DE69906047T2

DE69906047T2 - Vollständig rekombinanter gewebekleber

Info

Publication number: DE69906047T2
Application number: DE69906047T
Authority: DE
Inventors: D. Bishop; A. Brown; Gerald Lasser; B. Lewis
Original assignee: Zymogenetics Inc
Current assignee: Zymogenetics Inc
Priority date: 1998-05-01
Filing date: 1999-04-30
Publication date: 2003-10-16
Anticipated expiration: 2019-05-01
Also published as: JP4468577B2; ATE234642T1; CA2330972C; WO1999056797A9; AU3873499A; CA2330972A1; EP1073485B1; DE69906047D1; WO1999056797A1; JP2002513644A; EP1073485A1

Description

Diese Erfindung betrifft einen rekombinanten humanen Fibrinkleber bzw. ein rekombinantes humanes Fibrindichtungsmittel (rhFS), der/das rekombinantes humanes Fibrinogen (rhFbgn), rekombinantes humanes Thrombin (rhThrombin) und wahlweise rekombinanten humanen FXIII umfasst.
Fibrinkleber bzw. Fibrindichtungsmittel (FS) ist ein Gemisch von drei Proteinkomponenten: Fibrinogen (Fbgn), Thrombin und Faktor XIII (FXIII). Fbgn bildet die strukturelle Matrix des Dichtungsmittels bzw. Klebers und liegt in der größten Konzentration vor. Thrombin und FXIII sind Enzyme und liegen in viel niedrigeren Konzentrationen vor. Existierender FS wird hergestellt unter Verwendung von Fbgn, gereinigt von bzw. aufbereitet aus menschlichem Blut, und Thrombin, gereinigt von bzw. aufbereitet aus Bovin oder menschlichen Quellen. Fbgn für kommerziellen FS wird aus vereinigtem Plasma erhalten, aber Fbgn für FS wird auch gereinigt von bzw. aufbereitet aus Einfachdonorquellen und autologen Quellen durch viele Blutbanken. Unabhängig von der Quelle der Komponenten wird FS üblicherweise in Form von zwei Lösungen formuliert: Fbgn + FXIII und Thrombin + CaCl&sub2;. Beim Mischen setzt das Thrombin Fbgn zu Fibrin (Fbn) um und polymerisiert unter Bildung eines Gels. Thrombin setzt auch die zymogene (inaktive) Form von FXIII in die aktive Form um, die in der Anwesenheit von Calcium die polymerisierten Fbn-Moleküle kovalent vernetzt, um das Gel zu festigen und seine physikalischen Eigenschaften zu modifizieren (Abb. 1). Wenn Fbgn aus humanem Plasma aufbereitet wird, wird FXIII normalerweise als eine Verunreinigung von Fbgn mit aufberei tet (FS, das aus von Blut erhaltenem Fbgn hergestellt wird, kann auch andere Proteine wie Fibronectin (FN) und Wachstumsfaktoren als Verunreinigungen enthalten).
Die vorliegende Erfindung liefert einen vollständig rekombinanten Fibrinkleber bzw. ein vollständig rekombinantes Fibrindichtungsmittel (rhFS), umfassend rekombinantes humanes Fbgn (rhFbgn), rekombinantes humanes Thrombin (rhThrombin) und wahlweise rekombinanten humanen FXIII (rhFXIII) (zymogen oder aktiv). Rekombinanter humaner Fibrinkleber (rhFS) ist eine Alternative zu existierenden Fibrinklebern (FS), die aus nicht rekombinanten Bestandteilen erhalten werden.
rhFS ist frei von anderen Plasmaproteinen einschließlich Fibronectin, von Willebrand- Faktor, Plasminogen, Serumalbumin und Immunoglobulin, von denen zumindest einige aus praktischen Gründen immer in Fibrinklebern vorliegen, die aus Plasma erhalten werben, da sie aus dem Plasma durch weitgehend unselektive Ausfall ungstechniken erhalten werden. Bevor die vorliegende Erfindung gemacht wurde, war nicht bekannt ob Fibringele bei der vollständigen Abwesenheit dieser Komponenten gebildet werden könnten und es wurde nun festgestellt, dass dies möglich ist.
Der erfindungsgemäße FS kann bei der Behandlung eines Patienten verwendet werden, der sich in einem Zustand befindet, in dem ein Fibringel erforderlich ist, das Behandlungsverfahren umfassend die Verabreichung einer wirksamen Menge eines rekombinanten humanen Fibrinklebers (rhFS) an den Patienten, wie oben beschrieben wurde. ("Behandlung" beinhaltet "Prophylaxe" oder "Vorbeugung" unter geeigneten Umständen.) Der rhFS kann für die entsprechenden Umstände und Eigenschaften des Zustandes maßgeschneidert sein und es ist ein Vorteil der Erfindung, dass rhFS verlässlich und wiederholbar in verschiedenen Ausführungsformen für verschiedene Zwecke formuliert werden kann.
Gemäß eines ersten Aspekts liefert die Erfindung ein Verfahren für die Herstellung eines Fibrinklebers bzw. Fibrindichtungsmittels, umfassend das Mischen eines humanen rekombinanten Fibrinogens, eines rekombinanten humanen Thrombins, eines rekombinanten humanen Faktors XIII und von Calciumionen, wobei das Fibrinogen in Lösung in einer Konzentration von 20-30 mg/ml vorliegt, der Faktor XIII in Lösung in einer Konzentration von 3-10 ug/mg Fibrinogen vorliegt, Thrombin in der Lösung in einer Konzentration von 5-300 I. E./ml vorliegt und die Calciumionen in der Lösung in einer Konzentration von 5-20 mM vorliegen.
In einer spezifischen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird Saccharose in einer Konzentration von etwa 4,5% mit Fibrinogen, Faktor XIII, Thrombin und Calcium gemischt.
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens beträgt die Fibrinogenkonzentration 30 mg/ml, die Konzentration des Faktors XIII 10 ug/mg Fibrinogen, liegt Thrombin in der Lösung in einer Konzentration von 250-300 I. E./ml vor und liegen die Calciumionen in der Lösung in einer Konzentration von 20 mM vor. Wahlweise wird Saccharose auch bei einer Konzentration von etwa 4,5% mit Fibrinogen, Faktor XIII, Thrombin und Calcium gemischt.
Ein zweiter Aspekt der Erfindung liefert einen Fibrinkleber bzw. ein Fibrindichtungsmittel, umfassend ein humanes, rekombinantes Fibrinogen, ein rekombinantes, humanes Thrombin, einen rekombinanten humanen Faktor XIII und Calciumionen, wobei Fibrinogen in der Lösung in einer Konzentration von 20-30 mg/ml vorliegt, der Faktor XIII in der Lösung in einer Konzentration von 3-10 ug/mg Fibrinogen vorliegt, Thrombin in der Lösung in einer Konzentration von 5-300 I. E./ml vorliegt und die Calciumionen in der Lösung in einer Konzentration von 5-20 mM vorliegen.
In einer spezifischen Ausführungsform der Erfindung umfasst der Fibrinkleber weiterhin Saccharose in einer Konzentration von etwa 4,5% mit Fibrinogen, Faktor XIII, Thrombin und Calcium.
In einer bevorzugten Ausführungsform liefert die Erfindung einen Fibrinkleber, wobei die Konzentration von Fibrinogen 30 mg/ml beträgt, die Konzentration von Faktor XIII 10 ug/mg Fibrinogen beträgt, Thrombin in der Lösung in einer Konzentration von 250-300 I. E./ml vorliegt und die Calciumionen in der Lösung in einer Konzentration von 20 mM vorliegen. Wahlweise kann der Fibrinkleber zusätzlich Saccharose in einer Konzentration von etwa 4,5% bezüglich Fibrinogen, Faktor XIII, Thrombin und Calcium umfassen.
Bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung werden nun eingehender beschrieben. Bezug genommen wird auf die beigefügten Zeichnungen:
Abb. 1 zeigt den biochemischen Mechanismus, durch den Fbgn, Thrombin und FXIII unter Bildung von FS kombinieren. Beim Mischen setzt Thrombin Fbgn zu Fibrin (Fbn) um, das unter Bildung eines Gels polymerisiert. Thrombin setzt auch die zymogene (inaktive) Form von FXIII in die aktive Form um, die in der Anwesenheit von Calcium die polymerisierten Fbn-Moleküle kovalent vernetzt, um das Gel zu festigen und seine physikalischen Eigenschaften zu modifizieren.
Abb. 2 zeigt Profile der optischen Dichte, die die Gelbildung von rhFbgn und aus Plasma erhaltenem Fbgn (hFbgn) und von Fbgn aus kommerziellem FS (TISSEEL®) zeigen. Diese Darstellungen zeigen, dass Fbgn aus unterschiedlichen Quellen unter identischen Probenbedingungen bzw. Ansatzbedingungen ein unterschiedliches Verhalten aufweisen. Bedingungen der TBS-Probe (20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 120 mM NaCl) 0,2 mg/ml Fbgn, 0,5 E/ml rhThrombin und 2,7 ug rhFXIII/mg rhFbgn, zugegebenen zum rhFbgn, um näherungsweise FXIII-Anteile zu normieren.
Abb. 3 zeigt Messungen, die verwendet werden, um rhFS unter Verwendung von mechanischen Messungen (Thromboelastographie) und optischen Messungen (UV- Vis) zu charakterisieren. Beide Techniken liefern Informationen bezüglich der Gelbildungsgeschwindigkeit und den abschließenden Eigenschaften von rhFS und können verwendet werden, um die Wirkung der Proteinformulierung und der Pufferkomponenten auf die Eigenschaften des rekombinanten Fibrinklebers zu bewerten. Üblicherweise delektieren optische Messungen die Gelbildung früher als mechanische Messungen. Bedingungen des Ansatzes: 20 mM Tris- HCl, pH 7,4, 250 mM NaCl, 5% Saccharose, 20 mM CaCl&sub2;, 3,0 mg/ml rhFbgn, 1,0 E/ml rhThrombin, 3 ug rhFXIII/mg rhFbgn, 37ºC. Die optischen Messungen wurden unter Verwendung einer Küvette mit einer Weglänge von 1 mm vorgenommen.
Abb. 4 zeigt eine Darstellung, die die Wirkung von rhFXIII auf die adhäsive Zugfestigkeit bzw. Zughaftfestigkeit von rhFS demonstriert, der an Silastic (Silikongummi medizinischer Qualität) und mehrteiliger Kalbshaut anhaftet. Die geklebten Teile bzw. die Klebstoffträger wurden zu Scheiben mit einem Durchmesser von 2 cm verarbeitet und an individuell angefertigte Edelstahleinspannvorrichtungen mit Epoxidharz geklebt. Abstandshalter wurden zwischen der oberen und unteren Einspannvorrichtung verwendet, um eine bekannte Dicke von rhFS zu erzeugen, die gesehen werden konnte, so dass das Fehlverhalten (kohäsiv gegenüber adhäsiv) festgestellt werden konnte. Die Endzugfestigkeit bzw. Grenzzugfestigkeit (UTS) wird als die Bruchkraft bzw. Reißkraft angegeben, normiert auf die Oberfläche von rhFS. Bedingungen der Probe bzw. des Ansatzes: TBS (20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 120 mM NaCl), 20 mM oder 5 mM CaCl&sub2; (Silastic bzw. Kalbshaut), 30 mg/ml rhFibrinogen, 1,0 E/ml oder 0,5 E/ml rhThrombin (Silastic bzw. Kalbshaut) und 10 ug oder 5 ug rhFXIII/mg rhFbgn (Silastic bzw. Kalbshaut). Die Proben wurden für 30 Minuten bei 37ºC inhibiert und mit 5,0 mm/Minute oder 2,5 mm/Minute auseinander gezogen (Silastic bzw. Kalbshaut).
Abb. 5 ist eine Darstellung, die die Wirkung der Fbgn-Konzentration auf das Verdichtungsverhalten von FS zeigt. Das Verhalten von FS unter Verwendung von aus Plasma erhaltenem Fbgn und von rhFbgn wird verglichen. Die Daten werden als prozentualer Wert des ursprünglichen Volumens angegeben, das durch den Kleber nach dem Zentrifugieren eingenommen wird. Bedingungen des Ansatzes bzw. der Probe: TBS (20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 120 mM NaCl), 5 mM CaCl&sub2;, 2,5 bis 15 mg/ml Fbgn, 0,5 E/ml rhThrombin und 10 ug ml/rhFXIII (nur dem rhFbgn zugegeben). Die Proben wurden für eine Stunde bei 37ºC inkubiert, bevor sie für 45 Sekunden bei 8000 xg zentrifugiert wurden.
Abb. 6 ist eine Darstellung, die die Wirkung von zugegebenem Salz (zunehmende Ionenstärke) und zugegebenem Sorbitol auf das Verdichtungsverhalten von rhFS zeigt. Das Verhalten von FS unter Verwendung von aus Plasma erhaltenem humanem Fbgn (hFbgn) wird als Referenz gezeigt. Die Daten werden als prozentualer Wert des ursprünglichen Volumens aufgetragen, das durch den Kleber nach dem Zentrifugieren eingenommen wird. Bedingungen der Probe: TBS (20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 120 mM NaCl), 5 mM CaCl&sub2;, 2,5 bis 15 mg/ml Fbgn, 0,5 E/ml rhThrombin und 67 ug rhFXIII/mg rhFbgn (nur rhFbgn zugegeben). Die Proben wurden für eine Stunde bei 37ºC inkubiert, bevor sie für 45 Sekunden bei 8000 xg zentrifugiert wurden.
Abb. 7 ist ein Diagramm, das das Verhältnis zwischen Steifheit, gemessen durch TEG, und Opazität von rhFS über einen weiten Bereich von Pufferbedingungen und rhThrombin-Konzentrationen veranschaulicht. Die Eigenschaften von rekombinantem und aus Plasma erhaltenem FS in TBS und die allgemeinen Wirkungen von Formulierungsänderungen werden in dem Diagramm angegeben. Am Grenzwert niedriger Opazität (feines Gel) wird das Gel brüchig und das mechanische Verhalten des Gels verschlechtert sich schnell. Bedingungen des Ansatzes: 20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 120 bis 500 mM NaCl, 0 bis 9% Saccharose, 20 mM CaCl&sub2;, 3,0 mg/ml rhFibrinogen, 1,0-1,4 E/ml rhThrombin, 3 ug rhFXIII/mg rhFbgn, 37ºC. Die optischen Messungen wurden unter Verwendung einer Küvette mit einer Weglänge von 1 mm vorgenommen.
Abb. 8 zeigt eine visuelle Demonstration des Übergangs der Struktur von rhFS von einer groben Gelstruktur zu einer feinen Gelstruktur, wenn die Ionenstärke oder die Saccharosekonzentration des Formulierungspuffers erhöht wird. Bedingungen der Probe bzw. des Ansatzes: TBS (20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 120-250 mM NaCl), 4,5% Saccharose, 20 mM CaCl&sub2;, 23,7 mg/ml rhFbgn, 1 E/ml rhThrombin, 10 ug/rhFXIII/mg rhFbgn, 37ºC.
Abb. 9 veranschaulicht den offenbarten Bereich von FXIII-Konzentrationen in kommerziellem FS (Radosevich et al. 1997, Jackson et al. 1996). Die rhFXIII-Konzentration wurde als Verhältnis von FXIII zu Fbgn (E/mg) aufgetragen. Zum Vergleich mit den Daten im Rest dieses Berichts: 1 Einheit = 10 ug/FXIII (Yorifuji et al., 1988). Unter der Annahme von 1 E/ml/FXIII und 2,5 mg/ml Fbgn beträgt das Verhältnis von FXIII zu Fbgn in normalem humanem Plasma etwa 0,4 E/mg.
Abb. 10 ist eine Darstellung, die die Wirkung von zugegebenem rhFXIII und zugegebener Saccharose auf das Verdichtungsverhalten von rhFS zeigt. Das Verhalten von FS unter Verwendung von aus Plasma erhaltenem Fbgn (hFbgn) wird als Referenz angegeben. Die Daten werden als prozentualer Wert des ursprünglichen Volumens aufgetragen, das durch den Kleber nach dem Zentrifugieren eingenommen wird. Die rhFXIII-Konzentration wird als Verhältnis von rhFXIII zu rhFibrinogen (ug/mg) angegeben. Bedingungen der Probe: TBS (20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 120 mM CaCl&sub2;, 2,5 mg/ml rhFbgn, 0,5 E/ml rhThrombin). Die Proben wurden rar eine Stunde bei 37ºC inkubiert, bevor sie für 45 Sekunden bei 8000 xg zentrifugiert wurden.
Abb. 11 ist eine Darstellung, die den konzentrationsabhängigen Effekt von rhEXIII auf die Entwicklung der mechanischen und optischen Eigenschaften von rhFS zeigt, die durch Thromboelastographie (TEG) und UV-Vis-Spektroskopie gemessen wurden. Bedingungen des Ansatzes: TBS (20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 120 mM NaCl), 4,5% Saccharose, 20 mM CaCl&sub2;, 3,0 mg/ml rhFbgn, 1,0 E/ml rhThrombin, 37ºC. Die rhFXIII-Konzentration wird als Verhältnis von rhFXI- II zu rhFbgn angegeben (ug/mg). Die optischen Messungen wurden unter Verwendung einer Küvette mit einer Weglänge von 1 mm vorgenommen.
Abb. 12 ist eine Darstellung, die den konzentrationsabhängigen Effekt von rhFXIII auf die mechanischen Eigenschaften von rhFS zeigt, die durch TEG bestimmt wurden. Bedingungen der Probe: TBS (20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 120 mM NaCl), 4,5% Saccharose, 20 mM CaCl&sub2;, 3,0 mg/ml rhFbgn, 1,0 E/ml rhThrombin, 37ºC. Die rhFXIII-Konzentration wird als Verhältnis von rhFXIII zu rhFbgn angegeben (ug/mg). Die TEG-Amplitude (mm) wurde 30 Minuten nach dem Mischen gemessen.
Abb. 13 ist eine Darstellung, die den konzentrationsabhängigen Effekt von rhFXIII auf die mechanischen Eigenschaften von rhFS zeigt, die durch Parallelplattenrheometrie gemessen wurden. Das Elastizitätsmodul wurde bei geringer Deformation der Probe (1 Hx Oszillationen bei 1 % Verformung) für 30 Minuten gemessen, gefolgt von Oszillationen zunehmender Amplitude, bis die Probe riss. Bedingungen des Ansatzes: TBS (20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 120 mM NaCl), 4,5% Saccharose, 20 mM CaCl&sub2;, 23 mg/ml rhFbgn, 1,0 E/ml rhThrombin, 37ºC. Die rhFXIII-Konzentration wird als Verhältnis von rhFXIII zu rhFbgn angege ben (ug/mg). Die Daten werden als mittlere Abweichung und Standardabweichung von fünf Wiederholungsversuchen aufgetragen.
Abb. 14 ist eine Darstellung, die die Wirkung von rhFXIII und 4,5% Saccharose sowohl allein als auch zusammen auf die Zughaftfestigkeit bzw. adhäsive Zugfestigkeit von rhFS zeigt, welches an Silastic (Silikongummi medizinischer Qualität) anhaftet. Die Grenzfestigkeit (UTS) wird als Reißkraft angegeben, normiert auf die Oberfläche von rhFS. Bedingungen des Ansatzes: TBS (20 mM Tris- HCl, pH 7,4, 120 mM NaCl), 20 mM, 30 mg/ml rhFbgn, 1,0 E/ml rhThrombin und 10 ug rhFXIII/mg rhFbgn. Die Proben wurden für 30 Minuten bei 37ºC inkubiert und mit 5,0 mm/Minute auseinander gezogen.
Abb. 15 ist eine Darstellung, die den konzentrationsabhängigen Effekt von rhFXIII auf die Abbaugeschwindigkeit bzw. Zersetzungsgeschwindigkeit von rhFS durch Plasmin demonstriert. Die rhFXIII-Konzentration wird als Verhältnis von rhFXIII zu rhFibrinogen aufgetragen (ug/mg). Die Geschwindigkeit (%/Minute) ist die Anfangsgeschwindigkeit, bestimmt aus dem linearen Teil der Auftragungen der lysierten Fraktion als Funktion der Zeit (vgl. eingefügte Darstellung). Bedingungen der Probe: TBS (20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 120 mM NaCl), 4,5% Saccharose, 20 mM CaCl&sub2;, 20 mg/ml rhFibrinogen, 3,0 E/ml rhThrombin und 0 bis 1,48 mg/ml rhFXIII. Die Proben wurden bei 37ºC für 16 Stunden inkubiert und mit einer Lösung von 8 ug/ml hPlasmin in 50 mM Tris-HCl, pH 8,6, 10 mM CaCl&sub2; lysiert.
Abb. 16 ist eine Darstellung, die die Wirksamkeit von rhFS bei der Reduzierung des Seromavolumens nach einer Radikalmastektomie demonstriert. Dies ist die erste vorklinische Demonstration der Wirksamkeit eines vollständig rekombinanten humanen Fibrinklebers. Das Gewicht der Seromaflüssigkeit am Tag 5 wird angegeben. Die Fehlerbalken stellen die Standardabweichung dar. Bedingungen des Ansatzes: TBS (20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 120 mM NaCl), 4,5% Saccharose, 20 mM CaCl&sub2;, 30 mg/ml rhFibrinogen, 287,5 E/ml rhThrombin und 300 ug/ml rhFXIII/mg rhFbgn.
rhFbgn für die erfindungsgemäße Verwendung kann grundsätzlich durch jedes geeignete rekombinante Verfahren hergestellt werden. Da üblicherweise etwas mehr als 98 Gew.-% der Proteinkomponenten eines Fibrinklebers Fibrinogen sind, ist es allerdings bevorzugt, dass rhFbgn durch ein Verfahren hergestellt wird, das ohne weiteres die Massenherstellung ermöglicht. Aus diesem Grund beinhalten die geeignetsten rekombinanten Verfahren die Herstellung von rhFbgn in Körperflüssigkeiten von transgenen Tieren, insbesondere der Milch von Plazentasäugetieren wie Schafen, Schweinen, Rindern, Ziegen, Kaninchen und Kamelen. Ein Verfahren für die Herstellung von rhFbgn auf diese Weise wird in WO-A-9523868 offenbart, deren Lehre hiermit durch Bezugnahme eingefügt wird. Während es bevorzugt ist, dass das in der Erfindung verwendete rhFbgn Aα-, Bβ- und γ- Ketten mit den spezifischen Sequenzen umfasst, die in WO-A-9523868 in SEQ ID 1,3 bzw. 5 (oder SEQ ID 2, 4 bzw. 6) offenbart werden, können Allelvariationen, sowohl natürlicher als auch künstlicher bzw. synthetischer Art, toleriert werden, beispielsweise in den in WO-A-9523868 festgelegten Grenzen (mindestens 90%, 95% oder 99% Identität zu den entsprechenden natürlichen Ketten, wobei zunehmende Werte bevorzugt sind).
In menschlichem Plasma liegen etwa 80% des Fibrinogens als γ-Fibrinogen vor und die restlichen 20% sind γ'-Fibrinogen, welches die alternativ gespleißte γ'-Kette umfasst. Eine biologische Funktion der γ'-Kette besteht darin, den Faktor III zu binden, und sie tut dies mit großer Affinität. In der vorliegenden Erfindung ist es bevorzugt, dass rhFbgn ausschließlich γ-Fibrinogen ist, das heißt es liegt kein γ' vor. Dies vermeidet die Komplexität eines zusätzlichen Transgenkonstrukts, das in dem Wirtstier vorliegt, und weicht auch dem möglichen Problem der rhFbgn-Anbindung an den Faktor XIII des transgenen Wirtstieres (z. B. ein Schaf) aus, die ansonsten schwierig zu entfernen wäre. Überra schenderweise ist rhFbgn ohne γ'-Kette nicht übermäßig beeinträchtigt und nach wie vor können annehmbare Fibrinogengele gebildet werden.
