JP4104462B2 - コラーゲンスポンジを調製する方法、コラーゲンフォームの一部を抽出するための装置、および伸長したコラーゲンスポンジ - Google Patents
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Description
本発明は、コラーゲンスポンジを調製する方法に関する。本発明に従って作製したコラーゲンスポンジは、主に毛細管出血を停止させるために外科において特に有用である。コラーゲンスポンジはまた、フィブリン膠調製物によってコーティングされる担体として用いてもよい。本発明はまた、コラーゲンフォームの一部を抽出する装置にも関する。本発明はさらに、主に消化管で用いられる伸長したコラーゲンスポンジに関する。
コラーゲンは60年代後半以降、止血剤として用いられている。コラーゲンは、全ての哺乳類において最も頻繁に認められる構造タンパク質である。約300 kDaの単量体タンパク質(トロポコラーゲン)は、特異的部位で共有結合している。したがって成熟タンパク質は不溶性であり、高い張力を有する特徴的な原線維を形成する。多数のコラーゲンサブクラスが記述されており、最も一般的なものは、皮膚、腱、骨、および角膜における主なコラーゲンタイプであるI型コラーゲンである。コラーゲンは、長さが約290 nmの三重らせんから実質的に成る線維様タンパク質である。これらの三重らせん(トロポコラーゲン分子)5個が交互して直径約3.6 nmの微小線維を形成する。これらの微小線維は、原線維間および原線維内相互作用のために容易に近づくことができる極性および非極性セグメントを有する。微小線維は、四面体格子に充填されて、直径約30 nmの小原線維を形成する。次に、これらの小原線維が集合して、結合組織の基本単位であるコラーゲン原線維となり、これは直径が数百nmであり、したがって光学顕微鏡では薄い線のように見える(参考文献1参照)。製造過程の間に生成されるコラーゲンゲルおよびコラーゲンスポンジは、顕微鏡で証明されるように、最小の単位としてこれらの原線維を含む。
フィブリン膠調製物によるコラーゲンスポンジのコーティングの成否は、コラーゲンスポンジのきめに依存することが判明した。このように、本発明の目的は、特に、創傷を治癒および密閉する材料を得るために、フィブリン膠調製物によるコーティングに適したコラーゲンスポンジを作製する目的で、特定のきめを有するコラーゲンスポンジを作製する方法を提供することである。本発明のさらなる目的は、湿度、弾性、密度、および弾性係数が改善されたという意味において、先行技術のスポンジに関して改善された物理的特徴を有するコラーゲンスポンジを作製する方法を提供することである。本発明のさらなる目的は、コラーゲンスポンジが創傷に一度適用されると、それが空気または液体をコラーゲンスポンジの中に浸透させないという意味において、空気および液体を通さないコラーゲンスポンジを調製する方法を提供することである。本発明のなおさらなる目的は、消化管または気管において用いることができる創傷密閉材料を提供することである。
− コラーゲンゲルを調製する段階、
− コラーゲンフォームを得るためにコラーゲンゲルに空気を混合する段階、
− その中に小室を有する担体の乾燥ブロックを得るために、コラーゲンフォームを乾燥させる段階、
− 小室の直径が0.75mmより大きく4mm未満であるスポンジの一部、または小室の平均対角線寸法が多くて3mmであるスポンジの一部をコラーゲンスポンジのブロックから単離する段階。
− 腱を−10℃〜−30℃の温度で保存して、腱を剥離する、
− 腱から異種タンパク質を除去する、
− 腱における胚含有量を減少させる、
− 腱を膨張させる、
− 膨張した腱をホモジナイズする。
− コラーゲンフォームを作製するためにミキサーを用いて周囲の空気をゲルに混合する段階、
− 混合したゲルフォームを分画チャンネルに送る段階、
− 分画チャンネルに含まれるコラーゲンゲルとコラーゲンフォームとを分離する段階。
− 分画チャンネルに含まれるコラーゲンフォームの選択した部分を分離する段階、
− コラーゲンフォームの選択した部分を乾燥させるために分画チャンネルから送る。
− pH値が5.0〜6.0、
− 乳酸含有量が多くとも5%
