může vést zpět do mixéru. V tomto případě poměr mezi množstvím kolagenového gelu, který se vede zpět do mixéru z frakcionačního kanálku a množstvím čerstvého kolagenového gelu vedeného do mixéru, je s výhodou 0,1 až 0,5. Krok oddělení kolagenového gelu a kolagenové pěny s výhodou zahrnuje kroky oddělení vybrané části kolagenové pěny obsažené ve frakcionačním kanálku, vedení vybrané části kolagenové pěny ven z frakcionačního kanálku k jejímu vysušení.

Ve zvýhodněném provedení tohoto způsobu se udržuje ve frakcionačním kanálku teplota 15 až 40 °C, jako je 20 až 25 °C.

Po vmíchání vzduchu do kolagenového gelu se kolagenová pěna může homogenizovat po dobu 2 až 4 minut.

Před krokem sušení kolagenové pěny a po kroku vmíchání vzduchu do kolagenového gelu se ke kolagenové pěně může přidat neutralizační činidlo, přičemž kolagenová pěna se s výhodou neu-7 CZ 305120 B6 tralizuje proto, aby se z hodnoty pH obvykle 2,5 až 3,5 dosáhlo hodnoty pH kolagenové pěny 6,5 až 8,5. Lze použít neutralizační činidlo obsahující roztok amoniaku, přičemž kolagenová pěna se s výhodou neutralizuje po dobu 5 až 30 hodin, jako 10 až 20 hodin, jako 24 hodin.

Před krokem sušení kolagenové pěny se kolagenová pěna s výhodou naplní do sušicího kontejneru, a to takovým způsobem, že během plnění se do pěny nedostane v podstatě žádný vzduch.

Krok sušení s výhodou obsahuje sušení při teplotě 15 až 60 °C, jako při 20 až 40 °C, po dobu 50 až 200 hodin, jako 100 až 150 hodin tak, aby se získala vysušená kolagenová houba. Sušení lze provést při lehce sníženém atmosférickém tlaku, jako při tlaku 70 až 90 kPa (700 až 900 mbar), jako 80 kPa (800 mbar).

Kolagenová houba vyrobená způsobem podle tohoto vynálezu s výhodou splňuje alespoň jedno z následujících kritérií:

hodnota pH 5,0 až 6,0, obsah mléčné kyseliny maximálně 5 %, obsah amoniaku maximálně 0,5 %, obsah rozpustného proteinu vypočteného jako obsah albuminu maximálně 0,5 %, obsah síranového popele maximálně 1,0 %, obsah těžkých kovů maximálně 20 ppm, mikrobiologická čistota s maximálně 10³ CFU/g, obsah kolagenu 75 až 100 %, hustota 1 až 10 mg/cm³, jako 2 až 7 mg/cm³, modul pružnosti 0,05 až 1 MPa, jako 0,1 až 0,5 MPa.

Krok oddělení částí kolagenové houby může obsahovat rozdělení kolagenové houby na množství částí pomocí rozřezání. Získané části lze tvarovat do jakékoliv žádoucí formy, jako je kónická, cylindrická, v to zahrnujíc cylindrickou s prstencovým průřezem, obdélníková, polygonální, krychlová a ploché proužky nebo může být vhodnou granulační metodou převedena na granulát atd.

Druhý předmět předloženého vynálezu se týká způsobu přípravy kolagenové houby, který obsahuje kroky přípravy kolagenového gelu, vmíchání vzduchu do kolagenového gelu tak, aby se získala kolagenová pěna, vysušení kolagenové pěny tak, aby se získal vysušený blok kolagenové houby s dutinami, z bloku kolagenové houby oddělení částí houby, které mají následující vlastnosti: modul pružnosti v rozmezí 0,05 až 0,1 MPa, hustotu v rozmezí 1 až 10 mg/cm³, průměr dutiny větší než 0,75 mm a menší než 4 mm nebo střední průměr dutiny maximálně 3 mm.

