ES2711728T3

ES2711728T3 - Composiciones de péptidos de autoensamblaje

Info

Publication number: ES2711728T3
Application number: ES15719023T
Authority: ES
Inventors: Eun Seok Gil; Karl Gilbert; Manav Mehta
Original assignee: 3D Matrix Ltd
Current assignee: 3D Matrix Ltd
Priority date: 2014-03-10
Filing date: 2015-03-10
Publication date: 2019-05-07
Anticipated expiration: 2035-03-10
Also published as: BR112016020584A2; CA2939696C; DK3116896T3; EP3116896B1; CN106459154A; KR20160127827A; JP2020055836A; JP2022036947A; AU2019219809A1; JP7397042B2; WO2015138514A1; US10654893B2; CA2939696A1; JP2017510568A; AU2015229549B2; EP3466965A1; US20160362451A1; EP3116896A1; JP6628733B2; RU2016139369A

Abstract

Una composición IEIK13 que comprende: un péptido IEIK13 a una concentración de al menos el 0,25%; cuya composición tiene un pH mantenido dentro del intervalo de aproximadamente 2,5 a aproximadamente 4,0.

Description

DESCRIPCION

Composiciones de peptidos de autoensamblaje

LISTA DE SECUENCIAS

Esta solicitud hace referencia a una lista de secuencias enviada de forma electronica como un archivo ascii.txt denominado "2004837-0046_Sequences.txt". El archivo .txt se genero el 9 de marzo de 2015 y tiene un tamano de 1 kb.

ANTECEDENTES

Los agentes peptfdicos con la capacidad de autoensamblarse en estructuras de gel tienen una amplia diversidad de usos en contextos terapeuticos y de investigacion. Un agente peptfdico de este tipo, por ejemplo, un polipeptido sintetico de 16 aminoacidos con una secuencia de repeticion de arginina, alanina y acido aspartico (es decir, RADARADARADARADA [SEQ ID NO: 1], tambien conocida como "RADA16"), esta disponible en el mercado con los nombres comerciales PuraStat®, PuraMatrix® y PuraMatrix GMP® de 3-D Matrix Medical Technology, y ha demostrado ser util en una amplia gama de aplicaciones clfnicas y de laboratorio, incluido el cultivo de celulas, la administracion de farmacos, la aceleracion del crecimiento del cartflago y el hueso, y la regeneracion del SNC, tejido blando y musculo cardfaco, y ademas como una matriz, andamio o atadura que puede asociarse con uno o mas agentes detectables, agentes, celulas y/o componentes celulares biologicamente activos.

Los documentos EP-A 1-2823830 y EP-A 1-2345433 divulgan preparaciones lfquidas de los peptidos IEIK13 y RADA 16.

RESUMEN

La presente divulgacion proporciona composiciones peptfdicas como se definen en las reivindicaciones adjuntas a la presente. Por lo tanto, la presente divulgacion describe, entre otras cosas, ciertas composiciones peptfdicas (y particularmente ciertas composiciones de agentes peptfdicos de autoensamblaje) y tecnologfas relacionadas con las mismas. En algunas formas de realizacion, dichas composiciones pueden ser o comprender soluciones. En algunas formas de realizacion, tales composiciones pueden ser o comprender geles. En algunas formas de realizacion, dichas composiciones pueden ser o comprender peptidos solidos (por ejemplo, secos/liofilizados).

Por ejemplo, la presente divulgacion demuestra que composiciones peptfdicas particulares (es decir, composiciones peptfdicas que tienen concentracion especffica, fuerza ionica, pH, viscosidad y/u otras caracterfsticas) tienen atributos utiles y/o sorprendentes (por ejemplo, gelificacion o cinetica de autoensamblaje [por ejemplo, velocidad de gelificacion y/o tasa y reversibilidad del autoensamblaje peptfdico], rigidez [por ejemplo, segun se evalua a traves del modulo de almacenamiento] y/u otras propiedades mecanicas). En algunas formas de realizacion, la presente divulgacion demuestra una utilidad particular de ciertas composiciones de este tipo en contextos especfficos (por ejemplo, en ciertas aplicaciones in vivo o in vitro).

Entre otras cosas, la presente divulgacion proporciona directrices que permiten la seleccion, diseno y/o formulacion de composiciones peptfdicas particulares utiles en ciertos contextos o aplicaciones.

La presente divulgacion establece el grado en que ciertos cationes y aniones interactuan con los agentes peptfdicos de autoensamblaje, y ademas como dichas interacciones pueden alterar ciertas propiedades del material (por ejemplo, reologicas) (por ejemplo, aumentar la rigidez mecanica y/o la viscosidad) de las composiciones peptfdicas. Aun adicionalmente, la presente divulgacion establece como dichas interacciones pueden influir, entre otras cosas, en la cinetica de gelificacion, la restauracion del estado gelificado (por ejemplo, el tiempo y/o el grado de gelificacion y/o la restauracion de las propiedades del gel) despues de la exposicion a la deformacion (por ejemplo, perturbacion mecanica u otra alteracion).

Los estudios descritos en el presente documento han identificado la fuente de diversos problemas con ciertas tecnologfas peptfdicas de autoensamblaje existentes, y ademas definen atributos y/o caracterfsticas particularmente utiles y/o necesarias especfficas para aplicaciones particulares de tecnologfas de composicion de peptidos.

En algunas formas de realizacion, las composiciones de estos peptidos pueden tener propiedades mejoradas con respecto a las composiciones de referencia apropiadas que tienen un nivel de pH diferente (por ejemplo, inferior), y/o fuerza ionica.

Las composiciones peptfdicas a un nivel de pH mas leve pueden tener propiedades reologicas mas rfgidas que las hacen adecuadas para una gama mas amplia de aplicaciones. El cambio del pH ambiental a mas de 4,0 tambien puede afectar beneficiosamente a la cinetica de la gelificacion de las composiciones peptfdicas. En algunas formas de realizacion, el pH aumentado puede ser un pH fisiologico que puede producirse cuando las composiciones peptfdicas se colocan en el cuerpo.

Como se describe en el presente documento, las propiedades reologicas de IEIK13 pueden mejorarse manteniendo la fuerza ionica aumentada. En algunas formas de realizacion, la fuerza ionica puede ser menor que la fuerza ionica crftica. En algunas formas de realizacion, las composiciones peptfdicas se pueden disolver en agua con sales en lugar de agua pura. En algunas formas de realizacion, las fuerzas ionicas pueden ser mas bajas que sus fuerzas ionicas crfticas.

En alguna forma de realizacion, el aumento de la fuerza ionica puede repercutir beneficiosamente en la rigidez y/o la cinetica de gelificacion en composiciones peptfdicas, lo que las hace adecuadas para una gama mas amplia de aplicaciones. En algunas formas de realizacion, el aumento de la fuerza ionica puede ser la fuerza ionica fisiologica, que puede tener lugar cuando las composiciones peptfdicas se ponen en el cuerpo.

Como se describe en el presente documento, las propiedades de IEIK13 pueden mejorarse manteniendo su nivel de pH en aproximadamente 3,5 o menos y, al mismo tiempo, sus concentraciones de sal a menos de sus niveles crfticos de fuerza ionica (es decir, sin precipitacion).

El IEIK13 se puede caracterizar en terminos de propiedades que incluyen apariencia, nivel de pH, nivel de fuerza ionica, cinetica de gelificacion, propiedades reologicas y viabilidad celular para optimizar las formulaciones peptfdicas para diversas aplicaciones. IEIK13 puede caracterizarse como composiciones peptfdicas similares a RADA16 en terminos de propiedades basicas de gelificacion y otras caracterfsticas.

En algunas formas de realizacion, una composicion peptfdica puede ser una solucion, un gel o cualquier combinacion de los mismos.

En algunas formas de realizacion, una composicion peptfdica puede estar presente a una concentracion inferior al 3%.

En algunas formas de realizacion, una composicion peptfdica puede tener un pH dentro del intervalo de aproximadamente 2,5 a aproximadamente 4,0, o dentro del intervalo de aproximadamente 3,0 a aproximadamente 4,0. En algunas formas de realizacion, el pH de una composicion peptfdica se puede lograr con una solucion seleccionada del grupo que consiste en hidroxido de sodio o hidroxido de potasio, hidroxido de calcio, carbonato de sodio, acetato de sodio, sulfuro de sodio, DMEM (medio de Eagle modificado por Dulbecco) y PBS (solucion salina tamponada con fosfato).

En algunas formas de realizacion, la fuerza ionica de una composicion peptfdica puede ser de aproximadamente 0,0001 M a aproximadamente 1,5 M. En algunas formas de realizacion, la potencia ionica de una composicion peptfdica puede ajustarse mezclando sales comunes, por ejemplo, NaCl, KCl, MgCh, CaCh, CaSO4, DPBS (solucion salina tamponada con fosfato de Dulbecco, 10X). En algunas formas de realizacion, las fuerzas ionicas de las composiciones peptfdicas pueden ajustarse mezclando sales comunes, en las que una o mas sales comunes estan compuestas por uno o mas cationes formadores de sal y uno o mas aniones formadores de sal, en la que los cationes formadores de sal se seleccionan del grupo que consiste en amonio, calcio, hierro, magnesio, potasio, piridinio, amonio cuaternario y sodio, en la que los aniones formadores de sal se seleccionan del grupo que consiste en acetato, carbonato, cloruro, citrato, cianuro, fluoruro, nitrato, nitrito y fosfato.

En algunas formas de realizacion, una composicion peptfdica puede tener una viscosidad en el intervalo de aproximadamente 1 a aproximadamente 10000 Pa ■ S. En algunas formas de realizacion, una composicion peptfdica puede tener un modulo de almacenamiento en el intervalo de aproximadamente 50 a aproximadamente 2500 Pa. En algunas formas de realizacion, un metodo para seleccionar una composicion peptfdica para aplicaciones en un sitio in vivo particular puede comprender etapas para determinar uno o mas parametros seleccionados del grupo que consiste en modulo de almacenamiento, viscosidad, tiempo de gelificacion, tiempo y/o extension de restauracion, etc., para la composicion peptfdica, comparando los parametros determinados con especificaciones para diversas aplicaciones, eligiendo la composicion peptfdica a la luz de la comparacion; y administrando la composicion peptfdica elegida al sitio.

La presente divulgacion tambien describe composiciones peptfdicas lfquidas que pueden comprender, por ejemplo, un peptido que tiene una longitud dentro del intervalo de aproximadamente 6 a aproximadamente 20 aminoacidos y una secuencia de aminoacidos de aminoacidos hidrofobos y aminoacidos hidrofilos alternantes, y puede estar caracterizada por que (i) tiene una viscosidad dentro del intervalo de aproximadamente 1 Pa ■ s a aproximadamente 500.000 Pa ■ s a temperatura ambiente; (ii) tiene un modulo de almacenamiento a 1 rad/s de frecuencia y 1 Pa de tension de oscilacion dentro del intervalo de aproximadamente 1 a aproximadamente 5000 Pa; y/o (iii) forma un gel dentro de un periodo de tiempo de aproximadamente 0 a aproximadamente 30 s cuando se expone a/se mantiene a un pH dentro del intervalo de aproximadamente 2,5 a aproximadamente 4,0 y/o una fuerza ionica dentro del intervalo de aproximadamente 0,0001 M a aproximadamente 1,5 M. Tal composicion puede ser una composicion acuosa.

La presente divulgacion tambien describe metodos para disenar, seleccionar y/o producir una composicion peptfdica que sea particularmente apropiada para su uso en un determinado contexto especffico. En algunos de dichos aspectos de la divulgacion, el determinado contexto especffico es o comprende la aplicacion a un sitio in vivo particular. En algunas formas de realizacion, dichos metodos proporcionados pueden comprender, por ejemplo: (i) determinar uno o mas parametros seleccionados del grupo que consiste en modulo de almacenamiento, viscosidad, tiempo de gelificacion, propiedad de pseudoplasticidad, tiempo de reensamblaje de nanofibra peptfdica, y/o uno o mas parametros diferentes como se describen en el presente documento que sean apropiados para la aplicacion al sitio particular in vivo; y (ii) disenar, seleccionar y/o producir una composicion peptfdica caracterizada por dichos parametros, de acuerdo con las directrices proporcionadas en el presente documento.

Como alternativa, o adicionalmente, en algunos aspectos particulares, la presente divulgacion proporciona metodos para seleccionar composiciones peptfdicas particulares, por ejemplo, para administracion a ciertos sitios in vivo; los ejemplos de tales metodos pueden comprender las etapas de (i) determinar uno o mas parametros seleccionados del grupo que consiste en modulo de almacenamiento, viscosidad, tiempo de gelificacion, propiedad de pseudoplasticidad, tiempo de reensamblaje de la nanofibra del peptido, y/o uno o mas parametros diferentes como se describen en el presente documento para una composicion peptfdica; (ii) comparar el uno o mas parametros determinados con un conjunto de caracterfsticas determinadas como apropiadas para la aplicacion al sitio particular in vivo; (iii) elegir la composicion peptfdica a la luz de la comparacion; y (iv) administrar la composicion peptfdica elegida al sitio.

