NO332462B1

NO332462B1 - Fremgangsmåte for fremstilling av en kollagensvamp.

Info

Publication number: NO332462B1
Application number: NO20033295A
Authority: NO
Inventors: Alfred Schaufler
Original assignee: Nycomed Pharma As
Priority date: 2001-01-25
Filing date: 2003-07-22
Publication date: 2012-09-24
Also published as: JP2007190399A; EG24589A; EA200300823A1; HUP0400768A3; IS6885A; BG108121A; CN1246047C; AU2002249528B2; AR032400A1; IL157095A0; NO20033295L; KR100847417B1; HK1058319A1; JP2004520124A; EA200401463A1; DK1368419T3; DE60203364D1; MXPA03006689A; ME00587B; MXPA03006687A

Description

OMRÅDET FOR OPPFINNELSEN

Foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for å fremstille en kollagensvamp som angitt i krav 1. Kollagensvampen produsert i samsvar med oppfinnelsen, er spesielt nyttig innen kirurgi, primært for å stoppe kapillærblødning. Kollagensvampen kan også anvendes som en bærer som kan dekkes med et fibrinlimpreparat.

BAKGRUNN FOR OPPFINNELSEN

Kollagen har vært anvendt som et hemostyptisk middel siden slutten av 1960-årene. Kollagen er det oftest forekommende strukturelle protein i alle pattedyr. Det monomere protein på ca. 300 kDa (tropokollagen) er kovalent kryssbundet på spesifikke steder. Det modnede protein er derfor uløselig, og danner karakteristiske fibriller med høy strekkstyrke. Mange underklasser av kollagen er blitt beskrevet, og den vanligste, som er kollagen type I, er hovedkollagentypen i hud, knokkelsener og hornhinne. Kollagen er et fibrøst protein som i det vesentlige består av en trippelheliks med en lengde på ca. 290 nm. 5 av disse trippelhelikser (tropo-kollagenmolekyler) er forskjøvet for å danne en mikro-fibrill med en diameter på ca. 3,6 nm. Disse mikrofibriller har polare og ikke-polare segmenter som er lett tilgjenge-lige for spesifikke inter- og intrafibrillære interaksjo-ner. Mikrofibriller er pakket inn i et tetragonalt gitter-verk for å danne subfibriller med en diameter på ca. 30 nm. Disse subfibriller settes deretter sammen til kollagen-fibrillen, basisenheten for bindevev, som har en diameter på flere 100 nm og som derfor er synlig i et lysmikroskop som en tynn linje, se referanse 1. Kollagengel og kollagensvamp, som er produsert under fremstillings-prosessen, omfatter disse fibriller som de minste enhetene, som vist med mikroskopi.

Kollagen kan anvendes som et materiale for å forbinde sår, muligens med en belegging som omfatter et fibrinlim. Fibrinlim, dvs. kombinasjonen av fibrinogen, trombin og aprotinin er med hell blitt benyttet terapeutisk i mange år for å lime vev og nerver, og for å forbinde overflater når det er mindre blødning. En ulempe ved fibrinlimet har vært at i tilfeller med stor blødning, vaskes limet vanligvis bort før tilstrekkelig polymerisering av fibrin har skjedd. For å overvinne dette problemet, har kirurger manuelt påført flytende fibrinlim på absorberbare bærere, så som kollagen-fleece.

Til tross for den imponerende suksess med disse kombinerte applikasjoner, har ikke denne metoden blitt anvendt i stor skala som følge av noen ulemper. Fremstillingen er relativt uhåndterlig, fremgangsmåten krever erfaring og fagperso-nell, og fremstillingen er ikke lett tilgjengelig i tilfeller med nødsituasjoner, idet tiden for fremstilling er i området 10-15 min. Disse faktorer stimulerte utviklingen av et forbedret produkt som resulterer i utviklingen av en fiksert kombinasjon av en kollagenbærer belagt med en belegging av faststoff-fibrinogen, faststoff-trombin og faststoff-aprotinin som beskrevet i EP 0 059 265. Produktet beskrevet i EP 0 059 265 som er blitt markedsført under varemerket TachoComb®, kan anvendes direkte på såret. Når beleggingen kommer i kontakt med vandige væsker som blod, andre kroppsvæsker eller saltløsning, oppløses komponentene og fibrin dannes. Produktet appliseres på såret med et lett trykk og kollagen bindes tett (limes) til den skadde overflaten. Hemostase oppnås og såret forsegles.

Ved siden av en viss blodkoagulasjonsstimulerende aktivitet, er virkningen av kollagen i TachoComb® hovedsakelig som for en bærer som adsorberer og yter mekanisk stabilitet til koaguleringspreparatet som den er belagt med. Andre fordeler ved kollagen, spesielt i en svampform, er dets bionedbrytbarhet, dets relative høye strekkstyrke, selv i våt tilstand, dets høye motstand mot penetreringen av væsker og luft, og dets høye fleksibilitet i våt tilstand.

Foreliggende oppfinnelse vedrører primært fremstillingen av en kollagensvamp som kan anvendes som en bærer for fibrinogen, trombin og/eller aprotinin, f.eks. som i TachoComb®. Kollagensvampen kan også anvendes direkte, dvs. uten en belegging, som en bandasje på topikale skader, for å støtte hemostase, så som for å forhindre ny blødning, for svak, diffus blødning fra parenkymatiske organer, for anvendelse ved brannskader, hudtransplantasjoner, dekubitus eller huddefekter, eller som en bandasje på topikale skader.