Es wurde angemerkt, dass rekombinantes Fibrinopeptid A, beispielsweise hergestellt in der Milch eines transgenen Schafs, im Vergleich zu dem aus Plasma erhaltenen Molekül überphosphoryliert ist. Bemerkenswerterweise ist trotz des anscheinend ungeeigneten Phosphorylierungsgrades das rekombinante Fibrinopeptid A nach wie vor durch Thrombin gespalten bzw. wird durch dieses abgespalten und es scheint, dass die Kinetik der Spaltungsgeschwindigkeit bzw. Abspaltungsgeschwindigkeit nicht wesentlich beeinträchtigt ist.
rhFbgn, beispielsweise hergestellt in der Milch eines transgenen Schafs, scheint untersialyliert zu sein. Auf Grund dieser Tatsache könnte erwartet werden, dass rhFbgn aus zwei Gründen in der Erfindung nicht funktional ist. Da die Löslichkeit von Fibrinogen bekanntermaßen von einer geeigneten Sialylierung abhängt und da Fibrinogen auf jeden Fall unter den am wenigsten löslichen Plasmaproteinen vorliegt, gibt es eine reale Wahrscheinlichkeit, das nicht ausreichend lösliches Fibrinogen in der vorliegenden Erfindung zugänglich wäre, um ein Fibringel geeigneter Zugfestigkeit zu bilden. Zweitens wird angenommen, dass der Sialylierungsgrad die Geschwindigkeit der Fibrinfaserbildung kontrolliert. Trotz dieser Gründe für die Annahme eines Scheiterns ermöglicht es die vorliegende Erfindung, dass Fibringele erfolgreich hergestellt werden können.
rhThrombin für die erfindungsgemäße Verwendung kann ebenso grundsätzlich durch jedes geeignete rekombinante Verfahren hergestellt werden. Da es ein Enzym ist, muss es in viel niedrigeren Mengen als rhFbgn vorliegen. Während eine Vielzahl von Wirten verwendet werden können, um rhThrombin zu erzeugen, beinhalten die am meisten bevorzugten rekombinanten Verfahren die Erzeugung von rhThrombin durch Säugetierzellen, beispielsweise CHO-Zellen. rhThrombin kann in inaktiver Form erzeugt werden und als Teil des Reinigungsverfahrens aktiviert werden. Verfahren für die Herstellung von rhThrombin auf diese Weise werden in US-5,476,777, US-A-5,502,034 und US-A-5,572,692 offenbart, deren Lehren hiermit durch Bezugnahme eingefügt werden.
Falls er vorliegt, kann rhFXIII für die erfindungsgemäße Verwendung wiederum grundsätzlich durch jedes geeignete rekombinante Verfahren hergestellt werden. Die am meisten bevorzugten rekombinanten Verfahren beinhalten die Erzeugung von rhFXIII durch Wirtszellen, die mikrobielle Zellen sein können, z. B. Hefezellen in Kultur. Säugetierzellen können ebenso unter bestimmten Umständen die Wirtszellen der Wahl sein. Verfahren für die Herstellung von rhFXIII auf diese Art und Weise werden in EP-A-0 268 772 offenbart, deren Lehre hiermit durch Bezugnahme eingefügt wird.
In den am meisten bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung wird rekombinantes humanes Fbgn (rhFbgn) in der Milch von transgenen Schafen abgesondert, rekombinantes humanes Thrombin (rhThrombin) wird als eine inaktive Form durch CHO-Zellen exprimiert und als Teil des Reinigungsverfahrens aktiviert; und rekombinanter humaner FXIII (rhFXIII) wird zytoplasmatisch durch Hefe exprimiert.
Als Produkt ist rhFS frei vom Risiko potenzieller humaner Pathogene, die mit aus Blut erhaltenen Produkten verknüpft sind. Die verwendeten rekombinanten Proteine können in starkem Maße gereinigt sein und besonders geprüft sein, um sicherzustellen, dass Verunreinigungen, die aus dem Wirtsorganismus stammen, während der Verarbeitung entfernt wurden. Eine rekombinante Herstellung sichert auch eine verlässliche und konsistente Quelle der drei Proteinkomponenten. Weiterhin kann rhFS formuliert werden, um seine funktionellen Eigenschaften für eine gegebene klinische Indikation bzw. gegebene klinische Indikationen zu optimieren.
rhFbgn kann zu einem makroskopischen Klumpen oder Gel polymerisieren und dieses Gel ist in der Lage, als ein Dichtungsmittel bzw. Kleber, Hämostat oder Wundheilungsmatrix in vitro und in vivo zu fungieren.
Die vollständige Charakterisierung von rhFS beinhaltet sowohl die biochemische Charakterisierung der individuellen Proteinkomponenten als auch die funktionale Charakterisierung des kombinierten Produkts. Die enzymatischen Komponenten von rhFS, rhThrombin und rhFXIII können bis zur Homogenität gereinigt und bezüglich ihrer Identität, Reinheit und spezifischen Aktivität genau charakterisiert werden. Folglich ist ihr Verhalten als Komponenten von rhFS mittels der Erfindung gut vorhersagbar. Im Gegensatz dazu wird rhFbgn als eine heterogene Population von miteinander in Beziehung stehenden Arten erhalten und sein Verhalten als Hauptkomponente von rhFS ist a priori weniger gut vorhersagbar, aber kann ohne weiteres charakterisiert werden.
Auf dem elementarsten Level ist rhFbgn sowie Fbgn, aufbereitet aus humanem Plasma, ein Molekül mit 340 kD, zusammengesetzt aus sechs disulfid-verbundenen Ketten: zwei Alpha-, zwei Beta- und zwei Gamma-Ketten. Allerdings kann jede dieser sechs Ketten heterogen sein. Die Heterogenität kann auf dem Niveau der primären Aminosäuresequenz (verursacht durch genetischen Polymorphismus, alternatives Spleißen oder Proteolyse) und/oder auf dem Niveau von Posttranslationsmodifikationen (wie z. B. Glykosylierung der Beta- und Gamma-Ketten oder Phosphorylierung der Alpha-Kette) vorliegen. Die Kombination von sechs potenziell heterogenen Ketten zu einem Molekül ermöglicht eine enorme Vielzahl von miteinander in Beziehung stehenden Arten, die alle als Fbgn identifiziert werden.
Es gibt mehrere Unterschiede zwischen rhFbgn und Fbgn, das aus menschlichem Plasma aufbereitet wurde. In aus Plasma erhaltenem Fbgn gibt es zwei alternativ gespleißte Gamma-Ketten (γ und γ'), wobei nur die Hauptform (γ) in rhFbgn vorliegt. Weiterhin ist die Glykosylierung der β- und γ-Ketten (es gibt keine Glykosylierung der α-Kette) von rhFbgn leicht unterschiedlich gegenüber derjenigen von aus Plasma erhaltenem Fbgn, aber ist ähnlich derjenigen bzw. entspricht derjenigen, die bei anderen Proteinen gefunden wird, die in der Milch von transgenen Tieren exprimiert wurden. Auch ist Ser3 der α-Kette von rhFbgn stärker phosphoryliert als Ser3 der α-Kette des aus Plasma erhaltenem Fbgn (diese Phosphorylierung verursacht keine funktionalen Unterschiede). Schließlich gibt es detektierbare Unterschiede in der Heterogenität, verursacht durch C- terminale Proteolyse einer Anzahl von äußerst protease-empfindlichen Stellen auf der α- Kette. Allerdings werden auch Unterschiede ähnlichen Ausmaßes zwischen aus Plasma erhaltenem Fbgn aus unterschiedlichen Quellen beobachtet.
In der Praxis können homogene Fbgn-Herstellungen nur unter großen Schwierigkeiten erreicht werden und Fbgn wird normalerweise als eine Population von miteinander in Beziehung stehenden Arten erhalten. Falls dies erwünscht ist, können mehrere unterschiedliche Fbgn-Unterpopulationen teilweise getrennt werden, basierend auf Unterschieden in der Löslichkeit und der Anbindung an Ionenaustauscherchromatografieharze (DEAE) (Lipinska et al., 1974, Hasegawa und Sasaki, 1990, Siebenlist et al. 1996). Wenn diese Unterpopulationen isoliert werden, unterscheiden sie sich in ihren biochemischen Eigenschaften nicht signifikant (Fibrinopeptid-Freisetzung durch Thrombin, prozentuale Klumpenbildungsfähigkeit bzw. Verklumpungsfähigkeit, Vernetzung durch FXIII). Allerdings unterscheiden sie sich signifikant in der Struktur des Fibringels, das sie bilden, und der physikalischen Eigenschaften dieser Gele (Hasegawa und Sasaki, 1990).
Eine signifikante Konsequenz der inhärenten Heterogenität von Fbgn ist darin zu sehen, dass es kein "Standard-Fbgn" gibt, mit dem die Eigenschaften von rhFbgn verglichen werden können. Das Fehlen eines Standards ist nicht beachtlich, wenn biochemische oder enzymatische Proben bzw. Ansätze verglichen werden. Alle Fbgn-"Qualitätsherstellungen" wechselwirken mit Thrombin und FXIII in gleicher Weise und sind zu > 95% verklumpbar. Allerdings sind es die physikalischen oder "funktionalen" Eigenschaften von FS, erhalten durch Mischen von Fbgn mit Thrombin und FXIII, die signifikant variieren können, abhängig von der Quelle des Fbgn. Als ein Beispiel für das Ausmaß der Variation, die bei unterschiedlichen Quellen von "Qualitäts"-Fbgn unter ansonsten identi schen Bedingungen beobachtet werden kann, werden die Verklumpungskurven von drei unterschiedlichen Fbgn-Proben in Abb. 2 gezeigt (die Interpretation dieser Kurven wird nachfolgend diskutiert).
Es ist weder praktisch noch notwendig, rhFbgn bis zur Homogenität zu reinigen, um funktionalen rhFS mit konsistenten Eigenschaften zu entwickeln. Es ist notwendig, funktionale Ansätze bzw. Proben zu haben, um rhFS zu charakterisieren, der hergestellt wird unter Verwendung von rhFbgn, hergestellt durch einen gegebenen Prozess. Mit diesen Ansätzen kann die Konsistenz von Charge zu Charge von rhFbgn selbst bewertet werden und die Spezifikation des Endprodukts, rhFS, kann festgelegt werden.
Die Prinzipien bzw. Grundsätze hinter den in vitro-Ansätzen, die entwickelt wurden, um die funktionalen Eigenschaften von rhFS zu charakterisieren, werden nun beschrieben. Detaillierte Protokolle sind den Beispielen beigefügt.
Makroskopisch erscheint rhFS als ein transparentes bis opakes, weißes, gummiartiges Gel. Mikroskopisch erscheint rhFS als ein Netzwerk oder eine Matrix von Fibrinfasern, ähnlich demjenigen, das in Blutklumpen gefunden wird (Abb. 3). Von dieser Matrix wird angenommen, dass sie ein vorläufiges Gerüst für die Wundheilung liefert (Clark et al., 1982). Von Störungen in der Struktur der Fibrinmatrix ist bekannt, dass sie signifikante Effekte auf die mechanischen und optischen Eigenschaften von rhFS ausüben (in der Tat wurden viele dieser gleichen Eigenschaften ursprünglich verwendet, um die biochemischen Prozesse zu erklären, die die Blutkoagulation begleiten). Die Fibringelstruktur kann gewichtige Effekte auf biologische Abläufe ausüben (Redl und Schlag, 1986).
Eine komplette Beschreibung der Gelstruktur von rhFS würde die Dicke der Fibrinfasern, den Abstand der Verzweigungspunkte, die Porengrößenverteilung, die Starrheit, Festigkeit etc. beinhalten. In der Praxis kann Mikroskopie nicht an jeder Probe durchgeführt werden und üblicherweise werden physikalische Techniken verwendet, um die funktiona len Eigenschaften von rhFS zu charakterisieren. Mehrere dieser Techniken wurden ursprünglich entwickelt, um die Blutkoagulation zu untersuchen und können nur bei rhFbgn-Konzentrationen verwendet werden, die ähnlich derjenigen sind, die in Blut gerunden wird (2,5 bis 3,0 mg/ml), was etwa 10-fach niedriger ist als diejenige, die in rhFS gefunden wird. Allerdings können verwandte Techniken verwendet werden, um zu verifizieren, dass das Verhalten von rhFS bei niedriger rhFbgn-Konzentration auf rhFS "voller Stärke" extrapolierbar ist. Ein Nachteil all dieser in vitro durchgeführten Ansätze liegt darin, dass sie rhThrombin-Konzentrationen unterhalb derjenigen Konzentration verwenden, die für hämostatische Anwendungen in vivo verwendet wird. Es sind Gelbildungszeiten von 10 Sekunden bis 30 Minuten und nicht Gelbildungszeiten, die Sekundenbruchteile betragen, notwendig, um die Zeitspanne bereitzustellen, damit rhFS im Instrument angebracht werden kann und Messungen in vitro aufgenommen werden können.
Viele dieser funktionalen Eigenschaften von rhFS können von niedrigen rhFbgn- Konzentrationen zu hohen rhFbgn-Konzentrationen extrapoliert werden. Um rhFbgn zu konservieren, wurden daher die meisten der anfänglichen Experimente unter Verwendung von rhFbgn-Konzentrationen von 2,5-3,0 mg/ml durchgerührt. Diese Experimente wurden entwickelt, um die Wirkungen des Formulierungspuffers und der rhFXIII- Konzentration auf die Eigenschaften von rhFS zu bewerten. Drei Ansätze bzw. Proben bildeten die Basis für dieses Screening: Verdichtung, Thromboelastographie und Messung der optischen Dichte.
Die Verdichtung wird verwendet, um den Widerstand von rhFS gegenüber Synärese (Verdichtung mit dem resultierenden Freisetzen der Flüssigkeit) zu quantifizieren. Problemlos synärisierte Gele verdichten leicht und verlieren leicht ihre Flüssigkeit, während weniger leicht synärisierte Gele ihre Form beibehalten. In der Praxis können die Eigenschaften von FS zwischen diesen beiden Extremen variieren. Bei Verdichtungsexperimenten wird das Volumen einer rhFS-Probe gemessen, bevor sie bei einer festgelegten Kraft für eine festgelegte Zeitspanne in einem Röhrchen, an dem sie nicht anhaftet, zentrifugiert wurde. Je größer der Widerstand gegenüber Synärese, desto mehr ursprüngliches Volumen wird durch die Probe beibehalten.
Thromboelastographie (TEG) wird verwendet, um die zeitabhängige Änderung in elastischen Eigenschaften des rhFS während der Gelbildung zu quantifizieren. Bei der TEG wird die Probe in einem Gefäß angebracht, das leicht in einer oszillierenden Weise rotiert. Im Zentrum des Gefäßes, jedoch ohne das Gefäß direkt zu berühren, befindet sich ein Stift, der an einem Dehnungsmessfühler angebracht ist. Befindet sich lediglich eine Flüssigkeit zwischen dem Gefäß und dem Stift, wird kein Signal erzeugt. Wird jedoch rhFS in dem Gefäß angebracht, wird ein stetig zunehmendes Signal erzeugt, wenn rhFS von einer Flüssigkeit zu einem Gel umgesetzt wird, an Steifheit zunimmt und mehr Bewegung des Gefäßes auf den Stift überträgt. Aus einer TEG-Aufzeichnung erhaltene Informationen beinhalten die Verklumpungszeit, zu der die Probe zum ersten Mal ein feststoffartiges Verhalten aufweist, die Steigung der Auftragung von Steifheit als Funktion der Zeit als ein Maß für die Geschwindigkeit der Gelstrukturalterung und die abschließende Steifheit des Gels nach 30 Minuten oder nachdem das Signal nicht weiter ansteigt (Abb. 3).
Mehrere andere Ansätze bzw. Proben, die die "Festigkeit" und die Abbaugeschwindigkeit von FS messen, sind für die in vitro-Charakterisierung der funktionalen Eigenschaften von rhFS bei hohen rhFbgn-Konzentrationen (25-30 mg/ml, abschließend) sehr nützlich. Die "Festigkeit" von rhFS umfasst mehrere Eigenschaften, die unabhängig voneinander gemessen werden können: die Steifheit oder Starrheit von rhFS, die Grenzkraft, die benötigt wird, um rhFS reißen zu lassen, entweder bei Zugbelastung oder Scherbelastung, und die Adhäsionskraft zwischen rhFS und dem Material, auf das es aufgetragen wurde (Klebstoffträger). Im Allgemeinen ist bei hohen Konzentrationen hergestellter rhFS oder rhFbgn zu opak für sinnvolle optische Messungen. Drei Proben bzw. Ansätze bilden die Basis für unsere in vitro-Untersuchungen von rhFS bei hoher rhFbgn-Konzentration: Pa rallelplattenrheometrie, Zugadhäsionstests und Messungen der Fibrinolysegeschwindigkeit.
Parallelplattenrheometrie kann in ähnlicher Weise wie TEG verwendet werden, jedoch über einen viel weiteren Bereich von Arbeitsparametern bzw. Betriebsparametern und rhFS-Konzentrationen. Der Rheometer misst die viskoelastischen Eigenschaften eines Gels, das zwischen einer fixierten kreisförmigen Platte und einer oszillierenden kreisförmigen Platte angebracht ist. Der Abstand zwischen den Platten, die Rotationsgeschwindigkeit der sich bewegenden Platte und der Betrag der Oszillationsbewegung können unabhängig voneinander variiert werden. Das Ausmaß der Verformung (% Verformung) und die Kraft, die benötigt wird, um diese Verformung zu verursachen (Beanspruchung), sind die prinzipiellen Messungen, die aufgenommen werden. Die Steigung der Kurve bezüglich der Beanspruchung in Abhängigkeit von der Verformung ist das Elastizitätsmodul (G') des Gels, ein Maß seiner Steifheit. Je steifer und starrer das Gel ist, desto höher ist das Elastizitätsmodul. Ein damit in Verbindung stehender Term, das Viskositätsmodul bzw. Verlustmodul (G"), welches das viskose Verhalten des Gels beschreibt, kann ebenso gemessen werden. Ebenso wie bei der TEG können zeitabhängige Messungen aufgenommen werden. Diese werden üblicherweise bei einem sehr kleinen Deformationsgrad (% Verformung) vorgenommen, so dass die Fibringelstruktur nicht beschädigt wird. Aus diesen Messungen können Verklumpungszeit, Geschwindigkeit der Gelstrukturalterung und maximales Elastizitätsmodul erhalten werden. Sobald sich rhFS verfestigt hat, kann eine Messung seiner kohäsiven Scherfestigkeit erhalten werden, indem allmählich der Betrag der oszillierenden Kraft (Beanspruchung), die auf das Gel einwirkt, erhöht wird, bis er reißt.
Die "Festigkeit" von rhFS kann ebenso mit Zugmessungen bestimmt werden. Unter Verwendung von Zugmessungen kann rhFS als ein massiver Feststoff getestet werden, um seine Kohäsivfestigkeit zu messen, oder er kann zwischen zwei Oberflächen (Klebstoffträger) angebracht werden und auseinander gezogen werden, um seine Adhäsionsfestig keit zu messen. Adhäsive Messungen können auch in Schergeometrie (Sierra, 1993, Siedentop et al., 1988, T. Brodneiwizc, persönliche Mitteilung) oder Schälgeometrie durchgerührt werden. Unabhängig von der Geometrie ist die Identifizierung der Bruchweise von rhFS ein wichtiger Teil des Ansatzes. Wir haben unsere Ansätze entwickelt, um einen Film von rhFS mit bekannter Dicke zu testen, so dass wir visuell zwischen kohäsivem Versagen bzw. Bruch eines schwachen, dennoch adhäsiven Klebers, und einem adhäsiven Bruch bzw. Versagen an der Kleber- bzw. Dichtungsmittel-Klebestoffträger- Grenzfläche eines ansonsten kohäsiv starken rhFS unterscheiden können. In der Praxis wird ein kohäsives Versagen bzw. ein kohäsiver Bruch nur bei sehr niedrigen Fibrinogen- Konzentrationen beobachtet. Wir haben auch einen Satz von wieder verwendbaren Edelstahleinspannvorrichtungen entwickelt, um die Präparation von Proben für Zugadhäsionstests schneller und reproduzierbarer vornehmen zu können. Dennoch können 20 oder mehr Wiederholungsversuche notwendig sein, um statistisch signifikante Ergebnisse zu erhalten.
Die Stärke der Adhäsion wird durch die Eigenschaften des Klebstoffträgers sowie durch rhFS bestimmt. Die Bedeutung dieses Punktes wird durch die Beobachtung veranschaulicht, dass die Stärke der Adhäsion von rhFS auf einem synthetischen Klebstoffträger wie SILASTIC® (Silikongummi medizinischer Qualität) wesentlich größer ist als die adhäsive Stärke bzw. Klebefestigkeit auf einem Gewebe wie Haut oder Dura (Abb. 4 und Siedentop et al., 1995, Park et al. 1997, Siedentop et al. 1997). Von einem praktischen Standpunkt aus betrachtet, wäre ein reproduzierbarer Klebstoffträger nützlich, um unterschiedliche Herstellungsarten von rhFS zu vergleichen. Während ein synthetischer Klebstoffträger wie Silastic ohne weiteres hergestellt werden kann, ist dies jedoch bei einem reproduzierbaren Gewebeklebstoffträger nicht möglich. Wir haben die adhäsive Zugfestigkeit von FS auf einer Vielzahl von synthetischen Klebstoffträgern (Edelstahl, Aluminiumfolie, Acetatfilm, Nitrozellulose, Silastic) und einer Reihe von Gewebearten (Schweinehaut, Kalbshaut, frische und gefrorene Rattenhaut voller Dicke und zahlreiche andere Gewebe wie Dura, Darmgewebe und Sehnengewebe, die als flache Schichten hergestellt werden können) be wertet. Zusätzliche Variablen wie Feuchtigkeit sind dafür bekannt, dass sie die Ergebnisse signifikant beeinflussen, sie sind jedoch schwierig in reproduzierbarer Weise zu kontrollieren (G. T. Rodeheaver, persönliche Mitteilungen). Im Allgemeinen sind diese Ansätze bzw. Proben relativ unempfindlich gegenüber kleinen Änderungen der Formulierungsvariablen, es sei denn, eine sehr große Anzahl an Wiederholungsproben wird getestet.