BREVE DESCRIPCION DEL DIBUJO

Los objetos y las caracterfsticas de la invencion se pueden entender mejor con referencia a los dibujos que se describen a continuacion, y las reivindicaciones.

La Figura 1 muestra formaciones de gel ejemplares de composiciones peptfdicas en soluciones de tampon de PBS. RADA16, IEIK13 y KLD12 se pusieron en placas a concentraciones variables del 0,5%, 1,0%, 1,5%, 2,0% y 2,5%. RADA16, IEIK13 y ^kL^dse gelificaron en todas las concentraciones.

Las Figuras 2A y 2B muestran propiedades reologicas ejemplares de RADA16. La Figura 2A muestra una prueba de barrido de esfuerzo realizada a 1 Pa y 10 rad/s. La Figura 2B muestra el modulo de almacenamiento medido en funcion de la concentracion de RADA16. El modulo de almacenamiento de las composiciones de RADA16 puede tener una relacion lineal con su concentracion.

Las Figuras 3A y 3B muestran propiedades reologicas ejemplares de IEIK13. La Figura 3A muestra una prueba de barrido de esfuerzo realizada a 1 Pa y 10 rad/s. La Figura 3B muestra modulos de almacenamiento medidos en funcion de la concentracion de IEIK. Los modulos de almacenamiento de las composiciones de IEIK13 pueden tener una relacion lineal con sus concentraciones.

Las Figuras 4A y 4B muestran propiedades reologicas ejemplares de KLD12. La Figura 4A muestra una prueba de barrido de esfuerzo realizada a 1 Pa y 10 rad/s. La Figura 4B muestra modulos de almacenamiento medidos en funcion de la concentracion de KLD12. Los modulos de almacenamiento de las composiciones de KLD12 pueden tener una relacion lineal con sus concentraciones.

Las Figuras 5A y 5B son graficos de barras que muestran el efecto del tratamiento con DMEM (medio de Eagle modificado por Dulbecco) en composiciones peptfdicas al 1%. La Figura 5A representa datos del modulo de almacenamiento (realizados a 1 Pa y 10 rad/s) antes o despues del tratamiento con DMEM en composiciones peptfdicas. La Figura 5B muestra el factor de aumentos del modulo de almacenamiento despues del tratamiento con DMEM.

La Figura 6A es una imagen de la mezcla RADA16 y DMEM (relacion en volumen 1:1). La mezcla goteaba y era turbia. La Figura 6B muestra la mezcla despues de la centrifugacion. RADA16 (es decir, la acumulacion translucida en el fondo del tubo de centrffuga) se precipito de la mezcla.

La Figura 7 ilustra nanoestructuras de composiciones de RADA16, KLD12 e IEIK13 a pH 2-3, y a pH fisiologico (DMEM). Si bien el tratamiento con DMEM puede formar composiciones rfgidas, la mezcla con DMEM puede precipitar peptidos.

La Figura 8 muestra ejemplos de pruebas de barrido de esfuerzo a 10 rad/s de composiciones de KLD12 al 1% a pH = 2,0 y 3,4. La Figura 9 muestra ejemplos de pruebas de barrido de esfuerzo a 10 rad/s de composiciones de IEIK13 al 1% a pH = 2,1 y 3,7. La Figura 10 muestra ejemplos de pruebas de barrido de esfuerzo a 10 rad/s de composiciones de RADA16 al 1% a pH = 2,5 y 3,4. Los modulos de almacenamiento de las composiciones peptfdicas se aumentaron con el aumento del pH.

Las Figuras 11A y 11B muestran pruebas de barrido de esfuerzo de frecuencia ejemplares de RADA16 a 1 Pa. La Figura 11A son mediciones de RADA16 al 1% a pH 2,5 y 3,4. La Figura 11B son mediciones de RADA16 al 2,5% a pH 2,5 y 3,4.

La Figura 12 son imagenes de RADA16 al 2,5% a pH 3,2, 3,4, 3,6 y 4,0. La composicion era clara cuando el nivel de pH era de aproximadamente 3,5, y ligeramente turbia a pH = 3,6. La composicion se precipito a pH = 4,0.

La Figura 13 ilustra nanoestructuras y/o reensamblaje de RADA16, KLD12 e IEIK13 a diferentes niveles de pH, con o sin esfuerzo de cizalladura. Las interacciones dominantes pueden determinarse por el pH y el esfuerzo de cizalladura.

Las Figuras 14-16 muestran las viabilidades celulares (mMSCs) de RADA16, IEIK y KLD, respectivamente, a concentraciones seleccionadas. * se indica que la viabilidad celular es significativamente inferior a la viabilidad celular en la siguiente columna de la izquierda (valor de p <0,05). # se indica que la viabilidad celular es significativamente superior a la viabilidad celular en la siguiente columna de la izquierda (valor de p <0,05).

La Figura 17A ilustra una estructura de IEIK13. La Figura 17B muestra imagenes SEM de IEIK13 antes y despues del tratamiento con DMEM. Las fibras IEIK13 despues del tratamiento con DMEM pueden ser mas gruesas que las fibras antes del tratamiento con DMEM.

La Figura 18 es un grafico de barras del modulo de almacenamiento, que muestra el efecto del pH en las propiedades reologicas de RADA16 al 2,5%. Los modulos de almacenamiento se midieron a 1 rad/s.

La Figura 19 es un grafico de barras del modulo de almacenamiento, que muestra el efecto del pH en las propiedades reologicas de IEIK13 al 1,5%. Los modulos de almacenamiento se midieron a 1 rad/s.

La Figura 20A muestra pruebas de viscosidad de flujo ejemplares de IEIK13 al 1% a pH = 2,1, 3,0, 3,3 y 3,5. La Figura 20B es un grafico de barras de mediciones de viscosidad ejemplares con una velocidad de cizalladura de 0,003 l/s.

Las Figuras 21A, 21B, 21C y 21D muestran las mediciones del modulo de almacenamiento en funcion del tiempo despues de aplicar una alta tension de cizalladura a IEIK13 al 1% a pH = 2,1, 3,0, 3,3 y 3,5, respectivamente. Las lfneas horizontales indican los modulos de almacenamiento originales de IEIK13 al 1%.

Las Figuras 22A y 22B son graficos de barras del modulo de almacenamiento en funcion de la concentracion de RADA16 a pH 2,2 y 3,4. La Figura 22A son mediciones antes del tratamiento con DMEM. La Figura 22B son mediciones despues del tratamiento con DMEM.

Las Figuras 23A y 23B son graficos de barras del modulo de almacenamiento en funcion de la concentracion de IEIK a pH 2,3 y 3,4. La Figura 23A son mediciones antes del tratamiento con DMEM. La Figura 23B son mediciones despues del tratamiento con DMEM.

Las Figuras 24 y 25 muestran la medicion del modulo de almacenamiento en funcion del tiempo. La Figura 24 incluye datos de RADA16 al 2,5% a pH 2,2, 2,6, 2,8, 3,1 y 3,4. La Figura 25 incluye datos de IEIK13 al 1,5% a pH 2,3, 2,6, 2,9 y 3,2. Las pruebas de barrido de tiempo se realizaron a 1 rad/s y a 1 Pa con placas de 20 mm y una distancia de separacion de 500 pm. Durante las pruebas de barrido de tiempo, se anadio DMEM a la camara que rodea las placas de medicion para remojar los peptidos en el tiempo = 0.

La Figura 26 ilustra nanoestructuras y/o reensamble de peptidos en condiciones de sal baja o en condiciones de sal alta (es decir, sobre la fuerza ionica crftica). Los metodos de aplicacion de soluciones salinas (tratamiento o mezcla) pueden cambiar las nanoestructuras. Si bien el tratamiento de peptidos con una solucion salina puede formar un gel rfgido, la mezcla de una solucion salina en peptidos puede causar la separacion de fases.

Las Figuras 27-29 muestran ejemplos de pruebas de barrido de frecuencia de 1 rad/s a 10 rad/s a 1 Pa. La Figura 27 son mediciones de KLD12 al 1% con o sin solucion de NaCl (fuerza ionica 0,2 M). La Figura 28 son mediciones de IEIK13 al 1% con o sin solucion de NaCl (fuerza ionica 0,02 M). La Figura 29 son mediciones de RADA16 al 1% con o sin solucion de NaCl (fuerza ionica 0,7 M).

La Figura 30 es un grafico de barras del modulo de almacenamiento a 1 rad/s. RADA16 al 1,0% se expuso a NaCI, cuyas fuerzas ionicas variaron de 0 a 1,0 M.

La Figura 31 es un grafico de barras del modulo de almacenamiento a 1 rad/s. IEIK13 al 1,0% se expuso a NaCI, cuyas fuerzas ionicas variaron de 0 a 0,04 M.

La Figura 32A muestra las pruebas de viscosidad de flujo de IEIK13 al 1% a concentraciones ionicas de NaCl de 0, 0,01 y 0,02 M. La Figura 32B es un grafico de barras de la viscosidad con una velocidad de cizalladura de 0,003 l/s.

Las Figuras 33A, 33B y 33C muestran las mediciones del modulo de almacenamiento en funcion del tiempo despues de aplicar un alto esfuerzo de cizalladura a IEIK13 al 1% a una fuerza ionica de NaCl de 0, 0,01 y 0,02, respectivamente. Las lfneas horizontales indican los modulos de almacenamiento originales de cada composicion de IEIK13 al 1%.

La Figura 34 muestra modulos de almacenamiento ejemplares de RADA16 al 1% a 1 Pa en funcion de la fuerza ionica de NaCl antes o despues del tratamiento con DMEM.

La Figura 35 muestra modulos de almacenamiento ejemplares de IEIK13 al 1% a 1 Pa en funcion de la fuerza ionica de NaCl antes o despues del tratamiento con DMEM.

La Figura 36 muestra modulos de almacenamiento ejemplares de RADA16 al 1% con sales seleccionadas (NaCl, KCl, MgCl2 y CaCL). * indica que G' es significativamente mas alto que el control (sin sal) (P <0,05). # indica que G' es significativamente inferior a RADA16 al 1% con una fuerza ionica de NaCl de 0,15 M (P <0,05).

La Figura 37 muestra modulos de almacenamiento ejemplares de RADA16 al 1% con sales seleccionadas (NaCl, KCl, MgCl2 y CaCh) despues del tratamiento con DMEM. * indica que G' es significativamente mas alto que el control (sin sal, despues del tratamiento con DMEM) (P <0,05).

La Figura 38 muestra mediciones del modulo de almacenamiento ejemplares en funcion del tiempo para IEIK13 al 1,5%, KLD12 al 1,5% y RADA16 al 2,5% despues del tratamiento con una solucion salina. Las pruebas de barrido de tiempo se realizaron a 1 rad/s y a 1 Pa con placas de 20 mm y una distancia de separacion de 500 pm. Durante las pruebas de barrido de tiempo, se anadio el tampon de solucion salina a la camara que rodea las placas de medicion para remojar los peptidos en el tiempo = 0.

La Figura 39 ilustra nanoestructuras y/o el reensamblaje de RADA16, KLD12 e IEIK13, a determinadas fuerzas ionicas. El alto esfuerzo de cizalladura puede cambiar las nanoestructuras y/o el reensamblaje. La Figura 40 muestra modulos de almacenamiento de RADA16 al 2,5% a 1 rad/s. La adicion de NaCl y la elevacion del pH aumentaron los modulos de almacenamiento de RADA16 al 2,5%.

Las Figuras 41 A, 41B, 41C y 41D ilustran las etapas utilizadas en la preparacion de composiciones peptfdicas con diferentes sales y/o concentraciones de sal como se describe en los Ejemplos 4 y 7. Los expertos en la tecnica apreciaran que se puede utilizar una estrategia similar, por ejemplo, para analizar composiciones peptfdicas con diferentes pH, concentraciones peptfdicas, etc. En la Figura 41A, el polvo peptfdico se coloco con un vial de vidrio. En la Figura 41B, el polvo peptfdico se disolvio primero en agua desionizada a una fraccion seleccionada del volumen final; se agito vorticialmente y/o se utilizo sonicacion a voluntad para lograr o asegurar la solubilizacion completa. En la Figura 41C, se anadio una solucion de sal concentrada en la parte superior, en una cantidad y concentracion dependiente del volumen de agua desionizada utilizada. En la Figura 41D, la solucion se mezclo, por ejemplo, mediante agitacion vorticial. Las Figuras 42A, 42B, 42C, 42D, 42E, 42F y 42G son imagenes verticales e invertidas de RADA16 al 0,5% y una mezcla de CaCL 0,005, 0,05, 0,125, 0,250, 0,500 y 1 M, respectivamente. La Figura 42E muestra un gel optimo y totalmente funcional. La Figura 42F muestra un gel semifuncional. La Figura 42G muestra un gel no funcional.

La Figura 43 muestra las mediciones del modulo de almacenamiento de RADA16 al 0,5% mezclado con NaCl, KCl y CaCl2 a concentraciones de 0,125, 0,250 y 0,500 M.

