SK10352003A3

SK10352003A3 - Nosič s pevným fibrinogénom a pevným trombínom

Info

Publication number: SK10352003A3
Application number: SK1035-2003A
Authority: SK
Inventors: Dagmar Stimmeder
Original assignee: Nycomed Pharma As
Priority date: 2001-01-25
Filing date: 2002-01-25
Publication date: 2004-02-03
Also published as: JP2007190399A; EG24589A; EA200300823A1; HUP0400768A3; IS6885A; BG108121A; CN1246047C; AU2002249528B2; AR032400A1; IL157095A0; NO20033295L; KR100847417B1; HK1058319A1; JP2004520124A; EA200401463A1; DK1368419T3; DE60203364D1; MXPA03006689A; ME00587B; MXPA03006687A

Description

Oblasť techniky

Predložený vynález sa týka absorbovateľného prostriedku na okamžité použitie na zlepenie tkaniva, utesnenie tkaniva a na zastavenie krvácania, ktorý vo svojej podstate zahŕňa nosič pokrytý pevne zakotvenými ľudskými zložkami fibrinového lepidla, ktorým je ľudský fibrinogén a ľudský trombín. Túto zakotvenú kombináciu je možné napríklad priamo použiť na povrch poranenia. Pri styku s krvou, telesnými tekutinami alebo fyziologickým roztokom tento systém napodobňuje konečnú fázu koagulačnej kaskády, v ktorej trombín katalyzuje konverziu fibrinogénu na fibrín a aktiváciu faktora XIII za zisku faktora XIIla. Akonáhle vznikne faktor Xllla, potom pomocou kovalentného zosieťovania stabilizuje fibrínovú zrazeninu.

Povrch poranenia a nosič sa navzájom zlepia prostredníctvom polymerizácie, ako v dvojzložkovom lepidle. Počas tohto procesu, ktorý trvá asi 3 až 5 minút, sa prostriedok tohto vynálezu na plochu poranenia s výhodou pritláča. Zložky prostriedku tohto vynálezu sa enzymaticky odbúravajú počas 4 až 6 mesiacov po jeho aplikácii.

Doterajší stav techniky

Existujú komerčné fibrínové lepidlá, ktoré napodobňujú posledný krok koagulačnej kaskády a ktoré zahŕňajú vysoko koncentrovaný fibrinogénový roztok určený na zmiešanie s trombínovým roztokom a to ešte pred aplikáciou na operačné poranenie. Tieto zmesi obsahujú inhibítor fibrinolýzy, napríklad aprotinín alebo εaminokaprónovú kyselinu, aby sa predišlo predčasnému rozpusteniu fibrínovej zrazeniny fíbrinolytickým enzýmom plazmínom. Tieto dvojzložkové fibrínové lepidlá sú cenné pri rôznych operačných postupoch, ale ak je krvácanie silné, môžu byť predtým, ako dôjde k zastaveniu krvácania, odplavené. Dvojzložkové fibrínové lepidlá navyše vyžadujú urobiť niektoré prípravné kroky, vrátane zohratia alebo rozpustenia. Preto sú pre prácu troška nepraktické, ťažkopádne a nepohodlné a pre úspešné použitie týchto fibrínových lepidiel je potrebná skúsenosť.

Počas poslednej dekády sa použitie mnohých fibrínových lepidiel stalo v chirurgii pri mnohých indikáciách metódami voľby. Vo väčšine pokusov s fibrínovými lepidlami sa však navyše použila kolagénová pletenina, aby sa zlepšili hemostatické a adhezívne vlastnosti, čo indikuje ich nevýhody a ich obmedzené použitie chirurgmi.

Kolagén sa ako hemostatické činidlo používa už od konca šesťdesiatych rokov minulého storočia. Kolagén je vo všetkých cicavcoch najbežnejších štruktúrnym proteínom. Monomérny proteín s asi 300 kDa (tropokolagén) sa v určitých miestach kovalentne zosieťuje. Hotový proteín je preto nerozpustný a vytvára charakteristické vlákienka s vysokou pevnosťou v ťahu. Boli opísané mnohé podtriedy kolagénu, pričom najbežnejším je kolagén typu 1, hlavný kolagénový typ v koži, šľachách, kostiach a rohovke. Kolagén je vláknitý proteín zahrňujúci trojzávit s dĺžkou asi 290 nm. Päť týchto trojzávitov (tropokolagénových molekúl) je usporiadaných do mikrovlákna s priemerom asi 3,6 nm. Tieto mikrovlákna majú polárne a nepoláme segmenty, ktoré sú ľahko dostupné pre špecifické interfibrilárne a intrafibrilárne interakcie. Mikrovlákna sú zabalené do tetragonálnej mriežky a tvoria subfibrily s priemerom asi 30 nm. Tieto subfibrily sa potom usporiadajú do kolagénového vlákna, čiže základnej jednotky spojivového tkaniva, ktoré má priemer niekoľko stoviek nanometrov a ktoré je preto viditeľné vo svetle mikroskopu ako tenká čiarka.

Kolagén je možné použiť ako materiál na utesnenie poranenia, prípadne s poťahom obsahujúcim fibrínové lepidlo. Fibrínové lepidlá, t.j. kombinácia fibrinogénu. trombínu a aprotinínu, sa úspešne terapeuticky používajú počas mnohých rokov na lepenie tkanív a nervov a na utesnenie povrchov, ktoré slabo krvácajú. Jednou z nevýhod fibrinového lepidla je, že v prípade väčšieho krvácania sa lepidlo obvykle odplaví ešte predtým, ako dôjde k dostatočnej polymerizácii fibrínu. Na prekonanie tohto problému začali chirurgovia manuálne aplikovať kvapalné fibrínové lepidlá na absorbujúce nosiče, ako je kolagénová pletenina.

Napriek značnému úspechu týchto kombinovaných aplikácií nebol tento spôsob kvôli niektorým nevýhodám použitý v širokom meradle. Príprava je totiž relatívne ťažkopádna, spôsob uskutočnenia vyžaduje skúsenosť a zručný personál a prípravok nie je v stavoch núdze pohotovo k dispozícii a čas na prípravu je v rozmedzí 10 až 15 minút. Tieto faktory stimulovali vývoj zlepšeného výrobku, čo viedlo k vývoju pevného kombinovaného prostriedku kolagénového nosiča pokrytého poťahom pevného fibrinogénu, pevného trombinu a pevného aprotinínu, ako je opísané v patente EP 0 059 265.

Funkcia kolagénového nosiča opísaná v EP 0 059 265 spočíva predovšetkým v úlohe nosiča, ktorý adsorbuje a ktorý dodáva mechanickú stabilitu koagulačnému prípravku, ktorým je potiahnutý.

Tak bol vyvinutý výrobok, ktorý kombinuje hemostatické vlastnosti fibrínového lepidla s prínosom kolagénu ako nosiča a tento výrobok sa vyrába pod obchodným názvom TachoComb®. TachoComb® je na použitie pripravená a ľahko aplikovateľná pevná kombinácia kolagénovej náplasti pokrytej nasledujúcimi aktívnymi zložkami fibrínového lepidla - ľudským fibrinogénom, hovädzím trombínom a hovädzím aprotinínom.

TachoComb® sa predáva od začiatku 90. rokov 20. storočia firmou Nycomed Pharma a bol použitý v klinických pokusoch v Európe u viac ako 2500 pacientov. Výrobok bol navyše použitý u viac ako 700 pacientov v japonskom klinickom programe pri mnohých rôznych indikáciách, ako resekcii pečene a pľúc, operáciách žlčovodu, operáciách sleziny, ľadvín a slinivky brušnej, ORĽ operáciách, gynekologických operáciách a cievnych operáciách. O produkte TachoComb® bolo zistené, že je účinný a bezpečný.

Počas uskutočnených klinických pokusov neboli hlásené žiadne klinické komplikácie spojené s aplikáciou výrobku TachoComb®. V troch japonských štúdiách sa však objavili protilátky proti aprotinínu.

Počas všetkých rokov klinického používania tisícok náplastí TachoComb® bolo nahlásených celkom iba 37 spontánnych nepriaznivých účinkov lieku (ADR). Šestnásť z týchto ADR by mohlo byť teoreticky spojených s reakciami na zložky náplasti TachoComb® (horúčka, pyrexia, eozinofília, predĺžený protitrombínový čas, hypersenzivita, imunologické alebo alergické reakcie). Jeden ADR (imunologická odozva) bol zrejmé spojený s pôsobením výrobku TachoComb®.

Vo WO 97/37 694 (Immuno France S.A.) je v porovnávacom príklade 4 opísané, že keď bol použitý kolagénový výrobok alebo výrobok TachoComb® , tak keď sa použil TachoComb®, nedošlo k zastaveniu smrteľného krvácania, a to v protiklade k zastaveniu krvácania počas 5 minút, keď bol pripravený kolagénový výrobok podľa WO 97/37 694, ktorý neobsahoval trombín.

Vo WO 96/40 033 sú zdôraznené nevýhody hovädzieho trombínu použitého vo výrobku TachoComb®, a tieto spočívajú vtom, že použitie hovädzieho alebo iných druhov trombínu môže spôsobiť škodlivú vírusovú kontamináciu a možný je i prenos hovädzej choroby, ako je bovinná spongiformná encefalopatia.

Podstata vynálezu

Predložený vynález sa týka pevného prostriedku obsahujúceho nosič, ktorý má aspoň jednu z nasledujúcich vlastností :

- modul pružnosti v rozmedzí 5 až 100 N/cm, ako 10 až 50 N/cm,

- hustotu 1 až 10 mg/cm³, ako 2 až 7 mg/cm³,

- priemer dutiny väčší ako 0,75 mm a menší ako 4 mm a/alebo stredný priemer dutiny pod 3 mm a na uvedenom nosiči rovnomerne distribuovaný a zakotvený :

a) pevný fibrinogén a

b) pevný trombín.

Prostriedok môže mať dva, tri alebo všetky vyššie uvedené fyzikálne vlastnosti V súčasne zvýhodnených uskutočneniach sa materiál nosiča vyrobí podľa opisu v patente DK 2001 00 135 a ďalej v prihláške s názvom Spôsob prípravy kolagénovej huby, zariadenie na oddelenie časti kolagénovej peny a pozdĺžna kolagénová huba, podanej firmou Nycomed Pharma AS dňa 25. januára 2002, ktorá si na uvedenú prihlášku nárokuje prioritu. V tomto kontexte by sa termín priemer dutiny mal chápať ako najdlhšie priame vzdialenosti od steny k stene dutiny, t.j. najdlhšie diagonálne priame vzdialenosti v dutine. Dutiny môžu mať polygonálny tvar, ako je oktogonálny tvar. Keď sa nosič rozkrojí, dutiny sa rozdelia a vzniknú kaverny. Pevný fibrinogén a pevný trombín sú zakotvené na nosiči a ich väčšia časť je v kavernách, čím sa dosiahne v podstate rovnomerná distribúcia pevného trombínu a pevného fibrinogénu . Vďaka tomu a vďaka zakotveniu je možné na nosič naniesť značné množstvo fibrinogénu a trombínu, a to v protiklade k situácii, keď sa kvapalné prostriedky trombínu a fibrinogénu na materiál napríklad nakvapkajú alebo rozprášia.

Príprava pokrytého nosiča

Príprava pokrytého nosiča zahŕňa v podstate prípravu suspenzie aktívnych zložiek, rovnomernú distribúciu suspenzie na nosič, vysušenie pokrytého nosiča na pevný prostriedok s aktívnymi zložkami ukotvenými na nosiči.

Príprava suspenzie s fibrinogénom a trombínom obsahuje prípravu fibrinogénovej zmesi fibrinogénu s alkoholom ako je etanol, prípravu trombínovej zmesi trombínu s alkoholom ako je etanol, zmiešanie fibrinogénovej zmesi a trombínovej zmesi tak, aby sa získala uvedená suspenzia.

V kroku prípravy zmesi je možné zmes homogenizovať alebo preosiať a získať suspenziu obsahujúcu častice fibrinogénu a trombínu so stredným priemerom častíc podľa Folka a Warda 25 až 100 pm. Teplota je 0 až 12 °C.

Nosičom môže byť kolagénový nosič, ako je kolagénová huba. Kolagénová huba má spĺňať aspoň jedno a s výhodou mnoho ďalších nasledujúcich kritérií, ako je hodnota pH 5,0 až 6,0, obsah kyseliny mliečnej maximálne 5 %, obsah amoniaku maximálne 0,5 %, obsah rozpustného proteínu vypočítaného ako obsah albumínu maximálne 0,5 %, obsah síranového popolu maximálne 1,0 %, obsah ťažkých kovov maximálne 20 ppm, mikrobiologická čistota s maximálne 10³ CFU/g, obsah kolagénu 75 až 100 %, hustota 1 až 10 mg/cm³ , modul pružnosti v rozmedzí 5 až 10 N/cm.