Trotz der Tatsache, dass die Adhäsionsproben so schwierig durchzuführen sind, ist die adhäsive "Stärke" bzw. "Festigkeit" eine funktionelle Eigenschaft, die von großer Bedeutung ist. Allerdings gibt es in der Literatur keine Untersuchungen, die die in vitro-" Festigkeit" unterschiedlicher FS-Herstellungen mit ihrer in vivo-Wirksamkeit in Bezug setzen. Unabhängig davon wird ein Adhäsionsansatz mit lebenden Tieren nach wie vor üblicherweise als ein QC-Ansatz für FS verwendet. (Dies belegt die Schwierigkeit, reproduzierbare, biologisch relevante Klebstoffträger für Adhäsionsansätze bzw. Adhäsionsproben zu finden.) In einer Konfiguration wird ein Hautpflaster voller Dicke mit einer festgelegten Größe aus dem Rücken einer betäubten Maus oder Ratte entfernt und dann mit FS wieder angeklebt. Nach einer festgelegten Inkubationszeit wird das Hautpflaster abgezogen, während die Kraft, die benötigt wird, um es zu entfernen, durch ein Materialprüfungsinstrument aufgezeichnet wird (Kjaergard und Weis-Fogh, 1994). Beim Vergleich unterschiedlicher FS- Formulierungen mit Zugansätzen unter Verwendung von betäubten Ratten und mit Ansätzen unter Verwendung von Schweinehaut haben wir ähnliche Resultate beobachtet (S. Busby und M. Buddle, Daten nicht gezeigt).
Beim Heilen einer chirurgischen Stelle, auf die FS aufgetragen wurde, entwickelt idealerweise das neu geformte Gewebe in der Wunde eine mechanische Festigkeit mit einer Geschwindigkeit, die nahe an derjenigen liegt, mit der FS abgebaut wird und seine mechanische Festigkeit verliert. Wie bei der Adhäsion bestimmt das Untersuchen der Eigenschaften des umgebenden Gewebes zusätzlich zu den Eigenschaften von rhFS selbst die in vivo- Abbaugeschwindigkeit. Unglücklicherweise ist die minimale Festigkeit, die die heilende Wunde aufrecht erhalten muss, nicht genau festgelegt und variiert in Abhängigkeit von dem Ort der Wunde und der Art des umgebenden Gewebes. Ebenso wie die "Festigkeit" eine funktionale Eigenschaft ist, die von großer Bedeutung ist, trifft gleiches auf die Abbaugeschwindigkeit zu.
Während FS in vivo über proteolytische und zellulare Prozesse abgebaut werden kann, wird der in vitro-Abbau am einfachsten für die Proteolyse bestimmt. Wird aus Plasma erhaltenes Fbgn verwendet, um FS herzustellen, und enthält es nach wie vor Plasminogen, dann kann die Proteolyse (Fibrinolyse) durch die Zugabe von Plasminogenaktivatoren wie Streptokinase oder tPA ausgelöst werden. Ist der FS frei von endogenem Plasminogen, wie dies der Fall ist bei rhFS, dann muss die Fibrinolyse durch die Zugabe von Plasmin, Plasminogen plus Aktivator oder anderen Proteasen wie Leukozytelastase ausgelöst werden (Edwards, et al. 1993). Für unsere Untersuchungen wählten wir Plasmin. Fibrinolyseansätze können durchgerührt werden, entweder durch die Zugabe von Protease zum FS vor der Polymerisation oder durch Anbringen des bereits polymerisierten FS in einer Lösung, die Protease enthält. Da rhFS normalerweise nicht dahingehend formuliert wird, Proteasen zu enthalten, wurde letzteres Ansatzformat übernommen. Bei der visuellen Beobachtung zersetzt sich rhFS eher an der Grenzfläche von Lösung/Kleber bzw. Dichtungsmittel als dass es sich homogen im gesamten Volumen zersetzt. Da der Volumenanteil von rhFS seine strukturelle Integrität bis zu den letzten Lysisstufen bewahrt, kann unlysierter rhFS problemlos von der Lösung entfernt werden, die Protease und lösliche Fbn-Fragmente enthält. Dies liefert die Basis für einen simplen Ansatz bzw. eine simple Probe, in dem/der die Konzentration von löslichen Fbn-Fragmenten in abgestimmten Zeitintervallen gemessen wird, um die Fibrinolysegeschwindigkeit zu bestimmen. Die Konzentration von Fragmenten kann unter Verwendung von UV-Vis- Spektrofotometrie gemessen werden (Siebenlist und Mosesson, 1994). Wir haben Fibrinolyseexperimente durchgeführt unter Verwendung von rhFS, der einer Gelbildung unterzogen wurde, gefolgt von einem Inkubieren über Nacht bei 37ºC. Die rhFS-Proben wurden dann in eine Lösung von humanem Plasmin bei 37ºC gegeben. In bestimmten Zeitintervallen wurden Proben der Lösung entnommen und die Konzentration von lösli chen Fragmenten wurde gemessen, basierend auf ihrer Absorption bei 280 nm. Nachdem sich rhFS vollständig gelöst (lysiert) hatte, wurde die Absorption erneut gemessen, um den Wert für 100% Lysis zu erhalten. Die Zeitpunkte wurden dann als %-Lysis in Abhängigkeit von der Zeit aufgetragen, um die Fibrinolysegeschwindigkeit zu erhalten.
Die meisten der hierin offenbarten Experimente wurden in einem Tris-HCl, NaCl (TBS)- Puffersystem durchgerührt. Andere Puffersysteme können ebenso für diesen Zweck geeignet sein. Während sich das spezifische Verhalten von rhFS in Abhängigkeit von der abschließenden Formulierung des Puffers etwas ändern kann, sollten die hierin beschriebenen allgemeinen Trends Bestand haben.
Pilotexperimente zeigten an, dass in TBS formulierter rhFS dazu neigte, leichter zu synärisieren als FS, hergestellt mit aus Plasma erhaltenem Fbgn, seinem endogenen FXIII und rhThrombin. Obwohl die Gelbildungsgeschwindigkeit hoch war, war rhFS nicht sehr steif, wenn er durch TEG charakterisiert wurde, und er war sehr opak, wenn er durch OD-Messungen charakterisiert wurde. Diese Eigenschaften zeigten an, dass die Gelstruktur extrem grob war und dicke Fasern und große Poren aufwies.
Während es keine biologisch begründete Rechtfertigung gab, die Gelstruktur von rhFS zu modifizieren, wurde die Gelstruktur, die zwischen den Extremen einer groben und einer feinen Struktur lag, für unsere anfängliche Bewertung bestimmt. Die Gelstruktur kann durch viele unterschiedliche Formulierungsvariablen moduliert werden: Fbgn-Konzentration, FXIII-Konzentration, Thrombin-Konzentration, pH, Ionenstärke und Additive wie Zucker.
Mit aus Plasma erhaltenem Fbgn verdichten sich FS-Gele ohne weiteres bei niedriger Fbgn-Konzentration, aber widerstehen einer Verdichtung bei Fbgn-Konzentration oberhalb von ~5 mg/ml Fbgn. Der Effekt der rhFbgn-Konzentration auf die Verdichtung wurde zuerst untersucht, um zu sehen, ob die rhFbgn-Konzentration allein verwendet werden kann, um rhFS mit den erwünschten funktionalen Eigenschaften herzustellen, oder ob dies nicht möglich ist. Im Gegensatz zu dem Verhalten von FS, das aus von Plasma erhaltenem Fbgn hergestellt wurde, verbesserte sich das Verdichtungsverhalten bei hohen rhFbgn-Konzentrationen nicht signifikant (Abb. 5).
Die Zugabe von rhFXIII zu rhFS hatte ebenso kaum eine Wirkung auf die Verdichtung. Dies wird ausführlich im nächsten Abschnitt diskutiert. Eine zunehmende Thrombin- Konzentration kann eine feinere Gelstruktur erzeugen. Da rhFS eine rasche Gelbildung zeigt (10-20 Sekunden), selbst bei niedriger rhThrombin-Konzentration (1 E/ml), war es jedoch nicht möglich, die rhThrombin-Konzentration signifikant zu erhöhen.
Die Wirkungen der Ionenstärke (zugegebenes NaCl) und von Zuckern (zugegebene Saccharose oder zugegebenes Sorbitol) auf die Eigenschaften von rhFS wurden untersucht. Sowohl NaCl als auch Zucker reduzierten die Verdichtung in synergistischer Weise (Abb. 6). Gleichzeitig nahm die Steifheit, gemessen durch TEG, zu und die Opazität, gemessen durch OD, nahm ab. Weiterhin neigten sowohl zugegebenes NaCl als auch zugegebener Zucker dazu, die Verklumpungszeiten zu erhöhen. Wenn die rhThrombin-Konzentration erhöht wurde, um die erhöhte Verklumpungszeit zu kompensieren, wurde eine weitere Erhöhung der Steifheit und eine Abnahme der OD beobachtet. Dieses Verhalten zeigte an, dass rhFS in Richtung einer feineren Gelstruktur verschoben wurde.
Wenn die Daten aus einer Vielzahl von Experimenten unter Verwendung variierender NaCl-, Zucker-(Saccharose-) und rhThrombin-Konzentrationen kombiniert wurden, entstand ein allgemeines Bild der Wirkung dieser Formulierungsvariablen auf die Gelstruktur (Abb. 7). Wurden NaCl, Saccharose oder rhThrombin erhöht, nahmen Steifheit und Widerstand gegenüber Verdichtung zu, während die Opazität abnahm. Im extremen Bereich transparenter Gele nahm jedoch die Steifheit schlagartig ab und man erhielt spröde, leicht zu beschädigende, jedoch nicht komprimierbare Gele.
Auch waren die konzentrationsabhängigen Effekte von Salz und Zucker nicht linear, obwohl dies nicht ohne weiteres aus Abb. 7 ersichtlich ist. Es gab eine graduelle Modifikation der Eigenschaften, bis ein scharfer Übergang bei einem bestimmten kritischen Wert beobachtet wurde. Diese Art von nicht linearem Verhalten wurde für viele Variablen beobachtet, die die Gelstruktur beeinflussen (Shulman und Ferry, 1949).
Obwohl der Effekt des Formulierungspuffers auf die physikalischen Eigenschaften von rhFS bei hoher rhFbgn-Konzentration nicht eingehend untersucht worden ist, kann der Effekt von unterschiedlichen Formulierungspuffern visuell beobachtet werden (Abb. 8).
Als ein Resultat dieser Experimente wurde ein Formulierungspuffer mit 4,5% Saccharose in TBS für die weitere Arbeit gewählt. Es ist anzumerken, dass diese Pufferkomponenten nur gewählt wurden, um die möglichen Wirkungen von Formulierungsvariablen auf die Gelstruktur zu veranschaulichen. Es ist nicht beabsichtigt, dass sie einen optimierten Formulierungspuffer darstellen und TBS + 4,5% Saccharose kann ein empfohlener Formulierungspuffer für ein Endprodukt sein oder auch nicht. Der Puffer mit TBS + 4,5% Saccharose erzeugte rhFS mit einer Gelstruktur, die weder extrem grob noch extrem fein war und sich in einer ähnlichen Weise verhielt wie diejenige von FS, der aus einem von Plasma erhaltenen Fbgn hergestellt wurde.
Wenn FS aus Fbgn hergestellt wird, das aus vereinigtem humanem Plasma erhalten wurde, liegt FXIII normalerweise als eine Verunreinigung vor, die zusammen mit Fbgn aufbereitet wird. Als solche wird die Konzentration von FXIII angegeben, wird jedoch nicht in aktiver Weise kontrolliert. Mit wenigen Ausnahmen enthält FS, der aus gesammeltem menschlichem Blut erhalten wurde, FXIII in Anteilen, die nahe den in Blut gefundenen Anteilen oder unterhalb diesen liegen (Abb. 9). Während allgemein davon ausgegangen wird, dass FXIII eine notwendige Komponente von FS ist (insbesondere in Europa, wo einige aus Plasma erhaltene FS FXIII-Konzentrate aufweisen, die wieder zugegeben wurden, wenn FXIII während der Reinigung bzw. Aufbereitung von Fbgn abgereichert wur de), ist diese Annahme insbesondere in den USA nach wie vor umstritten. Da die Bestandteile von rhFS in hohem Maße gereinigt sind, enthält rhFS kein rhFXIII, es sei denn, es wurde unfreiwillig zugegeben. Für Überwachungszwecke muss diese Zugabe und die Konzentration von rhFXIII im Endprodukt experimentell eingestellt werden. Diese Justierung ist der Zweck der Experimente, die in den folgenden Absätzen beschrieben werden.
Wie zuvor erwähnt, wurde vor der Bewertung der Wirkung des Formulierungspuffers auf die Eigenschaften von rhFS die Zugabe von rhFXIII als ein Mittel bewertet, die Gelstruktur zu modifizieren und den Widerstand gegenüber der Verdichtung zu erhöhen. Die Zugabe von rhFXIII auf rhFS hatte kaum eine Wirkung auf die Verdichtung. Nachdem der Puffer mit TBS + 4,5% Saccharose für weitere Experimente gewählt wurde, wurde die Wirkung von rhFXIII erneut bewertet. Wiederum hatte die Zugabe von rhFXI- II zu rhFS kaum einen zusätzlichen Effekt auf die Verdichtung, der oberhalb dem Effekt lag, der durch die Zugabe von Saccharose erhalten wurde (Abb. 10). Dies würde nahe legen, dass rhFXIII kaum einen Effekt auf die Porosität der Gelstruktur ausübt. Unsere Beobachtungen stehen im Gegensatz zu denjenigen, die neulich von Nair et al. bereichtet wurden (Nair und Shats, 1997), die einen erhöhten Widerstand gegenüber einer Verdichtung als Ergebnis einer erhöhten Vernetzung durch FXIII zeigten.
Zugegebener rhFXIII hatte ebenso kaum eine Wirkung auf die OD, was nahe legt, dass rhFXIII die Fasergröße oder Porenstruktur des Gels nicht wesentlich modifiziert. Allerdings hatte rhFXIII einen signifikanten Effekt bezüglich der Starrheit von rhFS, wie durch TEG gemessen wurde (Abb. 11).
Bei der Darstellung als Dosis-Respons-Kurve ist der Effekt von rhFXIII in der TEG nicht linear und zeigt eine sehr steile Dosis-Respons bei niedrigen rhFXIII-Konzentrationen und eine flachere Dosis-Respons bei höherer rhFXIII-Konzentration (Abb. 12). Die Änderung des Verhaltens findet bei 3-4 ug rhFXIII pro mg rhFbgn statt. Dieses Niveau entspricht in etwa demjenigen, das endogen im Plasma (und in existierendem FS) gefunden wird. Folglich würde die Rolle von FXIII bei der Bestimmung der Eigenschaften von FS in Experimenten unbeachtet bleiben, die unter Verwendung von aus Plasma erhaltenem Fbgn durchgerührt werden, es sei denn, es wurde in spezifischer Weise von kontaminierendem FXIII befreit (das heißt die Zugabe von supra-physiologischen Mengen an FXIII führt kaum zu einer Veränderung in der TEG-Amplitude).
Die Rheometrie bestätigte, dass die durch rhFXIII induzierte Zunahme der Steifheit, die unter Verwendung von TEG beobachtet wurde, zu hoher rhFbgn-Konzentration rhFS extrapoliert werden kann. Mit dem Rheometer wird eher das aktuelle Elastizitätsmodul (G') als eine Signalamplitude als Funktion der rhFXIII-Konzentration gemessen. Die Dosis- Respons-Kurve ist nicht linear, wie in der TEG beobachtet wird. Zusätzlich zu der Zunahme des Moduls wird die Scherreißfestigkeit von rhFS durch die Zugabe von rhFS drastisch erhöht. Der höchste Wert auf der Kurve der Reißbeanspruchung in Abhängigkeit vom rhFXIII/rhFbgn-Verhältnis (Abb. 13) repräsentiert den hohen Beanspruchungsgrenzwert des Rheometers, daher wurde der dosisabhängige Effekt von rhFXIII auf die Reißbeanspruchung von rhFS oberhalb von 10 ug, rhFXIII/mg rhFbgn nicht bestimmt. Während die Bedeutung des Elastizitätsmoduls auf die in vitro-Funktion von rhFS schwierig festzustellen ist, sollte die Zunahme der Reißbeanspruchung, bewirkt durch die Zugabe von rhFXIII, für in vivo-Anwendungen wie die Hauttransplantatfixierung relevant sein.
Wenn rhFS riss, verblieb rhFS in Pflastern auf beiden Platten des Rheometers, was nahe legte, dass rhFS kohäsiv versagte. Die Zunahme der Reißfestigkeit von rhFS, die die Zugabe von rhFXIII begleitet, ist konsistent mit Berichten in der Literatur, die zeigen, dass die Vernetzung durch FXIII in signifikanter Weise die kohäsive Zugfestigkeit von FS erhöht (Marx und Blankenfeld, 1993, Nowotny et al., 1982).
Während die vorteilhafte Wirkung von FXIII auf die Kohäsivfestigkeit bzw. Kohäsivstärke von FS allgemein akzeptiert wird, wird die Wirkung von FXIII auf die adhäsive Fes tigkeit kontrovers diskutiert (G. Marx, persönliche Mitteilung). Unsere Untersuchungen erhellen diese Kontroverse etwas. Wurde rhFS in TBS formuliert, wurde eine Formulierung, von der gezeigt wurde, dass sie eine sehr grobe Gelstruktur erzeugt, eine signifikante Zunahme der adhäsiven Zugfestigkeit unter Verwendung von Silastic als Klebstoffträger beobachtet (Abb. 14). Ähnliche Ergebnisse wurden erhalten unter Verwendung von Acetat und Rinderhaut als Klebstoffträger. Wurde jedoch Saccharose der Formulierung zugegeben, nahm die adhäsive Zugfestigkeit (gegenüber Silastic) selbst in der Abwesenheit von rhFXIII zu und es wurde kein zusätzlicher Effekt von rhFXIII beobachtet (Abb. 14). Diese Beobachtungen legen nahe, dass die Messungen der adhäsiven Zugfestigkeit, insbesondere gegenüber synthetischen Klebstoffträgern, sehr empfindlich auf die Gelstruktur reagieren. Wir schlagen vor, dass die Wahl des Formulierungspuffers den beobachteten Effekt von rhFXIII auf die adhäsive Zugfestigkeit von rhFS entweder verstärken oder vermindern könnte.
Die Wirkung von rhFXIII auf die Abbaugeschwindigkeit von rhFS wurde ebenso bewertet. Wie die "Festigkeit" ist die Abbaugeschwindigkeit eine funktionale Eigenschaft von großer Bedeutung. Dem ist so trotz der Tatsache, dass die Eigenschaften des umgebenden Gewebes zusätzlich zu den Eigenschaften von rhFS selbst die Abbaugeschwindigkeit bestimmen und dass es keine Untersuchungen gibt, die die Abbaugeschwindigkeit mit der in vivo-Wirksamkeit in Beziehung setzen. Frühere Untersuchungen durch Edwards et al. und Siebenlist und Mosesson haben gezeigt, dass FXIII die Fibrinolysegeschwindigkeit in einer dosisabhängigen Weise reduziert (Edwards et al., 1993, Siebenlist und Mosesson, 1994).
Anfängliche Experimente legten fest, dass eine Plasminkonzentration von 8 ug/ml (~0,2 cu/ml) die meisten rhFS-Proben in 4 bis 6 Stunden lysierte. Die gleiche Plasminkonzentration wurde verwendet, um rhFS, enthaltend zunehmende Konzentrationen von rhFXIII, zu lysieren. Der größte Effekt von rhFXIII wurde zwischen 0 und 3 ug rhFXIII pro mg rhFbgn (etwa physiologisches Niveau) beobachtet. Allerdings rührten supra physiologische Konzentrationen von 3 bis 74 pg rhFXIII pro mg rhFbgn weiterhin zu einer Abnahme der Fibrinolysegeschwindigkeit in einer dosisabhängigen Weise (Abb. 15). Dieses dosisabhängige Verhalten entspricht demjenigen, das von Siebenlist und Mosesson unter Verwendung von nicht rekombinanten Reagenzien, aber ähnlichen Lysisbedingungen berichtet wurde. Kürzlich haben Siebenlist und Mosesson ihre Untersuchungen verfeinert und berichteten, dass zusätzlich zu der Konzentration von FXIII die anfängliche Struktur des Fibringels die Anzahl an multimeren (unterschiedlich von dimeren) Vernetzungen, umfassend die γ-Kette von Fibrinogen, bestimmt, und dass diese multimeren Vernetzungen die Fibrinolysegeschwindigkeit des Gels bestimmen (Siebenlist und Mosesson, 1994). Diese Ergebnisse verleihen unserer Fähigkeit, die Gelstruktur durch Modifikation des Formulierungspuffers zu modulieren, Bedeutung. Unsere Vorhersage ist, dass die Wahl des Formulierungspuffers die Wirkung von rhFXIII auf die Fibrinolysegeschwindigkeit von rhFS entweder erhöhen oder erniedrigen könnte.
Viele der Daten, die den Bedarf für anti-fibrinolytische Mittel wie Aprotinin und EACA belegen, und FXIII ist FS, basierend auf in vitro-Messungen von "Festigkeit" und Abbaugeschwindigkeit. Dem ist so trotz der Tatsache, dass die Versagensweise bzw. Bruchweise von FS in vivo schwierig zu bestimmen ist und im Allgemeinen nicht angegeben wird. Während eine direkte Korrelation von in vitro-Eigenschaften und in vivo- Wirksamkeit hergestellt werden kann, gibt es in der Literatur keine Untersuchungen, die diese Korrelation unzweifelhaft vornehmen. Daher ist zusätzlich zu den in vitro-Ansätzen eine gewisse Form von in vivo-Ansatz notwendig, um die Funktion von rhFS in einer chirurgischen Anwendung zu verifizieren.
Fibrinkleber bzw. Fibrindichtungsmittel (FS) werden seit 50 Jahren klinisch verwendet. Ausgehend von einem hämostatischen Mittel hat FS inzwischen eine Nische in einer Vielzahl von klinischen Anwendungen von Nervenanastomose bis zur Verwendung als Matrix for die Knochenregeneration gefunden. Die Verwendung von FS in der Medizin wurde durch einige Personen befürwortet, die das Potential dieses Produkttyps erkennen. Wäh rend FS für die Verwendung in Europa, Kanada und Japan zugelassen ist, hat es sich in der Hauptströmung der Medizin noch zu finden. Vielleicht hat die Tatsache, dass es ein aus Plasma erhaltenes Produkt ist und keine konsistente Formulierung aufweist, den Blick von einigen klinischen Medizinern bezüglich seines Potentials getrübt.
Wie man sich vorstellen kann, wurde FS zusammen mit vielen klinischen Untersuchungen in Tieruntersuchungen eingesetzt. Viele dieser Modelle wurden anscheinend auf Grund des individuellen Interesses von Chirurgen und deren klinischen Schwerpunkte entwickelt. Im Allgemeinen wurden diese Modelle nicht in andere Laboratorien exportiert.
Nachfolgend werden einige der klinischen Anwendungen für FS und die Tiermodelle hervorgehoben, die verwendet wurden, um diese zu testen. Der in all diesen Modellen verwendete FS wurde aus Plasma erhalten. Abgesehen von dem Zusatz von proteolytischen Inhibitoren und dem variierenden Thrombinlevel gibt es wenig oder keine Information bezüglich der FS-Formulierung. Die Fähigkeit, die rhFbgn-, rhFXIII- und rhThrombin- Konzentrationen zusammen mit Pufferadditiven präzise zu manipulieren, liefert die aufregende Möglichkeit, die Eigenschaften von rhFS in konsistenter Weise zu modulieren. Jede klinische Anwendung von rhFS kann von einer kundengerecht angefertigten Formulierung profitieren.

