CZ318998A3

CZ318998A3 - Hemostatická houba na bázi kolagenu, způsob její přípravy, kryt na ránu a kit k přípravě tohoto krytu

Info

Publication number: CZ318998A3
Application number: CZ983189A
Authority: CZ
Inventors: Wolfgang Biering; Hamza Mansour; Günther Schlag; Thomas Seelich; Edgar Scheel; Georg Habison
Original assignee: Baxter Aktiengesellschaft
Priority date: 1996-04-04
Filing date: 1997-04-02
Publication date: 1999-09-15
Also published as: NO984619D0; HUP9903586A3; EP0891193A1; RU2193897C2; CA2251475A1; JP5373553B2; DE69724243D1; JP2010046516A; DE69724243T2; NO314070B1; HUP9903586A2; ATE247494T1; US6649162B1; NO984619L; AU726163B2; SK137398A3; AU2635997A; EP0891193B1; CA2251475C; JP2000510357A

Description

(57) Anotace:

Vynález se týká hemostatické houby na bázi , kolagenu a aktivátoru nebo proaktivátoru hemokoagulace, rovnoměrně rozptýlených v celé houbě, která se vysuší, takž obsahuje 2 % vody, výhodně v rozmezí od 2 % do 25 %, zejména od 10 do 20%, a postup přípravy této

CO houby, a rovněž tak kryt na ránu a kit k přípravě tohoto krytu. Způsob výroby houby zahrnuje deidifikaci surového kolagenového materiálu s cílem získat kolagenový gel, smíchání gelu s aktivátorem nebo proaktivátorem he, mokolagenu za vzniku homogenní směsi a následné usušení, lyofllizací nebo vzduchem.

3189-98

Hemostatická houba na bázi kolagenu, způsob její přípravy,

Oblast techniky

Vynález .se týká hemostatické houby na bázi kolagenu a trombinu a způsob její přípravy, a rovněž se vynález týká krytu neboli povlaku na rány.provedeného aplikací této houby, a kitu neboli soupravy k přípravě tohoto povlaku na rány.

Dosavadní stav techniky

Biologická lepidla, založená na principu koagulačních faktorů lidského nebo živočišného původu, jsou známa z dosavadního stavu techniky již dlouhou dobu. V patentech Spojených států amerických č. 4 362 567, 4 298 598 a 4 377 572 byla popsána metoda výroby tkáňových adheziv na bázi fibrinogenu a faktoru XIII. Tkáňová adheziva se obvykle používají spolu se samostatnou složkou, obsahující trombin, který enzymaticky působí na fibrinogen za vzniku trombinu, a na faktor XIII za vzniku aktivního faktoru XIIla, který se zesítěním spojuje s fibrinem za vzniku stabilní fibrinové sraženiny.

Při použití na rozsáhlých krvácejících plochách se tkáňová adheziva obvykle aplikují na kolagenovou roušku, která se poté přiloží na ránu.

V patentu Spojených států amerických č. 4 600 574 je popsáno tkáňové adhezivum na bázi kolagenu v kombinaci s fibrinogenem a faktorem XIII. Tento materiál se dodává • * · • · « · · ♦ » ·

Μ ···· ··· • · · · · * · «« · · β · · ·· ** v lyofilizované formě a je připraven k okamžitému použití. Fibrinogen a faktor XIII se spojují s kolagenem napuštěním plochého materiálu ^obsahujícího kolagen roztokem fibrinogenu a faktoru XIII, načež se provede lyofilizace uvedeného materiálu.

Tkáň zacelující kolagenový chirurgický obvaz podle evropského patentu EP 0 049 469 se připravuje podobným způsobem spojením kolagenu a fibrinogenu a případně antibiotika pomocí lyofilizace.

Z přírodního hovězího kolagenu se- průmyslově vyrábějí hemostatické houby, například Colgen^ (firmy IMMUNO AG), jako povlak na krvácející rány. Tyto produkty působí na intrinsické a extrinsické dráhy hemostázy bez vzniku lepidla, to znamená, že působí dosti pomalu. Jejich tuhá struktura jim však udílí mechanickou pevnost.

Jestliže se kolagen kombinuje s fibrinogenem a trombinem způsobem, popsaným v evropském patentu č.

EP 0 059 265, je třeba materiál připravovat pečlivě, aby se zcela zamezilo přítomnosti vody. V přítomnost byť jen minimálního množství vody dochází k přeměně fibrinogenu na fibrin a materiál je již k zacelování tkáně nevhodný. Proto se tento materiál obvykle dodává v lyofilizované podobě, hermeticky zabalen, spolu s desikantem (čili látkou absorbující atmosférickou vlhkost).