− アンモニア含有量が多くとも0.5%
− アルブミン含有量として計算した可溶性タンパク質含有量が多くとも0.5%
− 硫酸塩の灰含有量が多くとも1.0%
− 重金属含有量が多くとも20 ppm
− 微生物純度が多くとも103 CFU/g
− コラーゲン含有量が75%〜100%
− 密度が2〜7 mg/cm3のような1〜10 mg/m3、
− 弾性係数が10〜50 N/cm 2 のような5〜100 N/cm 2 。
− コラーゲンゲルを調製する段階、
− コラーゲンフォームを得るためにコラーゲンゲルに空気を混合する段階、
− その中に小室を有するコラーゲンスポンジの乾燥ブロックを得るためにコラーゲンフォームを乾燥させる段階、
− 以下の特性を有するスポンジの一部をコラーゲンスポンジのブロックから単離する段階、
− 弾性係数が5〜100 N/cm 2 の範囲である、
− 密度が1〜10 mg/cm3の範囲である、
− 小室の直径が0.75mmより大きく4mm未満であるか、または小室の平均直径が多くとも3mmである。
− コラーゲンフォームの流れを受けるための入り口、コラーゲンフォームの流れの一部のための出口、およびコラーゲンフォームの流れの方向に対して下方に傾斜した底の部分を含む、分画チャンネル、
− 出口の部分が分画チャンネルの末端で垂直方向に移動可能である、分画チャンネルの底の部分でコラーゲンゲルのための少なくとも一つの出口。
腸: 0.5〜6 cm
直腸: 1〜4 cm
大腸: 2〜6 cm
小腸: 0.5〜3 cm
食道: 0.5〜2 cm
気管: 1〜4 cm
− 創傷の包帯、
− 以下のような止血の支持体、
− 実質臓器からの弱い散在性出血、
− コラーゲンスポンジを適用する前に、ectrosurgeryまたは結紮が行われている場所での外科技法、
− 再出血の予防(縫合の確保)、
− 火傷に対する適用
− 局所損傷に対する包帯、
− 抗生物質の輸送のような薬物輸送。
好ましい態様において、本発明は、図1および図2に示すように以下の段階を含む:
ウマ腱は−18℃〜−25℃で輸送して凍結する。
半分凍結した状態で、腱の薄い皮膚を手またはナイフによって機械的に除去する。次に、腱を−18℃〜−25℃で再度超低温凍結する。
任意選択的に、剥離した凍結腱を70%エタノール中で30分間消毒して、エタノール下で製造室に移した。次に、腱を洗浄して、洗浄後、腱をブロックに圧縮して、−18℃〜−25℃で超低温凍結する。次に、凍結した腱のブロックを切断機によって切片にして、回転するナイフによって厚さ約1mmの切片に切断する。
可溶性のタンパク質を除去するために、腱切片をまず、注射用水に3〜6時間浸漬した後、注射用水によって洗浄するか、または上清がヘモグロビン不含となるまで、脱塩水、または1〜10 mMの範囲内のCa2+および/またはMg2+イオンを含む塩溶液によって洗浄する。次に、腱切片を70%エタノール中で15分間消毒して、0.45%乳酸の飲料水溶液(濾過滅菌して発熱物質を除去する)によって2回洗浄して、エタノールを除去する。
洗浄した腱切片を0.45%乳酸に2〜5日間、好ましくは4日間浸漬した後、コラーゲンゲルにホモジナイズする。0.45%乳酸に曝露することは、主なウイルス不活化段階の一つであると考えられる。
溶解攪拌子によって、濾過滅菌した空気をコラーゲンゲルに入れて泡立てる。生じた泡を分画して、泡の大きさが1〜3mmの分画を採取する。泡をスチール製の容器から樽に注ぎ、これを約3分間回転させて均一な泡を得る。泡を乾燥容器に充填する。容器の基部は、泡を排水することができるように液体が浸透可能な薄い織物からなる。5〜24時間後、好ましくは18〜24時間後、排水したフォームをアンモニアガス、例えばDAB品質の26%アンモニア溶液から生成されたガスに曝露する。このプロセスにおいて、過剰なアンモニアのために、フォームのpHはアルカリ領域にシフトする。その後の乾燥プロセスの際にアンモニアを除去すると、中性の産物が得られる。
フォームは、高級スチール製乾燥室において暖かい空気中で48〜150時間、好ましくは120〜150時間乾燥させる。その結果、ブロックで形成されたコラーゲンスポンジが得られる。