Orthopädie

FS ist wirksam als ein Lieferteil für osteogenische Faktoren, Knochenpulver, Korallengranulat und autologe reduzierte Knochen in Knochenreparaturmodellen. Ein menschlicher FS-Versuch war bezüglich der Meniskus-Wiederherstellung erfolgreich. Allerdings wurde nicht belegt, dass er ein Ersatz für Nahtmaterialien bei der Wiederherstellung des Meniskus in Tieren ist. Seine Verwendung als eine Probenzuführungsmatrix bzw. Medikamentenzuführungsmatrix ist in dieser Anwendung vielversprechend. Die Ergebnisse von mehreren veröffentlichten Untersuchungen werden nachfolgend zusammengefasst:
1. FS kann als ein Träger oder Gerüst bei der Knochenwiederherstellung fungieren. Ein bilaterales Kaninchen-Cranioplastie-Modell zeigte beschleunigte Osteogenese mit FS, kombiniert mit TGF-Beta und Korallen (Calciumcarbonat der Löcherkoralle) (Arnaud et al., 1994).
2. Eine Kombination von entmineralisiertem Knochenpulver und FS ermöglichte ein Stattfinden der Knochenbildung, eine verbesserte Handhabung von Knochenpulver und ein erleichtertes Formen bzw. eine erleichterte Formgebung von Implantaten in einem kalvarischen Rattendefektmodell. Die Konzentration von Fbgn im FS betrug 30 mg/ml (Lasa et al. 1995).
3. Die Zugabe von FS zu Korallengranulat förderte die Knochenwiederherstellung in einem Kaninchenoberschenkeldefektmodell. Zwei kommerzielle FS wurden verglichen, wobei einer PDGF und einer TGF-Beta enthielt. Beide Produkte zeigten eine gesteigerte Knochenbildung bei einem Monat, wohingegen bei zwei Monaten nur der mit Wachstumsfaktoren angereicherte FS eine signifikante Erhöhung der Knochenwiederherstellung zeigte (Kania et al., 1998).
4. Endothelzellenwachstumsfaktor, kombiniert mit FS, zeigte eine verbesserte Heilung der Meniskuswiederherstellung nach 1 Woche. Kein Unterschied wurde bei 12 Wochen gesehen (Nabeshima et al. 1995).
Die Rekonstruktion von heterologen oder homologen Knochentransplantaten würde von einem rhFS mit hoher Adhäsivfestigkeit und Zugfestigkeit profitieren, während die Elastizität nicht so wichtig sein könnte. Für die Sehnenchirurgie würde jedoch ein maßgeschneiderter rhFS von einem hohen Maß an Elastizität und Zugfestigkeit profitieren, die durch eine hohe Thrombin-Konzentration und optimalen rhFXIII erreicht werden könnten, um eine geeignete Starrheit sicherzustellen und eine Bewegung bzw. Beweglichkeit zu ermöglichen. Die vorliegende Erfindung ermöglicht es, dass solche unterschiedlichen Anforderungen in präziser Weise befriedigt werden.