' V případě, že se v hemostatické houbě nepoužije fibrinogen, lze zajistit absorbci trombinu nebo jeho prekurzoru do porézní struktury biologicky absorbovatelného kolagenu podle metodou podle zveřejněné mezinárodní patentové přihlášky VO 90/13320. Celkový obsah vody v tomto * » τ -- • · ·!»»»·· β « fc « t ' «·»· ·

9 · · · 9 · materiálu je nižší než 50 % hmotnostních/celkovou hmotnost. Tento materiál se připravuje injikováním vodného roztoku trombinu nebo jeho prekurzoru, spolu s látkami stabilizujícími trombin, do pevného materiálu na několika místech. Nej vhodnějšími látkami stabilizujícími trombin jsou aminokyseliny, PEG nebo polysacharidy. Výsledkem aplikace roztoku trombinu do kolagenového houby je poměrně vysoký obsah vody. I když lze houbu sušit při zvýšených teplotách, vzhledem k nebezpečí denaturalizace trombinu a kolagenu se dosahuje pouze mírného stupně vysušení.

V důsledku injekční' aplikace trombinu je jeho distribuce v houbě vysoce nerovnoměrná, což snižuje reprodukovatelnost a spolehlivost krytí rány.

Homogenní směs disperzního nebo rozpustného kolagenu s trombinem se připravuje podle patentu Spojených států amerických č. 4 515 637. Získaný roztok se následně lyofilizuje a zbavuje volné vlhkosti, přičemž výsledkem je produkt, který je stabilní při skladování. I když suché kolagenové houby vykazují vysokou mechanickou pevnost, ukázaly se být poměrně málo pružné, což. znamená, že by se mohly při chirurgickém použití zlomit. Jako základní předpoklad pro vyřešení problémů se stabilitou trombinu se však ukázalo jako podstatné vysušení produktu do stavu, kdy nebude obsahovat vůbec žádnou vlhkost.

Případné použití hemostatické kolagenové pastovité kompozice, obsahující vodný roztok trombinu, je popsáno v evropském patentu EP 0 372 966. Tato pasta se dodává v tubě nebo ve stříkačce. Tato pasta se však obtížně používá k zastavení krvácení na rozsáhlé krvácející ploše.

Φ · » τ - • * φ φ φ φ » φφ • · · φ φ ♦ ♦ φφφφ φ • φ φφφ · · φ • «φφ φφφφ φφφ φφ ·« φφ

Při aplikací materiálu lidského nebo živočišného původu pacientovi vzniká riziko přenosu patogenních látek ze zdrojového materiálu. Trombin se obvykle vyrábí z lidské nebo živočišné krevní plazmy, takže vzniká nebezpečí přenosu krvi přenášených virů, jako je viru AIDS, viru hepatitidy a parvoviru. Proto se provádějí opatření k deaktivaci virů, které by mohly být případně přítomny ve frakcích plazmy, jako jsou právě přípravky na bázi trombinu. V evropském patentu EP 0 541 507 se popisuje metoda výroby bezvirového trombinového přípravku z frakcí lidské krevní plazmy.

Kromě předběžného'ošetření'kolagenovéhozdroj ového materiálu vysokými koncentracemi zásaditých látek se kolagen obvykle ošetřuje beta nebo gama zářením. Tyto prostředky představují běžná opatření k deaktivaci všech virů nebo prionů, které by snad potenciálně mohly být přítomny ve zdrojovém materiálu.

D

Běžně na trhu dostupný produkt, TachoComb , který se vyrábí metodou podle evropského patentu EP 0 059 265, je po zabalení připravené roušky ošetřen gama zářením. Ukázalo se, že ošetření zářením zničí nativitu fibrinogenu. Denaturovaný fibrinogen se potom obtížně sráží. Proto je tento materiál méně účinný, než in šitu připravená kombinace kolagenu a tkáňového adheziva na bázi fibrinogenu, jejíž složky se dodávají ve formě kitu, který se snadno samostatně ošetří tak, aby došlo k deaktivaci virů.

Podstata vynálezu

Předmětem předkládaného vynálezu je výroba kompjresivní houby, připravené k okamžitému použití a obsahující resorbčni kolagenový materiál, která netrpí výše popsanými » * · · * « t >» • · · » ϋ · · ··· · · • · ♦ · ♦ · · nevýhodami, zvláště pokud se týče pružnosti a mechanické stability materiálu.

Tento vynález se tedy týká hemostatické houby na bázi kolagenu a aktivátoru nebo proaktivátoru srážení krve, který je v houbě rovnoměrně rozptýlen. Tato houba se dodává v suché formě (vysušená vzduchem nebo lyofilizací). Přesto ovšem obsahuje jisté množství, minimálně 2 %, vody, výhodně v rozmezí od 2 % do 25 %. Zejména je výhodný je obsah vody v rozmezí od 10 % do 20 %, přičemž tento podíl zajišťuje stabilitu při skladování při zvýšených teplotách.

Podle předmětného vynálezu bylo zcela překvapivě zjištěno, že jistý obsah vody činí houbu pružnou, přičemž si zachovává svoji fyzikálně-chemickou strukturu a mechanickou pevnost.