V predloženom zvýhodnenom uskutočnení vynálezu sa kolagénový nosič vyrobí spôsobom opísaným v patente DK 2001 00 135. V nižšie uvedenej tabuľke sú uvedené fyzikálne vlastnosti troch príkladov kolagénových nosičov.

Príklad	I	II	III
Hodnota pH	5,3	5,1	5,4
Obsah kyseliny mliečnej	2,3	2,8	2
Obsah amoniaku	0,1	0,2	0,1
Obsah rozpustného proteínu (%)	0,04	0,05	0,08
Obsah síranového popola (%)	0,3	0,3	0,3
Mikrobiologická čistota (CFU/g)	<12 až 345	<18 až 124	<11 až 33
Obsah kolagénu vztiahnutý na hmotnosť sušiny	95	95	98
Obsah vody (%)	14	15	16
Modul pružnosti (N/cm)	10,4 až 42,1	15 až 50	12,3 až 41,0
Veľkosť pórov (priemer, stredná hodnota) (mm)	2,9	2,1	2,9
Hustota (mg/cm³)	2,9 až 5,3	2,9 až 5,9	2,4 až 5,0

Rovnomerná distribúcia suspenzií sa dosiahne buď pomocou zariadenia na ponáranie, ako je opísané v US patentoch č. 5 942 278 a 6 177 126, alebo je možné suspenziu na nosič naniesť pomocou aplikátora, ktorý má aspoň jednu dýzu. Postrekovači aplikátor posúva suspenziu dýzou, pričom nosič a dýza sa oproti sebe vzájomne relatívne pohybujú. Aplikátor môže obsahovať alebo môže byť umiestnený v blízkosti dopravného pásu, miešacej jednotky pripojenej k pumpe alebo systému púmp alebo iného zásobného zariadenia a dýzy, alebo systému dýz, ktorý sa pohybuje naprieč, napríklad v pravých uhloch k dopravnému pásu. V závislosti od konkrétnych charakteristík prostredia môže mať dýza alebo systém dýz rôzne tvary a veľkosti. Dýzu alebo systém dýz je možné pripojiť k zásobnému zariadeniu pomocou trubíc. Zásobné zariadenie môže privádzať nanášané médium z miešacej jednotky k systému dýz. Počas procesu nanášania sa systém dýz môže pohybovať napriek nosičom. Vo svojej pohotovostnej polohe môže byť držaný na jednej strane dopravného pásu. Proces nanášania môže byť iniciovaný svetelným čidlom indikujúcim prítomnosť nosiča na dopravnom páse a podobne môže byť zastavený aj signálom tohto čidla. Takýto aplikátor má relatívne malý mŕtvy objem a ľahko sa s ním pracuje, ľahko sa čistí. Navyše má aj možnosť v ktoromkoľvek okamžiku prerušiť proces nanášania, je použiteľný v relatívne širokom rozmedzí viskozít ajeho výsledkom je homogénne pokrytie.

Obidva systémy nanášajú objem 0,08 až 0,12 ml suspenzie na cm² nosiča.

Dôležitým krokom je sušenie suspenzie fibrinogénu, trombínu a alkoholu, aplikované ako mokrý poťah na nanášací povrch nosiča. Príklad tohto spôsobu obsahuje krok vystavenia pokrytého nosiča tlaku menšom ako 100 kPa (1000 mbar) tak, aby sa získal suchý potiahnutý povrch nosiča a aby sa na pokrytom povrchu zakotvil vysušený poťah. Použitím zníženého tlaku a pomocou zníženého tlaku v procese sušenia, udržiavaním nízkej teploty (2 až 10 °C) a relatívne vysokej vlhkosti (80 až 95 %) je možné takto získať štruktúru a žiadané fyzikálne vlastnosti nosiča, konkrétne vo forme kolagénu, ako je kolagénová huba, rovnako ako fibrinogénu a trombínu.

Termín „zahrňujúce vo svojej podstate znamená, že tieto tri zložky sú všetky podstatné a nutné pre tento vynález. V prostriedku však môžu byť taktiež prítomné nepodstatné aditíva, ako sú vápenaté ióny a farbiace značkovače ako je riboflavín.

Prostriedok môže ďalej obsahovať ďalšie vhodné zložky, ako je jedna alebo viacej farmaceutických aktívnych zložiek, ktoré je možné napríklad vybrať zo skupiny pozostávajúcej z antibiotických činidiel, ako sú antibakteriálne alebo antimykotické a antineoplastické činidlá.

Hoci nosičovým materiálom je s výhodou kolagénová huba, ktorá obsahuje materiál kolagénového typu I z cicavčích, transgénnych alebo rekombinantných zdrojov, môže byť tento materiál vyrobený aj z iných typov kolagénu, tj. kolagénu typu I, II, lll, IV, VII a X. Nosičom môže byť taktiež biodegrovateľný polymér ako je polyhyalurónová kyselina, polyhydroxykyselina, napríklad kyselina mliečna, glukónová kyselina, hydroxybutánová kyselina, celulóza alebo želatína.

Vo výhodnom uskutočnení tohto vynálezu prostriedok obsahuje nosič, ktorý má jednu alebo viac aktívnych strán, kde je prítomný fibrinogén v množstve 2 až 10 mg/cm², ako 4,3 až 6,7 mg/cm² , s výhodou 5,5 mg/cm² a kde je prítomný trombín v množstve 1,0 až 5,5 IU/cm² , s výhodou 2,0 IU/sm². Fibrinogén a/alebo trombín je s výhodou ľudský, napríklad prečistený z prírodného zdroja, a to pomocou spôsobov známych odborníkom v odbore, alebo transgénny alebo rekombinantný ľudský fibrinogén a/alebo trombín vyrábaný spôsobmi známymi odborníkom v odbore.

Výrobky podľa predchádzajúcich prác v odbore, ako je TachoComb®, Beriplast® a TissuSeal® všetky obsahujú aprotinín alebo podobné antifibrinolytické činidlá. Aprotinín je možné získať iba z hovädzieho zdroja. Predmetom výskumu prekladateľov tohto vynálezu je vyvinúť prostriedok s vylepšeným nosičovým materiálom, ktorý má iba zložky ľudského, rekombinantného alebo transgénneho pôvodu. Preto sa výskum orientoval smerom k materiálu nosiča a preto bolo skúmané, či by bolo možné nahradiť hovädzí trombín ľudským trombínom a vyhnúť sa použitiu aprotinínu. Predkladatelia tohto vynálezu pracovali na tomto cieli dvojstupňovým procesom.

Najskôr bol ako následný produkt po výrobku TachoComb® vyvinutý TachoComb H, kde bol napríklad hovädzí trombín nahradený ľudským trombínom. S výrobkom TachoComb H boli urobené klinické testy, a to terapeutické konfirmačné (fáza llla) klinické testy na indikáciu zastavenia krvácania, zlepenia tkaniva a utesnenia tkaniva. Doteraz nepublikované výsledky získané v týchto štúdiách potvrdili účinnosť a bezpečnosť 'výrobku TachoComb H pri kontrole striekania krvi a úniku vzduchu, čím tento výrobok účihkoval ako pomocná terapia pri zastavení krvácania, zlepení tkaniva a utesnení tkaniva počas operácie. Konkrétne bolo pri cievnej a pečeňovej chirurgii presvedčivo preukázané, že TachoComb H je účinný pri lokálnom zastavení krvácania, čo sa prejavilo ako významné zníženie času do zastavenia krvácania v porovnaní s kontrolnými pokusmi.

Taktiež bolo zistené, že TachoComb H môže byť schopný zmenšiť rozsah pľúcnych defektov, čo vedie k rýchlejšiemu vyriešeniu úniku vzduchu a môže byť vhodný pri utesňovaní veľkých pľúcnych trhlín a u rozdutia pľúc.

TachoComb® a TachoComb H však obidva ako integrálna súčasť výrobku obsahujú aprotinín. Aprotinín bol považovaný za nutný na inhibíciu možnej premeny malých množstiev plazminogénu na plazmín vo fibrinogénovej zložke a na prevenciu predčasného rozkladu fibrínovej zrazeniny, zvlášť za hyperfibrinolytických podmienok.

Aby bolo možné otestovať hypotézu, že aprotinín je nevyhnutný, urobili predkladatelia tohto vynálezu nové pokusy. Pokusy in vitro preukázali antifibrinolytickú ochranu aprotinínu v zrazenine a že TachoComb® bez aprotinínu (TachoComb S) sa nerozpustil počas veľmi krátkeho času. Preto boli navrhnuté záťažové modely pokusov na zvieratách a TachoComb S bol porovnaný s výrobkom TachoComb H, aby sa preukázala podobná účinnosť. Vo všetkých modeloch TachoComb H, i TachoComb S boli použité ako jediný prostriedok na zastavenie krvácania.

Aby sa vyskúmala účinnosť a histopatologický charakter tohto zvýhodneného uskutočnenia predloženého vynálezu prostriedku TachoComb S v porovnaní s prostriedkom TachoComb H, boli urobené štyri obsiahle experimentálne série. TachoComb S alebo TachoComb H sa aplikovali na orgány pečene, sleziny, slinivky brušnej alebo mozgu/mozgových blán psov, prasiat alebo králikov. Pokusy boli navrhnuté takým spôsobom, aby sa podobali normálnym operačným podmienkam, silne zaťažkávacím podmienkam a hyperfibrinolytickým podmienkam.

V týchto štyroch štúdiách získané výsledky nepreukázali akýkoľvek relevantný rozdiel medzi výrobkami TachoComb S a TachoComb H. Obidva výrobky sa s ohľadom na účinnosť pri zastavení krvácania a uzatvárania poranení chovali podobne, vrátane veľmi zaťažkávajúcich stavov, ako bolo pri zvýšenom vnútornom tlaku v orgánoch alebo pri hyperfibrinolýze indukovanej lokálnou aplikáciou r-tPA.

Z toho je možné odvodiť, že preklinický program navrhnutý na vyhodnotenie paušálne nutnej prítomnosti aprotinínu ako zložky výrobku TachoComb H, preukázal podobnú účinnosť výrobkov TachoComb H a TachoComb S. Obidva výrobky boli úspešne použité ako jediný prostriedok na zastavenie krvácania, zlepenie tkaniva a utesnenie tkaniva pri všetkých experimentálnych podmienkach. Počas pokusov na zvieratách neboli zaznamenané žiadne nežiaduce tkanivové reakcie. V dôsledku toho bol aprotinín z prostriedku predloženého vynálezu vylúčený.

Očakáva sa, že prostriedok tohto vynálezu bude klinicky vykazovať rovnaké hemostatické vlastnosti, rovnaké výsledky pri lepení tkaniva a utesňovaní tkaniva ako jeho predchodcovia a že bude mať rovnaké alebo dokonca ešte uspokojivejšie vlastnosti z hľadiska svojho bezpečnostného profilu. Neprítomnosť aprotinínu, ktorý je v súčasnosti k dispozícii iba z hovädzích zdrojov, dodáva výrobku väčšiu bezpečnosť vo vzťahu k hypersenzitívnym reakciám. V tomto zmysle by sa malo poznamenať, že protilátky proti aprotinínu sa objavili v troch japonských štúdiách. S prostriedkom bez aprotinínu sa žiadna takáto imunologická odozva nepredpokladá.

V tomto výhodnom uskutočnení sa vynález týka prostriedku na zastavenie krvácania, utesnenie tkaniva a zlepenie tkaniva, ktorý obsahuje ohybný nosič, ktorý má aspoň jednu z nasledujúcich fyzikálnych vlastností, a to modul pružnosti v rozmedzí 5 až 100 N/cm, najmä 10 až 50 N/cm, hustotu 1 až 10 mg/cm³, najmä 2 až 7 mg/cm³, priemer dutiny väčší ako 0,75 mm a menší ako 4 mm a/alebo stredný priemer dutiny pod 3 mm a ktorý ďalej obsahuje pevný fibrinogén a pevný trombin a neobsahuje žiadne antifibrinolytické činidlo ako je aprotinín, ε-aminokaprónová kyselina alebo a₂-antiplazmín, pričom pevný fibrinogén a pevný trombin sú zakotvené na nosiči takým spôsobom, že keď sa so vzorkou pokrytého materiálu 2 minúty trepe na trepačke Vibrofix pri frekvencii 1000 otáčok za minútu, je abrázia menšia ako 1,0 mg/cm², a ak sa pokrytý nosičový materiál ponorí do endoskopického zariadenia a potom sa vyberie, je materiál v podstate nezmenený a má stratu poťahového materiálu menšiu ako 20 % ako indikáciu ohybnosti nosiča a pevnej adhézie pevného fibrinogénu a pevného trombínu, a uvedený materiál je v podstate vzduchotesný a kvapalinotesný a má faktor pružnosti aspoň 1,25, čo sa určuje testom obsahujúcim fixáciu pokrytého nosiča na latexovú fóliu, trojnásobné tlakové roztiahnutie latexu a pri treťom roztiahnutí zmeranie plochy pokrytého nosiča v bode najväčšieho roztiahnutia latexovej fólie a porovnania roztiahnutej plochy pokrytého nosiča s východiskovou plochou pokrytej plochy.