Hauttransplantation

Kultivierte Epidermisschichten sind ein wichtiges Werkzeug für die Wiederherstellung der Haut nach ernsthaften Verbrennungen. FS erhöht die Transplantataufnahme, insbesondere in schwierigen Transplantationsbereichen, und verbessert die mechanische Stabilität. Die Ergebnisse von mehreren veröffentlichten Untersuchungen werden nachfolgend zusammengefasst:
1. FS wurde vor der Abscheidung von kultivierten Epidermisschichten auf ein Muskelbett in Nacktmäusen aufgetragen. Es fand eine verbesserte Transplantataufnahme statt (Xu et al., 1996).
2. Eine Untersuchung, die im Wesentlichen wie die obige vorgenommen wurde, zeigte, dass FS die Transplantataufnahme erhöhte und die mechanische Stabilität der Epidermisschichten verbesserte. Außerdem zeigte die histologische Untersuchung keine Störung durch FS bezüglich der Sequenz der Grundmembranbildung (Auger et al., 1993).
3. Die Infektion von Transplantatstellen ist mit dem Versagen des Hauttransplantats verknüpft. Ein Rattenmodell zeigte, dass FS die Transplantatanhaftung gegenüber infizierten Stellen wieder herstellt (Jabs et al., 1992).
Die Hauttransplantation kann es erforderlich machen, dass Verklumpungen mit kleinen Poren gebildet werden, wodurch der Widerstand gegenüber einer Verdichtung erhöht wird. Eine hohe Zugfestigkeit und Klebestärke kann ebenso von Vorteil sein. Ein Dichtungsmittel bzw. Kleber der Erfindung kann mit hohen rhFXIII- und rhThrombin- Konzentrationen maßgeschneidert werden. Alternativ ist es für einige Verfahren hinsichtlich größerer Poren innerhalb der Verklumpung wünschenswert, eine Infiltration von Epitelzellen während der Geweberegeneration zu ermöglichen. Dies könnte durch niedrige rtiThrombin-Konzentration, aber hohe rhFXIII-Konzentration bewerkstelligt werden.

Hämostase

Die Fähigkeit von FS, Blutungen zu kontrollieren, wurde in zahlreichen Modellen getestet. Es wurde gezeigt, dass das Durchsickern aus Nahtfäden sowie eine starke Blutung nach einer ernsthaften Leber- oder Milzverletzung gestoppt werden kann. Die Ergebnisse mehrerer veröffentlichter Untersuchungen werden nachfolgend zusammengefasst:
1. FS erreichte eine Hämostase in einem Kaninchenmodell mit Milzschädigungen. Schnittwunden bzw. Risswunden (klein und groß), keilförmige Resektionen und Stichwunden wurden erfolgreich mit FS repariert, was eine Wiederherstellung der Milz ermöglicht (Kram et al., 1986).
2. Ein Modell, entwickelt in weißen Neuseelandkaninchen, veranschaulichte die Wirksamkeit von FS als ein hämostatisches Mittel nach einer teilweisen Milzschädigung. Es gab keine wiederkehrende Blutung und über einen Zeitraum von 10 Wochen fand eine komplette Heilung statt (Kuzu et al., 1992).
3. Eine ernsthafte Blutung wurde durch PS kontrolliert und folgte der Entfernung von Teilen einer Rattenniere. Hämostase wurde in 0,5 Minuten erreicht, im Vergleich zu 4 Minuten beim Kontrollversuch (Raccuia et al. 1992).
4. FS stoppte die Blutung in einem Schweineherzkammerrissmodell, wie nach 30 Minuten beobachtet wurde, was das Potential von FS in der Notfallmedizin anzeigt (Kjaergard et al. 1995).
5. Ein hämostatischer FS-Verband wurde in einem Schweinemodell verwendet, um die Blutung aus einer Risswunde der Oberschenkelarterie zu kontrollieren, was seine Verwendung als ein Adjuvans für die Kontrolle der Blutung in der prähospitalen Phase veranschaulicht (Larson et al., 1995).
In Ausführungsformen der Erfindung, die für die Verwendung in der Hämostase besonders geeignet sind, kann wenig oder kein rhFXIII erforderlich sein, da eine Verklumpungspersistenz nicht erwünscht sein könnte, jedoch kann ein hoher Thrombingehalt vorteilhaft sein, um eine rasche Verklumpung zu fördern.

Wundheilung

In der Praxis beinhaltet jede klinische Verwendung von FS eine Wundheilung. Die Verwendung von Fibrinkleber bzw. Fibrindichtungsmittel wurde mit dem Verhindern von Adhäsionen, abnehmender Wundenkontraktion und erhöhter Hauttransplantatanhaftung in Verbindung gebracht. Die Ergebnisse von mehreren veröffentlichten Untersuchungen werden nachfolgend zusammengefasst:
1. In einem Rattenhauttransplantationsmodell wurde gezeigt, dass FS die Wundenkontraktion von Defekten voller Dicke inhibiert, wenn es vor dem Transplantat aufgebracht wird (Brown et al., 1992).
2. In einem Kaninchengebärmutterhalsmodell wurden Adhäsionen durch FS dramatisch reduziert (De Iaco et al. 1994).
3. Bilaterale Hautlappen, die über die Ohrspeicheldrüse in Kaninchen gezogen wurden und mit FS verklebt wurden, zeigten einen signifikant geringeren Wundfluss und eine verbesserte Coaptation von Hautlappen (Bold et al., 1996).
4. Subkutane Taschen in den Rückenbereichen von Ratten wurden mit FS implantiert. Es zeigte sich, dass FS biokompatibel ist, eine entzündliche Reaktion bzw. Entzündungsreaktion nicht fördert, eine Zunahme an Blutgefäßen und Kapillaren und eine erhöhte extrazellulare Matrix zeigte (Romanos und Strub, 1998).
5. Nach dem Ausschneiden einer Parietalmuskelschicht wurden Bauchfelladhäsionen durch FS in einem Rattenmodell verhindert, wobei die Bewertung eine Woche nach dem chirurgischen Eingriff erfolgte (Lindenberg und Lauritsen, 1984).

Seroma-Vorbeugung

Das Auftreten von Seroma nach Mastektomie, Halsresektion oder jedem chirurgischen Eingriff, der einen abgezogenen Hautlappen zurücklässt, ist ein signifikantes klinisches Problem. Es hat sich gezeigt, dass FS ein wirksames Mittel bei der Vorbeugung der Seroma-Bildung ist. Die Ergebnisse von mehreren veröffentlichten Untersuchungen werden nachfolgend zusammengefasst:
1. Ein Rattenmastektomiemodell wurde verwendet, um die Wirksamkeit von kommerziellem, durch Licht aktiviertem FS mit einem aus einer Blutbahn erhaltenem FS zu vergleichen. Beide zeigten eine Wirksamkeit (Wang et al., 1996). Dieselbe Gruppe (UV a) hat die Wirksamkeit von autologem FS in einem menschlichen Mastektomieversuch demonstriert (Moore et al., 1997).
2. Das Rattenmastektomiemodell wurde verwendet, um die Wirkung von Fbgn- und Thrombin-Konzentration auf die Wirksamkeit von FS bezüglich der Reduzierung des Seroma-Volumens zu bewerten. Obwohl statistisch nicht signifikant, zeigt der Trend, dass Seroma-Volumina sowohl mit zunehmender Fbgn-Konzentration als auch mit zunehmender Thrombin-Konzentration abnahmen. Der Basis-FS zeigte eine typische Wirksamkeit (Sanders et al., 1996).
3. Es wurde gezeigt, dass FS in einem Rattenmodell mit modifizierter radikaler Halssezierung wirksam ist. Fünf Tage nach dem chirurgischen Eingriff zeigten nur 10% der Versuchstiere Seroma, verglichen mit 85% der Kontrolltiere (Lindsey et al., 1988).
4. Das Rattenmastektomiemodell wurde von einer anderen Gruppe reproduziert, um die Wirksamkeit von FS bei der Reduzierung des Seroma-Volumens zu zeigen. Außerdem zeigte diese Untersuchung auch eine erhöhte Lappenanhaftung gegenüber dem Muskelbett 7 Tage nach dem chirurgischen Eingriff (Harada et al., 1992).

Träger für Wachstumsfaktoren und Chemotherapeutika

Das Fasernetzwerk in einer FS-Verklumpung kann als eine Drogenzuführungseinheit bzw. Medikamentenzuführungseinheit fungieren, die an einer spezifischen Stelle aufgebracht werden kann. Additive können in dem FS "gefangen" werden oder enzymatisch mit dem Fibrin vernetzt werden. Diese Art der Anwendung scheint sehr vielversprechend zu sein. Die Ergebnisse von mehreren veröffentlichten Untersuchungen werden nachfolgend zusammengefasst:
1. Ein Gemisch aus Endothel-Wachstumsfaktor und FS induzierte eine auf eine Stelle ausgerichtete Angiogenese von der Aorta zum Herzen in einem Rattenmodell, die Bewertung erfolgte 9 Wochen nach der Implantation (Fasol et al., 1994).
2. Das Antikrebsmittel MMC wurde mit FS konjugiert. Man stellte eine langsame Freisetzung sowie eine therapeutische Wirkung gegenüber einem bösartigen Tu mor in einem Mausmodell fest. Der Komplex war für normales Gewebe nicht gefährlich (Yano et al. 1995).
3. Ein Kaninchenautotransplantatmodell wurde verwendet, um zu zeigen, dass eine Abscheidung von FGF-b und FS die Revaskularisierung des ischämischen Luftweges aus dem Darmnetz erhöht und folglich zu einer verbesserten Epitelerhaltung eines Luftröhrenautotransplantats führt (Albes et al., 1994).
4. Eine saure FGF-FS-Mischung unterstützt die Regenerierung von einigen Nervenfasern, wenn es mit menschlichen Schwann-Zellen angebracht wird, um eine spinale mittlere Brustrippentransektion in einem Nacktrattenmodell zu überspannen (Guest et al., 1997).
Das Rattenmastektomiemodell wurde verwendet, um zu verifizieren, dass ein rational formulierter rhFS, enthaltend rhFbgn, rhThrombin und rhFXIII, in vivo funktional ist. Dies ist der erste vorklinische Beleg der Wirksamkeit eines vollständig rekombinanten humanen Fibrinklebers bzw. Fibrindichtungsmittels (rhFS). Dieses Modell ist etabliert und korreliert mit der klinischen Wirksamkeit. Dieses Modell verwendet rhFS als ein Hämostat, ein raumfüllendes Mittel und einen Klebstoff, um den Hautlappen zu befestigen. Weiterhin ist es eher ein chronisches als ein akutes Modell. Dieses Modell liefert eine wesentliche Herausforderung, um die Wirksamkeit von rhFS zu testen. Experimentelle Ergebnisse werden in den Beispielen vorgelegt.
Zusammenfassend lässt sich daher sagen, dass der Fibrinkleber, gemäß der Erfindung hergestellt aus drei gereinigten, gut charakterisierten, rekombinanten Komponenten, ein funktionales Produkt ist. Verdichtungsansätze, Thromboelastographie (TEG) und Messungen der optischen Dichte (OD) zeigen, dass die Wahl des Formulierungspuffers die funktionalen Eigenschaften (und die Gelstruktur) von rhFS signifikant beeinflussen können. TEG, Parallelplattenrheometrie und Zugadhäsionsansätze zeigen, dass rhFXIII in signifikanter Weise die Starrheit, Reißfestigkeit und Klebefestigkeit von rhFS erhöht. Fibrinolysansätze bzw. Fibrinolyseproben zeigen, dass rhFXIII die Abbaugeschwindigkeit von rhFS reduziert. Allerdings legen Zugadhäsionstests und die Literatur bezüglich Fibrinolysgeschwindigkeiten nahe, dass der vorteilhafte Effekt von rhFXIII durch Änderungen des Formulierungspuffers und der Gelstruktur moduliert werden kann. Schließlich zeigen in vivo-Experimente unter Verwendung eines Rattenmastektomiemodells die Wirksamkeit einer rational bestimmten Formulierung von rhFS in einem belegten Tiermodell. Dies ist die erste Demonstration der Wirksamkeit eines vollständig rekombinanten Fibrinklebers.
Die Erfindung wird durch die folgenden, nicht limitierenden Beispiele veranschaulicht.
1. Bestimmung der Fibrinogen-Konzentration unter Verwendung von Absorption.
2. Bestimmung der Thrombin-Konzentration unter Verwendung eines chromogenen Aktivitätsansatzes.
3. Bestimmung der Thrombin-Konzentration unter Verwendung eines Verklumpungsansatzes.
4. Bestimmung der Faktor-XIII-Konzentration unter Verwendung von ELISA.
5. Bestimmung von % verklumpbarem Fibrinogen.
6. Herstellung von konzentrierten Fibrinogenlösungen unter Verwendung von Ethanolausfällung.
7. Bestimmung des Widerstandes gegenüber Synärese unter Verwendung von Verdichtung.
8. Bestimmung der Gelbildungsgeschwindigkeit und der Geleigenschaften durch Thromboelastographie (TEG).
9. Bestimmung der Gelbildungsgeschwindigkeit und der Geleigenschaften durch Messungen der optischen Dichte.
10. Bestimmung der Gelbildungsgeschwindigkeit und der Geleigenschaften durch Parallelplattenrheometrie.
11. Bestimmung der Fibrinolysegeschwindigkeit durch Plasmin.
12. Bestimmung der adhäsiven Zugfestigkeit des Fibrinklebers.
13. Rattenmastektomiemodell.

BEISPIEL 1

Bestimmung der Fibrinogen-Konzentration unter Verwendung von Absorption

Dieses Verfahren verwendet die Absorption einer Fibrinogenlösung, um die Fibrinogen- Konzentration zu bestimmen.

Literaturstellen

1. Mihalyi E., Biochemistry, 7(1): 208-223 (1968)

Materialien

TBS: 20 mM Tris, pH 7,4, 120 mM NaCl
rhFibrinogen 0,1 bis 0,6 mg/ml in TBS
Quarz-Küvette, Weglänge 1 cm (Uvonic)
UV/Vis-Spektrofotometer

Verfahren

1. Auftauen der Fibrinogenlösung für 5 bis 30 Minuten bei 37ºC, Zentrifugieren bei 14.000 xg in einer Eppendorf-Zentrifuge für 5 Minuten, Aufbewahren bei Raumtemperatur.
2. Dialyse der Fibrinogenprobe gegen TBS, wenn der Formulierungspuffer störende Bestandteile enthält und für eine Blindwertbestimmung bzw. Eichung des Spektrofotometers nicht geeignet ist.
3. Verdünnen der Fibrinogenlösung auf 0,1 bis 0,6 mg/ml, so dass Azso im Bereich von 0,1 bis 0,9 AE liegt.
4. Nullwertbestimmung bzw. Eichung des Spektrofotometers gegen den Formulierungspuffer und Bestimmung der Konzentration des zu testenden Fibrinogens durch Messung der Absorption bei 280 nm und 320 nm [mg/ml Fbgn = (A&sub2;&sub8;&sub0;- A&sub3;&sub2;&sub0;)/1,51]. A&sub3;&sub2;&sub0; sollte auf Anzeichen einer Trübung untersucht werden, die anzeigen würde, dass die Fibrinogenlösung instabil ist und aggregiert.

BEISPIEL 2

Bestimmung der Thrombin-Konzentration unter Verwendung eines chromogenen Aktivitätsansatzes

Dieses Verfahren beschreibt einen Ansatz für die amidolytische Aktivität von Thrombin. Der Freisetzung von p-Nitroanilin aus einem synthetischen Substrat auf Grund der enzymatischen Wirkung von Thrombin folgt die Messung der Zunahme der Absorption bei 405 nm. Die quantitative Bestimmung von Thrombin wird durch Vergleich der Geschwindigkeit der Absorptionszunahme (v) mit einer Standardkurve unter den gleichen Bedingungen erreicht. Es ist anzumerken, dass von α-Thrombin, β-Thrombin und γ- Thrombin eine Aktivität gegenüber chromogenen Substraten berichtet wird, während ihre Verklumpungsaktivitäten variieren.