La Figura 44 muestra las mediciones del modulo de almacenamiento de RADA16 al 2,5% y RADA16 al 2,5% con CaCl20,125 M.

Las Figuras 45A y 45B muestran las mediciones del modulo de almacenamiento de RADA16 con 0,125, 0,250 y 0,500 M despues de una perturbacion mecanica. El * indica que la muestra de control y la muestra perturbada son significativamente diferentes.

La Figura 46 son mediciones del modulo de almacenamiento de RADA16 al 2,5% tratado con CaCL y CaSO4 en funcion del tiempo.

La Figura 47A son datos reologicos ejemplares de IEIK13 e IEIK13 con carmfn de indigo. La Figura 47B muestra la rigidez de IEIK13 y IEIK13 con carmfn de indigo. La Figura 47C muestra la rigidez de RADA16 y RADA16 con la Solucion de Ringer. La Figura 47D es una imagen de RADA16 con la solucion de Ringer invertida. La Figura 46E son imagenes de IEIK13 e IEIK13 con carmfn de indigo invertido. La Figura 47F es una imagen de IEIK13 con carmfn de indigo y colocada dentro de una jeringa.

La Figura 48 es un grafico de RADA16 al 2,5% y RADA16 al 2,5% con NaCl, que muestra un aumento en la presion de rotura de un pulmon.

DEFINICIONES

El termino "agente" como se usa en el presente documento puede referirse a un compuesto o entidad de cualquier clase qufmica incluyendo, por ejemplo, polipeptidos, acidos nucleicos, sacaridos, lfpidos, moleculas pequenas, metales o combinaciones de los mismos. En algunas formas de realizacion, un agente es o comprende un producto natural ya que se encuentra en y/o se obtiene de la naturaleza. En algunas formas de realizacion, un agente es o comprende una o mas entidades que estan hechas por el hombre en el sentido de que estan disenadas, creadas y/o producidas a traves de la accion de la mano del hombre y/o no se encuentran en la naturaleza. En algunas formas de realizacion, un agente puede utilizarse de forma aislada o pura; en algunas formas de realizacion, un agente puede utilizarse de forma en bruto. En algunas formas de realizacion, los agentes potenciales se proporcionan como colecciones o bibliotecas, por ejemplo, que pueden analizarse para identificar o caracterizar los agentes activos dentro de ellas. Algunas formas de realizacion particulares de agentes que pueden utilizarse de acuerdo con la presente invencion incluyen moleculas pequenas, anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, aptameros, acidos nucleicos (por ejemplo, ARNsi, ARNsh, hfbridos de ADN/ARN, oligonucleotidos antisentido, ribozimas), peptidos, mimeticos de peptidos, etc. En algunas formas de realizacion, un agente es o comprende un polfmero. En algunas formas de realizacion, un agente no es un polfmero y/o esta sustancialmente libre de cualquier polfmero. En algunas formas de realizacion, un agente contiene al menos un resto polimerico. En algunas formas de realizacion, un agente carece o esta sustancialmente libre de cualquier resto polimerico.

Como se usa en el presente documento, el termino "aminoacido", en su sentido mas amplio, se refiere a cualquier compuesto y/o sustancia que puede incorporarse a una cadena polipeptfdica, por ejemplo, a traves de la formacion de uno o mas enlaces peptfdicos. En algunas formas de realizacion, un aminoacido tiene la estructura general H²N-C(H)(R)-COOH. En algunas formas de realizacion, un aminoacido es un aminoacido de origen natural. En algunas formas de realizacion, un aminoacido es un aminoacido sintetico; en algunas formas de realizacion, un aminoacido es un D-aminoacido; en algunas formas de realizacion, un aminoacido es un L-aminoacido. "Aminoacido estandar" se refiere a cualquiera de los veinte L-aminoacidos estandar que se encuentran comunmente en los peptidos de origen natural. "Aminoacido no estandar" se refiere a cualquier aminoacido, diferente de los aminoacidos estandar, independientemente si se prepara de manera sintetica o se obtiene de una fuente natural. En algunas formas de realizacion, un aminoacido, que incluye un aminoacido carboxi y/o amino terminal en un polipeptido, puede contener una modificacion estructural en comparacion con la estructura general anterior. Por ejemplo, en algunas formas de realizacion, un aminoacido puede modificarse por metilacion, amidacion, acetilacion y/o sustitucion en comparacion con la estructura general. En algunas formas de realizacion, dicha modificacion puede, por ejemplo, alterar la semivida en circulacion de un polipeptido que contiene el aminoacido modificado en comparacion con uno que contiene un aminoacido no modificado por lo demas identico. En algunas formas de realizacion, dicha modificacion no altera significativamente una actividad relevante de un polipeptido que contiene el aminoacido modificado, en comparacion con uno que contiene un aminoacido no modificado por lo demas identico. Como resultara evidente a partir del contexto, en algunas formas de realizacion, el termino "aminoacido" se usa para referirse a un aminoacido libre; en algunas formas de realizacion, se usa para referirse a un residuo de aminoacido de un polipeptido.

Como se usa en el presente documento, el termino "en torno a" o "aproximadamente", aplicado a uno o mas valores de interes, se refiere a un valor que es similar a un valor de referencia establecido. En ciertas formas de realizacion, el termino "en torno a" o "aproximadamente" se refiere a un intervalo de valores que se encuentran dentro del 25%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, o menos en cualquier direccion (mayor de o menor de) del valor de referencia establecido a menos que se indique de otro modo o sea evidente de otra manera a partir del contexto (excepto cuando dicho numero exceda el 100% de un posible valor).

Dos eventos o entidades estan "asociados" entre sf, como se usa ese termino en el presente documento, si la presencia, nivel y/o forma de uno esta correlacionado con la del otro. Por ejemplo, una entidad particular (por ejemplo, polipeptido, firma genetica, metabolito, etc.) se considera asociada con una enfermedad, trastorno o condicion particular, si su presencia, nivel y/o forma se correlaciona con la incidencia y/o la susceptibilidad a la enfermedad, trastorno o afeccion (por ejemplo, a traves de una poblacion relevante). En algunas formas de realizacion, dos o mas entidades estan ffsicamente "asociadas" entre sf si interactuan, directa o indirectamente, de modo que esten y/o permanezcan en proximidad ffsica entre sf. En algunas formas de realizacion, dos o mas entidades que estan asociadas ffsicamente entre sf estan unidas covalentemente entre sf; en algunas formas de realizacion, dos o mas entidades que estan asociadas ffsicamente entre sf no estan unidas covalentemente entre sf, sino que estan asociadas no covalentemente, por ejemplo, por medio de enlaces de hidrogeno, interaccion de van der Waals, interacciones hidrofobas, magnetismo y combinaciones de los mismos.

El termino "comparable" se usa en el presente documento para describir dos (o mas) conjuntos de condiciones, circunstancias, individuos o poblaciones que son suficientemente similares entre sf para permitir la comparacion de los resultados obtenidos o los fenomenos observados. En algunas formas de realizacion, conjuntos comparables de condiciones, circunstancias, individuos o poblaciones se caracterizan por una pluralidad de caractensticas sustancialmente identicas y una o una pequena cantidad de caractensticas variadas. Los expertos en la tecnica apreciaran que los conjuntos de circunstancias, individuos o poblaciones son comparables entre sf cuando se caracterizan por un numero y tipo suficientes de caractensticas sustancialmente identicas para justificar una conclusion razonable de que las diferencias en los resultados obtenidos o los fenomenos observados en o con diferentes conjuntos de circunstancias, los individuos o las poblaciones, son a causa de o son indicativos de la variacion en aquellas caractensticas que se vanan. Los expertos en la tecnica apreciaran que el lenguaje relativo utilizado en el presente documento (por ejemplo, mejorado, activado, reducido, inhibido, etc.) generalmente se referira a comparaciones hechas en condiciones comparables.

Ciertas metodologfas descritas en el presente documento incluyen una etapa de "determinacion". Los expertos en la tecnica que lean la presente memoria descriptiva, apreciaran que dicha "determinacion" puede utilizarse o lograrse a traves del uso de cualquiera de una diversidad de tecnicas disponibles para los expertos en la tecnica, incluyendo, por ejemplo, tecnicas espedficas a las que se hace referencia explfcitamente en el presente documento. En algunas formas de realizacion, la determinacion implica la manipulacion de una muestra ffsica. En algunas formas de realizacion, la determinacion implica la consideracion y/o la manipulacion de datos o informacion, por ejemplo, utilizando un ordenador u otra unidad de procesamiento adaptada para realizar un analisis relevante. En algunas formas de realizacion, la determinacion implica recibir informacion relevante y/o materiales de una fuente. En algunas formas de realizacion, la determinacion implica comparar una o mas caractensticas de una muestra o entidad con una referencia comparable.

El termino "gel", como se usa en el presente documento, se refiere a materiales viscoelasticos cuyas propiedades reologicas los distinguen de soluciones, solidos, etc. En algunas formas de realizacion, se considera que es un gel si su modulo de almacenamiento (G') es mayor que su modulo (G''). En algunas formas de realizacion, se considera que una composicion es un gel si hay redes qmmicas o ffsicas reticuladas en la solucion, que se distingue de las moleculas enredadas en la solucion viscosa.

El termino "in vitro" como se usa en el presente documento se refiere a eventos que tienen lugar en un ambiente artificial, por ejemplo, en un tubo de ensayo o recipiente de reaccion, en un cultivo celular, etc., en lugar de dentro de un organismo multicelular.

El termino "in vivo", como se usa en el presente documento, se refiere a eventos que tienen lugar dentro de un organismo multicelular, tal como un ser humano y un animal no humano. En el contexto de los sistemas basados en celulas, el termino se puede usar para referirse a eventos que tienen lugar dentro de una celula viva (en contraposicion a, por ejemplo, los sistemas in vitro).

El termino "peptido", como se usa en el presente documento, se refiere a un polipeptido que es tipicamente relativamente corto, por ejemplo, que tiene una longitud de menos de aproximadamente 100 aminoacidos, menos de aproximadamente 50 aminoacidos, menos de 20 aminoacidos, o menos de 10 aminoacidos.

El termino "polipeptido", como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier cadena polimerica de aminoacidos. En algunas formas de realizacion, un polipeptido tiene una secuencia de aminoacidos que se produce en la naturaleza. En algunas formas de realizacion, un polipeptido tiene una secuencia de aminoacidos que no se produce en la naturaleza. En algunas formas de realizacion, un polipeptido tiene una secuencia de aminoacidos que esta modificada para ser disenada y/o producida a traves de la accion de la mano del hombre. En algunas formas de realizacion, un polipeptido puede comprender o consistir en aminoacidos naturales, aminoacidos no naturales, o ambos. En algunas formas de realizacion, un polipeptido puede comprender o consistir solo en aminoacidos naturales o solo aminoacidos no naturales. En algunas formas de realizacion, un polipeptido puede comprender D-aminoacidos, L-aminoacidos, o ambos. En algunas formas de realizacion, un polipeptido puede comprender solo D-aminoacidos. En algunas formas de realizacion, un polipeptido puede comprender solo L-aminoacidos. En algunas formas de realizacion, un polipeptido puede incluir uno o mas grupos colgantes u otras modificaciones, por ejemplo, modificando o uniendose a una o mas cadenas laterales de aminoacidos, en el extremo N del polipeptido, en el extremo C del polipeptido, o cualquier combinacion de los mismos. En algunas formas de realizacion, dichos grupos colgantes o modificaciones pueden seleccionarse del grupo que consiste en acetilacion, amidacion, lipidacion, metilacion, pegilacion, etc., incluyendo combinaciones de los mismos. En algunas formas de realizacion, un polipeptido puede ser dclico, y/o puede comprender una porcion dclica. En algunas formas de realizacion, un polipeptido no es cfclico y/o no comprende ninguna porcion cfclica. En algunas formas de realizacion, un polipeptido es lineal. En algunas formas de realizacion, un polipeptido puede ser o comprender un polipeptido grapado. En algunas formas de realizacion, el termino "polipeptido" puede adjuntarse a un nombre de un polipeptido de referencia, actividad o estructura; en tales casos, se usa en el presente documento para referirse a polipeptidos que comparten la actividad o estructura relevante y, por lo tanto, pueden considerarse miembros de la misma clase o familia de polipeptidos. Para cada clase de este tipo, la presente memoria descriptiva proporciona y/o los expertos en la tecnica conoceran polipeptidos ejemplares dentro de la clase cuyas secuencias de aminoacidos y/o funciones se conocen; en algunas formas de realizacion, tales polipeptidos ejemplares son polipeptidos de referencia para la clase o familia de polipeptidos. En algunas formas de realizacion, un miembro de una clase o familia de polipeptidos muestra una homologfa o identidad de secuencia significativa con, comparte un motivo de secuencia comun (por ejemplo, un elemento de secuencia caracterfstica) con, y/o comparte una actividad comun (en algunas formas de realizacion a un nivel comparable o dentro de un intervalo designado) con un polipeptido de referencia de la clase; en algunas formas de realizacion con todos los polipeptidos dentro de la clase). Por ejemplo, en algunas formas de realizacion, un polipeptido miembro muestra un grado general de homologfa o identidad de secuencia con un polipeptido de referencia que es de al menos aproximadamente el 30-40%, y con frecuencia es mayor de aproximadamente el 50%, 60%, 70%, 80% , 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o mas, y/o incluye al menos una region (por ejemplo, una region conservada que puede ser, en algunas formas de realizacion, o comprender un elemento de secuencia caracterfstico) que muestre una identidad de secuencia muy alta, a menudo mayor del 90% o incluso del 95%, 96%, 97%, 98% o 99%. Tal region conservada generalmente incluye al menos 3-4 y con frecuencia hasta 20 o mas aminoacidos; en algunas formas de realizacion, una region conservada incluye al menos un tramo de al menos 2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 o mas aminoacidos contiguos. En algunas formas de realizacion, un polipeptido util puede comprender o consistir en un fragmento de un polipeptido parental. En algunas formas de realizacion, un polipeptido util puede comprender o consistir en una pluralidad de fragmentos, cada uno de los cuales se encuentra en el mismo polipeptido parental en una disposicion espacial diferente entre si que se encuentra en el polipeptido de interes (por ejemplo, fragmentos que estan unidos directamente en el precursor pueden estar separados espacialmente en el polipeptido de interes o viceversa, y/o los fragmentos pueden estar presentes en un orden diferente en el polipeptido de interes que en el precursor, por lo que el polipeptido de interes es un derivado de su polipeptido parental.