Výhodným uskutočnením vynálezu, kde fibrinogén a trombín sú ľudské, napríklad prečistené z prírodného zdroja, alebo transgénny alebo rekombinantný ľudský fibrinogén a trombín, je také uskutočnenie, kde je k dispozícii tesniace fibrínové lepidlo iba hovädzieho pôvodu spolu so zakotvenou kombináciou aktívnych zložiek pokrývajúcich ohybný nosič a ktoré má niekoľko výhod : pripravenosť na okamžité použitie, nie je potrebný čas na zahriatie alebo prípravný postup, ľahko sa aplikuje priamo na väčšinu plôch tkaniva a orgánov, je možná endoskopická aplikácia, nie sú žiadne problémy s podtekaním krvi alebo odplavením z cieľovej plochy, kombinuje sa lepivý účinok fibrínového uzatvárania a mechanickej podpory ohybného nosiča, prostriedok je vysoko ohybný a odoláva veľkému naťahovaniu a stláčaniu, účinne sa zastavuje krvácanie a tkanivo sa utesní počas 3 až 5 minút, prostriedok má priaznivý bezpečnostný profil, tj. neobsahuje hovädzie zložky, je biodegradovateľný a zanecháva iba menšie jazvy, je ho možné skladovať pri 2 až 8 °C, má očakávanú skladovateľnosť 36 mesiacov alebo pri laboratórnej teplote aspoň počas 2 rokov.

Dôvod pre vývoj zvýhodneného prostriedku tohto vynálezu sa odvodzuje od želania zbaviť sa hovädzej zložky, aby sa predišlo akémukoľvek, dokonca aj teoretickému riziku prenosu chorôb z kráv na človeka, vrátane prenosnej spongiformnej encefalopatie (TSEs). Aktívne zložky, čiže fibrinogén a trombín, majú tak ľudský pôvod a hovädzí aprotinín, čiže inhibitor fibrinolytického enzýmu plazrnínu, sa odstránil. Výhodou zvýhodneného prostriedku tohto vynálezu neobsahujúceho žiadne hovädzie zložky je, že boli vylúčené riziká prenosu chorôb prostredníctvom hovädzieho materiálu, vrátane bovinnej spongiformnej encefalopatie (BSE).

Podobne ako iné fibrínové lepidlá pracuje aj prostriedok tohto vynálezu prostredníctvom napodobňovania posledného kroku kaskády koagulácie kn/i. Zmes fibrinogénu a trombínu tvorí na povrchu ohybného nosiča zakotvenú pevnú vrstvu. Pri kontakte s tekutinami, napr. krvácajúcim povrchom, telesnými tekutinami alebo fyziologickým roztokom, sa zložky vrstvy rozpustia, difundujú do kavít poranenia a začnú reagovať.

Polymerizačný proces vytvára silnú adhéziu medzi povrchom poranenia a náplasťou nosiča. Počas času nutného na zlepšenie, tj. 3 až 5 minút, by prostriedok tohto vynálezu mal s výhodou byť jemne pritláčaný na povrch poranenia. Nosičová náplasť tvorí mechanickú oporu, ktorá dovoľuje poranenie tampónovať. Náplasť udržuje koagulačné zložky na mieste, keď poranenie silne krváca a bráni potenciálne obnovenie krvácania. Mechanizmus účinku zahŕňa konverziu fibrinogénu trombínom na fibrín a to odštiepením peptidov. Monoméry fibrínu spontánne polymerizujú na fibrínové vlákna vytvárajúce viskóznu a elastickú zrazeninu, ktorá lepí nosičovú náplasť na povrch poranenia. Fibrínová matrica následne slúži ako základná konštrukcia pre migráciu fibrinoblastu (obrázok 8).

Povrch poranenia a nosič sa navzájom zlepia prostredníctvom polymerizácie, ako v dvojzložkovom lepidle. Mechanická stabilita nosičovej náplasti dodáva hemostatickému účinku fibrínovej zlúčeniny aj tampónový účinok. Aktívne zložky sú navyše prítomné iba na povrchu nosiča vystaveného poranenej ploche a vďaka efektu tampónového účinku a vďaka jemného tlaku tak nosičom nedifundujú. V dôsledku toho a v protiklade k situácii, keď sa používa väčšina fibrínových lepidiel, tu nedochádza k adhézii poranenej plochy pokrytej prostriedkom tohto vynálezu na iné orgány alebo ich časti, keď sa použije prostriedok tohto vynálezu.

Na rozdiel od kyanakrylátových lepidiel a lepidiel na báze želatíny-rezorcínuformaldehydu (GRF), ktoré sú pre parenchymatické tkanivo vysoko histotoxické, pevný prostriedok tohto vynálezu sa fyziologicky odbúrava a počas týždňov alebo mesiacov po aplikácii je nahradený tkanivom, a to hlavne cestou dvoch mechanizmov :

1. Fibrínová zrazenina sa odbúrava čiastočne fibrinolýzou a čiastočne bunkovou fagocytózou;

2. Nosič sa odbúrava vrstvu po vrstve absorptívnym granulačným tkanivom a premieňa sa na pseudokapsule zahrňujúce endogénne spojivové tkanivo.

Prostriedok tohto vynálezu je vhodný na zastavenie krvácania, zlepenie tkaniva a utesnenie tkaniva, obzvlášť pri chirurgických zásahoch v gastrointestinálnom systéme, ako na pažeráku, žalúdku, tenkom čreve, hrubom čreve, konečníku, na parenchýmových orgánoch, ako je pečeň, slinivka brušná, ľadviny, pľúca, nadľadvinky, štítna žľaza a lymfatické uzliny, v kardiovaskulárnej chirurgii, chirurgii hrudníka zahŕňajúceho chirurgiu priedušnice, priedušiek alebo pľúc, pri chirurgických zásahoch v oblasti ucha, nosa a krku (ORL) zahrňujúcich zubnú chirurgiu, v gynekologickej, urologickej, kostnej (napríklad resekcii spongiózy) chirurgii a neodkladnej chirurgii, neurologickej chirurgii, chirurgii lymfatických, žlčových a cerebrospinálnych (CSF) píšťal a únikoch vzduchu počas chirurgie hrudníka a pľúc. Predložený vynález sa taktiež týka použitia opísaných prostriedkov na vyššie uvedené ciele.

Je potrebné zdôrazniť, že prostriedok tohto vynálezu je v podstate vzduchotesný a kvapalinotesný, čo je dôvodom na to, že tento výrobok je obzvlášť vhodný pri liečení lymfatických, žlčových a cerebrospinálnych (CSF) píšťal a únikoch vzduchu počas pľúcnej a hrudnej chirurgie. Navyše, pretože je tento výrobok v podstate kvapalinotesný, je vysoko užitočný v chirurgii vysoko krvácajúcich orgánov, ako sú pečeň a slezina a pre chirurgiu napríklad v gastrointestinálnom trakte.

Výrobok tohto vynálezu sa aplikuje vtedy, keď bežnými metódami nie je možné kontrolovať krvácanie alebo lymfatický, žlčový, vzduchový alebo CSF únik, alebo keby tieto metódy priniesli nepriaznivé výsledky.

Nosičom je s výhodou kolagénová huba, pletenina alebo náplasť, ktorých termíny sa v tomto opise a nárokoch používajú ako synonymá. Zložky, čiže kolagén, fibrinogén a trombín, majú s výhodou cicavčí pôvod. Pevné zložky sú s výhodou ľudského pôvodu. Kolagén, fibrinogén a trombín môžu byť buď prečistené z prírodného zdroja alebo je to rekombinantný alebo transgénny ľudský fibrinogén a/alebo trombín.

V súčasnosti je výhodným zdrojom kolagénu kôň. Aby sa predišlo vírusovému prenosu kolagénovou náplasťou v dôsledku kontaminácie konskými vírusmi, ktoré sú pre človeka patogénne, je pre preventívne prostriedky dôležitý jednak vhodný výber zdroja materiálu a jednak inaktivácia potenciálne patogénných činidiel vo výrobnom procese.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Obrázok 1

1.1 Opraskin® : nepokrytý/pokrytý

1.2 Pokrytý Opraskin® : ponorenie do endoskopíckého zariadenia

1.3 Pokrytý Opraskin ® : rozvinutý po ponorení do endoskopíckého zariadenia

Obrázok 2

2.1 Willospon® forte : nepokrytý/pokrytý

2.2 Pokrytý Willospon® forte : ponorenie do endoskopického zariadenia

2.3 Pokrytý Willospon® forte : rozvinutý po ponorení do endoskopického zariadenia

Obrázok 3

3.1 Willospon® Special : nepokrytý/pokrytý

3.2 Pokrytý Willospon® Special : ponorenie do endoskopického zariadenia

3.3 Pokrytý Willospon® Special : rozvinutý po ponorení do endoskopického zariadenia

Obrázok 4

4.1 Ethisorb® Patch : nepokrytý/pokrytý

4.2 Pokrytý Ethisorb® Patch : ponorenie do endoskopického zariadenia

4.3 Pokrytý Ethisorb® Patch : rozvinutý po ponorení do endoskopického zariadenia

Obrázok 5

5.1 Tabotamp® NU Knit: nepokrytý/pokrytý

5.2 Pokrytý Tabotamp® NU Knit: ponorenie do endoskopického zariadenia

5.3 Pokrytý Tabotamp® NU Knit : rozvinutý po ponorení do endoskopického zariadenia

Obrázok 6 |

6.1 Huba Nycomed : nepokrytá/pokrytá (laboratórna vzorka)

6.2 Pokrytá huba Nycomed (laboratórna vzorka) : ponorenie do endoskopického zariadenia

6.3 Pokrytá kolagénová huba Nycomed (laboratórna vzorka): rozvinutá po ponorení do endoskopického zariadenia

6.4 Pokrytá kolagénová huba Nycomed (výrobná vzorka = TachoComb®) rozvinutá po ponorení do endoskopického zariadenia

Obrázok 7

endoskopický nástroj : Endodock®

Obrázok 8

Krvná koagulácia a degradácia zrazeniny a nosičovej náplasti. Aktívne zložky pokrytia nosiča sú znázornené v šedých tieňovaných rámčekoch.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Nižšie uvedené príklady I až IV opisujú rôzne postupy prípravy pokrytej kolagénovej huby s rôznymi fibrinogénovými a trombínovými základnými materiálmi.

Fibrinogénové základné materiály

Zložka	% z celkového obsahu látok
Prípravok A	Prípravok B	Prípravok C
Ľudský fibrinogén	36 až 52	42 až 47	36 až 52
Ľudský albumín	16 až 24	20 až 24	16 až 24
Celkový proteín	52 až 76	62 až 71	52 až 76
Chlorid sodný	8 až 14	0	8 až 14
Citrát trisodný	2 až 4	1 až 3	2 až 4
Arginín(hydrochlorid)	15 až 26	15 až 21	15 až 26
Glycín	0	6 až 9	1 až 2
Histidín	0	3 až 5	0
Sacharóza	0	0	1 až 2
Zostatková vlhkosť	<2	2 až 4	<1,5

Trombínové základné materiály

Prípravok	Aktivita	Zostatková	Ďalšie látky, aditíva
Ľudský trombín A	360 až 540	< 3%	Ľudský albumín, chlorid sodný, citrát sodný
Ľudský trombín B	7 až 10	< 3%	Ľudský albumín, chlorid sodný, citrát sodný
Ľudský trombín C	35 až 60	< 3%	Ľudský albumín, chlorid sodný, octan sodný, glycín

Príklad I

V tomto príklade obsahuje suspenzia ľudský fibrinogénový prípravok B a ľudský trombínový prípravok B.