Literaturstellen

S. Sonder und J. Fenton II "Thrombin Specificity with Tripeptide Chromogenic Substrates", Clinical Chem., Band 32, Nr. 6, 1986.

Materialien

TBS/BSA-Puffer: 20 mM Tris, pH 7,4, 120 mM NaCl, 1 mg/ml BSA (Sigma)
hThrombin-Standard (HT 1002a: Enzyme Research Laboratories) Arbeitsstammlösung, Verdünnung von Thrombin bei -80ºC in 25 mM Tris, pH 7,4, 50% Glyzerin. Vorgeschlagen werden 100 ul/Ampulle bei 500 E/ml.
Spektrozyme TH-Substrat (H-D-HHT-L-Ala-L-Arg-pNA.2AcOH: American Diagnostica)
10%ige Essigsäurelösung
Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen (Nung Maxisorp)
Plattenableser bzw. Plattenablesevorrichtung für Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen (Molecular Devices)

Verfahren

1. Tägliches Entfernen einer Ampulle mit einer Arbeitsstandardverdünnung aus dem Kühlschrank und Verdünnen mit TBS/BSA auf die höchste Standardkonzentration einer gewünschten Standardkurve (das heißt 20 ug/ml: 31,7 ul Standardstammlösung + 968 ul TBS/BSA-Puffer).
2. Herstellung einer Reihe von 1 : 2-Verdünnungen, beginnend mit diesem Standard, für insgesamt mindestens 8 Standards; 100 ul Std. + 100 ul Puffer.
3. Verdünnen der Proben und Kontrollieren im TBS/BSA-Puffer, um sich innerhalb des Standardkurvenbereichs zu befinden. Zwei oder drei Verdünnungen jeder Probe sind im Allgemeinen mit eingeschlossen.
4. Zweifache Zugabe von 90 ul/Vertiefung an Probe, Standard, Kontrollen und Puffereichproben in die Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen.
5. Lösen von 50 mM chromogenem Spektrozyme TH-Substrat in 10 ml dH&sub2;O. Es wird Platte mit 5 ml benötigt.
6. Zugabe von 50 uI/Vertiefung an Substrat in die Platte.
7. Kinetisches Ablesen von A&sub4;&sub0;&sub5; für etwa 5 Minuten oder wie gewünscht. Alternativ ermöglicht man die Farbentwicklung über 7-10 Minuten und stoppt die Reaktion mit 50 ul/Vertiefung an 10%iger Essigsäure vor dem Ablesen von A&sub4;&sub0;&sub5;. Eine lineare Standardkurve kann dann konstruiert werden, indem die Konzentration in Ab hängigkeit von A&sub4;&sub0;&sub5; aufgetragen wird. Wiedergabe als E/ml-Thrombinaktivität. Für den kinetischen Ansatz ist die lineare Kurve an die Auftragung der Konzentration in Abhängigkeit von den anfänglichen linearen Geschwindigkeitspunkten anzupassen ( mOD/Minute), Wiedergabe als E/ml-Thrombinaktivität.

BEISPIEL 3

Bestimmung der Thrombin-Konzentration unter Verwendung eines Verklumpungsansatzes

Thrombinabbauprodukte können eine geringere Verklumpungsaktivität aufweisen, während sie bezüglich der amidolytischen (chromogenen) Aktivität die gleiche Aktivität aufweisen. Es ist daher notwendig, die Verklumpungsaktivität im Thrombinendprodukt zu erproben. Unter Verwendung der manuellen ST-4-Verklumpungsdetektionsvorrichtung, verkauft von American Bioproducts, wurde ein simpler Ansatz entwickelt. Diese Vorrichtung verwendet individuelle Einwegküvetten bei 37ºC und bestimmt den Verklumpungsendpunkt elektromechanisch. In jede Küvette wird ein kleines Eisenkügelchen gegeben, welches konstant durch die Probe (Thrombin) schwingt, was auf die alternierende Polarität eines elektromagnetischen Feldes zurückzuführen ist. Bei konstanter Viskosität bleibt die Bewegung konstant. Mit Zugabe von Fibrinogen und dem Beginn der Klumpenbildung erhöht sich die Viskosität, wodurch die Bewegung des Balls bzw. Kügelchens abnimmt. Ein Algorithmus verwendet die Änderung der Oszillationsamplitude, um die anfängliche Verklumpungszeit zu bestimmen. Die Vorrichtung wird in erster Linie in klinischen Labors für Koagulationstests bei Plasmaproben verwendet, aber sie kann problemlos für diese Art von Ansatz angepasst werden.

Materialien

hThrombin-Standard (HT 1002a: Enzyme Research Laboratories) Arbeitsstammlösung, Verdünnung von Thrombin bei -80ºC in 25 mM Tris, pH 7,4, 50% Glyzerin). Vorschlag: 100 ul/Ampulle bei 500 E/ml.
HFibrinogen (cat.#FIB3; pg und vWF und Fn abgereichert: Enzyme Research Labs)
TBS (20 mM Tris, 120 mM NaCl, pH 7,4)
TBS + 5 mM CaCl&sub2; + 0,1% BSA (Sigma)
ST-4-Verklumpungsdetektionssystem (American Bioproducts)

Allgemeines Verfahren

1. Tägliches Herstellen einer Fibrinogenlösung mit 0,25 mg/ml, Vorwärmen auf 37ºC.
2. Herstellung von Thrombinproben und Standardverdünnungen im linearen Bereich von 2,5 ug/ml bis 0,078 ug/ml (etwa 7, 7 bis 0,1 E/ml).
3. Starten des Instruments bzw. der Vorrichtung im "Fibrinogen"-Testmodus (delektiert weicheren Verklumpungsendpunkt).
4. Zugabe von 100 ul Thrombinprobe in die Küvette, 2 Minuten Inkubieren bei 37ºC.
5. Zugabe von 100 ul Fibrinogen mit einer automatisierten Pipette, um die Zeitvorrichtung und die Reaktion zu starten, gemessen werden die Sekunden bis zur Verklumpung.
6. Konstruieren der log/log-Standardkurve und Berechnen der Probenkonzentrationen von Thrombin.

BEISPIEL 4

Bestimmung der Faktor-XIII-Konzentration unter Verwendung von ELISA

Diese Protokoll ist eine Modifikation eines FXIII-ELISA-Standardprotokolls und verwendet polyklonalen Ab, gerichtet gegen rekombinanten FXIII [A&sub2;], für die Einfangreaktion und den gleichen pAb (biotinyliert) für die Detektion.

Materialien

Anti-FXIII-pAb (ZGI Charge D4679, 2,81 mg/ml) vom Kaninchen
biotinylierter Anti-FXIII-pAb (0,891 mg/ml) vom Kaninchen
Streptavidin-HRP (Pierce 21124)
rhFXIII-Standard (9-fache Charge)
OPD-Substrat (Sigma P8787)
30%ige Wasserstoffperoxidlösung
ELISA A (Beschichtungslösung): 0,1M Na&sub2;CO&sub3;, pH 9,6
ELISA B (Sperrpuffer): PBS, 0,05% Tween 20,1 % BSA
ELISA C (Waschpuffer): PBS, 0,05% Tween 20
OPD-Verdünnungsmittel (Farbentwicklung): 0,1M Zitrat, pH 5,0 (31,3 ml 0,1M Na- Zitrat + 187 ml 0,1M Zitronensäure)
Unterbrecherlösung: 1M H&sub2;SO&sub4;
ELISA-Platten mit 96 Vertiefungen (Nung Maxisorp)
Plattenableser für Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen (Molecular Devices)

Verfahren

1. Verdünnen von Anti-FXIII-pAb (ZGI Charge D4679, 2,81 mg/ml) vom Kaninchen auf ein Endkonzentration von 1 ug/ml in ELISA A (10 ml/Platte).
2. Zugabe von 100 ul/Vertiefung in die ELISA-Platten (Nung Maxisorp) und bei 4ºC über Nacht inkubieren.
3. 5-maliges Waschen der Vertiefungen mit ELISA C (200 ul/Vertiefung, 20 ml/Platte/Waschung).
4. Um die Platten zu blockieren, erfolgt Zugabe von 200 ul/Vertiefung (20 ml/Platte) an ELISA B und Inkubieren von mindestens 2 Stunden bei 37ºC unter Schütteln.
5. 5-maliges Waschen der Vertiefungen mit ELISA C (200 ul/Vertiefung).
6. Zugabe der Proben und Standards (100 ul/Vertiefung) und Inkubieren über mindestens 2,5 Stunden bei 37ºC unter Schütteln.
Die Standardlösung wurde hergestellt durch Zugabe von 10 ug/ml FXIII in ELISA B oder FXIII/Plasma. Da der Ansatz sehr empfindlich ist, wird eine 100-200 ug/ml Zwischenstammlösung von FXIII in PBS oder Wasser hergestellt und die Konzentration unter Verwendung von A&sub2;&sub8;&sub0; (c = 1,47) verifiziert, bevor die abschließende Verdünnung vorgenommen wird. Zwei 1 : 20-Reihenverdünnungen (100 ul + 1900 + 1900 ul) werden hergestellt, um die FXIII-Konzentration in den Arbeitsbereich des Ansatzes zu bringen, gefolgt von 7 1 : 2-Reihenverdünnungen (200 ul + 200 ul), um die Standardkurve zu erzeugen. 1 : 400 bis 1 : 25.600 entspricht 25 ng/ml bis 0,4 ng/ml in der Vertiefung, Alle Verdünnungen werden in ELISA B vorgenommen. Für eine routinemäßige Verwendung werden häufig drei Verdünnungen unbekannter Art verwendet (z. B. 1 : 500, 1 : 1000, 1 : 2000), sodass zumindest eine im linearen Responsbereich des Ansatzes liegt (~ 1-10 ng/ml).
7. 5-maliges Waschen der Vertiefungen mit ELISA C (200 ul/Vertiefung).
8. Verdünnen von biotinyliertem Anti-FXIII-pAb vom Kaninchen (0,891 mg/ml) auf eine Endkonzentration von 1 ug/ml in ELISA B, Zugabe von 100 ul/Vertiefung (10 ml/Platte) und Inkubieren über eine Stunde bei 37ºC unter Schütteln.
9. 5-maliges Waschen der Vertiefungen mir ELISA C (200 ul/Vertiefung).
10. Verdünnen von Streptavidin-HRP (Pierce #21124) auf eine Endkonzentration von 1 ug/ml in ELISA B, Zugabe von 100 ul/Vertiefung (10 ml/Platte) und Inkubieren über 45 Minuten bei 37ºC unter Schütteln.
11. 5-maliges Waschen der Vertiefungen mit ELISA C (200 ul/Vertiefung).
12. Lösen des OPD-Substrats (eine Tablette [Sigma P8787] in 12,5 ml OPD-Verdünnungsmittel) und Zugabe von 10 ul 30% H&sub2;O&sub2; unmittelbar vor der Verwendung.
13. Zugabe von 100 ul/Vertiefung (10 ml/Platte) an OPD-Lösung in die Platte und Beobachten hinsichtlich einer Farbentwicklung (gelb/orange).
14. Stoppen der Farbentwicklung durch Zugabe von 100 ul/Vertiefung IM H&sub2;SO&sub4; (Ansätze brauchen für die Entwicklung etwa 1 Minute bis 45 Sekunden).
15. Ablesen der Platte bei 490 nm.

BEISPIEL 5

Bestimmung des prozentualen Wertes an verklumpbarem Fibrinogen

Dieses Verfahren vergleicht die Menge an Fbgn in einer Lösung vor der Verklumpung mit der Menge an unverklumptem Protein, die nach der Zugabe von Thrombin vorliegt, und der Menge an Fbgn in der gewaschenen Verklumpung, um den prozentualen Anteil an ursprünglichem Fbgn zu bestimmen, der in die Verklumpung eingefügt wurde. Der auf der Messung des nicht eingefügten Proteins basierende Wert ist weniger genau, da Fibrinogenherstellungen hoher Qualität zu 95% oder mehr verklumpbar sind und es verbleibt zu wenig Protein in der Lösung, um eine genaue Messung vorzunehmen. Die Absorption wird verwendet, um Fbgn-Konzentrationen zu bestimmen. Anzumerken ist der unterschiedliche Extinktionskoeffizient für Fbgn, in Abhängigkeit davon, ob es in gepufferter Salzlösung (TBS oder PBS) oder in einer alkalischen Harnstofflösung gelöst wird.

Literaturstellen

1. Blomback, Birger & Blomback, Margareta, ARKIV FOR KEMI, Band 10, Nr. 29, 1956.
2. Mihalyi E., Biochemistry, 7(1): 208-223 (1968)

Materialien

40% Harnstoff in 0,2 N NaOH (frisch hergestellt)
15 mM Phosphatpuffer, pH 6,5, 75 mM NaCl
TBS: 20 mM Tris, pH 7,4, 120 mM NaCl
rhFibrinogen 1,5 bis 3,0 mg/ml in TBS
100 NIH-Einheiten/ml hThrombin (verdünnt aus 500 NIH-Stammlösung in Phosphatpuffer)
150 mM NaCl
Quarz-Küvette
UV-Vis-Spektrofotometer

Verfahren

1. Bestimmung der Konzentration von zu testendem Fbgn durch Messung der Absorption bei 280 nm [mg/ml Fbgn = (A&sub2;&sub8;&sub0;-A&sub3;&sub2;&sub0;)/1,51], Einstellen der Konzentration auf 1,5-3,0 mg/ml mit TBS, falls notwendig.
2. Bestimmung der Absorption der Fbgn-Ausgangslösung in der Harnstoff/NaOH- Lösung. Zugabe von 100 ul an Fbgn-Lösung zu 1 ml des Harnstoff/NaOH- Reagens. Messung der Absorption bei 282 nm (innerhalb von 10 Minuten, falls dies möglich ist)*, [mg/ml Fbgn = (A&sub2;&sub8;&sub2;-0,01)/0,148]. Hinzuweisen ist auf die Änderung der Wellenlänge und des Extinktionskoeffizienten.
* Wird innerhalb von 10 Minuten abgelesen, läuft die Steigung der Absorption/Konzentration durch Null. Die Messung ist für bis zu 4 Stunden gültig, aber nach 30 Minuten wird die Linie durch 0,01 AE von Null verschoben. Der Wert 0,148 für den Extinktionskoeffizienten beinhaltet einen Korrekturfaktor für die 1 : 11-Verdünnung, basierend auf dem 1%igen Extinktionskoeffizienten von 16,17. Dieser Extinktionskoeffizient ist geeignet für Fbgn aus Cohn-Fraktion I (EtOH ppt) oder größerer Reinheit in Harnstoff/NaOH.
3. Zu 1 ml der Fbgn-Ausgangslösung wird zugegeben: 2 ml 15 mM Phosphatpuffer, pH 6,5, 75 mM NaCl und 0,15 ml 100 NIH E/ml Thrombinlösung.
4. Man lässt die Lösung für 2 Stunden bei Raumtemperatur verklumpen.
5. Synärisieren (Komprimieren) der Verklumpung durch Verwirbeln und Pressen mit einem kleinen Spatel, um die überstehende Flüssigkeit zu verdrängen.
6. Dekantieren der überstehenden Lösung und Bestimmung der Proteinkonzentration wie in Schritt 1 [mg/ml Fbgn = = (A&sub2;&sub8;&sub0;-A&sub3;&sub2;&sub0;)/1,51].
7. 3-maliges Waschen der Verklumpung mit 0,15M NaCl.
8. Auflösen der Verklumpung in 1 ml Harnstoff/NaOH und 100 ul TBS. Nach dem Auflösen Bestimmung der Konzentration, wie in Schritt 2 beschrieben [mg/ml Fbgn = (A&sub2;&sub8;&sub2;-0,01)/0,148].
9. Die Konzentration von nicht verklumptem Fbgn, das in der überstehenden Flüssigkeit verbleibt (Schritt 6), und von Fbgn in der Verklumpung (Schritt 8) sollte 100% Fbgn in der Ausgangslösung ergeben.

BEISPIEL 6

Herstellung von konzentrierten Fibrinogenlösungen unter Verwendung von Ethanolausfällung

Ausfällung unter Verwendung von Ethanol (EtOH) und niedriger Temperatur wird verwendet, um die verdünnten Fibrinogenlösungen für die Herstellung von Fibrinkleber in in vivo- oder in vitro-Experimenten ausreichend zu konzentrieren. Zahlreiche in vivo- Modelle für Fibrinkleber verlangen Fibrinogen-Endkonzentrationen im Bereich von 20-30 mg/ml. Dies entspricht 40-60 mg/ml Fibrinogen in der 2x Arbeitslösung vor dem Mischen mit der Thrombinlösung. Unter Verwendung der EtOH-Ausfällung können routinemäßig Konzentrationen von 60-70 mg/ml Fibrinogen erhalten werden.
Während andere Ausfällungsverfahren zugänglich sind (Glycin oder Ammoniumsulfat), ist die Ausfällung mit EtOH einfacher und schneller, da das Ausfällungsmittel problemlos entfernt werden kann.

Literaturstelle

Dahlstrom K. K. etal., Plast. Reconstr. Surg. 1992; 89: 968-72.