El termino "referencia", como se usa en el presente documento, describe un estandar o control en relacion con el cual se realiza una comparacion. Por ejemplo, en algunas formas de realizacion, un agente, animal, individuo, poblacion, muestra, secuencia o valor de interes se compara con un agente de referencia o control, animal, individuo, poblacion, muestra, secuencia o valor. En algunas formas de realizacion, una referencia o control se prueba y/o se determina sustancialmente de manera simultanea con las pruebas o determinacion de interes. En algunas formas de realizacion, una referencia o control es una referencia o control historicos, opcionalmente incorporados en un medio tangible. Tfpicamente, como se entendera por los expertos en la tecnica, una referencia o control se determina o se caracteriza en condiciones o circunstancias comparables a las de la evaluacion. Los expertos en la materia apreciaran cuando hay suficientes similitudes para justificar la dependencia y/o comparacion con una posible referencia o control particular.

El termino "autoensamblaje" se usa en el presente documento en referencia a ciertos polipeptidos que, en condiciones apropiadas, pueden autoasociarse espontaneamente en estructuras de modo que, por ejemplo, las soluciones (por ejemplo, soluciones acuosas) que los contienen, desarrollen el caracter del gel. En algunas formas de realizacion, las interacciones entre los polipeptidos de autoensamblaje individuales dentro de una composicion son reversibles, de modo que la composicion puede hacer una transicion reversible entre un estado de gel y un estado en solucion. En algunas formas de realizacion, el autoensamblaje (y/o desmontaje) responde a uno o mas desencadenantes ambientales (por ejemplo, cambio en uno o mas de pH, temperatura, fuerza ionica, osmolaridad, osmolalidad, presion aplicada, esfuerzo de cizalladura aplicado, etc.). En algunas formas de realizacion, las composiciones de polipeptidos de autoensamblaje se caracterizan por una estructura de lamina beta detectable cuando los polipeptidos estan en un estado ensamblado.

DESCRIPCION DETALLADA DE CIERTOS ASPECTOS Y FORMAS DE REALIZACION

La presente divulgacion proporciona preparaciones de ciertos peptidos que pueden ofrecer una utilidad mejorada y un rendimiento mejorado en comparacion con otras preparaciones de los mismos peptidos. En algunos aspectos, las preparaciones divulgadas pueden ofrecer propiedades diferentes o unicas que, por ejemplo, pueden abordar los requisitos no cumplidos previamente asociados con diversas investigaciones y/o aplicaciones clfnicas. En algunos aspectos, ciertas caracterfsticas deseables de las preparaciones peptfdicas proporcionadas se proporcionan elevando el nivel de pH de la preparacion en comparacion con una preparacion estandar o de referencia del peptido y/o anadiendo una o mas sales a la preparacion, en comparacion con el tipo y/o cantidad de sal en una preparacion estandar o de referencia. En algunos aspectos, las preparaciones proporcionadas se caracterizan por una formacion de hidrogel mas estable y/u otros atributos relativos a una preparacion estandar o de referencia, como se describe en el presente documento.

Peptidos

El polipeptido para su uso de acuerdo con la presente divulgacion tiene una secuencia de aminoacidos: Ile-Glu-Ile-Lys-Ile-Glu-Ile-Lys-Ile-Glu-Ile-Lys-Ile (es decir, IEIK13, tambien conocido como (IEIK)3I; SEQ ID NO:3).

Composiciones

En algunos aspectos, las composiciones peptfdicas de acuerdo con la presente divulgacion pueden caracterizarse por propiedades reologicas y/u opticas particulares. En algunos aspectos, dichas propiedades reologicas pueden incluir una o mas cineticas de gelificacion, caracterfsticas de ensamblaje reversible, modulo de almacenamiento, viscosidad, etc. En algunos aspectos, se pueden probar y/o determinar (por ejemplo, medir) una o mas propiedades reologicas; en algunos aspectos, una o mas propiedades reologicas pueden ser evaluadas por observacion visual. En algunos aspectos, las propiedades opticas relevantes pueden incluir uno o mas grados de transparencia, claridad optica, etc. En algunos aspectos, se pueden probar y/o determinar (por ejemplo, medir) una o mas propiedades opticas; en algunos aspectos, pueden evaluarse una o mas propiedades opticas mediante observacion visual. En algunos aspectos, la claridad optica de composiciones particulares se puede describir como clara, ligeramente turbia o turbia. En algunos aspectos, las composiciones proporcionadas son claras.

En algunos aspectos, las composiciones proporcionadas se caracterizan por un nivel particular de rigidez. En algunos aspectos, la rigidez se evalua mediante la determinacion del modulo de almacenamiento. Como entenderan los expertos en la tecnica, en general, el modulo de almacenamiento y la rigidez tienen una correlacion positiva; es decir, un mayor modulo de almacenamiento esta relacionado con una mayor rigidez.

En algunos aspectos, las composiciones proporcionadas se caracterizan por propiedades de gelificacion particulares (por ejemplo, un grado particular de gelificacion dentro de un periodo de tiempo particular). En algunos aspectos, las composiciones proporcionadas se caracterizan por una gelificacion sustancialmente completa dentro de un periodo de tiempo con un intervalo de aproximadamente 10 segundos a aproximadamente 48 horas.

En algunos aspectos, las composiciones proporcionadas se caracterizan por un grado particular de restauracion de la gelificacion y/u otras propiedades materiales y/o reologicas. Por ejemplo, en algunos aspectos, cuando las composiciones proporcionadas que se han gelificado se someten a alteracion, muestran una capacidad para volver a gelificar dentro de un periodo de tiempo particular (por ejemplo, dentro de un intervalo de aproximadamente 10 segundos a aproximadamente 48 horas), y en un gel cuyas propiedades mecanicas y/o reologicas son razonablemente comparables a las del gel original.

En algunos aspectos, las composiciones proporcionadas se caracterizan por una capacidad para soportar el crecimiento y/o la viabilidad celular.

En algunos aspectos, una o mas propiedades materiales (por ejemplo, reologicas) de una composicion peptfdica descrita y/o utilizada en el presente documento pueden determinarse, por ejemplo, mediante la identidad del peptido (por ejemplo, secuencia de aminoacidos, grado de hidrofobicidad, etc.), concentracion peptfdica, pH, fuerza ionica (por ejemplo, concentracion de sal), identidad ionica, etc., y combinaciones de los mismos.

Concentracion peptfdica

De acuerdo con uno o mas aspectos, las propiedades reologicas de la composicion peptfdica como se describe en el presente documento pueden controlarse mediante la seleccion de la concentracion peptfdica. La presente divulgacion define parametros que permiten la seleccion y/o la produccion de composiciones peptfdicas con caracterfsticas particulares deseadas, por ejemplo, como se puede preferir especfficamente para una aplicacion o uso particular de las composiciones, mediante la seleccion y/o el ajuste de la concentracion peptfdica.

Por ejemplo, la presente divulgacion demuestra, entre otras cosas, que, para muchos peptidos, la rigidez de la composicion aumenta sustancialmente de forma lineal con la concentracion peptfdica. Ademas, como se describe en el presente documento, ciertas composiciones peptfdicas demostraron una propiedad de pseudoplasticidad sobre un nivel de esfuerzo crftico. Ademas, la presente divulgacion demuestra que las propiedades reologicas conseguidas a una concentracion peptfdica particular pueden variar dependiendo de la identidad del peptido. Por ejemplo, se encontro que el modulo de almacenamiento de KLD12 al 1,5% era similar al de RADA16 al 2,5%. Se encontro que el modulo de almacenamiento de IEIK13 al 1% era similar al de KLD12 al 2,5% y superior al de RADA16 al 2,5%. En general, el orden de resistencia reologica entre las composiciones ensayadas en los presentes Ejemplos fue IEIK13> KLD12> RADA16, por lo que una composicion de IEIK13 mostro una mayor resistencia reologica que una composicion de KLD12, que, a su vez, mostro una mayor resistencia reologica que una composicion de RADA16 cuando la concentracion peptfdica fue la misma en cada caso.

En algunos aspectos, la concentracion peptfdica en una composicion peptfdica para su uso de acuerdo con el presente es de al menos el 0,05%, al menos el 0,25%, al menos el 0,5%, al menos el 0,75%, al menos el 1,0% o mas. En algunos aspectos, la concentracion peptfdica en una composicion peptfdica para su uso de acuerdo con la presente es inferior al 5%, inferior al 4,5%, inferior al 4%, inferior al 3,5%, inferior al 3%, o menos. En algunos aspectos, la concentracion peptfdica en una composicion peptfdica para su uso de acuerdo con la presente invencion esta dentro de un intervalo entre aproximadamente el 0,5% y aproximadamente el 3%. En algunos aspectos, la concentracion peptfdica en una composicion peptfdica para su uso de acuerdo con la presente invencion esta dentro de un intervalo entre aproximadamente el 0,5% y aproximadamente el 2,5%. En algunos aspectos, la concentracion peptfdica en una composicion peptfdica para su uso de acuerdo con la presente invencion esta dentro de un intervalo entre aproximadamente el 1% y aproximadamente el 3%. En algunos aspectos, la concentracion peptfdica en una composicion peptfdica para su uso de acuerdo con la presente invencion esta dentro de un intervalo entre aproximadamente el 1% y aproximadamente el 2,5%. En algunos aspectos, la concentracion peptfdica en una composicion peptfdica para su uso de acuerdo con la presente invencion es de aproximadamente el 0,5%, aproximadamente el 1%, aproximadamente el 1,5%, aproximadamente el 2%, aproximadamente el 2,5%, aproximadamente el 3%, o mas. En algunos aspectos particulares, cuando el peptido es RADA16, la concentracion peptfdica en composiciones peptfdicas de la presente invencion esta dentro de un intervalo de aproximadamente el 0,05% a aproximadamente el 10%.

En algunos aspectos particulares, cuando el peptido es KLD12, la concentracion peptfdica en las composiciones peptfdicas de la presente invencion esta dentro de un intervalo de aproximadamente el 0,05% a aproximadamente el 10%.

En algunos aspectos particulares, cuando el peptido es IEIK13, la concentracion peptfdica en composiciones peptfdicas de la presente invencion esta dentro de un intervalo de aproximadamente el 0,05% a aproximadamente el 10%. pH

La presente divulgacion demuestra, entre otras cosas, que el pH puede afectar a las propiedades de las composiciones peptfdicas. Como se describe en el presente documento, la optimizacion del pH de las composiciones peptfdicas puede mejorar las resistencias mecanicas, de modo que las composiciones peptfdicas se puedan usar para diversas aplicaciones clfnicas. El ejemplo 3 en esta divulgacion ilustra detalles de ciertas formas de realizacion especfficas.

De acuerdo con una o mas formas de realizacion, las composiciones peptfdicas proporcionadas pueden tener un pH por encima (por ejemplo, significativamente por encima) del pI del peptido relevante y/o del obtenido cuando el peptido se solubiliza en agua. En algunas formas de realizacion, las propiedades de las composiciones peptfdicas pueden controlarse con pH. Por ejemplo, en algunas formas de realizacion, a un pH dentro del intervalo de aproximadamente 2,5 a aproximadamente 4,0, la rigidez y/o viscosidad de las composiciones peptfdicas puede aumentarse con respecto a la de una composicion de referencia apropiada (por ejemplo, del mismo peptido a la misma concentracion en agua).

En algunas formas de realizacion, las composiciones peptfdicas pueden comprender peptido y un disolvente, tfpicamente un disolvente acuoso, y el pH puede ajustarse a traves de un agente de ajuste del pH, tal como una base o un acido. En algunas formas de realizacion, las composiciones peptfdicas comprenden un peptido y un tampon.