Použitím nasledujúcich množstiev a parametrov sa získal výsledný objem suspenzie 3 500 ml ;

- Fibrinogénová zmes; 2800 ml etanolu (94 % pri 2 až 8°C), 492,5 g ľudského fibrinogénového prípravku B, 493,5 mg riboflavínu. Fibrinogénová zmes bola udržiavaná za miešania 8 až 16 hodín pri 2 až 8 °C.

- Trombínová zmes: 100 ml etanolu (100 % pri -30 °C), 12,27 g ľudského trombínového prípravku B. Trombínová zmes bola udržiavaná 8 až 16 hodín pri -30 °C.

- Suspenzia: 157 ml trombínovej zmesi sa pridalo k fibrinogénovej zmesi. Na doplnenie na výsledný objem suspenzie 3500 ml sa pridal 94 % etanol pri 2 až 8 °C.

Vlastnosti suspenzie :

1. Koncentrácia etanolu : 94,3 %

2. Sedimentačné chovanie :

a) sedimentačný objem po 5 minútach od začiatku: 98 % testovaného objemu

b) sedimentačný objem po 24 hodinách od začiatku: 64 % testovaného objemu.

3. Veľkosť častice (stredný priemer podľa Folka a Warda): 56,4 ±1,3 pm. Nosiče vo forme kolagénových prúžkov boli pokryté suspenziou. Za nasledujúcich podmienok sa v chladiacej komore najskôr preinkubovalo 48 prúžkov kalagénovej huby: teplota 5,2 °C, absolútna vlhkosť 4,8 g vody na kg vzduchu, inkubačný čas 18,5 hodiny.

Pokryté prúžky kolagénovej huby sa vysušili nasledujúcim spôsobom :

- pokryté prúžky sa inkubovali 15 minút pri teplote 5,2 °C a absolútnej vlhkosti 4,8 g vody na kg vzduchu,

- potom sa za zníženého tlaku pokryté prúžky vysušili v sušiacej komore za nasledujúcich podmienok :

Vzduchové podmienky : teplota 5,2 °C, absolútna vlhkosť 4,8 g vody na kg vzduchu, prietok vzduchu odsávacím ventilom 23 m³ za hodinu, tlak 5,9 kPa (59 mbar), čas sušenia 4 hodiny.

Keď sa s prúžkami 2 minúty trepalo na trepačke Vibrofix pri frekvencií 800 až 1200 otáčok za minútu, došlo k abrázii získaného pokrytia prúžkov kolagénovej huby o asi 0,2 mg/cm².

Príklad II

V tomto príklade obsahuje suspenzia ľudský fibrinogénový prípravok C a ľudský trombínový prípravok C.

Použitím nasledujúceho množstva a parametrov sa získal výsledný objem suspenzie 3500 ml :

Fibrinogénová zmes: 2252 ml etanolu (94 % pri 2 až 8 °C), 370,7 g ľudského fibrinogénového prípravku C, 493,5 mg riboflavínu. Fibrinogénová zmes bola udržiavaná za miešania 8 až 16 hodín pri 2 až 8 °C.

Trombínová zmes: 188 ml etanolu (100 % pri -30°C), 12 skúmaviek ľudského trombínového prípravku C (10 650 IU/skúmavku)/12 ml vody pre injekciu. Trombínová zmes bola udržiavaná 8 až 16 hodín pri -30 °C.

Suspenzia: 164,5 ml trombínovej zmesi sa pridalo k fibrinogénnej zmesi. Na doplnenie na výsledný objem suspenzie 3500 ml sa pri 2 až 8 °C pridal 94 % etanol.

Vlastnosti suspenzie:

1. Koncentrácia etanolu : 94,1 %

2. Sedimentačné chovanie:

a) sedimentačný objem po 5 minútach od začiatku: 94 % testovaného objemu

b) sedimentačný objem po 24 hodinách od začiatku: 71 % testovaného objemu.

3. Veľkosť častice (stredný priemer podľa Folka a Warda): 49,2 ± 0,93 gm.

Nosiče vo forme kolagénových prúžkov sa pokryli suspenziou. Za nasledujúcich podmienok sa v chladiacej komore najskôr preinkubovalo 48 prúžkov kolagénovej huby : teplota 4,8 °C, relatívna vlhkosť 90,3 %, inkubačný čas 22,25 hodiny.

Pokryté prúžky kolagénovej huby sa vysušili nasledujúcim spôsobom :

Pokryté prúžky sa inkubovali 13 minút pri teplote 4,9 °C a absolútnej vlhkosti 4,8 g vody na kg vzduchu.

Potom sa za nasledujúcich podmienok sušenia pokryté prúžky vysušili za zníženého tlaku v sušiacej komore :

Vzduchové podmienky : teplota 5,2 °C, absolútna vlhkosť 4,8 g vody na kg vzduchu, prietok vzduchu odsávacím ventilom 25 m³ za hodinu, tlak 6 kPa (60 mbar), čas sušenia 4 hodiny.

Keď sa 2 minúty trepalo prúžkami na trepačke Vibrofix pri frekvencii 800 až 1200 otáčok za minútu, došlo k abrázii získaného pokrytia prúžkov kolagénovej huby o asi 0,3 mg/cm².

Príklad III

Výsledný objem suspenzie 780 ml sa získal použitím nasledujúcich množstiev a parametrov:

Fibrinogénová zmes: 700 ml etanolu (94 % pri 2 až 8 °C), 84,42 g ľudského fibrinogénového prípravku C, 110 mg riboflavínu. Fibrinogénová zmes bola udržiavaná za miešania 8 až 16 hodín pri teplote 2 až 8 °C.

Trombínová zmes: 35 ml etanolu (100 % pri -30 °C), 0,54 g ľudského trombínového prípravku C.

Trombínová zmes sa udržiavala 8 až 16 hodín pri -30 °C.

Suspenzia : 23,0 ml trombínovej zmesi sa pridalo k fibrinogénovej zmesi. Na doplnenie na výsledný objem suspenzie 780 ml sa pri 2 až 8 °C pridal 100 % etanol.

Vlastnosti suspenzie:

1. Koncentrácia etanolu : 94 %

2. Sedimentačné chovanie:

a) sedimentačný objem po 5 minútach do začiatku: 92 % testovaného objemu

b) sedimentačný objem po 24 hodinách od začiatku: 72 % testovaného objemu.

3. Veľkosť častice (stredný priemer podľa Folka a Warda) : 60,5 ± 0,5 pm. Nosiče vo forme kolagénových prúžkov sa pokryli suspenziou. Za nasledujúcich podmienok sa v chladiacej komore najskôr preinkubovalo 8 prúžkov kolagénovej huby: teplota 6,0 °C, relatívna vlhkosť 85 %, inkubačný čas 18,5 hodiny.

Pokryté prúžky kolagénovej huby sa vysušili nasledujúcim spôsobom: Pokryté prúžky sa inkubovali 45 minút pri teplote 5 °C sa relatívnej vlhkosti 85 %. Potom sa za nasledujúcich podmienok sušenia pokryté prúžky vysušili za zníženého tlaku v sušiacej komore:

Vzduchové podmienky: teplota 5 °C, relatívna vlhkosť 85 %, prietok vzduchu odsávacím ventilom 1,2 m³ za hodinu, tlak 3,5 kPa (35 mbar), čas sušenia 4 hodiny.

Príklad IV

V tomto príklade obsahuje suspenzia ľudský fibrinogénový prípravok A a ľudský trombínový prípravok A.

Výsledný objem suspenzie 3120 ml sa získal použitím nasledujúcich množstiev a parametrov:

Fibrinogénová zmes : 2540 ml etanolu (100 % pri 2 až 8 °C), 311,6 g ľudského fibrinogénového prípravku A, 440 mg riboflavínu. Fibrinogénová zmes bola udržiavaná za miešania 8 až 16 hodín pri 2 až 8 °C.

Trombínová zmes: 210 ml etanolu (100 % pri -30°C), 229 g ľudského trombínového prípravku A.

Suspenzia: 87,3 ml vody pre injekciu sa pridalo k fibrinogénovej zmesi. K fibrinogénovej zmesi sa pridala trombínová zmes. Na doplnenie na výsledný objem suspenzie sa pri 2 až 8 °C pridal 100 % etanol.

Vlastnosti suspenzie :

1. Koncentrácia etanolu : 97 %

2. Sedimentačné chovanie :

a) sedimentačný objem po 5 minútach od začiatku : 95,6 % testovaného objemu

b) sedimentačný objem po 24 hodinách od začiatku : 63,5 % testovaného objemu.

3. Veľkosť častice (stredný priemer podľa Folka a Warda) : 51,8 ± 0,8 pm.

Nosiče vo forme kolagénových prúžkov sa pokryli suspenziou. Za nasledujúcich podmienok sa v chladiacej komore najskôr preinkubovalo 48 prúžkov kolagénovej huby: teplota 6,5 °C, relatívna vlhkosť 90 %, inkubačný čas 22,5 hodiny.

Pokryté prúžky kolagénovej huby sa vysušili nasledujúcim spôsobom :

Pokryté prúžky sa inkubovali 10 minút pri teplote 6,5 °C a 90 % relatívnej vlhkosti. Potom sa za nasledujúcich podmienok sušenia pokryté prúžky vysušili za zníženého tlaku v sušiacej komore.

Vzduchové podmienky: teplota 6,5 °C, 90 % relatívna vlhkosť, prietok vzduchu odsávacím ventilom 21 m³ za hodinu, tlak 5,8 kPa (58 mbar), čas sušenia 4 hodiny.

Keď sa 2 minúty trepalo prúžkami na trepačke Vibrofix pri frekvencii 800 až 1200 otáčok za minútu, došlo k abrázii získaného pokrytia prúžkov kolagénovej huby o asi 0,1 mg/cm².

Príklad 1

Aprotinín ako zložka výrobku TachoComb®.

In vitro štúdium antifibrinolytickej aktivity za vymývacích podmienok podobných situácii in vivo

Cieľom tohto výskumu bolo ukázať účinnosť aprotinínu ako zložky výrobku TachoComb H za hyperfibrinolytických podmienok použitím testových modelov in vitro.

TachoComb S je biela, pokrytá hubovitá náplasť. Táto náplasť penového suchého kolagénu sa použije ako nosič aktívnych pevných zložiek. Veľkosť náplasti je 9,5 cm x 4,8 cm x 0,5 cm. Aktívna strana je zafarbená na žlto. 1 cm² náplasti TachoComb S (hrúbka 0,5 cm) zahŕňa:

kolagén konského pôvodu 2,1 mg pokrytý ľudským fibrinogénom 5,5 mg ¹ ľudským trombínom 2,0 IU riboflavinom (žltá farba akoby značkovač pokrytej plochy) 16,5 pg

Experimentálne in vivo testy pre zistenie dávky potvrdili, že vyššie uvedené koncentrácie trombínu a fibrinogénu majú maximálnu adhezívnu silu (pozri príklad 3). Bol porovnaný výrobok TachoComb H obsahujúci ľudský trombín, ľudský fibrinogén a aprotinín s výrobkom TachoComb S obsahujúcim ako aktívne zložky iba ľudský trombín a ľudský fibrinogén.

Na kvantitatívne určenie účinnosti za hyperfibrinolytických podmienok boli vyvinuté dva testované modely, pričom tieto podmienky by mohli byť považované za odpovedajúce operačným podmienkam a tieto podmienky dovolili urobiť množstvo nutných testov na demonštráciu významného účinku.

V testovanom modeli 1 sa testovaná vzorka naniesla na syntetickú tkaninu, čiže adhézny povrch. Do tkaniny sa vyrezal definovaný otvor, aby sa simulovala napríklad perforácia krvnej cievy. Proces utesňovania bol vystavený dvom rôznym fibrinolytickým roztokom (inkubačným roztokom), ktoré pôsobili na otvor. Jeden z týchto roztokov ďalej obsahoval antifibrinolytickú zložku a₂ - antiplazmín.

Zloženie inkubačných roztokov :

Všetky látky sa zriedili pufrom 1:50 mM trometamol, 100 mM NaCl, 2,5 mM CaCI₂, 2 mg/ml BSA (neobsahujúci proteázu), 0,5 mg/ml azidu sodného.

Inkubačný roztok I (1 μΜ plazminogén, 1 nM tkanivový plazminogénový aktivátor (tPA), 1 μΜ ct₂ — antiplazmín), 49 μΙ pufru 1, pH 7,4, 5.1 μΙ plazminogénového roztoku (kone 4,9 μΜ aktivita ľudského plazminogénu podľa Coachrom), 50 μΙ roztoku tPA (50 nM), 100 ml a₂ - antiplazmínového roztoku (2,5 μΜ).