Podle předmětného vynálezu je rovněž důležité, aby byl trombin nebo prekurzor trombinu v materiálu rovnoměrně rozložen, aby se tak zabránilo lokální nestabilitě nebo hyperkoagulabilítě materiálu. Přes obsah vody je účinnost trombinu překvapivě stabilní, snad díky těsnému kontaktu trombinu a kolagenu v homogenní směsi.

Nicméně je možno podle předmětného vynálezu použít stabilizátory trombinu, jimiž jsou ve výhodném provedení látky ze skupiny polyolů, polysacharidů, polyalkylenglykolů, aminokyselin nebo jejich směsí. Jako příklad těchto látek je možno uvést následující látky, jejich použití je výhodné : sorbitol, glycerol, polyetylenglykol, polypropylenglykol, mono- nebo disucharidy, jako jsou glukóza nebo sacharóza, nebo libovolný cukr nebo sulfonovaná aminokyselina, schopná stabilizovat trombínovou. aktivitu.

« V « v w • · *»·*··* « 4 « » » · · ·♦·4 · * · * Φ fc ·«» ····«»«· »·· · 94 44

Tato houba se dodává jako pevný produkt, stabilní při skladování, kterou lze použít i po skladování v délce 6 měsíců, ve výhodném provedení po 2 nebo více letech při pokojové teplotě.

Termínem trombin nebo prekurzor trombinu se míní jako protein, který má při kontaktu s krví trombinovou aktivitu nebo který při aplikaci pacientovi indukuje trombinovou aktivitu. Jeho aktivita se vyjadřuje jako trombinová aktivita (NIH-jednotka) nebo aktivita ekvivalentní trombinu s odpovídající hodnotou jednotky-NIH . V následujícím textu, zahrnuje termín trombinová aktivita oba významy, tedy trombinovou aktivitu nebo jakoukoli ekvivalentní aktivitu. Protein s trombinovou aktivitou lze vybrat ze skupiny látek zahrnující alfa-trombin, meizo-trombin, deriváty trombinu nebo rekombinantní trombin. Vhodný prekurzor lze vybrat ze skupin látek zahrnující : protrombin, faktor Xa případně spolu s fosfolipidy, faktor IXa, aktivovaný protrombinový komplex, FEIBA, jakýkoliv aktivátor nebo proaktivátor intrinsické nebo extrinsické koagulace, nebo jejich směsi.

Podle vynálezu by bylo možno hemostatickou houbu používat spolu s dalšími fyziologickými látkami. Houba například za ideálních podmínek obsahuje další farmakologicky účinné látky, mezi jinými antifibrinolytika, jako je inhibitor aktivátoru plasminogenu, inhibitor plasmínu nebo deaktivátor fibrinolytik. Ideálně lze antifibrinolytikum vybrat ze skupiny látek tvořených aprotininem nebo derivátem aprotininu, alfa-2-makroglobulinem, inhibitorem nebo deaktivátorem proteinu C nebo aktivovaným proteinem C, substrátem napodobujícím vazbu na plasmin, který kompetuje

Ί

• « · · · φ · · * ··»· · • » · « » t

999 99 9 9 99 s přirozenými substráty, a protilátkou inhibující fibrinolytickou aktivitu.

Jako další farmakologicky účinnou látku lze spolu s houbou podle vynálezu použít antibiotikum, jako je antibakteriálni nebo antimykotická látka, ve výhodném provedení jako složku rovnoměrné rozptýlenou v houbě. Další vhodné kombinace jsou kombinace se specifickými enzymy nebo inhibitory enzymů, které mohou regulovat, tedy akcelerovat nebo inhibovat, resorpci houby. Mezi tyto látky patří kolagenáza, látky zesilující nebo inhibující její účinky. Dalšími látkami,'jichž lze použit spolu s houbou nebo které může být v houbě obsaženy, j sou i konzervační látky.

I když se výhodné provedení týká použití kolagenové houby, která obsahuje aktivátor nebo proaktivátor hemokoagulace jako jedinou aktivní složku, lze použít i dalších látek, které ovlivňují rychlost, hemokoagulace, hemostázu a kvalitu zacelení, jako je pevnost v tahu, vnitřní (adhezivní) pevnost a trvanlivost. V tomto směru lze použít prokoagulancií, která zesilují nebo zlepšují intrinsickou nebo extrinsickou koagulaci, jako jsou faktory nebo ko-faktory hemokoagulace, faktoru XIII, tkáňového faktoru, protrombinového komplexu, aktivovaného protrombinového komplexu, nebo částí komplexů, komplexu protrombinázy, fosfolipidů a iontů vápníku, V případě chirurgického výkonu, kdy je zapotřebí přesného zaceleni,, se může jevit jako výhodné prodloužení výkonu po aplikaci hemostatické houby pacientovi á před tím, než dojde ke koagulaci. Pokud bude houba podle vynálezu obsahovat i inhibitory hemokoagulace v odpovídajícím množství, zajistí se prodloužení koagulační reakce. Výhodně se pro tento účel používají inhibitory, jako je antitrombin III, případně to * · to to «to···.