Innen teknikkens stilling er en rekke metoder for å fremstille en kollagenbærer blitt foreslått. WO86/05811 beskriver en vektet mikrosvamp for å immobilisere bioaktive materialer i motive bioreaktorsystemer, hvor mikrosvampen omfatter en sterkt kryssbundet kollagenmatriks. Den sterkt kryssbundne kollagenmatriks fremstilles ved å male en kilde av Type I-, II- eller III-kollagen for å oppnå fibrer som har en diameter i størrelsesorden fra 1-50<y>m og en lengde som ikke er større enn 200 ym. Det malte kollagen formes som et løselig kollagen oppløst i et løsemiddel, eller et uoppløselig kollagen dispergert i et løsemiddel ved å blande med et løsemiddel, så som eddiksyre, melkesyre, propionsyre eller smørsyre. I tilfellet med en kollagendispersjon, utføres blandingen med et høyt nivå av agitering ved å anvende en blander, for å fremstille mikro-fibrer av kollagenet. Deretter blandes et vektetilsetnings-stoff med kollagenvæskeblandingen og den sammensatte blanding formes til små dråper og solidifiseres ved innfrysing. En rekke teknikker for å fremstille små partikler er beskrevet. Den frosne kompositt vakuumfrysetørkes, og kombinasjonen av innfrysing og tørking refereres til som lyofilisering. Den frysetørkede kollagenmatrikskompositt behandles for å kryssbinde kollagenet. Kollagenet kan kryssbindes ved enten å anvende kjemiske kryssbindings-midler, ved kraftig dehydrering ved en forhøyet temperatur, eller ved en kombinasjon. Kollagenmatriksen som tilstrebes er resistent mot kollagenase og annen enzymatisk degradering, og gjør dermed disse materialer spesielt egnet for å dyrke organismer. Etter å ha vasket den kryssbundne kollagenmatriks, kan mikrosvampene steriliseres og pakkes aseptisk. I den vektede mikrosvamp har kollagenmatriksen en åpning til overflateporestrukturen med en gjennomsnittlig porestørrelse i området fra ca. 1 til ca. 150<y>m, hvor porene i matriksen okkuperer fra ca. 70 til ca. 98 volum% av mikrosvampen. Mikrosvampen har videre en gjennomsnittlig partikkelstørrelse på fra ca. 100 til ca. 1000 ym, og en spesifikk tyngde på over ca. 1,05. Vektmaterialet kan være metall eller legeringer fra metall, metalloksider og keramiske materialer.

US patent nr. 5.660.857 beskriver en fremgangsmåte for å fremstille en kompositt som omfatter en uløselig protein-matriks og et oleaginøst materiale, som er nyttig som et materiale for kirurgiske bandasjer og biomedisinske implan-tater, og som et kosmetisk materiale for applikasjon på huden. Fremgangsmåten i US 5.660.857 omfatter trinnene å blande et protein, det oleaginøse materiale og vann for å danne en emulsjon av det oleaginøse materiale i en vandig dispersjon av proteinet, og deretter tørke eller frysetørke emulsjonen for å danne en film eller en svamp. Det uløselige fibrose protein er hovedsakelig omfattet av uløselig kollagen, som passende kan tilveiebringes fra bovint skinn. I en utførelsesform kan kollagenet svelles i melkesyre for anvendelse.

WO99/13902 beskriver en fremgangsmåte for å fremstille en meningeal vevsvekstmatriks som omfatter trinnet å fremstille fysiologisk kompatibelt kollagen, som er vesentlig fritt for aktive virus og prioner. Kollagenet formes til en film, en svamp, et ikke-vevd kollagen eller en filt. Kollagenet oppnås ved en prosess som omfatter rensing av skinn, tendoner, ligamenter eller ben for fett. Materialet blir deretter underkastet en enzymbehandling, hvorved kollagenmaterialet svelles. Kollagenmaterialet blir deretter ytterligere svellet med en syreløsning. Kollagen-blandingen homogeniseres deretter. Produktet som oppnås kan være en matriks tilveiebrakt i form av en kollagensvamp, en ikke-vevd matriks, filt eller film, eller en kompositt av to eller flere av de foregående former. En kollagensvamp kan tilveiebringes ved tilpasning av metodene for å danne kollagensvamper som er beskrevet i US 5.019.087. Svampen kan fremstilles ved lyofilisering av en kollagendispersjon fremstilt i følge WO99/13902. Svamptettheten oppnådd sies å være ca. 0,1 mg/cm<3>til ca. 120 mg/cm<3>. I følge beskrivelsen i WO99/13902 strekker porestørrelsen seg fra ca. 10 ym til ca. 500<y>m. Laminattype av kollagensvamp og kollagenfilm er angitt.

US patent nr. 5.618.551 vedrører et ikke-kryssbundet og potensielt kryssbindingsbart pepsinbehandlet kollagen eller gelatinpulver modifisert ved oksidativ spalting i en vandig løsning, som er løselig ved en sur pH og stabil under lagring ved en temperatur på under 0 °C i minst 1 måned. Patentet vedrører videre en fremgangsmåte for å fremstille pulveret, omfattende å fremstille en sur løsning av pepsinbehandlet kollagen, utsette den sure vandige løsning ved romtemperatur for kontrollert oksidasjon, presipitere det oksiderte og ikke-kryssbundne pepsinbehandlede kollagen ved en sur pH, og isolere, konsentrere og dehydrere det ikke-kryssbundne pepsinbehandlede kollagen for å oppnå det i form av et reaktivt surt pulver, og fryse og lagre det oppnådde reaktive sure pulver ved en temperatur på under 0

°C.