Materialien

95% EtOH (EtOH sollte ohne Additive/Verunreinigungen vorliegen)
TBSz*-Dialysepuffer: (102 mM NaCl, 20 mM Tris, 0,02% NaN&sub3;, pH 7,4)
Brookfield TC500-Kühlbad oder ein MeOH/H&sub2;O/Trockeneisbad bei -3,8ºC
Dialyseschlauch: 10-14.00 MG Grenzwert
gekühlte Zentrifuge

Verfahren

1. Bestimmung der Konzentration von zu konzentrierendem Fibrinogen durch Messung der Absorption bei 280 nm und 320 mn [mg/ml Fbgn = (A&sub2;&sub8;&sub0;-A&sub3;&sub2;&sub0;)/1,51].
2. Bei Raumtemperatur tropfenweise Zugabe von EtOH zu der Fibrinogenlösung bei leichter Verwirbelung/Vermischung auf eine Endkonzentration von 10 Vol.-% E- tOH.
3. Anbringen des Fibrinogens in dem Bad mit -3,8ºC über einen Zeitraum von 35 Minuten. Wird ein Trockeneisbad verwendet, ist die Temperatur bei minimalen Fluktuationen aufrecht zu erhalten. Der Schlauch bzw. die Schläuche sind während des Ausfällungsverfahrens nicht zu mischen oder zu stören.
4. Zentrifugieren der Lösung bei -3ºC bei 2500 xg für 20 Minuten.
5. Abdekantieren der überstehenden Flüssigkeit und Bestimmung der Konzentration von nicht ausgefälltem Fibrinogen durch Messung der Absorption bei 280 nm und 320 nm [mg/ml Fbgn = (A&sub2;&sub8;&sub0;-A&sub3;&sub2;&sub0;)/1,51], Wirkungsgrade der Ausfällung von > 90% sind üblich.
6. Anbringen des Pellets im Dialyseschlauch, Erwärmen auf 37ºC und tropfenweise Zugabe einer minimalen Menge an TBSz* über mehrere Stunden hinweg, um das Pellet aufzulösen. Durchführung der Dialyse gegen TBSz*, bis sich das Pellet aufgelöst hat, im Allgemeinen über Nacht (Fibrinogen aus unterschiedlichen Quellen kann in seinem Verhalten variieren).
7. Sammeln des gelösten Fibrinogens und Bestimmung der Konzentration durch Messung der Absorption bei 280 nm und 320 nm [mg/ml Fbgn = (A&sub2;&sub8;&sub0;-A&sub3;&sub2;&sub0;)/1,51], abschließende Wiedergewinnung von 70% ist üblich.
* Wird das Material in vitro verwendet, ist NaN&sub3; steriler Filter, Fibrinogen vor der EtOH-Ausfällung wegzulassen, und sind alle offenen Arbeiten in einem laminaren Luftstromabzug unter Verwendung steriler Puffer und Gewebekulturtechniken durchzuführen.

BEISPIEL 7

Bestimmung des Widerstandes gegenüber Synärese unter Verwendung von Verdichtung

Verdichtung misst die Kompressibilität eines Fibrinklebers, wenn er einer Zentrifugalkraft ausgesetzt wird. Die Kompressibilität wird ausgedrückt als der prozentuale Wert des ursprünglichen Volumens, das durch das Gel nach dem Zentrifugieren beibehalten wird. Je höher der prozentuale Wert des beibehaltenen ursprünglichen Volumens ist, desto größer ist der Widerstand gegenüber Kompression bzw. Verdichtung (Synerese). Allgemein korreliert der Widerstand gegenüber Kompressibilität mit hohem Elastizitätsmodul und hoher Zugfestigkeit. In diesem Ansatz werden zwei Lösungen, Fibrinogen +/- FXIII und Thrombin + CaCl&sub2;, hergestellt, so dass sie zweifach sind bezüglich Fbgn-, FXIII, Thrombin- und CaCl&sub2;-Konzentration und einfach sind in der Konzentration jeglichen Additivs (Salz, Zucker). Die Thrombin-Konzentration muss allgemein unterhalb von 3-5 E/ml (Endkonzentration) bleiben, um eine vorzeitige Verklumpung zu vermeiden und es der Lösung zu ermöglichen, gemischt zu werden und in die Röhrchen pipettiert zu werden.

Literaturstelle

Dhall et al., Thromb. Haemastas, 1976; 35: 737-45

Materialien

TBSz (20 mM Tris-HCl, 120 mM NaCl, 0,02% NaN&sub3;)
rhFibrinogen-Lösung (6 mg/ml in TBSz + rhFXIII bei zweifacher Konzentration + Additive bei einfacher Konzentration)
rhThrombin-Lösung (2 E/ml in TBSz + 40 mm CaCl&sub2; und Additive bei einfacher Konzentration)
Lecithin oder nicht haftendes Backspray (PAM, American Home Foods)
500 ul Eppendorf-Röhrchen
Eppendorf-Zentrifuge
1 cm³ Tuberculinspritze mit einer 26 g-Nadel

Verfahren

1. Bestimmung der Konzentration von rhFibrinogen und rhFXIII durch Messung der Absorption bei 280 nm und 320 nm [mg/ml Fbgn = (A&sub2;&sub8;&sub0;-A&sub3;&sub2;&sub0;)/1,51] und [mg/ml rhFXIII = (A&sub2;&sub8;&sub0;-A&sub3;&sub2;&sub0;)/1,49].
2. Beschichten der Eppendorf-Röhrchen (1,5 oder 0,5 ml) mit Lecithin oder PAM.
3. Herstellung der Fibrinogenlösungen.
4. Herstellung der Thrombinlösungen, Herstellung von Zwischenverdünnungen (üblicherweise 80 E/ml) von rhThrombin in TBSz, enthaltend 1 % PEG, Herstellen von 2x rhThrombin-Arbeitslösungen, jeweils frisch für jede Messung.
5. Erwärmen der Lösung in einem Wasserbad mit einer Temperatur von 37ºC für 5 Minuten.
6. Mischung gleicher Volumina (üblicherweise jeweils 250 ul) der Fibrinogenlösung und Thrombinlösung und Pipettieren in die vorgewogenen und mit Lecithin behandelten Röhrchen.
7. Inkubieren der Röhrchen für 1 Stunde in einem Wasserbad mit einer Temperatur von 37ºC.
8. Zentrifugieren der Röhrchen bei 8000 xg (10.000 U/Minute) für 45 Sekunden in einer Eppendorf-Zentrifuge bei Raumtemperatur.
9. Entfernen der Flüssigkeit oberhalb der komprimierten Probe mit einer vorgewogenen 1 cm³ Tuberculinspritze mit einer 26 g-Nadel, dann Rückwiegen.
10. Berechnen des prozentualen Wertes des beibehaltenen ursprünglichen Volumens = 100* (Gewicht des unkomprimierten Gels minus Gewicht der Flüssigkeit) / Gewicht des unkomprimierten Gels.

BEISPIEL 8

Bestimmung der Gelbildungsgeschwindigkeit und der Geleigenschaften durch Thromboelastographie (TEG)

TEG misst die Scherelastizität einer sich entwickelnden Verklumpung durch ein oszillierendes Gefäß und einen statischen Stift, der in die Verklumpung eingebettet ist. "Steifheit", Verklumpungszeit und Gelbildungsgeschwindigkeit werden bestimmt. In diesem Ansatz werden zwei Lösungen, Fibrinogen +/- FXIII und Thrombin -1- CaCl&sub2;, hergestellt, so dass sie zweifach sind bezüglich Fbgn-, FXIII-, Thrombin- und CaCl&sub2;- Konzentration und einfach sind in der Konzentration jeglicher Additive (Salz, Zucker). Die Thrombin-Konzentration muss allgemein unterhalb 3-5 E/ml (Endkonzentration) bleiben, um eine vorzeitige Verklumpung zu vermeiden und es der Lösung zu ermöglichen, gemischt und in die Röhrchen pipettiert zu werden.

Materialien

TBSz (20 mM Tris-HCl, 120 mM NaCl, 0,02% NaN&sub3;)
rhFibrinogen-Lösung (6 mg/ml in TBSz + rhFXIII bei zweifacher Konzentration + Additive bei einfacher Konzentration)
rhThrombin-Lösung (2 E/ml in TBSz + 40 mm CaCl&sub2; und Additive in einfacher Konzentration)
Mineralöl
Thromboelastograph (Haemoscope Corp. Morion Grove IL)

Verfahren

1. Bestimmung der Konzentration von rhFibrinogen und rhFXIII durch Messung der Absorption bei 280 nm und 320 nm [mg/ml Fbgn = (A&sub2;&sub8;&sub0;-A&sub3;&sub2;&sub0;)/1,51] und [mg/ml rhFXIII = (A&sub2;&sub8;&sub0;-A&sub3;&sub2;&sub0;)/1,49].
2. Herstellung der Fibrinogenlösungen (225 ul wird für jeden TEG-Durchlauf verwendet).
3. Herstellung der Thrombinlösungen, Herstellung von Zwischenverdünnungen (üblicherweise 80 E/ml) von rhThrombin in TBSz, enthaltend 1 % PEG. Herstellen von 2x rhThrombin-Arbeitslösungen, jeweils frisch für jede Messung (225 ml wird für jeden TEG-Durchlauf verwendet).
4. Vorwärmen der Lösung in einem Wasserbad mit einer Temperatur von 37ºC für 5 Minuten.
5. Zugabe von 200 ul der Thrombinlösung in ein Eppendorf-Röhrchen, Starten des TEG-Durchlaufs und Zugabe von 200 ul der Fibrinogenlösung und 4-6-faches Mischen in Abhängigkeit von dem Thrombingehalt.
6. Rasches Pipettieren von 360 ul des gemischten Klebers bzw. Dichtungsmittels in das TEG-Gefäß unter Verwendung von Umkehrpipettierung, um Bläschen zu vermeiden.
7. Zugabe mehrerer Tropfen von Mineralöl in jede Seite des Gefäßes, um ein Austrocknen des Klebers während des Durchlaufs zu vermeiden. Sammeln der Daten nach Bedarf (930-120 Minuten).
8. Gelbildungszeit (K), Gelbildungsgeschwindigkeit (Winkel) und Starrheit (Amplitude) werden berechnet und von der TEG-Software wiedergegeben.

BEISPIEL 9

Bestimmung der Gelbildungsgeschwindigkeit und der Geleigenschaften durch Messungen der optischen Dichte

Die Verknüpfung von Fibrinogenmonomeren, die der Thrombin induzierten Freisetzung von Fibrinopeptiden folgt, führt zu einer Gelbildung, die spektrofotometrisch als eine Zunahme der optischen Dichte (Trübheit bzw. Trübung) in Abhängigkeit von der Zeit verfolgt werden kann. Gelbildungszeit, Geschwindigkeit der Verklumpungsbildung und die maximale OD können bestimmt werden. Je höher die OD, desto dicker sind die Fibrinfasern und desto "gröber" ist das Gel. In diesem Ansatz werden zwei Lösungen, Fibrinogen +/- FXIII und Thrombin + CaCl&sub2;, hergestellt, so dass sie zweifach sind bezüglich Fbgn, FXIII, Thrombin und CaCl&sub2; und einfach sind in der Konzentration jeglicher Additive (Salz, Zucker). TBSz + 1x Additive stellen die Eichlösung bzw. Lösung für die Blindwertbestimmung dar. Die Thrombin-Konzentration muss allgemein unterhalb von 3-5 E/ml (Endkonzentration) bleiben, um eine vorzeitige Verklumpung zu vermeiden und es der Lösung zu ermöglichen, gemischt und in die Küvette pipettiert zu werden. Um den Ansatz zu starten, werden die beiden Lösungen in gleichen Volumenanteilen gemischt und die OD der Probe wird als Funktion der Zeit gemessen.

Materialien

TBSz (20 mM Tris-HCl, 120 mM NaCl, 0,02% NaN&sub3;)
rhFibrinogen-Lösung (6 mg/ml in TBSz + rhFXIII bei zweifacher Konzentration + Additive bei einfacher Konzentration)
rhThrombin-Lösung (2 E/ml in TBSz + 40 mm CaCl&sub2; und Additive in einfacher Konzentration)
Quarz-Küvette* (Uvonic)
UV-Vis-Spektrofotometer (Hewlett Packard 8452A Diode Array Spektrofotometer oder Ähnliches)
* Beträgt die Fibrinogen-Konzentration 0,2 mg/ml, kann eine Küvette mit einer Weglänge von 1 cm verwendet werden. Wird die Konzentration auf 3,0 mg/ml Fbgn erhöht, wird eine Küvette mit einer Weglänge von 1 mm verwendet.

Verfahren

1. Bestimmung der Konzentration von rhFibrinogen und rhFXIII durch Messung der Absorption bei 280 nm und 320 nm [mg/ml Fbgn = (A&sub2;&sub8;&sub0;-A&sub3;&sub2;&sub0;)/1,51] und [mg/ml rhFXIII = (A&sub2;&sub8;&sub0;-A&sub3;&sub2;&sub0;)/1,49].
2. Bestimmung des in der Küvette benötigten Volumens, so dass die Lösungshöhe oberhalb des Lichtweges liegt. Dies ist das Volumen jeder Lösung, das für jede Messung benötigt wird.
3. Herstellung der Fibrinogenlösungen.
4. Herstellung der Thrombinlösungen", Herstellung von Zwischenverdünnungen (üblicherweise 80 E/ml) von rhThrombin in TBSz, enthaltend 1% PEG, Herstellen von 2x rhThrombin-Arbeitslösungen, jeweils frisch für jede Messung.
5. Erwärmen der Lösung in einem Wasserbad mit einer Temperatur von 37ºC für 5 Minuten.
6. Eichen des Spektrofotometers mit einer Küvette, die TBSz enthält (+ 1x Additive, falls vorhanden).
7. Mischen der Fibrinogen- und Thrombinlösung im Verhältnis von 1 : 1. Zugabe der Fibrinogenlösung in ein Eppendorf-Röhrchen, Zugabe eines gleichen Volumenanteils an rhThrombin-Lösung und 4-6-faches Mischen mit der Pipette. Dispensieren des benötigten Volumens in die Küvette im Spektrofotometer unter Verwendung von Umkehrpipettierung. Beginnen mit dem Ablesen, sobald die Lösungen gemischt werden. Messung der Absorption (OD) als Funktion der Zeit (etwa alle 2 Sekunden) bei Wellenlängen von 350-600. Die Gesamtaufzeichnungszeit hängt von den experimentellen Endpunkten und den Additiven, die die Verklumpungsparameter verändern können, ab (üblicherweise 10 Minuten).

BEISPIEL 10

Bestimmung der Gelbildungsgeschwindigkeit und der Geleigenschaften durch Parallelplattenrheometrie

Das Rheometer misst die viskoelastischen Eigenschaften eines sich entwickelnden Gels durch eine oszillierende kreisförmige Platte. Zeitabhängige Messungen können bei einem sehr kleinen Deformationsgrad (% Verformung) vorgenommen werden, so dass die Gelstruktur nicht beschädigt wird. Weiterhin kann der Deformationsgrad und folglich der Betrag der angewendeten Kraft (Beanspruchung) erhöht werden, bis das Gel reißt bzw. bricht, um ein Maß für die kohäsive Festigkeit zu erhalten. In diesem Ansatz werden zwei Lösungen, Fibrinogen +/- FXIII und Thrombin + CaCl&sub2;, hergestellt, so dass sie zweifach sind bezüglich Fbgn-, FXIII-, Thrombin- und CaCl&sub2;-Konzentration und einfach sind in der Konzentration jeglicher Additive (Salz, Zucker). Im Gegensatz zum Thromboelastographen kann das Parallelplattenrheometer die Eigenschaften des Fibrinklebers bei voller Arbeitskonzentration messen (~ 30 mg/ml Fibrinogen, Endkonzentration). Die Thrombin-Konzentration muss allgemein unterhalb von 3-5 E/ml (Endkonzentration) bleiben, um eine vorzeitige Verklumpung zu vermeiden und es der Lösung zu ermöglichen, gemischt und in die Röhrchen pipettiert zu werden.

Materialien

TBSz (20 mM Tris-HCl, 120 mM NaCl, 0,02% NaN&sub3;)
TBSz + 1% PEG-8000 (Fluka 81288)
rhFibrinogen-Lösung (60 mg/ml in TBSz + rhFXIII bei zweifacher Konzentration + Additive bei einfacher Konzentration)
rhThrombin-Lösung (2 E/ml in TBSz + 40 mm CaCl&sub2; und Additive bei einfacher Konzentration)
CSL²-500-Rheometer
2 cm Edelstahl-Parallelplattengeometrie mit Lösungsmittelfalle, um ein Austrocknen der Probe während der Messung zu vermeiden.

Verfahren

1. Equilibrieren des Rheometers bei 37ºC, auf Null stellen und die Lücke bzw. den Abstand auf 100 um festlegen. Erneut auf Null stellen, nachdem das Instrument bei 37ºC equilibriert wurde, und Bestätigen, dass die Lücke und das Volumen, welches die Lücke auffüllen soll, korrelieren, ansonsten erneut auf Null stellen.
2. Auftauen von rhFbgn für 10 Minuten bei 37ºC, Zentrifugieren bei 14.000 U/Minute für 5 Minuten in einer Eppendorf-Zentrifuge und Bestimmung der Konzentration von rhFibrinogen- und rhFXIII-Lösungen durch Messung der Absorption bei 280 nm und 320 nm [mg/ml Fbgn = (A&sub2;&sub8;&sub0;-A&sub3;&sub2;&sub0;)/1,51] und [mg/ml rhFXIII = (A&sub2;&sub8;&sub0;-A&sub3;&sub2;&sub0;)/1,49].
3. Herstellung der Fibrinogenlösungen (20 ul wird für jeden TEG-Durchlauf verwendet).
4. Herstellung der Thrombinlösungen. Herstellung von Zwischenverdünnungen (üblicherweise 80 E/ml) von rhThrombin in TBSz, enthaltend 1% PEG. Herstellen von 2x rhThrombin-Arbeitslösungen, jeweils frisch für jede Messung (20 ul wird für jeden TEG-Durchlauf verwendet).
5. Vorwärmen der Lösung in einem Wasserbad mit einer Temperatur von 37ºC für 5 Minuten.
6. Zugabe von 20 ul der Thrombinlösung in ein Eppendorf-Röhrchen.
7. Zugabe von 20 ul der Fibrinogenlösung, 4-6-faches Mischen und Pipettieren von 32 ul in die fixierte untere Platte des Rheometers. Starten des Durchlaufs. Die untere Platte wird sich anheben und der FS sollte die Lücke zwischen der fixierten unteren Platte und der oszillierenden oberen Platte genau ausfüllen. Übliche Einstellungen sind 2 cm parallele Platten, 100 um. Abstand bzw. Lücke, 37ºC, 1 Hz Oszillationen bei 1% Verformung für 30 Minuten, gefolgt von Oszillationen mit stetig zunehmendem Moment (und % Verformung), bis das Gel reißt bzw. bricht. Elastizitätsmodul: G' (Pa) und Viskositätsmodul: G" (Pa) bei 30 Minuten und Oszillationsbeanspruchung bei Riss bzw. Bruch (Pa) werden angegeben.