• · β to · to· ···»· • » tototo · to to • •••to··· ··· ·· toto ·· spolu s heparinem, nebo jakýmkoli jiným inhibitorem serinové proteázy.

Kolagen v houbě podle vynálezu je výhodně živočišného původu, nejvýhodněji hovězího nebo koňského původu.

V případě přecitlivělosti pacienta na xenogenní proteiny však lze použít i lidského kolagenu. Další složky houby jsou ve výhodném provedení lidského původu, což činí houbu obzvláště vhodnou pro aplikaci lidským jedincům.

Oblast indikací houby podle vynálezu pro použití v medicíně je poměrně široká. Houbu lze použít nejen k zastavení krvácení na velmi rozsáhlých plochách s krvácením při vysokém krevním tlaku, ale i pro zastavení velmi pomalého krvácení (prosakování). S pomocí hemostatické houby podle vynálezu lze úspěšně provádět následující operace, a to uvnitř nebo vně organismu: výkony všeobecné chirurgie, například operace parenchymálních orgánů (játra, ledviny, slezina, atd.), kardiovaskulární výkony, hrudní chirurgii, transplantace, ortopedickou chirurgií, kostní chirurgii, plastickou chirurgii, operace uší, nosu a krku, neurochirurgii, urologické a gynekologické operace jakož i hemostázu, například při ošetření ran.

Tuto houbu podle předmětného vynálezu lze dodávat ve formě kompresívních obvazů. Přes jistý obsah vody v hemostatické houbě je tato houba schopna po přiložení na ránu vstřebat značné množství krve. Zavedením autologní nebo heterologní krve, fibrinogenu nebo krevních derivátů, se spustí hemokoagulace a dochází ke vzniku fibrinu, který zastaví krvácení a zacelí ránu/

Navíc lze houbu podle vynálezu aplikovat na ránu spolu v · ««»»«*« * · « · · · · · * · · « 9 9 9 9 · V 9

9999 9999 999 99 ·· ·· s fíbrinogenním přípravkem. Pro tento účel se dodává kit k přípravě houby, nebo povlaku nebo krytí rány, před aplikací na ránu nebo přímo během aplikace. Kromě houby obsahuje kit minimálně fibrinogenovou složku, ve výhodném provedení v podobě zajišťující stabilitu během skladování. Fibrinogen by mohl být ve formě fibrinového zacelujícího přípravku, jako je průmyslově vyráběné tkáňové adhezivum na bázi fibrinogenu, například TISSEEL (IMMUNO AG). Do jedné nebo více složek kitu nebo jako jeho samostatnou součást, lze inkorporovat i další farmakologicky účinné látky, jako například látky, která byly uvedeny výše.

Ukázalo se, že houba má výhodně tloušťku alespoň 3 milimetry, nejlépe 5 až 20 milimetrů, což závisí na indikaci. V případě, že se poměrně tlustá pružná houba aplikuje na ránu, je třeba, aby celá houba absorbovala co nejvíce krve a fibrinogenu dřív, než se vytvoří fibrin, který by mohl fungovat jako překážka absorbce dalších sekretů z rány. Proto houba podle vynálezu ve výhodném provedení obsahuje jistou trombinovou aktivitu, která zajišťuje absorpci tělních tekutin houbou a rychle a účinné zacelení rány. Bylo prokázáno, že k účinné hemostáze a ošetření ran je zapotřebí dosáhnout hodnoty 1 000 až 10 000, ve výhodném provedení 5 000 až 8 000 jednotek/gram.

Ve výhodném provedení se hodnota pH této houby podle předmětného vynálezu pohybuje v rozmezí od 6 do 8. Pokud je neutrální hodnota pH upravena v kolagenovém roztoku nebo gelu, vzniká problém' srážení kolagenu, který vede k tvorbě kolagenových vláken. V suspenzi, v níž došlo k vytvoření kolagenových vláken, již nelze dosáhnout absolutně rovnoměrného rozptýlení trombinu v kolagenovém materiálu. Proto, aby se dosáhlo homogenní distribuce aktivátoru nebo * » · » • · frfrfrfrβ··· frfrfr frfrfrfr, frfr frfr frfrfr « fr • frfr frfrfr ·»· frfr frfrfrfr proaktivátoru hemokoagulace, bylo třeba překonat problém s tvorbou vláken. Homogenní směs vzniká pouze za podmínky, že kolagen zůstává ve rozpustné formě nebo v podobě gelu, případně lyofilizovaného nebo vzduchem sušeného, pokud je ve formě gelu.