En algunas formas de realizacion, una composicion peptfdica de pH ajustado puede comprender uno o mas de hidroxido de sodio, hidroxido de potasio, hidroxido de calcio, carbonato de sodio, acetato de sodio, sulfuro de sodio, DMEM y/o PBS.

En algunas formas de realizacion, se puede implementar un dispositivo de titulacion automatizado para el ajuste del pH.

En algunas formas de realizacion, las composiciones proporcionadas tienen y/o se mantienen a un pH por encima (por ejemplo, materialmente por encima) del pi para el peptido relevante. En algunas formas de realizacion, las composiciones proporcionadas se han mantenido y/o se mantienen a un pH superior (por ejemplo, materialmente superior) al de una solucion acuosa del mismo peptido a la misma concentracion. En algunas formas de realizacion, las composiciones proporcionadas se han mantenido y/o se mantienen a un pH por debajo de aquel en el que la composicion esta o se vuelve turbia.

En algunas formas de realizacion, las composiciones proporcionadas se caracterizan por un pH a o por encima de aproximadamente 2,5-4,0; en algunas formas de realizacion, las composiciones proporcionadas se caracterizan por un pH mas cercano al pH fisiologico. En algunas formas de realizacion, las composiciones proporcionadas tienen un pH dentro del intervalo de aproximadamente 3,0-4,0. En algunas formas de realizacion, las composiciones proporcionadas tienen un pH igual o superior a aproximadamente 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3,0, aproximadamente 3,1, aproximadamente 3,2, aproximadamente 3,3, aproximadamente 3,4, aproximadamente 3,5 o superior. En algunas formas de realizacion, las composiciones proporcionadas tienen un pH igual o inferior a aproximadamente 4,3, aproximadamente 4,2, aproximadamente 4,1, aproximadamente 4,0, aproximadamente 39, aproximadamente 3,7, aproximadamente 3,6, aproximadamente 3,5, aproximadamente 3,4, o menos.

En algunas formas de realizacion, las composiciones de pH elevado (es decir, composiciones con un pH igual o superior a aproximadamente 2,5) como se describe en el presente documento, se caracterizan por una mayor rigidez reologica y/o propiedades de gelificacion mejoradas en comparacion con una composicion de referencia apropiada (por ejemplo, una composicion comparable del mismo peptido a la misma concentracion y opcionalmente con las mismas sales pero a un pH diferente). En algunas formas de realizacion, las composiciones de pH elevado son utiles en una gama mas amplia de aplicaciones que las composiciones de referencia correspondientes de pH inferior. La presente divulgacion demuestra especfficamente que, en algunas formas de realizacion, a pH elevado de 3,5 o menos, la rigidez de las composiciones de IEIK13 puede aumentarse significativamente, mientras que las de las composiciones de RADA16 y KLD12 puede que no. Sin desear quedar ligado a ninguna teorfa particular, la presente divulgacion propone que diferentes comportamientos de las composiciones peptfdicas a pH 3,5 o menos estan probablemente relacionados con la pKa del acido aspartico (D) (pKa = 3,71) en RADA16 y KLD12 y acido glutamico (E) (pKa = 4,15) en IEIK13.

Cuando el pH es mayor que la pKa del acido aspartico (D) y del acido glutamico (E), los grupos acidos en las cadenas peptfdicas estan mayormente cargados negativamente. Los grupos cargados negativamente inducen interacciones de carga-carga atractivas intra o inter-moleculares con grupos cargados positivamente en las cadenas peptfdicas (es decir, arginina (R) en RADA16 y lisina (K) en IEIK13 y KLD12) para formar agregados mas grandes, que son translucidos u opacos (es decir, estan por encima de su punto de turbidez) y proporcionan una posible separacion de fases, en lugar de formar nanofibras (es decir, composiciones viscosas claras).

Cuando el pH es inferior a la pKa del acido aspartico (D) y del acido glutamico (E), pero cercano a la pKa, los grupos cargados negativamente mas poblados pueden inducir interacciones entre carga mas atractivas con grupos positivos. Las composiciones pueden mantener la formacion de las nanofibras, de manera que aumenta la rigidez. Ciertas composiciones peptfdicas ejemplares particulares que tienen un pH de aproximadamente 3,5 se presentan en la Tabla 2. Dichas composiciones, que se consideran "composiciones de pH elevado" en el presente documento, pueden proporcionar un rendimiento mejorado (por ejemplo, en relacion con composiciones comparables de pH mas bajo, tales como composiciones de referencia relevantes como se describe en el presente documento, incluyendo en los ejemplos) en diversas aplicaciones. La resistencia mecanica y la versatilidad de las composiciones peptfdicas pueden mejorarse con un pH elevado.

Tabla 2 Formulaciones representativas para composiciones peptfdicas seleccionadas a aproximadamente pH 3,5

De acuerdo con una o mas formas de realizacion, el pH puede afectar a la cinetica de gelificacion (por ejemplo, el tiempo de respuesta para comenzar la gelificacion). Los efectos del pH en la cinetica de gelificacion pueden evaluarse para identificar el pH optimizado para composiciones peptfdicas como se describe en el presente documento.

En alguna forma de realizacion, las composiciones peptfdicas pueden gelificarse mas rapidamente a un pH mas alto. Por ejemplo, como se describe en el presente documento, las composiciones de IEIK13 sin ajuste de pH muestran un aumento inmediato del modulo de almacenamiento, mientras que las composiciones de RADA16 sin ajuste de pH (pH 2,2) no muestran aumento de modulo de almacenamiento durante los primeros 13 segundos. Con el ajuste del pH, tanto IEIK13 como RADA16 muestran un aumento inmediato del modulo de almacenamiento debido a la rapida gelificacion, como se muestra en las Figuras 24 y 25.

Fuerza ionica

La presente divulgacion demuestra que la fuerza ionica puede cambiar las propiedades reologicas de las composiciones peptfdicas. El aumento de la fuerza ionica de las composiciones peptfdicas puede mejorar generalmente las propiedades mecanicas para diversas aplicaciones clfnicas. Los efectos de la fuerza ionica sobre las propiedades de las composiciones peptfdicas pueden evaluarse, por ejemplo, como se describe en el presente documento, para identificar las fuerzas ionicas optimizadas para composiciones peptfdicas como se describe en el presente documento.

En algunas formas de realizacion, a una fuerza ionica dentro del intervalo de aproximadamente 0,0001 M a aproximadamente 1,5 M, se puede aumentar la rigidez, la viscosidad y/o la cinetica de gelificacion de las composiciones de peptidos. En algunas formas de realizacion, las composiciones peptfdicas pueden controlarse con fuerza ionica.

De acuerdo con una o mas formas de realizacion, las fuerzas ionicas de las composiciones peptfdicas se pueden ajustar con una o mas sales comunes incluyendo, pero sin limitacion, NaCl, KCl, MgCb, CaCb y CaSCM. Las sales comunes estan compuestas por cationes y aniones. En algunas formas de realizacion, los cationes pueden seleccionarse del grupo que comprende amonio, calcio, hierro, magnesio, potasio, piridinio, amonio cuaternario y sodio. En algunas formas de realizacion, los aniones pueden seleccionarse del grupo que comprende acetato, carbonato, cloruro, citrato, cianuro, fluoruro, nitrato y fosfato.

De acuerdo con una o mas formas de realizacion, cuando la fuerza ionica se aproxima a un nivel optimo (por ejemplo, rigidez mas alta), la adicion de una o mas sales o soluciones de sal puede regularse cuidadosamente. En algunas formas de realizacion, se puede anadir agua pura si la fuerza ionica es mayor que la deseada. La adicion de una o mas sales o soluciones de sal puede regularse para ajustar su osmolalidad para que sea hipotonica, isotonica o hipertonica dependiendo de sus aplicaciones.

En algunas formas de realizacion, para ajustar las fuerzas ionicas de ciertas composiciones peptfdicas a modo de ejemplo, se pueden anadir ciertas soluciones de tampon salino, por ejemplo, NaCl, KCl, MgCb, CaCb y DPBS (solucion salina tamponada con fosfato de Dulbecco, 10X).

En algunas formas de realizacion, las composiciones proporcionadas incluyen una o mas sales, cuya identidad y/o concentracion mantienen la composicion a una fuerza ionica crftica por debajo de aquella en la que se observa la precipitacion del material del peptido. En algunas formas de realizacion, se considera que la precipitacion del material ha tenido lugar cuando una composicion lfquida esta turbia (por ejemplo, de acuerdo con lo evaluado por inspeccion visual). Por lo tanto, en algunas formas de realizacion, las composiciones proporcionadas no son turbias y tienen una fuerza ionica inferior a las composiciones de otro modo comparables (por ejemplo, del mismo peptido a la misma concentracion) que estan turbias.

En algunas formas de realizacion, las composiciones proporcionadas se caracterizan por una fuerza ionica elevada con respecto a la de una composicion de referencia apropiada (por ejemplo, una composicion del mismo peptido a la misma concentracion y pH pero con sal diferente o concentracion diferente de la misma sal). En algunas formas de realizacion, las composiciones proporcionadas se caracterizan por una fuerza ionica cercana o a la fuerza fisiologica.

En algunas formas de realizacion, las composiciones como se describen en el presente documento se caracterizan por una mayor rigidez reologica y/o propiedades de gelificacion mejoradas en comparacion con una composicion de referencia apropiada de diferente fuerza ionica. En algunas formas de realizacion, las composiciones proporcionadas son adecuadas para su uso en una gama mas amplia de aplicaciones que son composiciones de referencia correspondientes de diferente fuerza ionica (por ejemplo, menor).

De acuerdo con ciertas formas de realizacion particulares, se proporcionan composiciones peptfdicas que comprenden IEIK13, KLD12 o RADA16 en una solucion de sal, composiciones que tienen una fuerza ionica diferente de la de una composicion de referencia del peptido relevante disuelto en agua y muestran una o mas propiedades mejoradas del material (por ejemplo, reologicas) relativas a esa composicion de referencia. En algunas formas de realizacion, las composiciones proporcionadas son mas rfgidas que las composiciones de referencia relevantes. En algunas formas de realizacion, las composiciones proporcionadas tienen fuerzas ionicas elevadas en relacion con las composiciones de referencia, pero todavfa tienen una fuerza ionica por debajo de sus puntos de sal crfticos.

Tabla 10. Observacion visual de la solubilidad de ciertas composiciones peptfdicas de autoensamblaje con sales seleccionadas

Sin desear quedar ligado a ninguna teorfa particular, la presente divulgacion propone que las propiedades de las composiciones peptfdicas con una fuerza ionica aumentada pueden estar relacionadas con la solubilidad de los peptidos. La solubilidad de los peptidos autoensamblados a un nivel de pH de aproximadamente 2 a 4 es en su mayorfa lo suficientemente alta como para hacer composiciones peptfdicas claras y homogeneas. El aumento de la fuerza ionica alrededor de las cadenas peptfdicas disminuye la solubilidad de los peptidos. Cuando la solubilidad de los peptidos es baja para que las composiciones se vuelvan turbias, este estado se puede denominar como un punto crftico. Cuando el aumento de la fuerza ionica es inferior a su punto crftico pero cercano a este, los peptidos pueden inducir interacciones hidrofobas mas fuertes que aumentan la rigidez. Cuando la solubilidad del peptido disminuye por debajo de su punto crftico (es decir, alta fuerza ionica), las composiciones peptfdicas pueden ser translucidas u opacas (es decir, por encima de su punto de turbidez) y pueden precipitarse (es decir, separacion de fases). Los peptidos pueden no formar nanofibras que produzcan soluciones claras y viscosas. Las interacciones hidrofobas aleatorias pueden ser dominantes sobre las interacciones hidrofobas que crean nanofibras autoensambladas a una fuerza ionica alta debido al efecto de saladura. Los agregados intramoleculares y/o intermoleculares aleatorios pueden causar separaciones de fase.

De acuerdo con una o mas formas de realizacion, las fuerzas ionicas crfticas pueden variar dependiendo de las identidades de la sal y el peptido. La relacion entre la solubilidad y la concentracion de sal se puede expresar mediante la siguiente ecuacion de Cohen:

donde S es la solubilidad de un peptido, B es una constante especffica del peptido, K es una constante especffica de la sal e I es una fuerza ionica de las sales. B esta relacionada con el pH y la temperatura. K esta relacionada con el pH.

En algunas formas de forma de realizacion, la solubilidad de los peptidos se puede gobernar por precipitacion salina de la constante K y la fuerza ionica I, cuando la temperatura y el pH son constantes (es decir, B es constante). La K e I mas elevadas dan como resultado una menor solubilidad peptfdica. A pH y temperatura constantes, K se decide por las identidades ionicas en las sales. En general, el orden de la constante K entre las cuatro sales es NaCl > KCl > MgCl²= CaCl².