GB 1 292 326 beskriver en fremgangsmåte og apparat for fremstillingen av kollagendispersjoner, samt deres applikasjoner, hvori en suspensjon av kollagenfibrer fremstilles og deretter introduseres i et behandlingskammer med omrør-ingsmidler. Et subatmosfærisk trykk finnes i behandlings-kammeret, hvor suspensjonen omdannes til en dispersjon ved omrøring og kontrollert forsuring ved hjelp av en mineral-ener organisk syre. I følge beskrivelsen i GB 1 292 326 kan fremstillingen av svampkollagene artikler utføres fra dispersjon eller geler av kollagen. I denne sammenheng refererer dokumentene til lyofilisering og til dispersjon eller geler som er svært rike på luftbobler. GB 1 292 326 nevner videre et problem med å kontrollere introduksjonen eller elimineringen av luftbobler på en tilfredsstillende måte. Dokumentet beskriver, i to eksempler, henholdsvis en kollagenisk dispersjon fri for luftbobler med et kollagen innhold på 2,5 %, og en luftet dispersjon av kollagen med en kollagenkonsentrasjon på 2,5 %.

Chemical abstract, Columbus Ohio, vol 98, 13. juni 1983, nr. 24, nevner et kollagen oppnådd fra dyrevev så som skinn eller sene-ben som er blitt underlagt syrebehandling. Kollagenet er reaggregert ved dialyse, under hvilken prosess et nett av sterkt bi-refringente krystallfibrer dannes. Kollagenet kan formes til ark på 0,5 mm-2 cm, eller blandes med luft for å danne svamper, eller dispergeres som en krem.

US 4453939 beskriver en sammensetning til bruk i forbindelse med sårheling omfattende en kollagenbærer som er dekket på en eller alle flater med en blanding av en fibrinogenkomponent og en trombinkomponent løst i alkohol. Fibrinkomponenten inneholder fibrinogen, faktor XIII-inneholdende fibrinogen eller en blanding derav. Trombin-komponenten inneholder trombin, en forbindelse som frigjør trombin i nærvær av kroppsvæske eller en blanding av disse forbindelsene. US 4453030 bygger på at det er mulig å frem-skaffe en sammensetning som inneholder alle komponentene som er nødvendig for blodkoagulering, og angir en prosess for fremstilling av en slik sammensetning, men beskriver imidlertid ikke isolering av kollagensvamp med definert tredimensjonal struktur.

US 6177126 vedrører en prosess for fremstilling av et materiale for sårheling. En flytende sammensetning tilsettes til en beholder med to eller flere plater der minst to av platene er perforert med ett eller flere hull. En bærer transporteres under beholderen i transportretningen. De perforerte platene beveges kontinuerlig slik at en flytende sammensetning kan dryppe ned på bæreren som transporteres under beholderen. Den flytende sammensetningen er en suspensjon omfattende en fibrinogenkomponent og en trombinkomponent og danner et lag på bæreren. Sammensetningen omfatter også aprotinin, et organisk løsningsmiddel og en alkohol.

BESKRIVELSE AV OPPFINNELSEN

Det er funnet at den suksessfulle belegging av en kollagensvamp med et fibrinlimpreparat avhenger av teksturen på kollagensvampen. Det er således et formål med foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe en fremgangsmåte for å fremstille en kollagensvamp med en viss tekstur, spesielt med det som formål å fremstille en kollagensvamp egent for belegging med et fibrinlimpreparat, for å oppnå et materiale for å hele og forbinde sår. Det er et ytterligere formål med oppfinnelsen å tilveiebringe en fremgangsmåte for å fremstille en kollagensvamp som har forbedrede fysikalske karakteristika i forhold til tidligere beskrevne svamper, når det gjelder forbedret fuktighet, elastisitet, tetthet og elastisitetsmodul. Det er et ytterligere formål med oppfinnelsen å tilveiebringe en fremgangsmåte for å fremstille en kollagensvamp som er luft- og væsketett i den forstand at, med en gang kollagensvampen anvendes på et sår, vil den ikke tillate luft eller væske å trenge gjennom kollagensvampen. Det er et ytterligere formål å tilveiebringe et sårlukkingsmateriale som kan anvendes i gastrointestinale trakter, eller luftrøret.

I et første aspekt av oppfinnelsen tilveiebringes således en fremgangsmåte for å fremstille en kollagensvamp som omfatter trinnene:

- å fremstille en kollagengel,

- å blande luft inn i kollagengelen, for å oppnå et kollagenskum, - å tørke kollagenskummet, for å oppnå en tørr blokk av kollagensvamp som har en tredimensjonal struktur med stablede kamre som er separert og vesentlig omsluttet av

vegger med kollagenmateriale,

- å isolere, fra blokken av kollagensvamp, deler av svamp med en kammerdiameter på mer enn 0,7 5 mm og mindre enn 4 mm, eller deler med en gjennomsnittlig diagonal kammerdimensjon på 3 mm.

I foreliggende sammenheng skal termen «kammerdiameter» forstås som den største rettlinje vegg-til-vegg-avstand i et kammer, dvs. som den største diagonale rett-linje-avstand i et kammer. Kamrene kan ha en polygonal form, så som en oktagonal form.