Postup přípravy houby podle předmětného vynálezu zahrnuje okyselení (acidifikaci) surového kolagenu, čímž se získá kolagenový gel a kolagen je poté k dispozici v rozpuštěném stavu. Hodnota pH acidifikovaného materiálu se pohybuje v rozmezí od 1,5 do 4, nejlépe v rozmezí od 2 do 2,5. K okyselení je vhodné použit slabou kyselinu, jako je kyselina citrónová. Kupodivu se ukázalo, že gelová forma bez tvorby vláken zůstává zachována i po neutralizaci, kdy se přísně udržuje teplota v rozmezí od Ido 8 ’C, ve výhodném provedení mezi 2 a 5 °C. Tato nízká teplota brání vysrážení kolagenu, je však nutno ji udržovat ve všech fázích přípravy houby před vysušením nebo lyofilizací. Před neutralizací nebo po ní lze do houby přimísit další složky, aby se dosáhlo jejich rovnoměrného rozptýlení. Neutralizace se ideálně provádí přidáním alkalického roztoku, jako je NaOH nebo Ca(OH)2Vysušení nebo lyofilizace je podle předmětného vynálezu kriticky důležité, protože v konečném stadiu je nutno zachovat jistý obsah vody. Ve výhodném provedení se houba suší nebo lyofilizuje v poměrně krátkém časovém úseku, čímž se zajistí přítomnost reziduálního obsahu vody ve výše uvedeném rozmezí. Případně lze postupovat tak, že po lyofilizací, při níž se získá suchá houba, se houba zvlhčí přidáním .vody nebo delší inkubací v médiu s relativní vlhkostí více než 80 %, případně až 100 %. K usnadnění procesu vysušení nebo lyofilizace je vhodné provést

to to toto • toto* to to · to to* to* inkorporaci hydrofilní látky, která dokáže, po uvážlivé a opatrné lyofilizaci nebo po aktivní absorpci vlhkosti uchovat konkrétní obsah vody. Ve výhodném provedení je touto látkou polyol nebo polysacharid, které mohou mít i ochranný účinek na labilní složky.

Konkrétní aplikací houby je její použití s jednou nebo více hemostatickými vrstvami různé struktury a/nebo složením, čímž se získá kompozitní povlak nebo kryt rány. Další vrstva může být tvořena z převážně části kolagenem k zesílení mechanické pevnosti krytu rány. Ve výhodném provedení se další materiály pro kombinaci volí- ze skupiny látek zahrnující modifikovaný nebo zesítěný kolagen, modifikovanou celulózu, jako je oxycelulóza, lidskiz tkáň a vicryl (společnost Ethnor). Výsledný kryt rány je za ideálních podmínek plně resorbční, přesto však má vysokou mechanickou pevnost. Kryt může případně obsahovat i fibrinogen, za předpokladu, že fibrinogen není v přímém kontaktu s trombinem. Pokud se má použít trombin a fibrinogen v kompozitním krytu rány, potom je podle vynálezu vhodné mezi vrstvu trombinu a vrstvu fibrinogenu vložit další vrstvu kolagenu.

Kryt neboli povlak rány, vyrobený z houby podle vynálezu a z jedné nebo více vrstev, je vhodné připravit z několika vrstev houby na sobě. Takto lze připravit několik hemostatických vrstev kolagenového materiálu a následně spojit vedle sebe. Vhodné je přikládání vrstev technologií sekvenčního nebo simultánního zmrazování neboli lyofilizace, což je proces, známý pod názvem co-freezing neboli ko-lyofilizace. Mezi další metody spojování patří vytvoření zesítěné vazby nebo lepení. Různé vrstvy lze připravit ochlazením houby podle vynálezu na teplotu pod • φ φ φ » φ» • φ * φ φφ· φ φ « φ φ · · φ «φφφ «φ φφ

Ο °C, ve výhodném provedení na teplotu v rozmezí od -10 °C do -1 “C, a rozstřikováním tekutiny nebo navrstvování kapaliny, která obsahuje kapalinu, která potom vytvoří po dalším zmražení neboli lyofilizaci několik na sobě nebo vedle položených vrstev.

Ve výhodném provedení podle vynálezu se se před lyofilizaci materiál ze směsi kolagenu a dalších složek uvede do konečného tvaru s konkrétními rozměry. Jako příklady těchto produktů lze uvést podložky a záplaty, roušky, krychličky, válečky, jehlany a vlákna, která lze lisovat nebo tvarovat do požadovaného tvaru. Ve výsledném. . produktu mohou být otvory nebo může být prostupný pro vzduch.

Dále je rovněž výhodné použití i konkrétního typu kolagenu, jako například kolagenu typů I, II, III, IV, VIII a X. Při použití lidského kolagenu je obzvláště vhodný kolagen typu IV. Kromě nativního kolagenu lze použít i fragmentováného nebo enzymaticky ošetřeného kolagenu, například pepsinem nebo pektinem.

Strukturu a mechanickou pevnost kolagenových vrstev lze dále ovlivňovat koncentrací kolagenu. Ve výhodném provedení se k přípravě houby používá, koncentrace kolagenu

Q · až 15'miligramů/cm .

Podle předmětného vynálezu je výhodné provádět spojení kolagenu a hemokoagulačních faktorů v přítomnosti malého množství kolagenu, v koncentraci 1 až 2 miligramy/cm^. Během lyofilizace nabývá kombinace pevné struktury a vzhledu podobného čistému lyofilizovanému kolagenu.