De acuerdo con una o mas formas de realizacion, la solubilidad de los peptidos se puede determinar mediante la secuencia de aminoacidos (por ejemplo, mediante composiciones de residuos de aminoacidos hidrofilos e hidrofobos en el peptido). Los peptidos con un contenido relativamente alto de aminoacidos hidrofobos (por ejemplo, IEIK13) tfpicamente tienen baja solubilidad en disolventes acuosos. Dichos peptidos a menudo se caracterizan por fuertes interacciones hidrofobas entre cadenas peptfdicas autoensambladas, lo que da como resultado una alta rigidez. Como se demuestra en el presente documento, las composiciones de dichos peptidos pueden mostrar aumentos drasticos de la rigidez con la adicion de una pequena cantidad de sal. Por el contrario, los peptidos con un contenido relativamente bajo de aminoacidos hidrofobos (por ejemplo, RADA16) tienen una alta solubilidad en disolventes acuosos. Estos peptidos tfpicamente tienen interacciones hidrofobas debiles entre los peptidos autoensamblados, lo que da como resultado una baja rigidez. La rigidez de las composiciones de dichos peptidos no aumenta significativamente ni siquiera con la adicion de una gran cantidad de sal. De acuerdo con este modelo, la presente divulgacion demuestra un orden de fuerza ionica crftica (por ejemplo, cuando la composicion se vuelve turbia) entre tres peptidos ilustrados particulares paralelos en hidrofobicidad relativa: RADA16 (0,9~1,2 M) > KLD12 (0,3~0,4 M) > IEIK13 (0,03~0,04 M).

De acuerdo con una o mas formas de realizacion, la fuerza ionica de una composicion peptfdica puede afectar a su cinetica de gelificacion. En alguna forma de realizacion, las fuerzas ionicas elevadas pueden acelerar la gelificacion de las composiciones peptfdicas. Las fuerzas ionicas requeridas para la gelificacion pueden depender de las identidades de la sal y/o el peptido. Por ejemplo, cuando los peptidos RADA16, KLD12 e IEIK13 se expusieron a un tampon salino (es decir, NaCl 0,15 M, comparable con el fluido corporal isotonico), solo se inicio la gelificacion de IEIK13. RADA16 y KLD12 no mostraron gelificacion o fue insignificante. Estos hallazgos pueden reflejar la disminucion de la solubilidad de los peptidos con una fuerza ionica elevada. IEIK13 es mas sensible a la fuerza ionica que RADA16 y KLD12 como se ha descrito anteriormente.

En algunas formas de realizacion, la fuerza ionica de una composicion peptfdica puede afectar a sus caracterfsticas de recuperacion, por ejemplo, despues de que los procesos de mezcla y/o agitacion descompongan los ensamblajes formados inicialmente (por ejemplo, nanofibras) que son resultado de interacciones peptido-peptido (tfpicamente hidrofobas).

Efectos del pH y la sal combinados

La presente divulgacion demuestra que el ajuste simultaneo del pH y la fuerza ionica (por ejemplo, a traves de la exposicion a condiciones fisiologicas) puede alterar las propiedades reologicas de las composiciones peptfdicas. Por ejemplo, como se describe en el presente documento, el aumento del nivel de pH y la fuerza ionica debido a la inclusion del medio de cultivo celular en las composiciones peptfdicas proporcionadas puede afectar a diversas propiedades (por ejemplo, propiedades reologicas) de tales composiciones.

En algunas formas de realizacion, la rigidez, la viscosidad y/o la cinetica de gelificacion de las composiciones peptfdicas pueden aumentarse en condiciones fisiologicas. En algunas formas de realizacion, las propiedades de las composiciones peptfdicas pueden controlarse con la combinacion del pH y la fuerza ionica.

Sin desear quedar ligando a ninguna teorfa particular, la presente divulgacion propone que existen dos interacciones intermoleculares principales que se relacionan con la rigidez de las composiciones peptfdicas: interacciones hidrofobas e interacciones de carga-carga.

En primer lugar, las interacciones hidrofobas y las interacciones electrostaticas repulsivas son la fuerza impulsora principal para formar soluciones viscosas a traves de la formacion de nanofibras de lamina p a bajo pH. Se predice que estas interacciones seran significativas a pH bajo, donde la mayorfa del acido aspartico y los acidos glutamicos estan protonados sin cargas negativas y una mayor parte de la arginina y la lisina estan cargadas positivamente. Las moleculas peptfdicas se autoensamblan para formar nanofibras debido a interacciones hidrofobas, mientras que las superficies de las nanofibras se hidratan debido a interacciones electrostaticas repulsivas entre las moleculas peptfdicas.

En algunas formas de realizacion, la rigidez de las composiciones peptfdicas en torno a los niveles de pH de aproximadamente 2 a aproximadamente 3 deberfa estar relacionada principalmente con su hidrofobicidad. IEIK13 tiene siete grupos de isoleucina (grupo hidrofobo fuerte), KLD12 tiene seis grupos de leucina (grupo hidrofobo fuerte), y RADA16 tiene ocho grupos de alanina (grupo hidrofobo debil). IEIK13 tiene un modulo de almacenamiento mas alto que KLD12 y RADA16 con el mismo pH y concentracion.

Como se muestra en la Figura 17B, cuando las moleculas de IEIK13 en una solucion acuosa se trataron con fluido corporal simulado, por ejemplo, DMEM, su estructura fibrosa se volvio mas espesa. La estructura fibrosa mas espesa puede producirse debido al aumento de las interacciones hidrofobas a pH fisiologico y la osmolalidad entre las nanofibras vecinas.

Las interacciones hidrofobas pueden inducir la formacion de nanofibras en un entorno acuoso, creando una composicion viscosa. Despues de la aplicacion de un alto esfuerzo de cizalladura (es decir, viscosidad y rigidez reducidas), los peptidos tambien pueden reformar las nanofibras para recuperar sus propiedades. Por lo tanto, los peptidos muestran propiedades tixotropicas a pH 2-3. Las composiciones peptfdicas recuperan lentamente sus propiedades originales una vez que se elimina el esfuerzo de cizalladura aplicado.

En segundo lugar, pueden producirse interacciones atractivas de carga-carga simultaneamente con las interacciones hidrofobas existentes en condiciones fisiologicas. Cuando el pH alrededor de las moleculas peptfdicas cambia de acido a neutro, las interacciones hidrofobas existentes pueden no descomponerse. Los grupos cargados negativamente y los grupos cargados positivamente inducen interacciones intermoleculares de carga-carga atractivas adicionales, de modo que las composiciones peptfdicas pueden ser mas rfgidas, como se demuestra en la Figura 7.

Sin embargo, cuando los ensamblajes peptfdicos en una condicion fisiologica se exponen a un alto esfuerzo de cizalladura, los ensamblajes peptfdicos se descomponen en agregados peptfdicos. Este es un proceso irreversible, como se ilustra en la Figura 7.

Por ejemplo, cuando se mezclaron 0,5 ml de DMEM con 0,5 ml de RADA16 al 2% mediante adicion por pipeteo varias veces, RADA16 no formo ensamblajes peptfdicos transparentes y viscosos (es decir, emulsiones turbias y lfquidas). Cuando la mezcla se centrifugo a 2500 rpm durante 5 min, la separacion de fases de RADA16 turbio precipito de la mezcla. En este caso, los ensamblajes peptfdicos (es decir, se formaron inicialmente mediante interacciones hidrofobas) probablemente se descompusieron durante el proceso de mezcla. Las interacciones atractivas de carga-carga fueron dominantes sobre las interacciones hidrofobas, que inducen la formacion de agregados intramoleculares e intermoleculares aleatorios. La separacion de fases se ilustra en la Figura 7.

De acuerdo con una o mas formas de realizacion, IEIK13, KLD12 o RADA16 pueden disolverse en tampon de sal (por ejemplo, NaCl), y su pH puede elevarse con tampon de sal alcalina (por ejemplo, NaOH). Sus fuerzas ionicas de sal pueden estar por debajo de sus puntos de sal crfticos. Su pH puede ser de aproximadamente 2,5 a aproximadamente 4,0. Las composiciones pueden tener una rigidez y viscosidad aumentadas en relacion con una composicion de referencia apropiada del mismo peptido a la misma concentracion.

En algunas formas de realizacion, las condiciones fisiologicas (por ejemplo, pH elevado y fuerza ionica de la sal) pueden acelerar la gelificacion de las composiciones peptfdicas. La gelificacion acelerada de IEIK13 en una condicion fisiologica puede estar relacionada con dos fuerzas impulsoras, es decir, un aumento del pH y la fuerza ionica. La aceleracion de la gelificacion de RADA16 en una condicion fisiologica puede tener una sola fuerza impulsora, es decir, un aumento del pH. En algunas formas de realizacion, la gelificacion acelerada de las composiciones peptfdicas con fluido corporal generalmente puede mejorar su funcion y tiempo de respuesta para diversas aplicaciones clfnicas.

Compatibilidad celular

De acuerdo con una o mas formas de realizacion, las composiciones peptfdicas proporcionadas estan generalmente asociadas con una alta viabilidad celular.

En algunas formas de realizacion, KLD12 e IEIK13 pueden tener viabilidades celulares similares o superiores en comparacion con RADA16. El orden de la viabilidad celular global entre estas composiciones peptfdicas fue KLD12 > IEIK13 > RADA16. En algunas formas de realizacion, las composiciones peptfdicas pueden tener viabilidades celulares superiores al 80% cuando sus concentraciones son de aproximadamente o inferiores al 0,75%. En algunas formas de realizacion, las viabilidades celulares pueden disminuir cuando las concentraciones peptfdicas son superiores al 0,75%.

Forma

En algunas formas de realizacion, las composiciones peptfdicas de acuerdo con la presente invencion estan en forma de un polvo seco, una solucion, un gel (por ejemplo, un hidrogel), o cualquier combinacion de los mismos.

En algunas formas de realizacion, una composicion de polvo seco comprende un peptido en una cantidad apropiada para dar como resultado una solucion de la concentracion deseada tras la adicion de un volumen seleccionado de disolvente (por ejemplo, un disolvente acuoso, incluyendo opcionalmente una o mas sales y/o uno o mas agentes de ajuste del pH). En algunas formas de realizacion, una composicion de polvo seco comprende el peptido y la sal de los tipos apropiados y cantidades relativas para dar como resultado una solucion de la concentracion peptfdica y la fuerza ionica deseadas como se describe en el presente documento tras la adicion de un volumen seleccionado de disolvente (por ejemplo, disolvente acuoso, opcionalmente incluyendo una o mas sales adicionales y/o uno o mas agentes de ajuste del pH). En algunas formas de realizacion, una composicion de polvo seco comprende el peptido y agente de ajuste del pH de los tipos apropiados y cantidades relativas para dar como resultado una solucion de la concentracion peptfdica y el pH deseados como se describe en el presente documento tras la adicion de un volumen seleccionado de disolvente (por ejemplo, disolvente acuoso, opcionalmente incluyendo una o mas sales y/o uno o mas agentes de ajuste del pH adicionales). En algunas formas de realizacion, una composicion de polvo seco comprende el peptido, sal y el agente de ajuste del pH de los tipos apropiados y cantidades relativas para dar como resultado una solucion de la concentracion peptfdica, el pH, y/o la fuerza ionica deseados como se describe en el presente documento tras la adicion de un volumen seleccionado de disolvente (por ejemplo, disolvente acuoso, opcionalmente incluyendo una o mas sales adicionales y/o uno o mas agentes de ajuste del pH adicionales).

En algunas formas de realizacion, una composicion proporcionada se aloja en un recipiente (por ejemplo, una jeringa, vial, pocillo, etc.). En algunas formas de realizacion, el recipiente es un recipiente graduado ya que incluye indicaciones de volumen. En algunas formas de realizacion, el recipiente esta adaptado para la conexion a un dispositivo de administracion tal como una canula o jeringa. En algunas formas de realizacion, el recipiente esta sellado de una manera (por ejemplo, una cubierta penetrable) que permita la adicion y/o eliminacion de material fluido (por ejemplo, lfquido) sin la eliminacion del sello.

Aplicaciones

En algunas formas de realizacion, la presente divulgacion proporciona un sistema para seleccionar composiciones peptfdicas para su uso en aplicaciones particulares. Los efectos de la identidad peptfdica, la concentracion peptfdica, el pH, la identidad de la sal y/o la concentracion de la sal, como se describe en el presente documento, pueden afectar a las caracterfsticas y, por lo tanto, a la utilidad de composiciones peptfdicas particulares para ciertas aplicaciones.

Para dar solo unos pocos ejemplos, en general, las composiciones peptfdicas con mayor rigidez son mas adecuadas para aplicaciones caracterizadas por hemostasia, tapones de tejido, antiadherencia o cierta regeneracion tisular. Las composiciones peptfdicas con tiempos de gelificacion mas rapidos pueden ser particularmente adecuadas para ciertas aplicaciones de tapones de tejido tal como, por ejemplo, hemostasia, tapon de tejido, antiadherencia o administracion de farmacos, tapon vascular, para los cuales se requieren o se prefieren tfpicamente tiempos de gelificacion de aproximadamente 1 minuto a aproximadamente 1 hora. Las composiciones peptfdicas con tiempos de recuperacion mas rapidos pueden ser particularmente adecuadas para la hemostasia, el tapon de tejido o el tapon vascular.