Det er blitt funnet at en kammerdiameter på mer enn 0,75 mm og mindre enn 4 mm, eller et kammerdiametergjennomsnitt på høyst 3 mm, gjør kollagensvampen spesielt nyttig for belegging med et fibrinlimpreparat. Fortrinnsvis har kollagengelen en tørr masse i området 2-20 mg tørr masse pr. lg gel, så som 4-18 mg, så som 5-13 mg, så som 6-11 mg pr. 1 g gel. Den dynamiske viskositet av kollagengelen er fortrinnsvis 2-20 Nem, så som 4-10 Nem, så som 6-8 Nem. Kollagensvampen har fortrinnsvis et vanninnhold på ikke mer enn 20 %, så som 10-15 %, så som ca. 18 %. Elastisitetsmodulen i kollagensvampen er fortrinnsvis i området 5-100 N/cm<2>, så som 10-50 N/cm<2>, og svampens tetthet er fortrinnsvis 1-10 mg/cm<3>, så som 2-7 mg/cm<3>.

Det er blitt funnet at en kollagensvamp fremstilt ved fremgangsmåten i samsvar med oppfinnelsen er luft- og væsketett på den måten at med en gang svampen benyttes til et sår, vil den ikke tillate luft eller væske, å passere gjennom kollagensvampen. Væsker absorberes i svampen. Denne effekt oppnås primært som følge av det faktum at trinnet med å blande luft inn i kollagengelen tilveiebringer en kollagensvamp som har en tredimensjonal struktur med stablede kamre som er separert og vesentlig omsluttet av vegger med kollagenmateriale, i motsetning til de kjente kollagensvamper

som har en fiberstruktur.

Kollagengelen kan omfatte forskjellige typer materiale, så som type I, II og III fra pattdyr, transgene eller rekombinante kilder, men alle andre typer kollagen kan benyttes. Kollagenet kan omfatte materiale fra sener valgt fra gruppen bestående av ekuine tendoner, humane tendoner og bovine tendoner. Kollagengelen kan i tillegg eller alternativt omfatte rekombinant kollagenmateriale. Kollageninnholdet av de isolerte deler av svamp er fortrinnsvis 50 % - 100 % relatert til tørr masse av svampen, så som 75 % - 100 %, så som 80 % - 100 %, så som 85 % - 100 %, så som 90 % - 100 %, så som 92-100 %, så som 92-98 %, så som 93-97 %, så som 94-96 %.

Trinnet for å fremstille kollagengelen omfatter fortrinnsvis trinnene: - å lagre tendonene ved en temperatur mellom -10 °C og

-30 °C, og å skrelle tendonene,

- å fjerne fremmed protein fra tendonene,

- å redusere bakterieinnholdet i tendonene,

- å svelle tendonene,

- å homogenisere de svellede tendonene.

Trinnene med å lagre, skrelle, fjerne protein, redusere bakterieinnhold og svelle kreves ved rensing av rå-materialet, når trinnet for homogenisering er ønsket ved oppnåelse av kollagenet i gelformen.

Trinnet for reduksjon av bakterieinnhold omfatter fortrinnsvis tilsetning av en syre, sa som en organisk syre, så som en melkesyre til tendonene. Videre tilsettes en organisk løsning, så som en alkohol, så som etanol, fortrinnsvis til tendonene. Videre omfatter trinnet å svelle tendonene fortrinnsvis tilsetning av melkesyre til tendonene. Melkesyren som benyttes kan være en 0,40-0,50 % melkesyre, så som en 0,45 % melkesyre.

Trinnet å svelle tendonene kan omfatte lagring av tendonene ved en temperatur på 4 °C - 25 °C, så som en temperatur på 10 °C - 20 °C, i en periode på 48-200 t, så som en periode på 100-200 t.

Trinnet å homogenisere de svellede tendoner utføres fortrinnsvis slik at det oppnås en partikkelstørrelse av kollagengelfragmenter, dvs. fiberballer, med en diameter på 0,8-1,2 cm, så som ca. 1 cm. Videre er kollagengelens fysikalske karakteristika fortrinnsvis som beskrevet ovenfor. Egnede karakteristika kan f.eks. oppnås ved utføre homogeniseringstrinnet av de svellede tendoner ved hjelp av en tannet diskmølle eller sammenlignbart homogeniseringsutstyr.

Trinnet å blande luft inn i kollagengelen omfatter fortrinnsvis trinnene: å blande omgivelsesluft inn i gelen ved å anvende en blander for å generere et kollagenskum, å putte det blandede gelskum inn i en fraksj oneringskanal, - å separere kollagengel og kollagenskum inneholdt i fraksjoneringskanalen.

Minst noe av kollagengelen som separeres fra kollagenskummet i fraksjoneringskanalen kan føres tilbake til blanderen. I det tilfellet er forholdet mellom mengden av kollagengel som er tilbakeført til blanderen fra fraksjoneringskanalen og mengden av fersk kollagengel som er ført til blanderen fortrinnsvis mellom 0,1 og 0,5. Trinnet å separere kollagengel og kollagenskum omfatter fortrinnsvis trinnene: - å separere en utvalgt del av kollagenskummet inneholdt i fraksjoneringskanalen,

å lede den utvalgte del av kollagenskummet ut fra fraksjoneringskanalen for tørking derav.

I en foretrukket utførelsesform av fremgangsmåten opprettholdes en temperatur på 15 °C til 40 °C, så som 20 °C til 25 °C, i fraksjoneringskanalen.