* v

9 9

999 99 ··· ♦ « «

99

Lyofilizovaná houba podle předkládaného vynálezu je ideálně šedavého zabarvení, podobné barvě vaty, pružná a pevná.

Vzduchem sušená houba je téměř průhledná.

Sterilizace houby podle vynálezu se podle předmětného vynálezu ve výhodném provedení provádí ozařováním, podle ještě výhodnějšího provedení po usušení beta nebo gama zářením dostatečné energie a vlnové délky. Kromě houby je možné ozářit i zdrojový materiál, což je frakce kolagenového materiálu v pevném stavu. Tento surový kolagenový materiál tedy lze dodávat jako kolagenový prášek, připravený ke sterilizaci ozářením.

V konkrétním použití se složky houby ošetřují samostatně, aby se deaktivovaly všechny případné patogeny, ve výhodném provedení pomocí chemických a/nebo fyzikálních metod, nejlépe tepelně, jako-například postupem podle evropského patentu ÉP 0 159 311. Přesto je vhodné připravenou houbu dodatečně sterilizovat klasickým běžně známým způsobem.

Příklady provedení vynálezu

V následujícím popisu je uvedeno několik příkladů konkrétního provedení předmětného vynálezu, které jsou ovšem pouze ilustrativní, jejich výčet není nijak vyčerpávající, přičemž tyto příklady nijak neomezují rozsah předmětného vynálezu.

Příklad 1

Postup přípravy kolagenového gelu » v *

* * · · · »· » · · · *··· · • * · · · * ·· ·· ·· ··

Podle tohoto provedení byl 1 gram suchého kolagenu (kolagenový materiál ve formě tekutiny, pasty, vláken nebo prášku) se rozpuštěn ve 100 mililitrech 0,01 M kyseliny citrónové. Tato směs se protřepávala až do vzniku homogenního a tekutého gelu. Hodnota pH byla upravena na 7,2 přidáním roztoku 1 NaOH za nepřetržitého míchání při teplotě 4 °C. Tento gel obsahoval 1 % kolagenu. Současně vznikl i 0,25 % kolagenový gel.

Příklad 2

Postup přípravy a lyofilizácé kolagenového gelu obsahujícího trombin

Podle tohoto postupu bylo použito 60 mililitrů 1 % kolagenového gelu, získaného postupem podle příkladu 1, přičemž tento podíl se smíchal s 5 mililitry roztoku trombinu obsahujícího 1000 IU/mililitr (HUMAN THROMBIN, IMMUNO AG) při teplotě 4 °C (IU je mezinárodní jednotka). Homogenní směs se nalila na desku 10 x 10 cm, která byla předem ochlazena na teplotu 4 °C. Deska se vložila do mrazicího boxu mrazicího zařízení, předem zchlazeného na teplotu 4 °C. Poté se cyklus mrazicího zařízení nastavil na teplotu -20 °C a produkt še lyofilizoval tak dlouho, až bylo dosaženo 15 % obsahu vody.

Výsledný produkt, který vypadal jako fexibilní ovčí rouno, se nakrájel na požadované rozměry. Materiál měl následující parametry:

• t » » • · ·· « ··· 4 4

4 « ·* ··

- 15 ··»»··»· * · · · • * ♦ · · » 9 * • ·· · »

Produkt I;
kolagen:	8,55 mg/cm^
trombin	50 mj./cm^
rozměry:	10 x 10 cm
tloušťka:	0,6 cm.
Příklad	3
Postup přípravy	krytu na rány s

Podle tohoto příkladu se 60 mililitrů 1 % kolagenového gelu, získaného postupem podle přikladu 1, halilo na desku 10 x 10 cm, zchlazenou na teplotu 4 °C. Deska se vložila do mrazicího boxu mrazicího zařízení, předem zchlazeného na teplotu 5 °C. Poté se cyklus mrazicího zařízení nastavil na teplotu -5 °C a produkt se zmrazil na -5 °C.

Poté se 20 mililitrů 0,25 %-ního kolagenového gelu, získaného postupem podle příkladu 1, smíchalo s 5 mililitry roztoku trombinu 1000 IU/milílitr (HUMAN THROMBIN, IMMUNO AG) a tato směs se míchala při teplotě 4 °C, čímž se dosáhlo homogenní struktury. Směs se rovnoměrně nalila na horní stranu zmražené kolagenové roušky, která stále ještě ležela na desce, a byla předem zmražená na teplotu -5 °C. Deska se rychle vložila zpět do mrazicího zařízení a cyklus mražení se nastavil na teplotu -20 °C. Lyofilizace probíhal až do dosažení koncové desorpční teploty 25 až 30 °C. Obsah vody v produktu činil 14 %. Výsledný produkt byl tvořen dvěma pevně přiléhajícími vrstvami a snadno se krájel a balil. Produkt měl následující parametry;