Inkubačný roztok II (1 μΜ plazminogén, 1 nM tkanivový plazminogénový aktivátor), 149 μΙ pufru 1, pH 7,4, 51 μΙ plazminogénového roztoku (kone. 4,9 μΜ aktivita ľudského plazminogénu podľa Coachrom), 50 μΙ roztoku tPA (50 nM)

Aby sa simuloval vymývací efekt, menila sa inkubačná vzorka v dvojhodinových periódach. Pri tejto príležitosti bola kontrolovaná aj adhézia. Vzorka sa vystavila tlaku 5 kPa (50 mbar). Čas, za ktorý sa vzorka pod tlakom < 5 kPa (50 mbar) oddelila, sa zaznamenal.

Testový model 2 sa uskutočnil na demonštráciu fibrinolytického účinku poškodeného črevného tkaniva. Testovaná vzorka sa naniesla na prasačie črevo (ex vivo) ako adhézny povrch. Do čreva sa vyrezal definovaný otvor, aby sa inkubačnému roztoku umožnilo prísť do styku s fibrínovou zrazeninou a stimulovať vymývací efekt. V zaznamenaných časoch sa vymenil inkubačný roztok, v tomto okamžiku sa vzorka vystavila tlaku 5 kPa (50 mbar). Čas, za ktorý sa vzorka pod tlakom < 5 kPa (50 mbar) oddelila, sa zaznamenal.

Výsledky odhalili značné rozdiely medzi výrobkom TachoComb H obsahujúcim aprotinín a výrobkom TachoComb S bez aprotinínu.

V testovanom modeli 1 pri použití inkubačného roztoku obsahujúceho tkanivový plazminogénový aktivátor, plazminogén a a₂-antiplazmí bol čas fibrinolýzy pre TachoComb H 41,2 ± 7,3 hodiny, v porovnaní s 12,8 ± 2,8 hodinami pre TachoComb S.

V testovanom modeli 1 pri použití inkubačného roztoku obsahujúcom iba tkanivový plazminogénový aktivátor a plazminogén bol čas hydrolýzy pre TachoComb H 31,6 ± 5,6 hodiny v porovnaní s 8,3 ± 1,8 hodinami pre TachoComb

S.

V testovanom modeli 2 bol čas do uvoľnenia výrobku TachoComb H 78,4 ± 16,3 hodiny , v porovnaní s 6,5 ±1,8 hodinami pre TachoComb S.

V testovanej vzorke je možné ešte pozorovať veľa fibrínu. Vzorka sa ale pod tlakom uvoľnila z povrchu čreva, pretože sila adhézie medzi fibrínovou zrazeninou a povrchom čreva sa zoslabila.

V obidvoch modeloch bol veľmi jasne demonštrovaný antifibrinoiytický účinok aprotinínu ako aktívnej zložky vo výrobku TachoComb H.

V testovanom modeli 1 bolo predĺženie času fibrinolýzy v dôsledku prítomnosti aprotinínu ako aktívnej zložky výrobku TachoComb H 320 % pre inkubačný roztok I obsahujúci cc₂-antiplazmín a inkubačný roztok II bez a₂-antiplazmínu. Testový model 1 taktiež ukázal ďalší antifibrinoiytický účinok a₂-antiplazmínu prostredníctvom predĺženia fibrinolýzy pre TachoComb H z 31,6 hodiny na 41,2 hodiny (130 %) a pre TachoComb S z 8,3 hodiny na 12,8 hodiny (154 %).

Príklad 2

Porovnanie pokrytej huby Nycomed (TachoComb S) s inými nosičovými výrobkami pokrytými identicky ako TachoComb S

Adhézia vrstvy

Postup

1. Pokrytie rôznych nosičov

Obchodné meno	Materiál	Vyrobené/Dodané
Opraskin®	Kolagénová huba	Lohmann, Postfach 2343, D-56513 Neuwied
Willospon® forte	Kolagénová huba (teľacia)	Will-Pharma,Postbus 30, NL 1160 AA Zwanenburg
Willospon® Spezial	Želatínová huba	Will-Phrama.Postbus 30. NL 1160 AA Zwanenburg
Ethisorb® Patch	Polyglactin 910/Polydioxanon	Johnson/Johnson (výrobca) Ethicon, Robert-Koch-Str.1 D-22851 Norderstedt
Tabotamp® NU Knit	Oxidovaná regenerovaná celulóza	Johnson/Johnson (výrobca) Ethicon, Robert-Koch-Str. 1 D-22851 Nordested
Collagen sponge Nycomed	Konská kolagénová huba	Nycomed Austria Sannt-peter-Str. 25 A-4021 Linec

Krycou suspenziou TachoComb S bola potiahnutá plocha o rozmeroch 2 cm x

4,5 cm. Množstvo suspenzie na pokrytie odpovedalo opisu pre TachoComb (5,5 mg fibrinogénu/cm²). Vzorky sa sušili.

1. Z každého pokrytého nosiča bola pripravená vzorka s rozmermi 1 cm x 4 cm.

2. Adhézia vrstvy bola testovaná nasledujúcim spôsobom Opis spôsobu

Prístrojové vybavenie

Analytické váhy (presnosť merania ± 0,5 mg)

Trepačka Vibrofix kombinovaná s upevňovacím zariadením

Pravítko s milimetrovým delením

Stopky, skalpel, skúmavky s vnútorným priemerom 2 cm opatrené uzáverom Postup

Pomocou skalpela sa z pokrytého nosiča vyrezala plocha o rozmeroch 4 cm x 1 cm. Vzorka sa umiestnila do zváženej skúmavky s uzáverom. Potom sa 2 minúty trepalo na trepačke Vibrofix (frekvencia 1000 za minútu) .

Prúžok sa vybral a prevážením sa zistilo zostatkové množstvo krycieho materiálu (abrázia v mg/cm²).

Výpočet hmotnosť zostatku (mg) - tára (mg)

Abrázia (mg/cm²) =4 cm²

Výsledky

Nosič	Látka	Abrázia (mg/cm²)
Opraskin ®	lyofilizovaný kolagén	2,1
Willospon® forte (3 mm)	lyofilizovaný kolagén	1,2
Willospon® Spezial (1 mm)	želatína	2,1
Ethisorb® Patch (ZVP609)	polyglactin/dioxanon	14,3
Tabotamp® NU Knit	oxidovaná celulóza	9,2
Collagén sponge Nycomed	kolagén, penový	0,15

Žiadny nosič okrem kolagénovej huby Nycomed nie je po pokrytí pružný. Vzorka sa musí vyrezať veľmi opatrne. Keď je vystrihnutá pomocou nožníc, dôjde k odlúpeniu veľkého množstva poťahového materiálu, pretože vrstva je sama o osebe neohybná. Medzi poťahovým materiálom a nosičom Ethisorb® Patch nebolo takmer žiadne spojenie. Keď sa trochu zatrepalo, celé pokrytie sa odlúpalo ako koberec. Rozdiel medzi kolagénovou hubou Nycomed a ostatnými nosičovými materiálmi je celkom jasný.

Pružnosť zvlhčeného pokrytého nosiča

Postup

1. Pokrytie rôznych nosičov

Krycou suspenziou TachoComb S sa pokryla plocha s rozmermi 2 cm x 4,5 cm každého nosiča. Množstvo krycej suspenzie odpovedalo opisu pre TachoComb (5,5 mg fibrinogénu/cm²). Vzorky sa vysušili.

2. Z každého pokrytého nosiča sa pripravila vzorka s plochou 5 až 7 cm². Bola určená presná východisková plocha vysušenej vzorky.

3. Vzorka sa zvlhčila a položila na elastickú latexovú fóliu upevnenú na špeciálne zariadenie, ako je podrobne opísané pod nadpisom Postup. Potom sa na latexovú fóliu vyvinul tlak, pri ktorom sa roztiahla. Po dvoch roztiahnutiach a uvoľneniach sa fólia roztiahla po tretíkrát. Plocha nosiča sa zmerala v bode najvyššieho roztiahnutia.

Opis spôsobu

Prístrojové vybavenie/Chemikálie

Peristaltická pumpa (IKA PA-SF)

Nádobka na vyrovnávanie tlaku (3 výstupy)

Tlakomer VDO (0 až 25 kPa (0 až 250 mbar)

Sklenená nálevka (priemer otvoru 1 : 30 mm, otvoru 2:15 mm)

Silikónové trubičky a sponky, latexové rukavice (Semper med), skalpel, pravítko s milimetrovým delením, nožničky Fyziologický roztok

Postup

K trom výstupom tlakovej vyrovnávacej nádobky sa pomocou silikónových rúrok vzduchotesne pripojilo nasledujúce vybavenie :

a) peristaltická pumpa,

b) tlakomer,

c) sklenená nálevka/otvor 2.

Z latexovej rukavice sa vystrihol dvojitý prúžok s rozmermi 8 cm x 8 cm. Tento prúžok sa vzduchotesne upevnil k sklenenej nálevke/otvor 1.

Skalpelom sa vyrezala plocha 5 až 7 cm² pokrytej plochy pokrytého nosiča. Zmerala sa plocha vzorky (východisková plocha). Pokrytie vzorky sa zvlhčilo fyziologickým roztokom a vzorka sa položila na latexovú fóliu. Potom sa na latexovú fóliu vzorka pritláčala asi 1 minútu.

Latexová fólia sa pomocou peristaltickej pumpy roztiahla tlakom 7 kPa (70 mbar). To sa dvakrát opakovalo, vždy s následným uvoľnením tlaku na latexovú fóliu.

Pri treťom roztiahnutí sa plocha zmerala (dĺžka a šírka) pokrytého nosiča a to v bode najväčšieho roztiahnutia latexovej fólie.

Výpočet plocha nosiča pri treťom roztiahnutí Faktor pružnosti =-východisková plocha vzorky

Výsledky

Nosič	Látka	Faktor pružnosti
Opraskin ®	lyofilyzovaný kolagén	1,78
Willospon ® forte (3mm)	lyofilyzovaný kolagén	1,53
Willospon® Spezial (1 mm)	želatína	1,79
Ethisorb® Patch (ZVP609)	Polyglactin/dioxan	1,0
Tabotamp® NU Knit	Oxidovaná celulóza	1,15
Collagen sponge Nycomed	kolagén, penový	1,55

Komentár

Pružnosť zvlhčenej kolagénovej huby Nycomed (TachoComb S) je jednou z dôležitých vlastností výrobku Pružnosť je nevyhnutná v chirurgii hrudníka a brušnej dutiny. Po prilepení by mal byť nosič schopný sledovať napríklad rozťahovacie a sťahovacie pohyby pľúc alebo čriev. Najmä Ethisorb® nevykazoval vôbec žiadnu pružnosť. Z pokrytia sa uvoľňoval okamžite. Pokrytý Willospon® Spezial a Opraskin® vykazovali počas testu štrukturálne defekty.

Použitie pokrytého nosiča v enedoskopickej chirurgii

Postup

1. Pokrytie rôznych nosičov

Krycou suspenziou TachoComb S sa pokryla plocha s rozmermi 2 cm x 4 cm každého nosiča. Množstvo krycej suspenzie odpovedalo opisu pre TachoComb (5,5 mg fibrinogénu/cm²). Vzorky sa vysušili.

2. Zaobchádzanie so vzorkami pokrytého nosiča pre použitie v endoskopickej chirurgii a strata pokrytia v dôsledku tohto zaobchádzania sa zdokumentovali prostredníctvom digitálneho fotografického vybavenia.

Opis spôsobu

Prístrojové vybavenie

Endodock : Endoskopický nástroj prispôsobený na použitie prostriedku TachoComb® v endoskopickej chirurgii (pozri obrázok 7). Digitálne fotografické vybavenie.

Zoznam študovaných nosičov

Nosič	Nosičový materiál
Opraskin®	lyofilyzovaný kolagén
Willospon® forte (3 mm)	fyofilyzovaný kolagén
Willospon® Spezial (1 mm)	želatína
Ethisorb® Patch (ZVP609)	polyglactin/dioxanon
Tabotamp® NU Knit	oxidovaná celulóza
Collagen sponge Nycomed	kolagén, penový

Postup

Odfotografované obrázky všetkých nosičov

1. obrázok : Dokumentácia nepokrytých a pokrytých nosičových vzoriek

2. obrázok : Pokryté vzorky sa ponoria do endoskopického zariadenia (Endodock). Vzorka sa musí ručne stenčiť, aby ju bolo možné obaliť okolo vodiaceho „kolíka“. Potom sa vzorka čiastočne ponorí do oceľovej trubičky s priemerom 10 mm. Dokumentácia vzorky čiastočne ponorenej do trubičky zariadenia Endodock.