コラーゲンのシートとも呼ばれるブロックは、例えば、コーティングのための担体として用いてもよい。切断は、垂直切断機によって行う。最初に、ブロックの側面を切断して、側部の長さが50 cmの垂直面を有するブロックを生じる。次に、このブロックを垂直に、幅11 cmの棒4本に切断する。棒を、その上下の面で形を整えて、寸法50×11×0.4〜0.7 cmの小片に切断する。コラーゲンスポンジの重量は好ましくは、TachoComb(登録商標)H、TachoComb(登録商標)、およびTachoTop(登録商標)のように、得られた最終製品におけるコラーゲンの如何なる仕様も考慮に入れる。
次に、コラーゲンスポンジ片に肉眼による検査を行う。以下の欠陥を一つまたはそれ以上を有する小片を廃棄する:
− 小室の平均直径が1mm未満または3mm以上である小片
− 不均一な小室構造を有する小片
− 穴を有する小片(スポンジの厚み以上の深さを有する単一の小室)
表1は、本発明に従う方法の三つの異なるサイクルのパラメータ値を示す。
本実施例は、トルク測定によるコラーゲンゲルの粘度の間接的測定に関する。
− 攪拌機:EUROSTAR POWERコントロールビスク
− ウィンドウズソフトウェア:IKASOFT dc
− データロガーDC2
− 既定の寸法の特殊な攪拌構築物(「フォーク」)、図4を参照のこと
− 内径14.6 cmおよび高さ20.5 cmの漏斗
− 温度計
− 秤
図を含む。
(図3)本発明に係る方法によって作製されたコラーゲンスポンジの表面の写真であ
る(ドイツ、エルランゲン大学病院外科のRoman Carbon教授の好意による)。
(図4)コラーゲンゲルの粘度の測定値を得るための攪拌装置を開示する。
Claims (36)
- 以下の段階を含む、コラーゲンスポンジを調製する方法:
− コラーゲンゲルを調製する段階、
− コラーゲンフォームを得るために、コラーゲンゲルに空気を混合する段階、
− 泡の大きさが1〜3mmの分画を採集する段階、
− コラーゲン材料の壁で封入されている積み重なった小室を備える三次元構造を有するコラーゲンスポンジの乾燥ブロックを得るためにコラーゲンフォームを乾燥させる段階、
− 小室の直径が0.75mmより大きく4mm未満であるスポンジの一部、または小室の平均対角線寸法が多くとも3mmである一部をコラーゲンスポンジのブロックから単離する段階。 - スポンジの単離された部分のコラーゲン含有量が50〜100%である、請求項1記載の方法。
- コラーゲンゲルが以下の起源:哺乳類、トランスジェニック、および組換え型起源の少なくとも一つからの異なるタイプのコラーゲン材料を含む、請求項1または2に記載の方法。
- コラーゲンが、ウマ腱、ウシ腱、およびヒト腱からなる群より選択される腱からの材料を含む、請求項3記載の方法。
- コラーゲンゲルを調製する段階が以下の段階を含む、請求項3または4記載の方法:
− 腱を−10℃〜−30℃の温度で保存して;腱を剥離する段階、
− 腱から異種タンパク質を除去する段階、
− 腱における胚含有量を減少させる段階、
− 腱を膨張させる段階、
− 膨張した腱をホモジナイズする段階。 - 胚含有量を減少させる段階が、腱に酸および有機溶媒を加える段階を含む、請求項5記載の方法。
- 酸が有機酸である、請求項6記載の方法。
- 有機溶媒がアルコールである、請求項6または7に記載の方法。
- 腱を膨張させる段階が腱に乳酸を加える段階を含む、請求項5〜8のいずれか一項記載の方法。
- 酸のpH値が1〜4の範囲である、請求項6〜9のいずれか一項記載の方法。
- 酸が0.45%乳酸である、請求項6〜10のいずれか一項記載の方法。
- 腱を膨張させる段階が、4℃〜25℃の温度で48〜200時間腱を保存する段階を含む、請求項5〜11のいずれか一項記載の方法。
- 腱が100〜120時間保存される、請求項12記載の方法。
- 膨張した腱をホモジナイズする段階が、粒子の長さまたは直径が0.8〜1.2cmである腱の粒子を含む物質を得る段階を含む、請求項5〜13のいずれか一項記載の方法。
- 膨張した腱をホモジナイズする段階が、粘度2〜20Ncmを有する物質を得る段階を含む、請求項5〜14のいずれか一項記載の方法。
- 膨張した腱をホモジナイズする段階が、歯のついた円板ミルまたは同等の機器によって行われる、請求項5〜15のいずれか一項記載の方法。