« v * « . · · · · · I» « · » fefefefe fefefe » * • fe fefefe *·· • fefe fefefefe fefefe ·· ·· fe·

Produkt II :
první vrstva:
kolagen:	8,55 mg/cm²
rozměry:	10 x 10 cm
tloušťka:	0,6 cm
druhá vrstva:
kolagen:	1,7 mg/cm²
trombin	50 m,j./cm²
rozměry:	10 x 10 cm
tloušťka:	0,2 cm

Další, na roušku položená vrstva fibrinogenu spolu s kolagenem o nízké koncentraci byla připravena následujícím způsobem: 20 mililitrů 0,25 %-ního kolagenového gelu, získaného postupem podle příkladu 1, se smíchalo s 6,5 mililitru roztoku fibrinogenu o koncentraci 80 mílígramů/mililitr (HUMAN FIBRINOGEN, IMMUNO AG) pří teplotě 4 °C. Směs se nalila na rovnoměrně na horní stranu zmražené kolagen-trombinové roušky, která stále ještě ležela na desce, a byla předem zmražená na -5 “C. Deska se vložila zpět do mrazicího pultu mrazicího zařízení a cyklus mražení se nastavil na -20 “C. Koncová desorpční teplota byla 25 až 30 °C, konečný obsah vody v produktu činil přibližně 15 %. Výsledný produkt byl tvořen třemi pevně k sobě přiléhajícími vrstvami a snadno se krájel a balil. Produkt měl následující parametry:

Φ·· φ φ φ φ • φ φ φ φ φ φφφφ φφφφ φ φ φ φ φφ φφ

Produkt III:
první vrstva:
kolagen:	8,55 mg/cm
rozměry:	10 x 10 cm
tloušťka:	0,6 cm
druhá vrstva:
kolagen:	1,7 mg/cm²
trombin	50 m.j./cm
rozměry:	10 x 10 cm
tloušťka:	0,2 cm
třetí vrstva:
kolagen:	1,7 mg/cm²
fibrinogen:	10 mg/cm²
rozměry:	10 x 10 cm
tloušťka:	0,2 cm

Tento výrobní postup lze použít k výrobě kompresívní houby tvořené řadou kolagenových vrstev, přičemž pořadí vrstev lze měnit podle potřebného stupně účinnosti. S pomoc tohoto postupu byly získány produkty s dále uvedenými parametry.

Směs 20 mililitrů 0,25 %-ního kolagenového gelu a 5 mililitrů roztoku trombinu 1000 IU/mililitr a 1 mililitr 40 M roztoku chloridu vápenatého byla smíchána při teplotě 4 °C a zmražená kolagenová vrstva byla připravena způsobem, jak uvedeno výše. Cyklus mrazicího boxu byl nastaven na -5 ’C po dobu 1 hodiny. Další vrstva byla vyrobena stejným způsobem jako je popsáno výše, s použitím 20 mililitrů 0,25 %-ního kolagenového gelu, teplota mrazicího boxu byla • ·

* 9

9 99

999 · · udržena na -5 ’C. Další vrstva byla připravena s použitím 20 mililitrů 0,25 % kolagenového gelu ve směsi s 6,5 mililitru roztoku fibrinogenu o koncentraci 80 miligramů/mililitr. Během lyofilizace byla dosažena konečná desorpční teplota 20 až 30 °C. Produkt mel následující parametry:

Produkt IV:

první vrstva:

kolagen: 1,77 mg/cm trombin '50' m.-j./cm - . .

rozměry: 10 x 10 cm tloušťka: 0,2 cm

CaCl2·' 1 ml z roztoku 40 mmol/1 druhá vrstva:

kolagen: 1,7 mg/cm rozměry: 10 x 10 cm tloušťka: 0,2 cm třetí vrstva:

kolagen: 1,7 mg/cm .

fibrinogen: 10 mg/cm^ rozměry: 10 x 10 cm tloušťka: 0,2 cm

Příklad 4

Použití houby u prasečího modelu a srovnání s průmyslově vyráběným produktem (TachoComb)

S použitím modelu resekce jater u heparinizovaných prasat bylo provedeno srovnání produktu I, získaného podle přikladu 2, s kolagenovým produktem neobsahujícím trombin • · • to to · * » «··to··» *to· ·· «« • · · • toto to· • tototo • toto to to • · · • to ·« a s produktem TachoComb (Nycomed).

Při použití kolagenového produktu nebyla dosažena hemostáza, výsledkem bylo vykrvácení s následnou smrtí. Hemostáza nebyla dosažena ani při použití výrobku TachoComb. V místě resekce bylo možno pozorovat přerušení tkáně, poté došlo k opakovanému krvácení a vepři vykrváceli (s následnou smrtí).

Při použití produktu I byla dosažena úplná hemostáza během 5 minut. Vepři byli po-operačně pozorováni po dobu 3 dní, poté byli utraceni. Při' pitvě nebyla v břišní- dutině, zjištěna žádná krev.