Como se indica en el presente documento, las composiciones peptfdicas de autoensamblaje han demostrado ser extremadamente utiles en una diversidad de contextos in vivo e in vitro, incluyendo, por ejemplo, andamios celulares, barreras para el movimiento de lfquidos, hemostaticos, rellenos de huecos, y mas. Diferentes composiciones de este tipo, como se describe en este documento, pueden ser mas utiles en diferentes contextos.

Por ejemplo, los contextos que implican la administracion de una composicion peptfdica durante la cirugfa (por ejemplo, como un hemostatico) pueden beneficiarse de la cinetica de gelificacion que permite que la composicion permanezca sustancialmente lfquida durante un periodo de tiempo apropiado para la administracion en el sitio quirurgico, seguida de una rapida gelificacion para formar un gel estable, preferiblemente claro y relativamente rfgido, a traves del cual pueden realizarse facilmente las manipulaciones quirurgicas.

Para dar ejemplos especfficos, como se describe en el presente documento, en algunas formas de realizacion, las composiciones de IEIK13 pueden ser particularmente utiles en una diversidad de aplicaciones biomedicas, por ejemplo, que requieren cierta rigidez y una rapida gelificacion. La presente divulgacion demuestra que ciertas composiciones de IEIK13 se caracterizan por una rigidez relativamente alta y/o velocidades de recuperacion rapidas despues de la aplicacion de un alto esfuerzo de cizalladura (por ejemplo, el autoensamblaje mas rapido). Ademas, la presente divulgacion demuestra que ciertas composiciones de IEIK13 pueden mostrar una rigidez particularmente util (por ejemplo, alta) cuando se ponen en contacto con un medio fisiologico.

La presente divulgacion tambien demuestra que ciertas composiciones de KLD12 pueden ser particularmente utiles, por ejemplo, cuando se requiere una inyeccion facil junto con una alta rigidez final. En algunas formas de realizacion, las nanofibras autoensambladas de KLD12 se pueden desmontar con un alto esfuerzo de cizalladura y luego volver a ensamblarse lentamente.

La presente divulgacion tambien demuestra que ciertas composiciones de KLD12 pueden ser particularmente utiles cuando se requiere una alta viabilidad celular. En algunas formas de realizacion, las concentraciones de KLD12 pueden aumentarse para tener una rigidez requerida para una aplicacion determinada.

EJEMPLOS

Ejemplo 1: Claridad optica de ciertas composiciones peptidicas de referencia

El presente Ejemplo ilustra la claridad optica y la estabilidad de fase (es decir, la ausencia de separacion de fases) de ciertas composiciones peptidicas de referencia en las que el peptido indicado se disolvio en agua. En algunas formas de realizacion, la claridad optica (y/o la estabilidad de fase) de las composiciones peptidicas proporcionadas se evalua en relacion con la de dichas composiciones de referencia. En algunas formas de realizacion, las composiciones proporcionadas de un peptido particular a una concentracion particular muestran claridad optica y/o estabilidad de fase al menos tan buena como la de una composicion de referencia del mismo peptido en la misma composicion disuelta en agua.

Como se puede ver con referencia a la Tabla 1, se prepararon diversas composiciones peptidicas de referencia que mostraron claridad optica (y tambien estabilidad de fase) en un intervalo de concentraciones peptidicas. En particular, las composiciones peptidicas a concentraciones del 0,05%, 0,1%, 0,5%, 1%, 1,5%, 2%, 2,5% o mas, mostraron un caracter optico claro y ausencia de separacion de fases.

T l 1 A l i

Ejemplo 2: Propiedades reologicas de las composiciones peptidicas en funcion de la concentracion

El presente Ejemplo describe los efectos de la concentracion peptfdica en las propiedades reologicas de ciertas composiciones peptidicas. En algunas formas de realizacion, las propiedades reologicas pueden tener una relacion lineal con la concentracion peptfdica.

En algunas formas de realizacion, las composiciones peptidicas con una rigidez deseada especffica pueden formularse para tener una concentracion peptfdica particular determinada utilizando un modelo matematico (es decir, la ecuacion de la lfnea de tendencia del modulo). Un cuadro de formulacion de las composiciones peptidicas puede relacionar sus concentraciones en agua desionizada con sus modulos de almacenamiento especfficos, por ejemplo, como se presenta a continuacion en la Tabla 3A. A partir de dicho cuadro, un experto en la tecnica puede formular una composicion peptfdica con las propiedades reologicas deseadas seleccionando un peptido particular y una concentracion peptfdica apropiada de manera que la composicion formulada tenga una rigidez deseada.

Por ejemplo, como se describe en el presente documento, en general, se demuestra que el orden de la resistencia reologica de las composiciones peptidicas que contienen los peptidos RADA16, KLD12 o IEIK13 es IEIK13 > KLD12 > RADA16.

Tabla 3A Cuadro de formulacion de composiciones peptfdicas variando su concentracion con agua desionizada para obtener modulos de almacenamiento especfficamente deseados, calculados con las ecuaciones de linea de tendencia lineal presentadas anteriormente.

El presente Ejemplo describe adicionalmente la medicion de diversas propiedades reologicas de ciertas composiciones peptfdicas a las concentraciones seleccionadas usando un reometro (AR500, TA Instruments) con placas de 40 mm. Se puso una composicion peptfdica (700 pl) en la placa del reometro y el exceso de composicion se elimino suavemente con toallitas Kimwipes. Las mediciones se realizaron despues de 2 minutos de tiempo de relajacion a 37°C. El modulo de almacenamiento, el modulo de perdida y la viscosidad (r|') se midieron a 37°C con las placas colocadas en un espacio geometrico de medicion de 300 pm, y las pruebas de barrido de esfuerzo se realizaron a 0,1 Pa ~ 1000 Pa de tension de oscilacion con una frecuencia angular a 10 rad/s.

Los resultados se muestran en las Figuras 2-4 para RADA16, IEIK13 y KLD12. Como se muestra en las Figuras 2-4, las composiciones peptfdicas mostraron modulos cercanos a la meseta cuando la tension de oscilacion fue menor de aproximadamente 10 a 200 Pa. Todas tenfan una disminucion drastica del modulo a una cierta tension de oscilacion elastica. Al menos dentro del intervalo de concentracion ensayado de aproximadamente el 1% a aproximadamente el 2,5%, las composiciones peptfdicas mostraron un aumento lineal del modulo de almacenamiento con una mayor concentracion (R2 de las lfneas de tendencia lineales estan entre 0,971~0,992). Ciertas composiciones peptfdicas demostraron una propiedad de pseudoplasticidad sobre un nivel de esfuerzo crftico.

Los resultados reologicos determinados para diversas composiciones peptfdicas ensayadas en el presente Ejemplo se enumeran en la Tabla 3. Como puede verse, se encontro que el modulo de almacenamiento de KLD12 al 1,5% era similar al de RADA16 al 2,5%. Se encontro que el modulo de almacenamiento de IEIK13 al 1% era similar al de KLD12 al 2,5% y superior al de RADA16 al 2,5%. En general, el orden de resistencia reologica entre las composiciones ensayadas aquf fue IEIK13 > KLD12 > RADA16.

Tabla 3 Propiedades reologicas de composiciones peptfdicas a las concentraciones seleccionadas

Ejemplo 3: Propiedades reologicas de las composiciones peptidicas en funcion del pH

El presente Ejemplo describe los efectos del pH en las propiedades reologicas de ciertas composiciones peptfdicas. En algunas formas de realizacion, el pH puede ser un parametro de control que afecta la rigidez, la viscosidad y/o el tiempo de recuperacion de las composiciones peptfdicas.

La Tabla 2, a continuacion, presenta concentraciones de pH observadas para composiciones de referencia en las que el peptido indicado se solubiliza en agua a la concentracion indicada.

Tabla 2 Valores de pH de composicio ua) a concentraciones seleccionadas.

En este ejemplo, los niveles de pH de las composiciones peptfdicas se ajustaron, por ejemplo, mediante la adicion de NaOH 0,1 N a 2 ml de una composicion peptfdica al 2,5%. Se observaron el pH y el aspecto de las composiciones ajustadas. Se anadio una sal acida si el nivel de pH era mas alto que el nivel deseado.

Los resultados se muestran en la Tabla 5. Particularmente, un aumento del pH (es decir, hasta aproximadamente 3,5 o menos) no cambio el color claro de las composiciones de RADA16, IEIK13 y KLD12, mientras que su rigidez aparente aumento. Con ciertas composiciones, cuando los niveles de pH de las composiciones peptfdicas fueron superiores a 3,5 (RADA16 y KLD12) o 3,7 (IEIK13), las composiciones peptfdicas comenzaron la separacion de fases (es decir, se volvieron turbias). En algunas formas de realizacion, las composiciones peptfdicas proporcionadas tienen un pH dentro del intervalo de aproximadamente 3,0 a aproximadamente 3,7 (particularmente para IEIK13), o aproximadamente de 3,0 a aproximadamente 3,5 (particularmente para RADA16 y/o KLD12).

Tabla 5 Observacion visual de ciertas composiciones peptfdicas a niveles de pH seleccionados

Las propiedades reologicas de ciertas composiciones peptfdicas se observaron antes y despues de ajustar sus niveles de pH a 3,4 (RADA16 y KLD12) o 3,7 (IEIK13). Las propiedades reologicas de los peptidos se evaluaron utilizando un reometro (AR500, TA Instruments) con placas de 40 mm. Especfficamente, se puso una composicion peptfdica (700 pi) en la placa del reometro y el exceso de composicion se elimino suavemente con toallitas Kimwipes. Las mediciones se realizaron despues de 2 minutos de tiempo de relajacion a 37°C. Los resultados de la prueba de barrido de esfuerzo se muestran en la Figura 8-11. Las composiciones de RADA16, KLD12 e IEIK13 a pH elevado fueron mas rfgidas que aquellas a 2,5 (RADA16), 2,0 (KLD12) y 2,1 (IEIK13).

El modulo de almacenamiento de ciertas composiciones peptfdicas a niveles de pH seleccionados se evaluo utilizando un reometro (DHR-1, TA Instruments) con placas de 20 mm. El modulo de almacenamiento de las composiciones de RADA16 y IEIK13 se aumento con el aumento del pH hasta 3,4. Los modulos de almacenamiento determinados para composiciones peptfdicas ensayadas se muestran en la Figura 18 para RADA16 y la Figura 19 para IEIK13, respectivamente.

Las viscosidades de las composiciones de IEIK13 al 1% a niveles de pH seleccionados se evaluaron utilizando un reometro (DHR-1, TA Instruments) con placas de 20 mm. Las viscosidades de las composiciones de IEIK13 aumentaron con el aumento del pH hasta 3,5. Las composiciones de IEIK13 mostraron una propiedad tfpica de pseudoplasticidad. Los resultados se muestran en las Figuras 20A y 20B.

Los tiempos de recuperacion de las propiedades reologicas se evaluaron a un pH seleccionado despues de aplicar un alto esfuerzo de cizalladura a composiciones de IEIK13 al 1%. Usando el reometro DHR-1 (TA Instruments), los cambios del modulo de almacenamiento de IEIK13 al 1% se midieron a 1 rad/s a 1 Pa despues de aplicar 1000 1/s de velocidad de cizalladura a las muestras durante 1 min. Las composiciones de IEIK13 a pH seleccionado mostraron un comportamiento tixotropico tfpico, lo que significa que sus propiedades reologicas se recuperaron lentamente. Sin desear quedar ligado por ninguna teorfa particular, se propone que los tiempos de recuperacion de las propiedades reologicas representan el tiempo requerido para volver a ensamblar las moleculas peptfdicas para formar autoasociaciones (por ejemplo, nanofibras) de nuevo en las composiciones. El tiempo de reensamblaje completo de la composicion de control de IEIK13 al 1% (pH 2,3) fue de hasta 12 horas o menos, mientras que el de las composiciones de IEIK13 con pH elevado fue de 6~10 min. Los resultados representativos se muestran en la Figura 21A-21D para IEIK13.

Ejemplo 4: Propiedades reologicas de las composiciones peptidicas en funcion de la fuerza ionica

El presente Ejemplo describe los efectos de la fuerza ionica en las propiedades reologicas de ciertas composiciones peptfdicas. En algunas formas de realizacion, la fuerza ionica puede ser un parametro de control de la rigidez, la viscosidad y/o el tiempo de recuperacion de las composiciones peptfdicas.