Etter å ha blandet luft inn i kollagengelen, kan kollagengelen homogeniseres i en periode på 2-4 min.

Før trinnet å tørke kollagenskummet og etter trinnet å blande luft inn i kollagengelen, kan en nøytralisator tilsettes til kollagenskummet, og kollagenskummet nøytraliseres fortrinnsvis for å komme fra en pH-verdi på vanligvis mellom 2,5 og 3,5 til en pH-verdi i kollagenskummet på mellom 6,5 og 8,5. En nøytralisator omfattende en ammoniakkløsning kan benyttes, og kollagenskummet nøytraliseres fortrinnsvis i en periode på 5-30 t, så som 10-20 t, så som ca. 24 t.

For trinnet å tørke kollagenskummet, fylles kollagenskummet fortrinnsvis inn i en tørkebeholder på en slik måte at hovedsakelig ingen luft trekkes inn i skummet under fylling.

Trinnet å tørke omfatter fortrinnsvis tørking ved en temperatur av mellom 15 °C og 60 °C, så som mellom 20 °C og 40 °C, i en periode på 50-200 t, for å oppnå en tørr kollagensvamp. Tørkingen kan utføres ved et trykk litt under atmosfærisk trykk, så som ved et trykk på mellom 700 og 900 mbar, så som ca. 800 mbar.

Kollagensvampen produsert ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen oppfyller fortrinnsvis minst ett av de følgende kriterier:

pH-verdi mellom 5,0 og 6,0,

- melkesyreinnhold på høyst 5 %,

- ammoniuminnhold på høyst 0,5 %

- løselig proteininnhold, kalkulert som albumininnhold, på høyst 0,5 %,

- sulfataskeinnhold på høyst 1,0 %,

- tungmetallinnhold på høyst 20 ppm,

- mikrobiologisk renhet, på høyst IO<3>CFU/g,

- kollageninnhold på 75-100 %,

tetthet på 1-10 mg/cm<3>, så som 2-7 mg/cm<3>,

- elastisitetsmodul i området fra 5-100 N/cm<2>,

så som 10-50 N/cm<2>.

Trinnet å isolere deler av kollagensvamp kan omfatte å dele opp kollagensvampen i en rekke deler ved skjæring. Delene som oppnås kan formes i enhver ønsket form, så som konisk, sylindrisk, inkludert sylindrisk med et annulært tverrsnitt, rektangulær, polygonal, kubisk og flate ark, eller de kan omformes til et granulat ved en egnet granuleringsmetode, etc.

En kollagensvamp kan også fremstilles ved en fremgangsmåte som omfatter trinnene:

- å fremstille en kollagengel,

- å blande luft inn i kollagengelen, for å oppnå et kollagenskum, - å tørke kollagenskummet, for å oppnå en tørr blokk av kollagensvamp som har kamre deri, å isolere, fra kollagensvampen, deler av svampen

som har de følgende egenskaper:

- elastisitetsmodul i området fra 5-100 N/cm<2>,

- tetthet i området fra 1-10 mg/cm<3>,

- kammerdiameter på mer enn 0,75 mm og mindre enn 4 mm, eller et kammerdiametergjennomsnitt på høyst 3 mm.

Det skal forstås at et hvert og alle trinn ved fremgangsmåten ifølge det første aspekt av oppfinnelsen også kan utføres i fremgangsmåten beskrevet over. Videre kan hvilket som heist og alle karakteristikker og trekk ved kollagensvampen fremstilt ved fremgangsmåten i følge det første aspekt av oppfinnelsen også oppnås ved fremgangsmåten beskrevet over.

Ifølge foreliggende oppfinnelse kan det anvendes en anordning for å ekstrahere en del av et kollagenskum og for å degenerere en annen del av kollagenskummet til en kollagengel, der anordningen omfatter: - en fraksjoneringskanal som omfatter et innløp for å motta en strøm av kollagenskum, et utløp for en del av kollagenskumstrommen, og en bunndel som er skrånende nedover i retningen av kollagen-skumstrømmen,

minst ett utløp for kollagengelen ved bunndelen av fraksjoneringskanalen,

hvori posisjonen til utløpet er flyttbar i en vertikal retning ved en ende av fraksjoneringskanalen.

Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen kan tilveiebringe

en forlenget kollagensvamp som har et gjennomgående hull eller utboring og en fleksibel vegg. I en foretrukket utførelsesform kan en slik kollagensvamp anvendes for å lukke sår eller reetablere gastrointestinal trakt- og luftrørvegger hos pattedyr.

Således kan kollagensvampen ha sirkulær eller ellip-

tisk tverrsnitt. Kollagensvampen kan anvendes både som en fylling, eller som i en gastrointestinal trakt,

eller som et ytre omslag anvendt på en ytre overflate av en gastrointestinal trakt.

Innerdiameteren til det gjennomgående hullet eller utboringen for applikasjon i forskjellige humane gastrointestinale trakter eller luftrør kan f.eks.

være som følger:

Tarmer: 0,5-6 cm

Rektum: 1-4 cm

Tykktarm: 2-6 cm

Tynntarm: 0,5-3 cm

Spiserør: 0,5-2 cm

Luftrør: 1-4 cm

Kollagensvampen kan f.eks. anvendes for å lukke sår etter kirurgisk fjerning av utposninger på gastrointestintrakt-vegger så som etter rektal kirurgi, så som etter kirurgisk fjerning av hemorroider. Eksempler på indikasjoner som er mulige med kollagensvampen er:

- sårbandasje,

- støtte for hemostase, så som:

- svak, diffus blødning fra parenkymatiske organer, kirurgiske prosedyrer pd kirurgilokasjoner hvor ektrokirurgi eller ligering er utført for applisering av kollagensvampen, - forhindring av ny blødning (sikring av sting),

- applikasjon på brannskader,

- bandasje på topikale skader,

- medikamentlevering, så som levering av anti-biotika .