Předpokládá se, že kterýkoliv z kroků a též všechny kroky způsobu týkajícího se prvého předmětu tohoto vynálezu lze také provést způsobem týkajícím se druhého předmětu tohoto vynálezu. Navíc kteroukoliv a všechny vlastnosti a rysy kolagenové houby vyrobené způsobem podle prvého předmětu vynálezu lze také získat způsobem podle druhého předmětu tohoto vynálezu.

Třetí předmět předloženého vynálezu se týká zařízení pro oddělení části kolagenové pěny a přeměny jiné části kolagenové pěny na kolagenový gel, které obsahuje frakcionační kanálek se vstupem pro vtok kolagenové pěny, výstup pro část toku kolagenové pěny a spodní část, která je nakloněná dolů ve směru toku kolagenové pěny, alespoň jeden výtok pro kolagenový gel na spodní části frakcionačního kanálku, kde poloha výtoku je pohyblivá ve vertikálním směru na konci frakcionačního kanálku.

Čtvrtý předmět předloženého vynálezu se týká podlouhlé kolagenové houby mající veskrz jdoucí otvor nebo vývrt a pružnou stěnu. Ve zvýhodněném provedení může být takováto kolagenová houba použita k uzavírání poranění nebo obnově stěn gastrointestinálního traktu a průdušnice u savců. Kolagenová houba tak může mít kruhový nebo eliptický průřez. Kolagenová houba se může aplikovat jako výplň v gastrointestinálním traktu nebo jako vnější rukáv použitý na vnější povrch gastrointestinálního traktu.

Vnitřní průměr veskrz jdoucího otvoru nebo vývrtu pro použití v různých částech gastrointestinálního traktu nebo průdušnice u lidí může být například následující:

-8CZ 305120 B6 střeva 0,5 až 6 cm, konečník 1 až 4 cm, tlusté střevo 2 až 6 cm, tenké střevo 0,5 až 3 cm, jícen 0,5 až 2 cm, průdušnice, 1 až 4 cm.

Kolagenovou houbu lze například použít pro uzavírání poranění po chirurgickém odstranění výdutí na stěnách gastrointestinálního traktu, jako po rektální chirurgii, jako po chirurgickém odstranění hemoroidů. Příklady indikací pro možné použití kolagenové houby podle tohoto vynálezujsou:

překrytí poranění, podpora při zástavě krvácení jako slabého, difuzního krvácení z parenchymových orgánů, chirurgické zákroky na operačních místech, kde se před aplikací kolagenové houby provedl elektrochirurgický zákrok nebo podvázání, prevence obnovení krvácení (zabezpečení stehů), aplikace na popáleniny, bandáž na místní poranění, podání léčiva jako je podání antibiotik.

Objasnění výkresů

Obrázky 1 a 2 obsahují vývojový diagram ilustrující kroky obsažené ve zvýhodněném provedení způsobu tohoto vynálezu, obrázek 3 je fotografií povrchu kolagenové houby vyrobené způsobem podle tohoto vynálezu (laskavě poskytl Prof. Dr. Roman Carbon, Chirurgická univerzitní klinika (Chirurgische Univ. Klinik), Erlangen, Německo) a obrázek 4 popisuje míchací zařízení pro získání a měření viskozity kolagenového gelu.

Ve zvýhodněném provedení vynález zahrnuje následující kroky, které jsou ilustrovány na obrázcích 1 a 2:

Krok 1 Dodání hlubokozmrazených koňských šlach

Koňské šlachy se dodávají a skladují při -18 až -25 °C.

Krok 2 Sloupnutí koňských šlach

V napůl zmrzlém stavu se ze šlach sloupne tenká povrchová vrstva, a to manuálně nebo mechanickým odstraněním nožem. Šlachy se poté opět hluboko zamrazí na -18 až -25 °C.