* 0 0 ·

· ·

0 «000 0000

0 00

0«· 0 0 • 0 ·

00 · ·

0 0*

0 0 *0 0 0»

JUBr. ΜΙΙοδ VŠETEČKA advokát

12fl 00 PRAHA 2, Hálkova Z

PATENTOVÉ

NÁROKY

Claims

1. Hemostatická houba, vyznačující se tím, že je na bázi kolagenu a aktivátoru nebo proaktivátoru hemokoagulace, rovnoměrně rozptýlených v této houbě, která je vysušena a má minimální obsah vody 2 %, výhodně v rozmezí od 2 do 25 %, nejvýhodněji 10 až 20 %.,

2. Hemostatická houba podle nároku 1, vyznačující se tím, že je lyofilizovaná nebo sušená vzduchem.

3. Hemostatická houba podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že má hodnotou pH v rozmezí od 6 do 8.

4. Hemostatická houba podle kteréhokoli nároku 1 až

3, vyznačující se tím, že uvedený aktivátor nebo proaktivátor hemokoagulace je zvolen ze skupiny látek zahrnující trombin, protrombin, aktivovaný faktor X, aktivovaný protrombinový komplex, FEIBA, ionty vápníku a jejich směsi.

5. Hemostatická houba podle kteréhokoli nároku 1 až

4, vyznačující se tím, že má tlouštku minimálně 3 milimetry, výhodně přinejmenším 5 milimetrů až 10 milimetrů.

6. Hemostatická houba podle kteréhokoli nároku 1 až

5, vyznačující se tím, že obsah aktivátoru nebo proaktivátoru je v rozmezí od 1 000 do 10 000, výhodně

5 000 až 8 000 jednotek/trombinových ekvivalentů na jeden gram.

• · f « « « • 9 · *····* • 9 9 9

999999 999 99 «·

7. Hemostatická houba podle kteréhokoli nároku 1 až

6, vyznačující se tím, že dále obsahuje stabilizátor trombinu, výhodně zvolený ze skupiny látek zahrnující polyol, polysacharid, polyalkylenglykol, aminokyseliny nebo jejich směsi.

I

8. Hemostatická houba podle kteréhokoli nároku 1 až

7, vyznačující se tím, že dále obsahuje látku stabilizující obsah vody, výhodně polysacharid nebo polyol.

9. Hemostatická houba podle kteréhokoli nároku 1 až

8, vyznačující se tím, že dále obsahuje’ fármakologicky .....

účinnou látku, jako je konzervační látka, antifibrinolytikum, antibiotikum, jako je antibakteriální nebo antimykotická látka, růstový faktor, enzym nebo inhibitor enzymů.

10. Kryt rány vyznačující se tím, že obsahuje houbu podle kteréhokoli nároku 1 až 9, a další vrstvu, která je výhodně rovněž hemostatická a pevně přiléhá k uvedené houbě.

11. Kryt rány podle nároku 10, vyznačující se tím, že další vrstva sestává v podstatě z kolagenu.

12. Kryt rány podle nároku 10, vyznačující se tím, že další vrstva obsahuje fibrinogen, výhodně ve směsí s kolagenem.

13. Kit pro přípravu krytu rány vyznačující se tím, že obsahuje (a) houbu podle kteréhokoli nároku 1 až 9 a (b) fibrinogen, výhodně ve formě stabilní při skladování, • i · Φ > V φ φ · φφ φφ φφφφ φ φ · φφφ φφ* φφφ φφφφ «φφ φφ «« «· a případně (c) farmakologický účinnou látku.

14. Způsob výroby houby podle kteréhokoli nároku 1 až 9, vyznačující se tím, že zahrnuje acidifikaci surového kolagenového materiálu s cílem získat kolagenový gel, smíchání gelu s aktivátorem nebo proaktivátorem hemokoagulace za vzniku homogenní směsi, a usušeni, výhodně lyofilizací nebo vzduchem, uvedené směsi tak, aby její obsah vody byl minimálně 2 %, výhodně v rozmezí od 2 do 25 96, ještě výhodněji od 10 do 20 %.

15. Způsob podle nároku 14, vyznačující se tím, že se gel nebo směs neutralizuje přidáním zásaditého roztoku, jako je NaOH nebo Ca(OH)2·

16. Způsob podle nároků 14 nebo 15, vyznačující se tím, že se směs lyofilizuje s cílem vyrobit suchou houbu, která se poté zvlhčí.

17. Způsob podle kteréhokoli nároku 14 až 16, vyznačující sé tím, že se směs lyofilizuje v přítomnosti látky, která zachovává obsah vody.

18. Způsob podle kteréhokoli nároku 14 až 17, vyznačující se tím, že se směs lyofilizuje do konečného tvaru.

19. Způsob podle kteréhokoli nároku 14 až 18, vyznačující se tím, že se do směsi přidávají další látky, jako je stabilizátor trombinu nebo fyziologicky účinná látka.

• · • · · ·

20. Způsob podle kteréhokoli nároku 14 až 19,