3. obrázok : Vzorka sa opatrne vyberie von. Potom sa vzorka rozvinie. Pokrytie, ktoré sa v dôsledku tohto zaobchádzania so vzorkou oddelí, sa zhromaždí vedľa vzorky Zdokumentuje sa rozvinutá vzorka po ponorení do endoskopického zariadenia a úbytok pokrytia v dôsledku tohto zaobchádzania so vzorkou.

Komentár

Použitie prostriedku TachoComb S (pokrytá konská kolagénová huba/Nycomed) v endoskopickej chirurgii je najnáročnejšou aplikáciou výrobku. TachoComb S sa ponorí do endoskopického zariadenia. Trubička tohto vybavenia má obvykle priemer 10 až 13 mm. Pre ponorenie do trubičky sa TachoComb S stenčí a potom obalí okolo vedúceho „kolíka“ a potom sa opatrne ponorí do trubičky. Preto musí byť spojenie poťahu s nosičom a i vlastné spojenie silné, ale aby výrobok zostal dostatočne ohybný v suchom stave, aby sa mohol ohýbať a rolovať. Keď sa

TachoComb S vnáša do operovaného miesta, opatrne sa vyberie z trubičky. Potom sa musí rozvinúť a umiestniť na povrch poranenia. To často vyžaduje nejaké úpravy. Preto by adhézia vrstvy na nosič mala byť dostatočne silná, aby toto zaobchádzanie vydržala.

Výsledky

Výsledky sú na pripojených obrázkoch 1 až 6. Odhad odpadnutého krycieho materiálu je nasledujúci:

Opraskin ®	30 až 40 %
Willospon ® forte (3 mm)	60 až 70 %
Willospon ® Spezial (1 mm)	50 %
Tabotamp ® NU Knit	60 až 70 %
Ethisorb ® Patch	95 %
Collagen sponge Nycomed	<5 %

Pretože Ethisorb® je veľmi neohybný nosič, je adhézia poťahu veľmi zlá. Preto pri tomto prieskume stratil pokrytý Ethisorb® tekmer celé pokrytie. V porovnaní s pokrytou kolagénovou hubou od firmy Nycomed mali všetky ostatné študované nosiče pokrývaný povrch hladký. Preto pokrytie leží na nosiči ako „rovný koberec“. To vedie k trochu neohybnej štruktúre suchých pokrytých nosičov. Ohýbanie alebo rolovanie v ňom často spôsobuje praskliny.

Po ponorení pokrytých nosičov do trubičky endoskopického zariadenia a potom rozvinutia vzorky stratili všetky nosiče okrem kolagénovej huby firmy Nycomed pomerne veľa z pokrytia, takže veľké plochy zostali bez krycieho materiálu.

Štruktúra a zrnitosť kolagénovej huby firmy Nycomed je základom vysokej ohybnosti výrobku TachoComb S za podmienok vysušenia alebo zvlhčenia. Kolagénová huba firmy Nycomed je penová a má vo vnútri mnohouholníkové dutiny. Na povrchu sú tieto dutiny prerezané a vznikajú kaverny. Tieto kaverny zväčšujú povrch pokrytia. Počas pokrývania sa krycia suspenzia distribuuje rovnomerne na štruktúrovaný povrch. Počas sušenia sa roztok obsahujúci ako fibrinogén, tak trombín, zakotví ako pevná látka do týchto kaverien. Preto sa môže TachoComb

S narezať do žiadaných veľkostí a je možné ho ponoriť do endoskopického vybavenia s iba malou stratou krycieho materiálu alebo celkom bez strát.

V porovnaní so všetkými ostatnými študovanými nosičmi je veľkou výhodou suchého prostriedku TachoComb S jeho vysoká ohybnosť.

Príklad 3

Testy na nájdenie dávok aktívnych zložiek

Dávka aktívnych zložiek bola nájdená prostredníctvom dvoch rôznych experimentálnych modelov, v ktorých bola meraná sila adhézie: pevnosť v ťahu na krysej pečeni, sila adhézie ku krysej ľadvine pri zvýšenou tkanivovom tlaku.

A. Pevnosť v ťahu na krysej pečeni

Na ľavom laloku pečene zanestetizovanej krysy sa urobilo poranenie o rozmeroch 1 cm x 1 cm a 1 mm hlboké, aby sa získalo mokvavé krvácanie. Poranenie sa uzatvorilo kúskom prostriedku TachoComb S s rozmermi 1 cm x 1 cm, ktorý sa spojil s pružinovými váhami. Meral sa ťah, pri ktorom sa TachoComb S odtrhol.

B. Sila adhézie ku krysej ľadvine pri zvýšenou tkanivovom tlaku

Odrezaním asi jednej štvrtiny hmotnosti ľavej ľadviny zanestetizovanej krysy sa vytvorilo hladké, silno krvácajúce poranenie. Poranenie sa uzavrelo testovými prúžkami prostriedku TachoComb S. Uzatvorením žilového odtoku a čerpaním izotonického roztoku citrátovej soli (pH 7,2) do ľadviny sa zvýšil tkanivový tlak. Meral sa tlak, pri ktorom sa TachoComb S začal uvoľňovať.

Tabuľka 1

Sila adhézie prostriedku TachoComb S obsahujúceho rôzne množstvá fibrinogénu

Zloženie vrstvy	Sila adhézie (priemer ± smerodajná odchýlka)
Fibrinogén, mg/cm²	Trombin, IU/cm²	Pevnosť v ťahu na krysej pečeni, N/cm²n=5	Sila adhézie ku krysej ľadvine pri zvýšenom tkanivovom tlaku, kPa, n=5
0	0	0,20 ±0,02	4,7 ±0,9
0	2,40	0,20 ±0,03	6,3 ± 1,6
1,30	1,73	0,30 ±0,06	8,1 ±1,2
2,92	1,85	0,39 ±0,05	10,1 ± 1,3
5,10	1,87	0,39 ±0,03	11,0 ± 1,3
7,22	1,82	0,38 ± 0,02	9,7 ±1,3
10,02	1,75	0,40 ±0,07	8,7 ± 1,0

Tabuľka 2

Sila adhézie prostriedku TachoComb S obsahujúceho rôzne množstvá trombínu

Zloženie vrstvy	Sila adhézie (priemer ± smerodajná odchýlka)
Fibrinogén, mg/cm²	Trombin, IU/cm²	Pevnosť v ťahu na krysej pečeni, N/cm²n=5	Sila adhézie ku krysej ľadvine pri zvýšenom tkanivovom tlaku, kPa, n=5
0	0	0,20 ±0,02	4,7 ±0,9
6,15	0	0,27 ±0,01	5,7 ±1,0
4,72	0,92	0,39 ±0,02	8,4 ±0,9
5,10	1,87	0,39 ±0,03	11,0± 1,3
4,78	4,95	0,35± 0,02	9,7 ±0,9
4,70	9,63	0,30 ±0,02	10,9 ± 1,3
4,75	19+,83	0,27 ± 0,03	9,1 ±2,0

Získané výsledky odhalili značné rozdiely medzi niekoľkými variáciami. Optimálne rozmedzie pre ľudský trombin bolo 0,9 až 10 IU/cm² s konštantným obsahom ľudského fibrinogénu 5 mg/cm². Optimálne rozmedzie pre ľudský fibrinogén bolo 2,9 až 7,2 mg/cm² s konštantným obsahom ľudského trombínu 2 IU/cm².

Tieto testy in vivo potvrdili, že ako koncentrácia fibrinogénu (4,3 až 6,7 mg/cm²), tak koncentrácia trombínu (1,5 až 2,5 IU/cm²), ktoré sa používajú v iných prípravkoch TachoComb (TachoComb® a TachoComb H) majú taktiež za výsledok maximálnu adhéznu silu pre TachoComb S.

Príklad 4

Účinnosť prostriedku TachoComb S pri utesňovaní lézie sleziny a pečene u psov

Cieľom tohto výskumu bolo porovnanie hemostatickej účinnosti prostriedku TachoComb H (obsahujúceho aprotinín) s prostriedkom TachoComb S (bez aprotinínu) na léziách sleziny a pečene u psov. K napodobneniu mokvavého krvácania bolo vybrané reznutie a prepichnutie (0,5 cm hlbokej) sleziny. Na napodobnenie silne krvácajúceho povrchového poranenia (2 až 3 cm²) bola urobená resekcia končeka horného pečeňového laloka. Bola použitá náplasť prostriedku TachoComb H alebo TachoComb S, ako jediného prostriedku na zastavenie krvácania z rán (z rovnakej série použitej na lézie sleziny a pečene u rovnakého psa). Pitva sa urobila po 48 hodinách od operácie, pretože to je perióda s najväčším rizikom obnoveného krvácania v klinickej praxi.

Úplná zástava krvácania sa dosiahla s obidvoma výrobkami. Nebol pozorovaný jediný prípad sekundárneho krvácania pri pitve po 48 hodinách od operácie, a to ani pri zbežnom pozorovaní a ani pri histologickom vyšetrení.

Keď sa s ohľadom na zástavu krvácania a hojenia poranenia vyhodnocovali slezinové a pečeňové lézie pokryté príslušnými náplasťami, tak taktiež histologický neboli zaznamenané žiadne rozdiely medzi psami, ktorým bol aplikovaný TachoComb H alebo TachoComb S. Po operácii nebol pozorovaný žiadny prípad sekundárneho krvácania.

Údaje krvného obrazu ukázali podobné výsledky pre obidve skúmané skupiny, s malým nárastom počtu bielych krviniek 48 hodín po operácii. Čo sa týka ktoréhokoľvek z vyhodnocovaných parametrov, tak neboli zaznamenané žiadne rozdiely medzi obidvoma skupinami alebo medzi časmi vyhodnotenia. Taktiež koagulačné testy neodhalili žiadne rozdiely vo vzťahu k prítomnosti alebo neprítomnosti aprotinínu. Po 48 hodinách od operácie bolo evidentné zvýšenie obsahu fibrinogénu v krvi v obidvoch skupinách, ktoré boli skúmané. Zvýšenie počtu bielych krviniek a obsahu fibrinogénu v krvi je možné prisúdiť odozve na operačné poranenie a obidva efekty nie sú považované za toxický vedľajší účinok prostriedkov TachoComb H alebo S.

Takže je možné urobiť záver, že TachoComb S (bez aprotinínu) vykazuje rovnakú účinnosť ako TachoComb H (obsahujúci aprotinín) v pôsobení na mokvavé a silno krvácajúce parenchymové poranenia u psov. Stabilita zrazeniny za vybraných podmienok nebola ovplyvnená prítomnosťou alebo neprítomnosťou aprotinínu.

Príklad 5

Porovnanie hemostatického účinku, tesniaceho účinku na poranenie a rezistenciu absorbovateľných prostriedkov TachoComb S a TachoComb H : Experimentálna štúdia na ošípaných

Účel štúdie

Tento test bol navrhnutý na určenie okamžitej účinnosti a krátkodobej odolnosti hemostatickej pleteniny na léziu sleziny uskutočnenú u ošípanej

Materiál a spôsoby

V tejto štúdii bolo použito 24 bachorov (bachyní) prasaťa. Náhodne boli testované 2 skupiny hemostatickej pleteniny: TachoComb H s aprotinínom a TachoComb S bez aprotinínu.

V operačný deň sa zvieratám aplikovala pletenina, ktorá priamo utesnila štandardizovaný rez 2 cm x 3 cm, ktorý bol chirurgicky vytvorený na spodnej časti sleziny.

Bol vyhodnotený okamžitý a hemostatický účinok pleteniny a to spočítaním počtu pľuzgierov a zmeraním času potrebného na zastavenie krvácania. Bola zaznamenaná adhézia prostriedku TachoComb H a S.

Po 72 hodinách bolo zvýšením vnútorného tlaku v slezine (stiahnutím cievnych žíl) skúmané krátkodobé fungovanie a odolnosť obidvoch materiálov.

Keď tlak dosiahol takmer stály stav, tak sa na zvýšenie tepnového tlaku intravenózne podal jednorázovo adrenalín (0,02 mg alebo 0,04 mg), a to buď v spojení s infúziou dobutaminchlórhydrátu alebo bez nej. Pri použití týchto farmakologických látok bolo u každého zvieraťa ako dôsledok zvýšeného krvného tlaku zaznamenané prasknutie iézie, ktorá bola opravená prostriedkami TachoComb H a S.

Výsledky

Medzi jednotlivými liečebnými pôsobeniami nebol počas času operácie sleziny zaznamenaný žiadny rozdiel v hemostatickom účinku.

Pri druhom prehliadnutí po 72 hodinách bol aj makroskopický vzhľad obidvoch pletenín identický.