Krok 3 Mechanické krájení sloupnutých koňských šlach

Sloupnuté, zmrazené šlachy se případně 30 minut dezinfikují v 70% ethanolu a do výrobních místností přecházejí v ethanolu. Poté se šlachy promyjí a po promytí se zhutní do bloků a hluboko zamrazí na -18 až -25 °C. Zmrazené bloky šlach se poté nakrájí řezacím strojem s rotujícím krájecím nožem na plátky o tloušťce asi 1 mm.

Krok 4 Promytí a dezinfekce plátků šlach

Pro odstranění rozpustných proteinů se plátky šlach nejprve namočí do vody pro injekce na 3 až 6 hodin, poté se promyjí vodou pro injekci nebo demineralizovanou vodou nebo solnými roztoky obsahujícími Ca²⁺ a/nebo Mg²⁺ ionty o koncentraci v rozmezí 1 až 10 mM, dokud není supematant prostý hemoglobinu. Plátky šlach se poté 15 minut dezinfikují v 70% ethanolu a dvakrát promyjí v 0,45% mléčné kyselině v pitné vodě (sterilní, filtrované a zbavené pyrogenů), aby se odstranil ethanol.

-9CZ 305120 B6

Krok 5 Výroba kolagenového gelu

Promyté plátky šlach se namočí do 0,45% mléčné kyseliny na 2 až 5 dnů, s výhodou na 4 dny a poté se zhomogenizují na kolagenový gel. Vystavení 0,45% mléčné kyselině je považováno za jeden z hlavních kroků virové inaktivace.

Krok 6 Napěnění

Do kolagenového gelu se pomocí rozpouštěcích míchadel nažene vzduch. Vznikající pěna se frakcionuje a frakce s velikostí bublinek 1 až 3 mm se odebere. Pěna se z ocelové nádoby vlije do sudu, kterým se pomalu rotuje po asi 3 minuty, aby se získala homogenní pěna. Tato pěna se naplní do sušicích kontejnerů. Základ kontejneru tvoří textilní tkanina, která je natolik prostupná pro tekutiny, že umožní odvodnění pěny. Po 5 až 24 hodinách, s výhodou 18 až 24 hodinách, se vysušená pěna vystaví plynnému amoniaku, generovanému například z 26% roztoku amoniaku čistoty DAB. Během tohoto procesu nadbytek amoniaku změní pH pěny do alkalické oblasti. Amoniak se odstraní během následného sušicího procesu, kdy vznikne výrobek s neutrálním pH. Krok 7 Sušení pěny

Pěna se suší v teplém vzduchu v sušicí komoře z vysoce jakostní oceli po dobu 48 až 150 hodin, s výhodou 120 až 150 hodin. Výsledkem je kolagenová houba tvarovaná do bloků.

Krok 8 Krájení kolagenových bloků

Bloky, také odkazované jako pruhy, kolagenu lze například použít jako nosiče určené k pokrytí. Krájení se provede pomocí vertikálního krájecího stroje. Nejprve se odříznou stany bloku, aby se získal blok s vertikálními stranami o délce strany 50 cm. Tento blok se poté vertikálně nařeže na 4 pruhy o šířce 11 cm. Tyto pruhy se opět seříznou na jejich horní a spodní straně a poté nakrájejí do proužků o rozměrech 50 cm x 11 cm x 0,4 až 0,7 cm. Hmotnost proužků kolagenové houby je s výhodou taková, aby vyhověla kterékoliv specifikaci kolagenu ve finálním výrobku, které se má dosáhnout, a to jako u výrobků TachoComb® H, TachoComb® a Tachotop®.

Krok 9 Třídění proužků kolagenové houby

Proužky kolagenové houby se poté podrobí vizuální kontrole. Proužky s jedním nebo více následujícími nedostatky se odstraní:

proužky mají střední průměr dutiny menší než 1 mm nebo větší než 3 mm, proužky mají nehomogenní strukturu dutin, proužky mají díry (jednotlivé dutiny s hloubkou větší než je tloušťka houby).