KORT BESKRIVELSE AV FIGURENE

Figurene 1 og 2 inneholder et flytdiagram som illustrerer trinnene som er involvert i en foretrukket utførelsesform av fremgangsmåten i følge oppfinnelsen. Fig. 3 er et fotografi av overflaten av en kollagensvamp fremstilt ved en fremgangsmåte ifølge oppfinnelsen (til disposisjon fra Prof. Dr. Roman Carbon, Chirurgische Univ. Klinik Erlangen, Tyskland). Fig. 4 beskriver en omrøringsanordning for å oppnå en måling av viskositeten til en kollagengel.

I en foretrukket utførelse omfatter oppfinnelsen de følgende trinn som illustrert i figur 1 og 2: Trinn 1: Levering av dypfrosne hestetendoner Hestetendonene er levert og lagret ved -18 °C til -25 °C.

Trinn 2: Skrelling av hestetendoner

I halvfrossen tilstand fjernes det tynne skinnet fra tendonene manuelt eller mekanisk med en kniv. Tendonene dypfryses deretter igjen ved -18 °C til -25 °C.

Trinn 3: Mekanisk skjæring av skrellede hestetendoner Valgfritt desinfiseres skrellede frosne tendoner i 30 min. i 70 % etanol, og føres til produksjonsrommet under etanol. Tendonene vaskes deretter, og etter vasking blir tendonene presset til blokker og dypfryses ved -18 °C til -25 °C. De frosne tendonblokkene skjæres deretter i skiver som har en tykkelse på ca. 1 mm med en kuttemaskin med en roterende kniv.

Trinn 4: Vasking og desinfisering av tendonskivene

For å fjerne løselige proteiner senkes tendonskivene først i vann for injisering i 3-6 timer, vaskes deretter med vann for injisering eller demineralisert vann eller salt-løsninger som inneholder Ca<2+>og/eller Mg<2+->ion i området fra 1-10 mM, inntil supernatanten er fri for hemoglobin. Tendonskivene desinfiseres deretter i 70 % etanol i 15 min., og vaskes 2 ganger i 0,45 % melkesyre i drikkevann (sterilfiltrert og depyrogenisert) for å fjerne etanolen.

Trinn 5: Fremstilling av kollagengel

De vaskede tendonskiver senkes i 0,45 % melkesyre i 2-5 dager, fortrinnsvis 4 dager, og homogeniseres deretter til en kollagengel. Eksponeringen for 0,45 % melkesyre antas å være ett av hovedvirusinaktiveringstrinnene.

Trinn 6: Skumming

Med oppløsningsomrørere blir sterilfiltrert luft pisket inn i kollagengelen. Det oppståtte skum fraksjoneres, og fraksjonen med en boblestørrelse på 1-3 mm oppsamles. Skummet helles fra stålbeholderen inn i en trommel som langsomt roteres i ca. 3 min. for å oppnå et homogent skum. Dette skum fylles på tørkebeholdere. Beholderens bunn består av en tekstilvev som er gjennomtrengelig for væsker, for å tillate drenering av skummet. Etter 5-24 t, fortrinnsvis 18-24 t, blir det drenerte skum eksponert for ammoniakkgass, f.eks. generert fra en 26 % ammoniakkløsning av DAB-kvalitet. Under denne prosess forskyver ammoniakk-overskuddet skummets pH til det alkaliske området. Ammoniakk fjernes under den etterfølgende tørkeprosess som resulterer i et nøytralt produkt.

Trinn 7: Tørking av skummet

Skummet tørkes i varm luft i et høygrads-ståltørkekammer i 48-150 t, fortrinnsvis 120-150 t. Resultatet er kollagensvamp formet i blokker.

Trinn 8: Oppskjæring av kollagenblokkene

Blokker, også referert til som ark, av kollagen kan f.eks. anvendes som bærere for en belegging. Oppkuttingen utføres med en vertikal skjæremaskin. Først blir sidene av blokkene kuttet av for å gi en blokk med vertikale sider med en sidelengde på 50 cm. Denne blokk kuttes deretter vertikalt i 4 stykker med en bredde på 11 cm. Stykkene blir igjen beskåret ved deres øvre og deres nedre side, og deretter skåret i strimler med dimensjoner på 50 x 11 x 0,4-0,7 cm. Vekten av kollagensvampstrimlene tas fortrinnsvis med i beregningen av enhver spesifikasjon av kollagen i sluttproduktet som skal oppnås, så som TachoComb® H, TachoComb® og Tachotop®.

Trinn 9: Sortering av kollagensvampstrimlene Kollagensvampstrimlene blir igjen gjenstand for en visuell kontroll. Strimler med en eller flere av de følgende defekter, vrakes: - strimler med en gjennomsnittskammerdiameter mindre enn 1 mm eller større enn 3 mm,

- strimler med ikke-homogen kammerstruktur,

- strimler med hull (enkle kamre med en dybde større enn tykkelsen på svampen).