Medzi obidvoma experimentálnymi skupinami neboli významné rozdiely v meraní akútneho tlaku a odolnosti voči prasknutiu.

Neobjavilo sa žiadne prasknutie materiálu. Krvácanie lézii bolo pozorované u 4 zvierat s prostriedkom TachoComb S a 2 zvierat s prostriedkom TachoComb H (s jedným ďalším pľuzgierom v skupine 4).

Histologické vyšetrenie ukázalo, že aprotinín môže mať ochranný účinok na štruktúru pleteniny, keď sa zdalo, že aprotinín modifikuje mikroskopickú štruktúru prostredníctvom zmenšenia degradácie pleteniny. Nebola pozorovaná žiadna špecifická bunková štruktúra.

Záver

Bol preštudovaný okamžitý hemostatický účinok 2 prostriedkov TachoComb, S a H a to v štandardizovanom modeli lézie sleziny na 24 ošípaných.

Obidva materiály sa chovajú podobne čo do účinnosti, priľnavosti k lézii a kompliancii s parenchýmom. Ich účinnosť bola impresívna.

Ich odolnosť biodegradácie a proteolýze bola študovaná 72 hodín od operácie prostredníctvom zvýšenia vnútorného tlaku v slezine (mechanickými a farmakologickými prostriedkami) a zaznamenala sa lokálna odolnosť pletenín výrobkov TachoComb H a S. Medzi obidvoma materiálmi nebol preukázaný žiadny významný rozdiel. Histopatologické nálezy však ukázali, že proteolytická degradácia prostriedku TachoComb S sa prejavila trochu viacej ako u prostriedku TachoComb H. TachoComb S alebo TachoComb H sa použili ako jediný prostriedok na zastavenie krvácania na uzavretie silne krvácajúcich slezinových lézii. u prasiat (povrch lézie 2 cm x 3 cm, 3 až 5 mm hlboké, n= 12 na skupinu). Po 72 hodinách bol vnútorný tlak v slezine ďalej zvýšený podviazaním slezinnej žily (žíl). Potom sa vnútorný tlak v slezine ďalej zvýšil injekciou adrenalínu. Prasatá boli sledované, či sa neobjavia známky nového krvácania alebo sa pod náplasťou neobjavia krvné pľuzgiere. Po pitve bola urobená histopatológia vzoriek (miesta lézie prekryté prostriedkami TachoComb H a S).

Prostriedky TachoComb S a TachoComb H mali podobnú účinnosť, priľnavosť k lézii a komplianciu k parenchýmu.

Príklad 6

Porovnanie hemostatického tesniaceho účinku na poranenie a odolnosť absorbovateľných prostriedkov TachoComb S a TachoComb H: Pokusná štúdia na ošípaných v modeli akútnej pankreatitídy

Účel štúdie

Tento test bol navrhnutý na zhodnotenie okamžitej účinnosti krátkodobej odolnosti hemostatickej pleteniny na slezinové lézie indukované u prasaťa v modeli akútnej pankreatitídy.

Materiály a spôsoby

V tejto štúdii sa použilo 20 bachorov (Bachyní) ošípanej. Náhodne boli testované 2 skupiny hemostatickej pleteniny. TachoComb H s aprotinínom a TachoComb S bez aprotinínu.

V operačnom dni sa zvieratám aplikovala pletenina priamo utesňujúca štandardizovanú léziu o rozmeroch 2 cm x 3 cm, ktorá sa chirurgicky vytvorila na spodnej časti sleziny.

Bol vyhodnotený okamžitý hemostatický účinok pleteniny a spočítaním množstva pľuzgierikov a meraním času potrebného na zastavenie krvácania. Bola zaznamenaná priľnavosť prostriedku TachoComb H a S.

Potom sa použitím sterilnej striekačky prepichol žlčník a odobrala sa žlč a 10 ml žlči sa injektovalo do Wirsungovho vývodného kanálika, aby sa indukovala pankreatitída. Hladiny enzýmov v krvi sa monitorovali pred operáciou a denne aj po operácii (hladiny lipázy a amylázy).

Na pankreatickom parenchýme na jeho napojenie k črevu sa umiestnili malé kúsky prostriedkov TachoComb H a S.

Po 72 hodinách bolo preskúmané krátkodobé fungovanie a odolnosť k enzymatickém rozkladu prostriedku TachoComb H a S, a to zvýšením vnútorného tlaku v slezine (stlačením žilových ciev a farmakologickými prostriedkami).

Keď tlak dosiahol takmer ustálený stav, tak sa na zvýšenie tepnového tlaku intravenózne podal jednorázovo adrenalín (0,02 mg alebo 0,04 mg), a to buď v spojení s premytým dobutaminchlórhydrátom rýchlosťou 0,3 až 0,6 mg/min., alebo bez neho.

Pri použití týchto farmakologických látok bolo u každého zvieraťa ako dôsledok zvýšeného krvného tlaku zaznamenané prasknutie lézie, ktorá bola opravená prostriedkami TachoComb H a S.

Výsledky

Na slezine sa obidva materiály chovajú podobne v okamžitej hemostatickej účinnosti, priľnavosti k lézii a kompliancii k parenchýmu. Ich účinnosť bola veľmi impresívna.

Obidve pleteniny boli pri makroskopickom preskúmaní nezmenené aj na tretí deň, hoci enzymatické podmienky boli náročné, obzvlášť počas druhého dňa v krvi a ešte na štvrtý deň v peritoneálnej tekutine.

V 72. hodine po zvýšení tlaku v slezine neboli zaznamenané žiadne významné zmeny v odolnosti obidvoch materiálov.

Jedno prasknutie materiálu sa objavilo v skupine prostriedku TachoComb Sa u 2 zvierat s prostriedkom TachoComb H ( s jedným pľuzgierom v skupine prostriedku TachoComb H).

Histopatologické nálezy neidentifikovali žiadny významný rozdiel v degradácii prostriedku TachoComb S v porovnaní s prostriedkom TachoComb H. Na slezine nebol pozorovaný žiadny špecifický bunkový profil. Kúsky prostriedkov TachoComb H a S na pankreatických vzorkách v tesnom kontakte s vysokou koncentráciou pankreatického enzýmu nevykazovali žiadnu väčšiu zmenu.

Záver

Na záver je možné konštatovať, že čo sa týka odolnosti k prasknutiu, tak za podmienok prostredia zvýšených pankreatických enzýmov nebol zaznamenaný žiadny jasný rozdiel medzi prostriedkami TachoComb S a TachoComb H.

Nebol detekovaný ani žiadny makroskopický, ani mikroskopický dôkaz modifikácie obidvoch pletenín prostriedku TachoComb H a S.

Hemostatická účinnosť prostriedkov TachoComb S a TachoComb H bola študovaná v štandardizovanom modeli lézie sleziny (povrch lézie 2 cm x 3 cm, cca 3 mm hlbokej, n=10/skupinu) na prasatách s akútnou pankreatitídou indukovanou spätnou injekciou žlče do Wirsungovho vývodového kanálika s následným podviazaním vývodu z pankreasu. Malé kúsky prostriedkov TachoComb H a S boli taktiež použité na pankreas na strane podviazania z pankreasu. Po 72 hodinách od operácie sa zvýšil vnútorný tlak v slezine podviazaním slezinnej žily a intravenózne sa podal adrenalín. Prostriedky TachoComb S a TachoComb H sa s ohľadom na hemostatickú účinnosť, priľnavosť k lézií a odolnosť voči zvýšenému tlaku vo vnútri sleziny chovali podobne, a to napriek značnému zvýšeniu hladín pankreatických enzýmov (20 až 100 násobný nárast amylázy a lipázy v krvi a 10 až 100 násobný nárast pankreatických enzýmov v peritoneálnej tekutine v porovnaní so základnými hladinami). Histopatologické nálezy neidentifikovali žiadny významný rozdiel v degradácii prostriedkov TachoComb S a TachoComb H. Na slezine nebol pozorovaný žiadny špecifický bunkový profil. Dokonca aj prostriedky TachoComb H a S na pankreatických vzorkách po úzkom kontakte s vysokými koncentráciami pankreatických enzýmov nejavili žiadne väčšie rozdiely v priľnavosti prostriedkov TachoComb H a S a histopatológia neodhalila žiadne väčšie rozdiely.

V tomto vysoko zaťažujúcom modeli akútnej pankreatitídy u prasiat neboli žiadne konkrétne makroskopické rozdiely medzi prostriedkami TachoComb S a TachoComb H.

Príklad 7

Komparatívne štúdie reakcie mozgového tkaniva a efektivity resorbovateľného prostriedku TachoComb H a TachoComb S : Experimentálne štúdie na modeli s králikmi v podmienkach normálnej koagulácie a podmienkach, lokálnej hyperfibrinolýzy

Cieľom tejto štúdie bolo porovnať účinnosť prostriedku TachoComb a TachoComb H po neurochirurgickej aplikácii. Králikom sa urobili mozgové lézie za normálnych koagulačných podmienok (reakcia mozgového tkaniva = BTR, n=12 králikov, vybrané n=10) a za hyperfibrinolytických podmienok (HP) za lokálnej aplikácie r-tPA (n=10 králikov). Boli urobené tri kortikálne lézie na hemisféru (celkom lézií na zviera, vyvŕtaná mozgová lézia bola 3 mm nlboká s priemerom 4 mm).

Séria BTR

Na dve z troch lézií na hemisféru sa postupne pôsobilo prostriedkom TachoComb H alebo TachoComb S a jedna lézia na hemisféru bola na kontrolu nechaná prázdna. Po utesnení lézií prostriedkom TachoComb H alebo S bol pri veľkom zväčšení meraný čas krvácania a to pri kontinuálnom omývaní fyziologickým roztokom pri malom prietoku. Keď sa dosiahla zástava krvácania vo všetkých léziách, indukoval sa vysoký tepnový tlak intravenóznou injekciou adrenalínu (0,01 mg/kg adrenalínu), atak sa stredný tepnový tlak (MAP) zvýšil na aspoň 15,6 kPa (120 mm ortuťového stĺpca). Počas tohto postupu sa stále sledovalo, či nedôjde k obnoveniu krvácania. Po znížení MAP na normálne hodnoty bola koža uzatvorená. Čas od pitvy bol 3 a 7 dni (n=5 králikov na skupinu). U troch zvierat boio pred pitvou na tretí deň urobené zobrazenie pomocou magnetickej rezonancie. Pri pitve sa miesta lézií zbežne prehliadli a boli odobraté vzorky pre histopatológiu.

Séria HF

Po uskutočnení lézií podľa návrhu v sérii BTR sa na léziu nakvapkala r-tPA (0,3 mg r-tPA v 0,5 ml fyziologického roztoku na léziu) a to pred tým, ako sa všetky lézie utesnili buď prostriedkom TachoComb S alebo TachoComb H. Čas krvácania sa meral pri vysokom zväčšení a kontinuálnom umývaní fyziologickým roztokom pri nízkom prietoku. Pitva s hrubým prehliadnutím sa uskutočnila na prvý deň (n=7) a tretí deň (n=3). Na vzorkách odobratých na tretí deň bolo z komparatívnych dôvodov urobené histopatologické vyšetrenie.

Počas celej štúdie neboli evidentné žiadne rozdiely medzi prostriedkami TachoComb S a TachoComb H a to ani s ohľadom na účinnosť utesnenia, toleranciu na zvýšený MAP a trvanie krvácania; ani s ohľadom na histopatológiu. U všetkých zvierat došlo k ťažkému krvácaniu pri sérii HF nie iba v mieste lézie, ale aj pod kožou celého obličaja. Napriek týmto ťažkým podmienkam mal TachoComb S v porovnaní s prostriedkom TachoComb H znova podobnú účinnosť.

Príklad 8

Neurochirurgická aplikácia prostriedkov TachoComb H a TachoComb S : Reakcia mozgového tkaniva a hemostatické účinnosť

Tekuté fibrínové lepidlá sa vo veľkom meradle používajú v neurochirurgii. O reakcii mozgového tkaniva na TachoComb® neexistujú žiadne rozsiahle údaje a použitie antifibrinolytických činidiel (t.j. aprotinínu) je doteraz kontraverzné. Predmety štúdie

Štúdia bola zameraná na dva hlavné body: Prvým predmetom bolo vyhodnotenie krátkodobej lokálnej reakcie mozgového tkaniva po aplikácii prostriedkov TachoComb H (TCH) a TachoComb S (TCS) na kortikálnych léziách v porovnaní so slepými kontrolnými pokusmi na léziách (CL), a to použitím histologických metód a moderných techník zobrazovania.