Vytříděné proužky se skladují maximálně 1 rok v dezinfikovaných kontejnerech z lehkého kovu při teplotě 15 až 25 °C.

Obrázek 3 je fotografií povrchu kolagenové houby vyrobené způsobem podle tohoto vynálezu, přičemž tato fotografie byla udělána při zvětšení asi 20 000 (laskavě poskytl Prof. Dr. Roman Carbon, Chirurgická univerzitní klinika (Chirurgische Univ. Klinik), Erlangen, Německo). Povrch ukázaný na fotografii obrázku 3 je povrchem příčného řezu v kolagenové houbě připravené způsobem podle předloženého vynálezu. Tmavé plochy na fotografii představují dutiny, zatímco světlé plochy na fotografii představují kolagenový materiál, v to zahrnujíc stěny kolagenového materiálu oddělujícího dutiny.

- 10CZ 305120 B6

Obrázek 4 ukazuje míchací zařízení pro získání měřítka viskozity kapaliny, které obsahuje nádobu upravenou tak, aby pojmula kapalinu a prostředky pro míchání uvedené kapaliny. Míchací prostředky obsahují tyčinku připojenou k prvku ve tvaru vidličky. Kapalina v nádobě se míchá točením tyčinky, což má za výsledek rotační pohyb prvku ve tvaru vidličky. Prvek ve tvaru vidličky obsahuje primární část 41, ke které je připojena tyčinka a prvou a druhou sekundární část 42. Sekundární části jsou připojeny ke koncům primární části. Jak prvek ve tvaru vidličky rotuje, jeho povrchy pohybují kapalinou, a tak kapalinu míchají.

V jednom provedení má zařízení následující rozměry. Nádoba je 110 mm vysoká a 146 mm široká. Tyčinka je 220 mm dlouhá a má průměr 10 mm. Primární část 44 vidličky je 90 mm dlouhá a 30 mm vysoká. Sekundární části 42 jsou 90 mm vysoké a 30 mm široké. Vzdálenost od vnějšího okraje sekundárních částí 42 k vnitřnímu povrchu nádoby je 28 mm.

Příklady uskutečnění vynálezu

Příklad 1

Níže uvedená tabulka 1 shrnuje hodnoty parametrů tří různých cyklů způsobu podle tohoto vynálezu.

Tabulka I Parametry tří cyklů způsobu tohoto vynálezu

	Cyklus 1	Cyklus 2	Cyklus 3
Sloupnutí šlach: odpad (%)	24	40	38
Biozátěž před sloupnutím (CFU/g šlach)	7x104	2,4x105	5x105
Biozátěž po sloupnutí (CFU/g šlach)	-	2x103	5xlO3
Hmotnost šlach na dávku (kg)	12,00	10,5	10,5
Promytí sloupnutých šlach deminerahzovanou vodou (min)	30	30	30
Odstranění rozpustného proteinu: promytí nakrájených šlach deminerahzovanou vodou až je omývací roztok prostý hemoglobinu (hod)	5	5	1,5
Dezinfekce 70% ethanolem (min)	15	15	15
Promytí v 0,45% mléčné kyselině (min)	21	21	21
Bobtnání v 0,45% mléčné kyselině (h)	144	120	120
Homogenizace	Ozubený mlýn Condux	Ozubený mlýn Condux	Ozubený mlýn Condux