- コラーゲンゲルの動的粘度が2〜20Ncmである、請求項1〜16のいずれか一項記載の方法。
- コラーゲンゲルに空気を混合した後に、コラーゲンフォームを2〜4分間ホモジナイズする段階をさらに含む、請求項1〜17のいずれか一項記載の方法。
- コラーゲンフォームを乾燥させる段階の前でコラーゲンゲルに空気を混合する段階の後に、コラーゲンフォームのpH値が6.5〜8.5となるように、コラーゲンフォームに中和剤を加えて、コラーゲンフォームを中和する段階をさらに含む、請求項1〜18のいずれか一項記載の方法。
- 中和剤がアンモニア溶液を含む、請求項19記載の方法。
- コラーゲンフォームが5〜30時間中和される、請求項19または20に記載の方法。
- コラーゲンフォームが20〜30時間中和される、請求項21記載の方法。
- 乾燥させる段階が、乾燥コラーゲンスポンジを得るために、15℃〜60℃の温度で48〜200時間乾燥させることを含む、請求項1〜22のいずれか一項記載の方法。
- 乾燥させる段階が、700〜900mbarの圧力下で行われる、請求項23記載の方法。
- 乾燥させる段階が、15℃〜40℃の温度で100〜200時間乾燥させることを含む、請求項1〜24のいずれか一項記載の方法。
- コラーゲンスポンジが以下の基準の少なくとも一つを満たす、請求項1〜25のいずれか一項記載の方法:
− pH値が5.0〜6.0の間である、
− 乳酸含有量が多くとも5%である、
− アンモニア含有量が多くとも0.5%である、
− アルブミン含有量として計算した可溶性タンパク質含有量が多くとも0.5%である、
− 硫酸塩の灰含有量が多くとも1.0%である、
− 重金属含有量が多くとも20ppmである、
− 微生物純度が多くとも103CFU/gである、
− コラーゲン含有量が75〜100%である、
− 密度が1〜10mg/cm3である、
− 弾性係数が5〜100N/cm2の範囲である。 - コラーゲンスポンジの水分含有量が20%以下である、請求項1〜26のいずれか一項記載の方法。
- コラーゲンスポンジの一部を単離する段階が、切断によって多数の部分にコラーゲンスポンジを分割する段階を含む、請求項1〜27のいずれか一項記載の方法。
- 以下の段階を含む、コラーゲンスポンジを調製する方法:
− コラーゲンゲルを調製する段階、
− コラーゲンフォームを得るために、コラーゲンゲルに空気を混合する段階、
− 泡の大きさが1〜3mmの分画を採集する段階、
− コラーゲン材料の壁で封入されている積み重なった小室を備える三次元構造を有するコラーゲンスポンジの乾燥ブロックを得るためにコラーゲンフォームを乾燥させる段階、
− 以下の特性を有するスポンジの一部をコラーゲンスポンジのブロックから単離する段階:
− 弾性係数が5〜100N/cm2の範囲である、
− 密度が1〜10mg/cm3の範囲である、
− 小室の直径が0.75mmより大きく4mm未満である、または小室の平均直径が多くとも3mmである。 - 請求項1〜28のいずれか一項記載の段階を含む、請求項29記載の方法。
- スポンジがその後にフィブリノーゲンとトロンビンの組合わせで被覆される、請求項1〜30のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項1〜31のいずれか一項に記載の方法により得ることができるコラーゲンスポンジ。
- 円形または楕円形の断面を有する、請求項32に記載の伸長したコラーゲンスポンジ。
- 哺乳類の消化管もしくは気管系において創傷を閉鎖するためまたは壁を再確立するためにスポンジを使用可能にするような外部寸法を有する、請求項33に記載の伸長したコラーゲンスポンジ。
- 穿孔または穴が、哺乳類の消化管または気管の内部または外部断面積に対応する対角線寸法を有する、請求項33又は34に記載の伸長したコラーゲンスポンジ。
- 直腸壁における創傷を閉鎖するためまたは直腸壁を再確立するために適したスポンジを作製するために、ヒト直腸の内部寸法に対応する外部寸法を有する請求項34または35に記載の伸長したコラーゲンスポンジ。
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