Druhým predmetom bolo preštudovanie hemostatickej účinnosti výrobkov Tachocomb H a S v podmienkach normálnej koagulácie (skupina BTR) a po lokálne indukovanej silnej hyperfibrinolýze (skupina HF) a vyhodnotiť, či aprotinín má nejaký vplyv na hemostatické kvalitatívne vlastnosti a silu adhézie prípravku.

Materiál a spôsob

Študovalo sa 22 mladých králikov, ktorým sa urobili tri kortikálne iézie na každej hemisfére. Dvanásť zvierat bolo použitých na štúdium reakcie mozgového tkaniva (BTR) a desať v skupine s hyperfibrinolytickými podmienkami (HF).

U zvierat na BTR boli ove lézie postupne vyplnené prostriedkom TachoComb H alebo TachoComb S, zatiaľ čo tretia zostala prázdna ako kontrolná vzorka. Bol meraný čas krvácania a bolo sledované krvácanie v dôsledku indukovaného zvýšenia tepnového tlaku. Na tretí a siedmy deň od operácie sa zvieratá zabili a urobilo sa histopatologické vyšetrenie. U troch zvierat z BTR skupiny sa pre vyhodnotenie opuchu urobilo' aj zobrazenie magnetickou rezonanciou a to na tretí deň po operácii, tesne pred ich utratením.

U zvierat v HF štúdii, u ktorých sa vopred indukovali ťažké fibrinolytické podmienky pomocou rekombinantného tkanivového plazminogénového aktivátora (r-tPA), sa na všetky tri lézie jednej hemisféry pôsobilo prostriedkom TachoComb H a na druhú hemisféru prostriedkom TachoComb S. Zmeral sa čas krvácania a u troch zvierat sa na tretí deň urobilo histologické vyšetrenie.

Výsledky

Za normálnych koagulačných podmienok (zvieratá v štúdii BTR) bola zástava krvácania sTCH aTCS významne rýchlejšia (P<0,001), ako bez žiadneho hemostatického činidla. Bolo preukázané, že medzi časmi krvácania pri použití obidvoch výrobkov nie je významný rozdiel (P=0,294), ale že tieto časy sú významne kratšie ako u lézií v slepých pokusoch (P<0,001).

Počas indukovanej arteriálnej hypertenzie sa obnovené krvácanie objavilo u 1 zo 24 lézií s TCG, 3 z 24 lézií sTCS a 19 z 24 kontrolných lézií. Prítomnosť hemostatického činidla tak zhodne bránila obnoveniu krvácania počas silne zvýšeného tepnového tlaku (χ² = 16,3, P > 0,001 ). V dôsledku neprítomnosti TCH a TCS počas vzrastu tepnového tlaku bolo 80 % riziko obnovenia krvácania.

Štatistická analýza časov krvácania v skupine s hyperfibrinolytickými podmienkami (zvieratá s HF) preukázala, že medzi časmi krvácania pri použití obidvoch výrobkov (znamienkový poradový test: P= 0,927 a T-test P = 0,4102) nie je žiadny rozdiel.

Nakoniec bola významnosť rozdielu medzi hemostatickou účinnosťou rovnakého výrobku v obidvoch koagulačných situáciách vylúčená aj podľa intervalu spoľahlivosti 99,73 % ( D < 3sDD = ns).

Záver

Prostriedky TachoComb H a TachoComb S neindukujú žiadne špecifické histologické zmeny v mozgovom tkanive. Obidva výrobky majú dobrú biokompatibilitu s mozgovým parenchýmom, pretože neindukujú väčšiu tkanivovú reakciu ako samotná lézia. Morfologicky neboli zjavné žiadne nepriaznivé účinky spojené s kombináciou výrobkov. Histologický vyšetrenie neodhalilo rozdiely medzi obidvoma výrobkami ani v podmienkach normálnej koagulácie, ani v podmienkach silne narušenej koagulácie.

Prostriedky TachoComb H a TachoComb S majú rovnakú hemostatickú účinnosť a adhéznu silu ako v podmienkach normálnej koagulácie, tak v podmienkach hyperfibrinolýzy. Existuje tak presvedčivý dôkaz, že aprotinín nemá vplyv na hemostatické kvalitatívne vlastnosti a silu priľnavosti a to ani v podmienkach silne narušenej koagulácie.

V porovnaní s literatúrou dosiahnu prostriedky TachoComb H a S oveľa rýchlejšiu zástavu krvácania ako oxidovaná celulóza a kolagénová pletenina.

PATENTOVÉ NÁROKY

Claims

1. Pevný prostriedok, vyznačujúci sa tým, že sa vo svojej podstate skladá z a) kolagénového nosiča, ktorý má aspoň dve z nasledovných fyzikálnych vlastností, ktorými je modul pružnosti v rozmedzí 5 až 100 N/cm, hustota 1 až 10 mg/cm³, priemer dutiny väčší ako 0,75 mm a menší ako 4 mm a/alebo stredný priemer dutiny pod 3 mm a na uvedenom nosiči rovnomerne distribuovanú a zakotvenú zmes b) pevného fibrinogénu a c) pevného trombínu.

2. Prostriedok podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že nosičom je kolagénová huba, ktorá obsahuje materiál kolagénu typu I z cicavčích, transgénnych alebo rekombinantných zdrojov.

3. Prostriedok podľa nároku 1 až 2, vyznačujúci sa tým, že obsahuje kolagénový nosič, ktorý má jednu alebo viacej aktívnych strán, kde je prítomný fibrinogén v množstve 2 až 10 mg/cm², ako 4,3 až 6,7 mg/cm², s výhodou 5,5 mg/cm² a trombín je prítomný v množstve 1,5 až 5,5 IU/cm², s výhodou 2,0 IU/cm².

4. Prostriedok podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 3, vyznačujúci sa tým, že obsahuje ľudský fibrinogén.

5. Prostriedok podľa nároku 4, vyznačujúci sa tým, že obsahuje fibrinogén prečistený z prírodného zdroja.

6. Prostriedok podľa nároku 4, vyznačujúci sa tým, že obsahuje transgénny alebo rekombinantný fibrinogén.

7. Prostriedok podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 6, vyznačujúci sa tým, že obsahuje ľudský trombín.

8. Prostriedok podľa nároku 7, vyznačujúci sa tým, že obsahuje trombín prečistený z prírodného zdroja.

9. Prostriedok podľa nároku 7, vyznačujúci sa tým, že obsahuje transgénny alebo rekombinantný trombín.

10. Materiál na zastavenie krvácania, utesnenie tkaniva a zlepenie tkaniva, vyznačujúci sa tým, že obsahuje pružný nosič, ktorý má aspoň dve z nasledovných fyzikálnych vlastností, ktorým je modul pružnosti v rozmedzí 5 až 100 N/cm, hustotu 1 až 10 mg/cm³, priemer dutiny väčší ako 0,75 mm a menší ako 4 mm a/alebo stredný priemer dutiny pod 3 mm a ktorý ďalej obsahuje zmes pevného fibrinogénu a pevného trombínu a neobsahuje žiadne antifibrinolytické činidlo ako je aprotinín, ε-aminokaprónová kyselina alebo 012antiplazmín, pričom pevný fibrinogén a pevný trombín sú zakotvené na nosiči takým spôsobom, že keď sa pokrytý materiál 2 minúty trepe na trepačke Vibrofix s frekvenciou 1 000 otáčok za minútu, je abrázia menšia ako 1,0 mg/cm² a keď sa pokrytý nosičový materiál ponorí do endoskopického zariadenia a potom sa vyberie, je materiál v podstate nezmenený a má stratu krycieho materiálu menšiu ako 20 %, ako indikáciu ohybnosti nosiča a pevnej adhézie pevného fibrinogénu a pevného trombínu, pričom tento materiál je v podstate vzduchotesný a kvapalinotesný a má faktor pružnosti aspoň 1,25 stanovený testom obsahujúcim fixáciu pokrytého nosiča na latexovú fóliu, trikrát roztiahnutie latexu tlakom a zmeranie plochy pokrytého nosiča pri treťom roztiahnutí v najvyššom bode roztiahnutia latexovej fólie a porovnanie roztiahnutej plochy pokrytého nosiča s východiskovou plochou pokrytej plochy.

11. Použitie nosiča majúceho aspoň dve z nasledovných fyzikálnych vlastností, ktorými je modul pružnosti v rozmedzí 5 až 100 N/cm, hustota 1 až 10 mg/cm³, priemer dutiny väčší ako 0,75 mm a menší ako 4 mm a/alebo stredný priemer dutiny pod 3 mm a dostatočné množstvo fibrinogénu a dostatočné množstvo trombínu na prípravu výrobku pre utesnenie tkaniva.

12. Použitie nosiča majúceho aspoň dve z nasledovných fyzikálnych vlastností, ktorými je modul pružnosti v rozmedzí 5 až 100 N/cm, hustota 1 až 10 mg/cm³, priemer dutiny väčší ako 0,75 mm a menší ako 4 mm a/alebo stredný priemer dutiny pod 3 mm a dostatočné množstvo fibrinogénu a dostatočné množstvo trombínu na prípravu výrobku pre zastavenie krvácania.

13. Použitie nosiča majúceho aspoň dve z nasledovných fyzikálnych vlastností, ktorými je modul pružnosti v rozmedzí 5 až 100 N/cm, hustota 1 až 10 mg/cm³: priemer dutiny väčší ako 0,75 mm a menší ako 4 mm a/alebo stredný priemer dutiny pod 3 mm a dostatočné množstvo fibrinogénu a dostatočné množstvo trombínu na prípravu výrobku pre utesnenie tkaniva.

14. Použitie nosiča podľa ktoréhokoľvek z nárokov 11 až 13 pre chirurgické zákroky v gastrointestinálnom trakte ako na pažeráku, žalúdka, tenkom čreve, hrubom čreve, konečníku, na parenchymových orgánoch ako je pečeň, slezina, slinivka brušná, ľadviny, pľúca, nadľadvinky, štítna žľaza a lymfatické uzliny, v kardiovaskulárnej chirurgii, chirurgii hrudníka zahrňujúceho chirurgiu priedušnice, priedušiek a pľúc, pri chirurgických zásahoch v oblasti ucha, nosa a krku, čiže ORL, zahrňujúce zubnú chirurgiu, v gynekologickej, urologickej, cievnej, kostnej chirurgii, napríklad resekcii spongiózy a neodkladnej chirurgii, neurologickej chirurgii, lymfatických, žlčových a cerebrospinálnych píšťalách, čiže CSF a únikoch vzduchu počas chirurgie hrudníka a pľúc.

15. Použitie nosiča podľa ktoréhokoľvek z nárokov 11 až 14, kde nosičom je biodegradovateľný polymér ako polyhyalurónová kyselina, poíyhydroxykyselina, napríklad kyselina mliečna, glukónová, hydroxybutánová, celulóza, želatína alebo kolagén ako je kolagénová huba, napríklad kolagénová huba zahrňujúca vo svojej podstate vlákna kolagénu typu I.

16. Použitie nosiča podľa ktoréhokoľvek z nárokov 11 až 15, kde tento nosič má jednu alebo viacej aktívnych strán, kde je prítomný fibrinogén v množstve 2 až 10 mg/cm², najmä 4,3 až 6,7 mg/cm², s výhodou 5,5 mg/cm² a trombín je prítomný v množstve 1,5 až 2,5 IU/cm², s výhodou 2,0 IU/cm².

17. Použitie nosiča podľa ktoréhokoľvek z nárokov 11 až 16, na ktorom je zakotvený ľudský fibrinogén, prečistený z prírodného zdroja, alebo transgénny alebo rekombinantný ľudský fibrinogén.

18. Použitie nosiča podľa ktoréhokoľvek z nárokov 11 až 17, kde na nosiči zakotvený fibrinogén je prečistený z prírodného zdroja.

19. Použitie nosiča podľa ktoréhokoľvek z nárokov 11 až 18, kde na nosiči zakotvený fibrinogén je transgénny alebo rekombinantný.

20. Použitie nosiča podľa ktoréhokoľvek z nárokov 11 až 19, kde na nosiči zakotvený trombín je ľudský, prečistený z prírodného zdroja alebo transgénny alebo rekombinantný ľudský trombín.

21. Použitie nosiča podľa ktoréhokoľvek z nárokov 11 až 20, kde na nosiči zakotvený trombín je prečistený z prírodného zdroja.

22. Prostriedok podľa ktoréhokoľvek z nárokov 11 až 21, vyznačujúci sa tým, že obsahuje trombín, ktorý je transgénny alebo rekombinantný.

1/8

1.1. Opraskin® nepokrytý pokrytý