- 11 CZ 305120 B6

Viskozita gelu (z kroutivé síly) (N.cm)	6,9 až 7,8	6,9 až 7,8	7,1 až 9,5
Hmotnost sušiny kolagenového gelu (mg/g)	6,3 až 8,3	8,9 až 9,4	7,8 až 9,4
Doba pěnění na blok (min)	37 až 47	51 až 58	54 až 62
Biozátěž (CFU/ml mokré pěny)	-	2	1
Odvodňovací perioda (h)	18,5	22	18
Doba neutralizace (h)	24	24	24,5
Sušící perioda (h)	147	148,5	144,5
Hmotnost najeden blok (g)	200 až 256	195 až 228	177 až 257
Biozátěž proužků kolagenové houby (CFU/g)	14 až 1000	< 18 až 124	<11 až 33
Výtěžek proužků kolagenové houby Délka 110 mm Šířka 500 mm Výška 4 až 7 mm Hmotnost 770 až 1500 mg/proužek	405	379	433

Níže uvedená tabulka II uvádí hodnoty parametrů pěti různých kolagenových hub získaných způ 5 sobem podle tohoto vynálezu.

Tabulka II Hodnoty parametrů pěti typů kolagenových hub

	Houba I	Houba II	Houba III
Hodnota pH (konkrétně 4 až 6)	5,4	5,1	5,4
Obsah mléčné kyseliny (%)	2,6	2,8	2
Obsah amoniaku (%)	0,2	0,2	0,1
Obsah rozpustného proteinu (%)	0,1	0,05	0,08
Obsah síranového popele (%)	0,4	0,3	0,3
Mikrobiologická čistota (CFU/g)	14 až 1000	<18 až 124	<11 až 33
Obsah kolagenu vztažený k sušině (%)	95	95	98
Obsah vody (%)	14	15	16
Modul pružnosti (kPa)	100 až 450	150 až 500	123 až 410
Velikost dutiny (průměr, střední	2,3	2,1	2,9

- 12CZ 305120 B6

hodnota) (mm)
Hustota (mg/cnT)	2,5 až 6,1	2,9 až 5,9	2,4 až 5,0

	Houba IV	Houba V
Hodnota pH	5,3	5,7
Obsah mléčné kyseliny (%)	2,3	1,1
Obsah amoniaku (%)	0,1	0,1
Obsah rozpustného proteinu (%)	0,04	0,11
Obsah síranového popele (%)	0,3	0,2
Obsah těžkých kovů (ppm)	<20	<20
Mikrobiologická čistota (CFU/g)	12 až 345	<15 až 48
Obsah kolagenu vztažený k sušině (%)	95	96
Obsah vody (%)	14	12
Modul pružnosti (kPa)	104 až 421	200 až 470
Velikost dutiny (průměr, střední hodnota) (mm)	2,9	2,5
Hustota (mg/cm3)	2,9 až 5,3	2 až 6,8

Příklad 2

Tento příklad se týká nepřímého měření viskozity kolagenového gelu měřením kroutivé síly.

K měření kroutivé síly bylo použito následující vybavení:

ío Míchačka EUROSTAR POWER control-visc Programové vybavení Windows IKASOFT dc Indikátor kroutivé síly VISCOKLICK VK 1 Sběrač dat DC2

Speciální konstrukce míchadla (vidličky) s definovanými rozměry, viz obrázek 4

Nálevka s vnitřním průměrem 14,6 cm a výškou 20,5 cm Teploměr Váhy

Nálevka se naplnila množstvím 1500 g kolagenového gelu. Teplota vzorku byla 23 °C. Do středu nálevky se upevnilo vidličkové míchadlo. Poté se začalo s měřením. Indikátor kroutivé síly se převedl na odpor míchadla v jednotkách N.cm, které reprezentují dynamickou viskozitu gelu.

K ověření měření kroutivé síly se připravil standardní roztok 59% polyethylenglykolu. Viskozita tohoto roztoku se změřila pomocí Haakeho viskozimetru RV 20 Rotovisko. Dynamická viskozita

- 13 CZ 305120 B6 η tohoto roztoku byla v rozmezí η = 925 ± 25 mPa.s při 23 °C. Tato viskozita byla naměřena výše uvedeným měřícím vybavením pro gely a takto změřená hodnota kroutivé síly by měla být v rozmezí 3,66 N.cm ± 5 % při 23 °C.