De sorterte strimlene lagres i maks. 1 år i desinfiserte lettmetallbeholder ved en temperatur på 15-25 °C.

Fig. 3 er et fotografi av overflaten av en kollagensvamp fremstilt ved en fremgangsmåte ifølge oppfinnelsen, fotografiet er tatt med en forstørrelsesfaktor på omtrent 20.000 (takket være Prof. Dr. Roman Carbon, Chirurgische Univ. Klinik Erlangen, Tyskland). Overflaten vist på fotografiet i Fig. 3, er en overflate av et tverrsnitts-kutt i en kollagensvamp fremstilt med en fremgangsmåte ifølge foreliggende oppfinnelse. De mørke områdene på fotografiet representerer kamre, mens de lyse områder på fotografiet representerer kollagenmateriale, inkludert vegger av kollagenmateriale som separerer kamrene.

Fig. 4 viser en omrøringsanordning for å oppnå et mål på viskositet av en væske, omfattende en beholder tilpasset for å ha plass til en væske og midler for å omrøre nevnte væske. Omrøringsanordningene omfatter en stang festet til et gaffelformet element. En væske i beholderen omrøres ved å påføre et moment mot stangen, som resulterer i en roterende bevegelse i det gaffelformede element. Det gaffelformede element omfatter en primær del 41, til hvilken stangen er festet og en første og en andre sekundær del 42. De sekundære deler er festet til endene av den primære del. Idet det gaffelformede element roterer, flytter overflatene væsken og omrører således væsken.

I en utførelsesform har anordningen de følgende dimensjoner. Beholderen er 110 mm høy og 146 mm bred. Stangen er 220 mm høy og har en diameter på 10 mm. Primærdelen 41 av gaffelen er 90 mm lang og 30 mm bred. De sekundære deler 42 er 90 mm høye og 30 mm brede. Avstanden fra en ytre kant av de sekundære deler 42 til en indre overflate av beholderen er 28 mm.

Eksempel 1

Tabell I nedenfor viser parameterverdier fra 3 forskjellige sykluser ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen. Tabell II nedenfor viser parameterverdier for 3 forskjellige kollagensvamper oppnådd ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen.

Eksempel II

Dette eksempel vedrører den indirekte måling av viskositeten av kollagen ved torque-måling.

Utstyret som anvendes for torque-målingen er:

- Omrøringsmaskin: EUROSTAR POWER kontroll-visk.

- Windows-Software: IKASOFT dc.

- Torque-indikator: VISCOKLICK VK 1.

- Datalogger DC 2.

- Spesial-omrøringskonstruksjon («gaffel») med

definerte dimensjoner, ref. Fig. 4.

- Trakt med en innerdiameter på 14,6 cm og en høyde på 20,5 cm.

- Termometer.

- Vekt.

En mengde på 1500 g kollagengel fylles i trakten. Temperaturen for prøven er 23 °C: «Gaffel»-omrøreren festes til senter av trakten. Deretter starter måling. Torqueindikatoren omformer motstanden fra omrøreren til en verdi (Nem) som representerer den dynamiske gelviskositeten.

For å verifisere målingen av torque'en, fremstilles en standardløsning med 59 % polyetylenglykol. Viskositet for denne løsning måles med et Haake Viskosimeter RV 20 Roto-visko. Den dynamiske viskositeten til denne løsningen er i området = 925 + 25 mPas ved 23 °C. Denne løsnings-viskositeten måles av det overfor nevnte gelmålingsutstyr, og torque-verdien som dermed måles, skulle være i området fra 3,66 Nem ± 5 % ved 23 °C.

REFERANSER

1. Baer, E. Gathercole, L.J. and keiler, A., structure hierarchies in tendon collagen: en interim summary, Prof. Colston Conf., 1974, 89; Hiltner, A. Cassidy, J.J. og Baer, E., Mechanical properties of biological polymers, Ann. Rev. Mater. Sei., 15, 455, 1985.

Claims

1. Fremgangsmåte for å fremstille en kollagensvamp,karakterisert vedat den omfatter trinnene: - å fremstille en kollagengel, - å blande luft inn i kollagengelen, for å oppnå et kollagenskum, - å tørke kollagenskummet, for å oppnå en tørr blokk av kollagensvamp som har en tredimensjonal struktur med stablede kamre som er separert og vesentlig omsluttet av vegger med kollagenmateriale, - å isolere, fra blokken av kollagensvamp, deler av svamp med en kammerdiameter på mer enn 0,75 mm og mindre enn 4 mm, eller deler med en gjennomsnittlig diagonal kammerdimensjon på 3 mm.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisertved at kollageninnholdet i de isolerte deler av svampen er 50-100 %.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 2,karakterisert vedat kollagengelen omfatter kollagenmateriale av forskjellige typer fra minst én av de følgende kilder: pattedyr, transgene og rekombinante kilder.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 3,karakterisertved at kollagenet omfatter materiale fra tendoner valgt fra gruppen bestående av: ekuine tendoner, bovine tendoner og humane tendoner.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 3 eller 4,karakterisert vedat trinnet for å fremstille kollagengelen omfatter trinnene: - å lagre tendonene ved en temperatur mellom -10 °C og -30 °C, og å skrelle tendonene, - å fjerne fremmed protein fra tendonene, - å redusere bakterieinnhold i tendonene, - å svelle tendonene, - å homogenisere de svellede tendonene.