BEISPIEL 11

Bestimmung der Fibrinolysegeschwindigkeit durch Plasmin

Fibrinolysegeschwindigkeiten werden verwendet, um den Effekt von Änderungen in Formulierungsvariablen auf die Gelstruktur und die Zersetzungsgeschwindigkeit bzw. Abbaugeschwindigkeit des Fibrinklebers zu untersuchen. Im Allgemeinen korrelieren niedrigere Lysisgeschwindigkeit in vitro mit langsameren bzw. geringeren Abbaugeschwindigkeiten in vivo. Fibringele werden hergestellt, in verdünnten Plasminlösungen suspendiert und leicht geschüttelt. Zu Beginn des Ansatzes gibt es außer Plasmin nahezu kein lösliches Protein in der Probe. Bei der Zersetzung bzw. dem Abbau des Gels durch Plasmin werden lösliche Fibrinfragmente freigesetzt, die durch Absorption der Lösung gemessen werden können, nachdem das Gel vollständig lysiert wurde.
Bei diesem Ansatz werden zwei Lösungen, Fibrinogen +/- FXIII und Thrombin + CaCl&sub2;, hergestellt, so dass sie zweifach sind hinsichtlich Fbgn-, FXIII-, Thrombin- und CaCl&sub2;-Konzentration und einfach sind in der Konzentration jeglicher Additive (Salz, Zucker). Dieser Ansatz verwendet Fibrinkleber bei voller Arbeitskonzentration (~ 30 mg/ml Fibrinogen, Endkonzentration). Die Thrombin-Konzentration muss allgemein unterhalb von 3-5 E/ml (Endkonzentration) bleiben, um ein vorzeitiges Verklumpen zu vermeiden und es der Lösung zu ermöglichen, gemischt und in die Röhrchen pipettiert zu werden.

Literaturstellen

K. R. Siebenlist und M. W. Mosesson, J. Biol. Chem. (1994) 45(11), 28418-28419.
M. W. Edwards et al. Fibrinolysis (1993) 7, 211-216.

Materialien

TBSz (20 mM Tris-HCl, 120 mM NaCl, 0,02% NaN&sub3;)
rhFibrinogen-Lösung (60 mg/ml in TBSz + rhFXIII bei zweifacher Konzentration + Additive bei einfacher Konzentration)
rhThrombin-Lösung (2 E/ml in TBSz + 40 mM CaCl&sub2; und Additive in einfacher Konzentration)
humanes Plasmin (Cat# Hplas: Enzyme Research Labs)
Lysis-Puffer (50 mM Tris-HCl, pH 8,6, 10 mM CaCl&sub2;)
Eppendorf-Röhrchen
Quarz-Küvetten mit einer Weglänge von 1 cm (Uvonic)
UV-Vis-Spektrofotometer (Hewlett Packard 8452A Diode Array Spektrofotometer oder Ähnliches)

Verfahren

1. Bestimmung der Konzentration von rhFibrinogen und rhFXIII durch Messung der Absorption bei 280 nm und 320 nm [mg/ml Fbgn = (A&sub2;&sub8;&sub0;-A&sub3;&sub2;&sub0;)/1,51] und [mg/ml rhFXIII = (A&sub2;&sub8;&sub0;-A&sub3;&sub2;&sub0;)/1,49].
2. Herstellung der Fibrinogenlösungen.
3. Herstellung der Thrombinlösungen. Herstellung von Zwischenverdünnungen (üblicherweise 80 E/ml) von rhThrombin in TBSz, enthaltend 1% PEG. Herstellen von 2x rhThrombin-Arbeitslösungen, jeweils frisch für jede Messung.
4. Erwärmen der Lösung in einem Wasserbad mit einer Temperatur von 37ºC für 5 Minuten.
5. Mischen gleicher Volumina (üblicherweise jeweils 20 ul) der Fibrinogenlösung und Thrombinlösung in einem Eppendorf-Röhrchen.
6. Inkubieren der Röhrchen über Nacht in einem Wasserbad mit einer Temperatur von 37ºC.
7. Unter Verwendung eines Spatels die Gele in jedem Röhrchen vorsichtig lockern bei minimaler Deformation.
8. Zugabe von 1,2 ml 8 ug/ml (etwa 0,2 cu/ml) Plasminlösung in jedes Röhrchen. Das Volumen der zugegebenen Plasminlösung hängt von der Menge an lysiertem Fibrin ab. Idealerweise beträgt die Absorption der Lösung nach vollständiger Lysis etwa 0,9 AE ohne Verdünnung.
9. Vorsichtiges Schütteln der Röhrchen bei 37ºC, um die Gele in der Schwebe zu halten. Die Lysis-Geschwindigkeiten hängen von der Oberfläche des Gels ab, die dem Plasmin ausgesetzt ist, so dass die Messungen ungültig sind, wenn das Gel nicht frei schwebt.
10. Messung der Absorption bei 280 nm und 320 nm zu festgelegten Zeitpunkten.
11. Messung der Absorption bei 280 nm und 320 nm, nachdem das Gel vollständig lysiert wurde.
12. Berechnung von % Lysis zu jedem Zeitpunkt: % Lysis = 100* (A&sub2;&sub8;&sub0;-A&sub3;&sub2;&sub0;) Zeit t/(A&sub2;&sub8;&sub0;-A&sub3;&sub2;&sub0;) vollständige Lysis.

BEISPIEL 12

Bestimmung der adhäsiven Zugfestigkeit des Fibrinklebers

Die adhäsive Zugfestigkeit des Fibrinklebers wird gemessen durch Bedeckung bzw. Abdeckung der sich gegenüber liegenden Oberflächen von zwei ineinander greifenden Edelstahleinspannvorrichtungen mit dem Material, an dem der Kleber anhaften soll (Klebstoffträger). Diese Oberflächen werden durch dünne Abstandshalter getrennt, so dass ein bekanntes Volumen an Kleber die Lücke zwischen den beiden Klebstoffträgern auffüllen wird. Der Fibrinkleber wird zwischen dem Klebstoffträger angebracht und erfährt eine Gelbildung. Nach der Gelbildung werden die Einspannvorrichtungen in einer Fixiervorrichtung auf einer Instron-Materialprüfungsvorrichtung angebracht. Die Einspannvorrichtungen werden dann bei einer konstanten Geschwindigkeit auseinander gezogen und die erzeugte Kraft wird gemessen, bis der Kleber versagt bzw. bricht und die Einspannvorrichtungen getrennt werden. In diesem Ansatz werden zwei Lösungen, Fibrinogen +/- FXIII und Thrombin + CaCl&sub2;, hergestellt, so dass sie zweifach sind hinsichtlich Fbgn-, FXIII-, Thrombin- und CaCl&sub2;-Konzentration und einfach sind in der Konzentration jeglicher Additive (Salz, Zucker). Dieser Ansatz kann die Eigenschaften von Fibrinkleber bei voller Arbeitskonzentration messen (~ 30 mg/ml Fibrinogen, Endkonzentration). Die Thrombin-Konzentration muss allgemein unterhalb von 3-5 E/ml (Endkonzentration) bleiben, um eine vorzeitige Verklumpung zu vermeiden und es der Lösung zu ermöglichen, gemischt und in die Einspannvorrichtung pipettiert zu werden.

Materialien

TBSz (20 mM Tris-HCl, 120 mM NaCl, 0,02% NaN&sub3;)
TBSz + 1% PEG-8000 (Fluka 81288)
rhFibrinogen-Lösung (60 mg/ml in TBSz + rhFXIII bei zweifacher Konzentration + Additive bei einfacher Konzentration)
rhThrombin-Lösung (2 E/ml in TBSz + 40 mM CaCl&sub2; und Additive in einfacher Konzentration)
Instron-Modell 4501, Materialprüfungsvorrichtung
Edelstahleinspannvorrichtungen für Zugversuch (Durchmesser 2 cm) und Befestigungsvorrichtungen
5-Minuten-Epoxykleber (Devcon)
0,005" dicke Silastic-Schicht mit matter Oberflächenbeschaffenheit (Dow Corning), 6x in Chloroform extrahiert, im Ofen getrocknet.

Verfahren

1. Verwendung von 5-Minuten-Epoxykleber, Verkleben von Silastic-Scheiben mit 2 cm (Klebstoffträger) auf die Edelstahleinspannvorrichtungen. Mindestens 30 Minuten setzen lassen und equilibrieren der Einspannvorrichtungen auf 37ºC.
2. Auftauen von rhFbgn für 10 Minuten bei 37ºC, Zentrifugieren bei 14.000 U/Minute für 5 Minuten in einer Eppendorf-Zentrifuge und Bestimmung der Konzentration von rhFibrinogen- und rhFXIII-Lösungen durch Messung der Absorption bei 280 nm und 320 nm [mg/ml Fbgn = (A&sub2;&sub8;&sub0;-A&sub3;&sub2;&sub0;)/1,51] und [mg/ml rhFXIII = (A&sub2;&sub8;&sub0;-A&sub3;&sub2;&sub0;)/1,49].
3. Herstellung der Fibrinogenlösungen (20 ul werden für jede Einspannvorrichtung verwendet.
4. Herstellung der Thrombinlösungen, Herstellung von Zwischenverdünnungen (üblicherweise 80 E/ml) von rhThrombin in TBSz, enthaltend 1% PEG. Herstellen von 2x rhThrombin-Arbeitslösungen, jeweils frisch für jede Messung (20 ul wird für jede Einspannvorrichtung verwendet).
5. Vorwärmen der Lösung in einem Wasserbad mit einer Temperatur von 37ºC für 5 Minuten.
6. Anbringen der Abstandshalter in den vorgewärmten Einspannvorrichtungen. Üblicherweise werden die Einspannvorrichtungen in Sechsersätzen hergestellt und drei Sätze (n = 18) werden für jede Bedingung getestet.
7. Zugabe von 20 ul der Thrombinlösung in ein Eppendorf-Röhrchen.
8. Zugabe von 20 ul der Fibrinogenlösung, 4-6-faches Mischen und Pipettieren von 32 ul auf die untere Einspannvorrichtung, Anbringen der oberen Einspannvorrichtung auf dem Kleber und Inkubieren für 30 Minuten bei 37ºC. Ein typisches Routineverfahren belädt drei Sätze von sechs Einspannvorrichtungen in Intervallen von 10 Minuten mit einer Inkubationszeit von 30 Minuten und testet sie dann.
9. Nach dem Inkubieren werden die Einspannvorrichtungen im Instron-Instrument angebracht und mit einer Geschwindigkeit von 0,5 mm/Minute auseinander gezogen.
10. Visuelle Überprüfung jeder Einspannvorrichtung nach dem Test auf Anzeichen mangelhafter Anordnung wegen unvollständiger Auffüllung der Lücke. Proben mit sichtbaren Fehlern werden aus der weiteren Analyse ausgeschlossen.
11. Wiedergabe der Grenzzugfestigkeit als die maximale Kraft, die pro Oberfläche an Kleber erhalten wird (g/cm²).

BEISPIEL 13

Rattenmastektomiemodell

Dieses Modell wurde ursprünglich von W. Spotnitx et al. an der University of Virginia entwickelt. Männliche Sprague-Dawley-Ratten mit einem Gewicht von 230-370 g wurden mit Natriumpentobarbital betäubt. Ein mittiger Schnitt wurde von der Brustbeineinkerbung bis zum Schwertfortsatz vorgenommen. Die Haut wurde von dem linken Brustmuskel abgetrennt, wodurch eine subkutane Tasche erzeugt wurde. Ein Schnitt wurde entlang der Brust bzw. Brustplatte links von der Brustbeinmittellinie vorgenommen. Der Brustmuskel wurde zurückgezogen, wodurch die Armgrube freigelegt wurde. Lymphgewebe und -knoten (2-3) wurden entfernt, gefolgt von der Entfernung des Brustmuskels. Fand eine Blutung statt, wurde das Gefäß mit 4-0-Seidennaht abgebunden. Die untere Oberfläche des Hautlappens wurde mit einer #22-Skalpellklinge zerrissen (60 Kratzer), um die subkutanen Lymphgefäße zu traumatisieren. Fibrinkleber (1,2 ml) oder Vehikel wurde dann auf die Tasche, die untere Oberfläche der Haut und auf den Brustkorb aufgetragen. Die Haut wurde mit 4-0-Seide unter Verwendung einer kontinuierlichen Naht, gefolgt von unterbrochenen Nähten geschlossen. Die Tiere wurden fünf Tage später getötet und die Flüssigkeit wurde aspiriert. Der Hohlraum wurde geöffnet, um auf restliche Flüssigkeit zu prüfen und für histopathologische Bewertung verwendet.
Das Modell wurde zuerst optimiert und getestet unter Verwendung von FS, hergestellt mit aus Plasma erhaltenem Fbgn und rhThrombin. Im Pilotexperiment reduzierte FS in signifikanter Weise Seroma-Volumina von 5,9 ml ± 3,2 auf 1,5 ml ± 1,4 (p < , 0008). Im Gegensatz zu der Erfahrung der UVa-Gruppe wurde bei keinem Tier eine Dehiszenz der Wunde beobachtet. Dies wurde der Modifizierung der Nahttechnik in unserem Modell zugeschrieben, ähnlich demjenigen, das von Harada et al., 1992, berichtet wurde.
Nachdem TBS + 4,5% Saccharose als ein Formulierungspuffer für rhFS identifiziert wurde, wurde rhFS in demselben Modell getestet. Der Träger bzw. das Vehikel war TBS + 4,5% Saccharose und die rhThrombin-Konzentration wurde von 250 auf 287,5 E/ml (Endwert) erhöht, um langsamere Verklumpungszeiten auf Grund der Saccharose zu kompensieren. Ansonsten waren die beiden Experiment identisch. Im Vergleich zu einer Vehikelkontrolle reduzierte rhFS in drastischer Weise die Flüssigkeitsansammlung 5 Tage nach dem chirurgischen Eingriff (Abb. 16). Seroma-Volumina wurden von 6,4 ml ± 3,2 auf 1,2 ml ± 1, 1 reduziert (p < , 0001). Es war keine Entzündung mit rhFS verknüpft, auch wurden keine abnormalen Parameter in dem Wundbett histologisch festgestellt. Obwohl keine antifibrinolytischen Mittel in der rhFS-Formulierung vorliegen, war der Kleber 5 Tage nach dem chirurgischen Eingriff relativ in Takt.

Literaturstellen

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Claims

1. Verfahren zur Erzeugung eines Fibrinklebers bzw. Fibrindichtungsmittels, umfassend das Mischen eines humanen rekombinanten Fibrinogens, rekombinanten humanen Thrombins, rekombinanten humanen Faktors XIII und von Kalziumionen, worin das Fibrinogen in einer Konzentration in Lösung von 20-30 mg/ml vorliegt, der Faktor XIII in Lösung in einer Konzentration von 3-10 ug/mg an Fibrinogen vorhanden ist, das Thrombin in Lösung in einer Konzentration von 5-300 I. E./ml vorhanden ist und die Kalziumionen in Lösung in einer Konzentration von 5-20 mMol vorliegen.

2. Verfahren nach Anspruch 1, worin Saccharose in einer Konzentration von etwa 4,5% mit dem Fibrinogen, dem Faktor XIII, dem Thrombin und dem Kalzium gemischt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Konzentration an Fibrinogen 30 mg/ml beträgt, die Konzentration des Faktors XIII 10 ug/mg an Fibrinogen beträgt, das Thrombin in Lösung in einer Konzentration von 250-300 I. E./ml vorhanden ist und die Kalziumionen in Lösung in einer Konzentration von 20 mMol vorliegen.

4. Verfahren nach Anspruch 3, worin Saccharose in einer Konzentration von etwa 4,5% mit dem Fibrinogen, dem Faktor XIII, dem Thrombin und dem Kalzium gemischt wird.

5. Fibrinkleber bzw. Fibrindichtungsmittel, umfassend ein humanes rekombinantes Fibrinogen, rekombinantes humanes Thrombin, rekombinanten humanen Faktor XIII und Kalziumionen, worin das Fibrinogen in einer Konzentration in Lösung von 20-30 mg/ml vorhanden ist, der Faktor XIII in Lösung in einer Lösung von 3-10 ug/mg an Fibrinogen vorhanden ist, das Thrombin in Lösung in einer Konzentration von 5-300 I. E./ml vorhanden ist und die Kalziumionen in Lösung in einer Konzentration von 5-20 mMol vorliegen.

6. Fibrinkleber oder Fibrindichtungsmittel nach Anspruch 5, worin Saccharose in einer Konzentration von etwa 4,5% des Fibrinogens, Faktors XIII, Thrombins und Kalziums vorhanden ist.

7. Fibrinkleber oder Fibrindichtungsmittel nach Anspruch 5, worin die Konzentration an Fibrinogen 30 mg/ml beträgt, die Konzentration an Faktor XIII 10 ug/mg Fibrinogen beträgt. Thrombin in Lösung in einer Konzentration von 250-300 I. E./ml vorliegt und die Kalziumionen in Lösung in einer Konzentration von 20 mMol vorhanden sind.

8. Fibrinkleber oder Fibrindichtungsmittel aus Anspruch 7, worin Saccharose in einer Konzentration von etwa 4,5% des Fibrinogens, des Faktors XIII, des Thrombins und des Kalziums vorhanden ist.