Odkazy

1. Baer E., Gathercole L. J. a Keller A.: Strukturní hierarchie šlachového kolagenu: předběžný souhrn (Structure hierarchies in tendon collagen: an interim summary), dokumenty Colstonské konference 1974, 189, Hiltner A., Cassidy J. J. a Baer E.: Mechanické vlastnosti biologických polymerů (Mechanical properties of biological polymers), Ann. Rev. Mater. Sci. 15, 455 (1985).

PATENTOVÉ NÁROKY

Claims (30)

1. Způsob přípravy kolagenové houby, vyznačující se tím, že zahrnuje následující stupně:

- přípravu kolagenového gelu;

- vmíchání vzduchu do kolagenového gelu pro získání kolagenové pěny;

- vysušení kolagenové pěny pro získání suchého bloku kolagenové houby s trojrozměrnou strukturou s uspořádanými komůrkami, které jsou oddělené a v podstatě zcela obklopené stěnami kolagenového materiálu; a

- oddělení částí houby s průměrem komůrek větším než 0,75 mm a menším než 4 mm nebo středním průměrem nejvýše 3 mm z bloku kolagenové houby.

2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že obsah kolagenu v oddělených částech houby je 50 až 100 %.

3. Způsob podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že kolagenový gel obsahuje kolagenový materiál různých typů z alespoň jednoho zdroje zvoleného ze savčího, transgenního nebo rekombinantního zdroje.

4. Způsob podle nároku 3, vyznačující se tím, že kolagen zahrnuje materiál ze šlach vybraných ze skupiny sestávající z koňských šlach a hovězích šlach.

5. Způsob podle nároku 3 nebo 4, vyznačující se tím, že stupeň přípravy kolagenového gelu zahrnuje následující stupně:

- uložení šlach při teplotě -10 až -30 °C ajejich sloupnutí;

- odstranění cizího proteinu ze šlach;

- snížení obsahu choroboplodných zárodků ve šlachách;

- nabobtnání šlach; a

- homogenizaci nabobtnaných šlach.

6. Způsob podle nároku 5, vyznačující se tím, že stupeň snížení obsahu choroboplodných zárodků zahrnuje přidání kyseliny a organického rozpouštědla ke šlachám.

- 14CZ 305120 B6

7. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že kyselinou je organická kyselina, jako kyselina mléčná.

8. Způsob podle nároku 6 nebo 7, vyznačující se tím, že organickým rozpouštědlem je alkohol, jako ethanol.

9. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 5 až 8, vyznačující se tím, že stupeň nabobtnání šlach zahrnuje přidání kyseliny mléčné ke šlachám.

10. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 5 až 9, vyznačující se tím, že kyselina má hodnotu pH v rozmezí 1 až 4, přednostně 1,5 až 3,5 a zvláště přednostně 2,5 až 3,0.

11. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 5 až 10, vyznačující se tím, že kyselinou mléčnou je 0,45% kyselina mléčná.

12. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 5 až 10, vyznačující se tím, že stupeň bobtnání šlach zahrnuje uložení šlach při teplotě 4 až 25 °C po dobu 48 až 200 hodin.

13. Způsob podle nároku 12, vyznačující se tím, že se šlachy uloží na dobu 100 až 120 hodin.

14. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 5 až 13, vyznačující se tím, že ve stupni homogenizace nabobtnaných šlach se získává hmota obsahující částice šlach, kde tyto částice mají délku nebo průměr 0,8 až 1,2 cm.

15. Způsob podle kteréhokoliv z předchozích nároků, vyznačující se tím, že stupeň vmíchání vzduchu do kolagenového gelu zahrnuje následující stupně:

- vmíchání okolního vzduchu do gelu prostřednictvím za použití mixéru pro vznik kolagenové pěny;

- uvedení namíchané gelové pěny do frakcionačního kanálku; a

- oddělení kolagenového gelu a kolagenové pěny obsažené ve frakcionačním kanálku.