6. Fremgangsmåte ifølge 5,karakterisert vedat trinnet å redusere bakterieinnhold omfatter tilsetning av en syre og en organisk løsning til tendonene.

7. Fremgangsmåte ifølge krav 6,karakterisertved at syren er en organisk syre, så som melkesyre.

8. Fremgangsmåte ifølge krav 6 eller 7,karakterisert vedat den organiske løsning er en alkohol, så som etanol.

9. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av krav 5-8,karakterisert vedat trinnet å svelle tendonene omfatter tilsetning av melkesyre til tendonene.

10. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av krav 5-9,karakterisert vedat syren har en pH-verdi i området fra 1-4, så som 1,5-3,5, så som 2,5-3,0.

11. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av krav 5-10,karakterisert vedat melkesyren er en 0,45 % melkesyre.

12. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 5-11,karakterisert vedat trinnet å svelle tendonene omfatter lagring av tendonene ved en temperatur på 4 °C - 25 °C i en periode på 48-200 t.

13. Fremgangsmåte ifølge krav 12,karakterisertved at tendonene lagres i en periode på 100-120 t.

14. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 5- 13,karakterisert vedat trinnet å homogenisere de svellede tendoner omfatter oppnåelse av en substans som omfatter partikler av tendoner, hvor partiklene har en lengde eller diameter på 0,8-1,2 cm.

15. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 5-15,karakterisert vedat trinnet å homogenisere de svellede tendoner omfatter oppnåelse av en substans som har en viskositet på 2-20 Nem.

16. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 5-15,karakterisert vedat trinnet å homogenisere de svellede tendoner utføres med en tannet diskmølle eller sammenlignbart utstyr.

17. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av de foregående krav,karakterisert vedat kollagengelen har en dynamisk viskositet på 2-20 Nem.

18. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av de foregående krav,karakterisert vedat trinnet å blande luft inn i kollagengelen omfatter trinnene: - å blande omgivelsesluft inn i gelen med en blander for å generere et kollagenskum, - å føre det blandede gelskum inn i en fraksjoneringskanal, - å separere kollagengel og kollagenskum inneholdt i fraksj oneringskanalen.

19. Fremgangsmåte ifølge krav 18,karakterisertved at minst noe av kollagengelen som separeres fra kollagenskummet i fraksjoneringskanalen føres tilbake til blanderen.

20. Fremgangsmåte ifølge krav 19,karakterisert vedat forholdet mellom mengden av kollagengel som er tilbakeført til blanderen fra fraksjoneringskanalen og mengden av fersk kollagengel som er ført til blanderen er mellom 0,1 og 0,5.

21. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 18-20,karakterisert vedat trinnet å separere kollagengel og kollagenskum omfatter trinnene: - å separere en utvalgt del av kollagenskummet inneholdt i fraksjoneringskanalen, - å lede den utvalgte del av kollagenskummet ut fra fraksjoneringskanalen for tørking derav.

22. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 18-21,karakterisert vedat den videre omfatter oppnåelse av en temperatur mellom 15 °C og 40 °C i fraksjoneringskanalen.

23. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av de foregående krav,karakterisert vedat den videre omfatter, etter blanding av luft inn i kollagengelen, å homogenisere kollagenskummet i en periode på 2-4 min.

24. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av de foregående krav,karakterisert vedat den videre omfatter, før trinnet å tørke kollagenskummet og etter trinnet å blande luft inn i kollagengelen, å tilsette en nøytralisator til kollagenskummet og nøytralisere kollagenskummet for å oppnå en pH-verdi i kollagenskummet mellom 6,5 og 8,5.

25. Fremgangsmåte ifølge krav 24,karakterisert vedat nøytralisatoren omfatter en ammoniakkløsning.

26. Fremgangsmåte ifølge krav 24 eller 25,karakterisert vedat kollagenskummet er nøytralisert i en periode på 5-30 t.

27. Fremgangsmåte ifølge krav 26,karakterisertved at kollagenskummet er nøytralisert i en periode på 20-30 t.

28. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av de foregående krav,karakterisert vedat trinnet å tørke omfatter tørking ved en temperatur mellom 15 °C og 60 °C i en periode på 48-200 t, for å oppnå en tørr kollagensvamp.

29. Fremgangsmåte ifølge krav 28,karakterisert vedat trinnet å tørke utføres ved et trykk på 700-900 mbar.

30. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av de foregående krav,karakterisert vedat trinnet å tørke omfatter tørking ved en temperatur mellom 15 °C og 40 °C i en periode på 100-200 t.

31. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av de foregående krav,karakterisert vedat kollagensvampen oppfyller minst ett av de følgende kriterier: - pH-verdi mellom 5,0 og 6,0, - melkesyreinnhold på høyst 5 %, - ammoniuminnhold på høyst 0,5 % - løselig proteininnhold, kalkulert som albumininnhold, på høyst 0,5 %, - sulfataskeinnhold på høyst 1,0 %, - tungmetallinnhold på høyst 20 ppm, - mikrobiologisk renhet, på høyst IO<3>CFU/g, - kollageninnhold på 75-100 %, - tetthet på 1-10 mg/cm<3>, - elastisitetsmodul i området fra 5-100 N/cm<2>.

32. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av de foregående krav,karakterisert vedat kollagensvampen har et vanninnhold på ikke mer enn 20 %.

33. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av de foregående krav,karakterisert vedat trinnet å isolere deler av kollagensvamp omfatter å dele kollagensvampen i en rekke deler ved skjæring.