16. Způsob podle nároku 15, vyznačující se tím, že alespoň část kolagenového gelu odděleného od kolagenové pěny ve frakcionačním kanálku se odvádí zpět do mixéru.

17. Způsob podle nároku 16, vyznačující se tím, že poměr mezi množstvím kolagenového gelu, který se vede zpět do mixéru z frakcionačního kanálku a množstvím čerstvého kolagenového gelu vedeného do mixéru je v rozmezí od 0,1 do 0,5.

18. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 15 až 17, vyznačující se tím, že stupeň oddělení kolagenového gelu a kolagenové pěny zahrnuje následující stupně:

- oddělení vybrané části kolagenové pěny obsažené ve frakcionačním kanálku; a

- odvedení této vybrané části kolagenové pěny ven z frakcionačního kanálku k jejímu vysušení.

19. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 15 až 18, vyznačující se tím, že ve frakcionačním kanálku se udržuje teplota 15 až 40 °C.

- 15CZ 305120 B6

20. Způsob podle kteréhokoliv z předchozích nároků, vyznačující se tím, že po vmíchání vzduchu do kolagenového gelu se kolagenová pěna dále homogenizuje po dobu 2 až 4 minut.

21. Způsob podle kteréhokoliv z předchozích nároků, vyznačující se tím, že před stupněm vysušením kolagenové pěny a po stupni vmíchání vzduchu do kolagenového gelu se do kolagenové pěny přidá neutralizační činidlo a kolagenová pěna se neutralizuje, aby se dosáhlo hodnoty pH kolagenové pěny v rozmezí 6,5 až 8,5.

22. Způsob podle nároku 21, vyznačující se tím, že se použije neutralizační činidlo obsahující roztok amoniaku.

23. Způsob podle nároku 21 nebo 22, vyznačující se tím, že se kolagenová pěna neutralizuje po dobu 5 až 30 hodin.

24. Způsob podle nároku 23, vyznačující se tím, že se kolagenová pěna neutralizuje po dobu 20 až 30 hodin.

25. Způsob podle kteréhokoliv z předchozích nároků, vyznačující se tím, že stupeň sušení zahrnuje sušení při teplotě 15 až 60 °C po dobu 48 až 200 hodin tak, že se získá vysušená kolagenová houba.

26. Způsob podle nároku 25, vyznačující se tím, že stupeň sušení se provádí při tlaku 70 až 90 kPa.

27. Způsob podle kteréhokoliv z předchozích nároků, vyznačující se tím, že stupeň sušení zahrnuje sušení při teplotě 15 až 40 °C po dobu 100 až 200 hodin.

28. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 25 až 27, vyznačující se tím, že stupeň sušení se provádí v takovém rozsahu, aby kolagenová houba měla obsah vody do 20 %.

29. Způsob podle kteréhokoliv z předchozích nároků, vyznačující se tím, že stupeň oddělení částí kolagenové houby zahrnuje rozdělení kolagenové houby do více částí krájením.

30. Způsob přípravy kolagenové houby podle kteréhokoliv z předchozích nároků, vyznačující se tím, že zahrnuje následující stupně:

- přípravu kolagenového gelu;

- vmíchání vzduchu do kolagenového gelu pro získání kolagenové pěny;

- vysušení kolagenové pěny pro získání suchého bloku kolagenové houby s trojrozměrnou strukturou s uspořádanými komůrkami, které jsou oddělené a v podstatě zcela obklopené stěnami kolagenového materiálu; a

- oddělení z bloku kolagenové houby částí houby s následujícími vlastnostmi:

- modul pružnosti v rozmezí 0,05 až 1 MPa, hustota v rozmezí 1 až 10 mg/cm³, a

- průměr komůrky větší než 0,75 mm a menší než 4 mm nebo střední průměr komůrky maximálně 3 mm.