Las observaciones visuales de las composiciones de RADA16, KLD12 e IEIK13 con las sales seleccionadas (por ejemplo, KCl, MgCb, CaCb) se resumen en las Tablas 7-9. Las composiciones peptfdicas a ciertas fuerzas ionicas fueron claras y mostraron una mayor rigidez que las de una fuerza ionica mas baja. Para RADA16 (Tabla 7), la fuerza ionica dentro del intervalo de aproximadamente 0,85 ~ 1,15 M (dependiendo de las identidades de sal) no cambio de forma apreciable la opacidad de las composiciones de RADA16. Para KLD 12 (Tabla 8), la fuerza ionica dentro del intervalo de aproximadamente 0,25 ~ 0,35 M (dependiendo de las identidades de sal) no cambio de forma apreciable la opacidad de las composiciones de KLD12. Para IEIK13 (Tabla 9), la fuerza ionica dentro del intervalo de aproximadamente 0,025 ~ 0,035 M (dependiendo de las identidades de sal) no cambio la opacidad de las composiciones de IEIK13. La rigidez aparente de las composiciones de RADA16, KLD12 e IEIK13 se aumento con el aumento de la fuerza ionica.

Sin desear quedar ligado a ninguna teorfa particular, se propone que el aumento de las propiedades reologicas puede relacionarse con la constante de precipitacion salina, K, de cada sal. La constante K de NaCl para RADA16 puede ser mas alta que las otras sales. Las propiedades reologicas de las composiciones de RADA16 con NaCl fueron ligeramente mas altas que las de KCl y CaCb.

Tabla 7 Observacion visual de com osiciones de RADA16 con sales seleccionadas a tem eratura ambiente

Tabla 8 Observacion visual de com osiciones de KLD12 con sales seleccionadas a tem eratura ambiente

T l rv i n vi l m ii n IEIK1 n l l i n m r r min

Se determinaron las fuerzas ionicas crfticas a partir de las observaciones visuales registradas en las Tablas 7-9. Cuando las fuerzas ionicas de las composiciones peptfdicas fueron superiores a 0,9 M (RADA16), 0,3 M (KLD12) o 0,03 M (IEIK13), las composiciones peptfdicas comenzaron la separacion de fases. 0,9 M, 0,3 M y 0,03 M pueden representar intensidades ionicas crfticas para RADA16, KDL12 e IEIK13, respectivamente.

Las Figuras 27-29 muestran las propiedades reologicas medidas con un reometro (DHR-1, TA Instruments) con placas de 20 mm cuando las fuerzas ionicas son ligeramente mas bajas que las fuerzas ionicas crfticas. Las fuerzas ionicas de RADA16, KDL12 e IEIK13 fueron 0,7 M, 0,2 M y 0,02 M, respectivamente, para las mediciones. Las propiedades reologicas de las composiciones de RADA16, KLD12 e IEIK13 fueron mayores despues de ajustar sus niveles de fuerza ionica con NaCl a 0,7 M (RADA16), 0,2 M (KLD12) o 0,02 M (IEIK13).

Las propiedades reologicas de las composiciones peptfdicas a las fuerzas ionicas seleccionadas se midieron usando un reometro (DHR-1, TA Instruments) con placas de 20 mm. Las propiedades reologicas de las composiciones de RADA16 al 1% aumentaron con el ajuste de la fuerza ionica hasta 0,7 M, mientras que disminuyeron con la fuerza ionica superior a 0,7 M. Las propiedades reologicas de las composiciones de IEIK13 al 1% aumentaron con el ajuste de la fuerza ionica hasta 0,03 M, mientras que disminuyeron con la fuerza ionica superior a 0,03 M. Los resultados coinciden con las inspecciones visuales de las composiciones peptfdicas a las concentraciones ionicas salinas seleccionadas. Los resultados se muestran en la Figura 30 para RADA16 y en la Figura 31 para IEIK13.

Se evaluaron las viscosidades de las composiciones peptfdicas a los niveles de fuerza ionica seleccionados. Las viscosidades de las composiciones de IEIK13 aumentaron con el aumento de la fuerza ionica. Las composiciones de IEIK13 al 1% mostraron una propiedad tfpica de pseudoplasticidad. Se evaluaron las viscosidades de las composiciones de IEIK13 al 1% utilizando un reometro (DHR-1, TA Instruments) con placas de 20 mm. Los resultados se muestran en las Figuras 32A y 32B para IEIK13.

Los tiempos de recuperacion de las propiedades reologicas se evaluaron despues de aplicar un alto esfuerzo de cizalladura a las composiciones de IEIK13 al 1% a las fuerzas ionicas seleccionadas. Usando un reometro DHR-1 (TA Instruments), los cambios en el modulo de almacenamiento de IEIK13 al 1% se midieron con pruebas de barrido de tiempo a 1 rad/s a 1 Pa despues de aplicar 1000 1/s de velocidad de cizalladura a las muestras durante 1 min. Las composiciones de IEIK13 a las fuerzas ionicas seleccionadas mostraron un comportamiento tixotropico tfpico, recuperando sus propiedades reologicas lentamente. Los tiempos de recuperacion de las propiedades reologicas se basan en el reensamblaje de las moleculas peptfdicas para volver a formar nanofibras. El tiempo de reensamblaje completo de las composiciones de control de IEIK13 al 1% sin adicion de sal fue de hasta 12 horas o menos, mientras que el de las composiciones de IEIK13 con NaCl 0,01 M y 0,02 M fue inferior a 1 min ~ 3 min. Los resultados se muestran en las Figuras 33A-33C para IEIK13.

Ejemplo 5: Propiedades reologicas de las composiciones peptidicas en funcion tanto del pH como de la fuerza ionica

El presente Ejemplo describe las propiedades reologicas de las composiciones peptfdicas a pH y fuerza ionica aumentados. En particular, el presente Ejemplo describe los efectos de un medio fisiologico, tal como un medio de cultivo celular, sobre las propiedades reologicas de ciertas composiciones peptfdicas.

Los efectos del medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) (pH 7,4) sobre las propiedades reologicas de las composiciones de IEIK13, KLD12 y RADA16 se evaluaron utilizando un reometro (AR500, TA Instruments) con placas de 40 mm. DMEM es un medio de cultivo celular que contiene 6,4 g/l de NaCl, 3,4 g/l de NaHCO³(bicarbonato sodico), cantidades menores de otras sales, diversos aminoacidos y 4,5 g/l de glucosa. El pH de DMEM es 7,2 ± 0,2 y la osmolalidad es 335 ± 30 mOsm/kg de H²O. DMEM esta cercano a los fluidos fisiologicos humanos, por ejemplo, la sangre.

Antes de mezclarse con la solucion de DMEM, las composiciones peptfdicas al 1% se mantuvieron a 4°C durante al menos 48 horas. Para realizar experimentos, se anadio por pipeteo suavemente 1 ml de composicion peptfdica y se puso en la placa del reometro. Se anadieron suavemente 2 ml de la solucion de DMEM alrededor de la composicion peptfdica. La composicion del peptido se trato con el DMEM durante dos minutos, despues se elimino el medio, y las placas se colocaron en un espacio de medicion geometrico a aproximadamente 450 pm. Las mediciones se realizaron a 37°C despues de 2 minutos de relajacion. Las pruebas de frecuencia se realizaron de 1 rad/s a 100 rad/s a 1 Pa de tension de oscilacion.

Las propiedades reologicas de las composiciones peptfdicas al 1% se midieron antes y despues del tratamiento con DMEM durante 2 minutos; los resultados se presentan en la Figura 5A. El factor de aumento de los modulos de almacenamiento despues del tratamiento con DMEM se muestra en la Figura 5B. Como puede verse, las composiciones peptfdicas mostraron grandes aumentos de los modulos de almacenamiento despues del tratamiento con DMEM. Las diferencias de factor entre RADA16, KLD12 e IEIK13 despues del tratamiento con DMEM fueron relativamente pequenas en comparacion con las anteriores al tratamiento con DMEM. De manera similar, las composiciones peptfdicas mas rfgidas (por ejemplo, IEIK13) mostraron un factor de aumento menor del modulo de almacenamiento que las composiciones peptfdicas menos rfgidas (por ejemplo, RADA16) despues del tratamiento con DMEM. Las interacciones intermoleculares crfticas aumentaron despues del tratamiento con DMEM, lo que puede determinar la rigidez final.

Usando un reometro DHR-1 (TA Instruments), las propiedades reologicas de las composiciones peptfdicas a las concentraciones seleccionadas se midieron antes y despues del tratamiento con DMEM. Las pruebas de barrido de frecuencia se realizaron de 1 rad/s a 10 rad/s a 1 Pa y los modulos de almacenamiento en los graficos fueron a 1 rad/s. Las propiedades reologicas de las composiciones de RADA16 y IEIK13 se aumentaron con el tratamiento con DMEM y/o la elevacion del pH. Los resultados se muestran en las Figuras 22A y 22B para RADA16 y las Figuras 23A y 23B para IEIK, respectivamente.

Usando un reometro DHR-1 (TA Instruments), las propiedades reologicas de las composiciones peptfdicas a las fuerzas ionicas seleccionadas se evaluaron 10 min despues del tratamiento con DMEM. Se realizaron pruebas de barrido de frecuencia de 1 rad/s a 10 rad/s a 1 Pa y se selecciono el modulo de almacenamiento a 1 rad/s para los datos. Las propiedades reologicas de las composiciones de RADA16 aumentaron con el ajuste de la fuerza ionica hasta 0,7 M, mientras que disminuyeron con 0,7 M o mas. A una fuerza ionica de 0,9 M o mas de NaCl, las composiciones de RADA16 se volvieron turbias. Las propiedades reologicas de RADA16 no cambiaron con el tratamiento con DMEM (por ejemplo, sin gelificacion). Sin embargo, las propiedades reologicas de las composiciones de IEIK13 aumentaron con los tratamientos con DMEM a las fuerzas ionicas seleccionadas. Los resultados se muestran en la Figura 34-35.

Se disolvieron IEIK13, KLD12 y RADA16 en tampon de sal (por ejemplo, NaCl) y se mantuvieron a un nivel elevado de pH ajustado con tampon de sal alcalina (por ejemplo, NaOH). Las composiciones tenfan sus niveles de pH a aproximadamente 2,5-4,0 y una fuerza ionica inferior a sus puntos crfticos. Con respecto a RADA16, KLD13 e lElK13, las composiciones peptfdicas todavfa eran claras con NaCl al 0,9% (es decir, fuerza ionica de 0,15 M) a pH 3,4 (ajustado con NaOH). Las propiedades reologicas de RADA16 con NaCl al 0,9% a pH 3,4 fueron mas rfgidas que las de control de RADA16 (es decir, sin fuerza ionica y elevacion del pH) y RADA16 con NaCl al 0,9% (sin elevacion del pH). Los resultados se muestran en la Figura 40.

Se realizo un ensayo de rojo Congo para determinar la formacion de gel de composiciones peptfdicas en una solucion de PBS (solucion salina tamponada con fosfato) (pH 7,4), como se muestra en la Figura 1. Se sembraron en placas 100 pl de cada gel a concentraciones seleccionadas en un portaobjetos de vidrio. Despues de 30 segundos, se anadieron 500 pl de una solucion al 1% de de Rojo Congo alrededor y en la parte superior de cada una de las alfcuotas de la composicion y despues se elimino el exceso de solucion de Rojo Congo antes del examen. RADA16, IEIK13 y KLD12 se pusieron en placas a las concentraciones seleccionadas del 0,5%, 1,0%, 1,5%, 2,0% y 2,5%. La observacion visual determino el exito o el fracaso de la gelificacion en cada concentracion. RADA16, IEIK13 y KLD se gelificaron en todas las concentraciones.

Ejemplo 6: Viabilidad celular

El presente Ejemplo describe la capacidad de ciertas composiciones peptfdicas para soportar la viabilidad celular. En algunas formas de realizacion, las composiciones peptfdicas proporcionadas se caracterizan porque soportan una alta viabilidad celular, particularmente en comparacion con composiciones de referencia apropiadas.

Se realizo un ensayo de viabilidad celular (citotoxicidad) para medir la viabilidad de las celulas madre mesenquimales de raton (mMSC) C57 BL/6 con las composiciones de IEIK13, KLD12 y RADA16 como se describe en el presente documento. Las mMSC son una lfnea celular de uso frecuente en sistemas de cultivo tisular con hidrogel. Las composiciones peptfdicas se prepararon a una concentracion del 2,5% y despues se diluyeron a concentraciones del 1,5%, 1,25%, 1,0%, 0,75% y 0,50% con sacarosa. La concentracion final de sacarosa fue del 10%. Las celulas se lavaron y se resuspendieron en sacarosa al 10% hasta una concentracion final de 5 millones de celulas/ml. Las celulas se centrifugaron y el sobrenadante se elimino. Las celulas se resuspendieron en composiciones peptfdicas con sacarosa al 10%. Despues se siguio el protocolo para el cultivo en placas de cultivo y su posterior aislamiento como se describe en las Pautas de uso de PuraMatrix® (sitio web de BD/Corning). Los resultados se muestran en las Figuras 14-16 para RADA16, IEIK13 y KLD12, respectivamente.

Las viabilidades celulares en las composiciones de IEIK13 y KLD12 al 0,5% fueron similares al 0,25%. La viabilidad celular en las composiciones de RADA16 al 0,5% es significativamente mas alta que al 0,25%. Sin embargo, las viabilidades celulares disminuyeron significativamente cuando las concentraciones de peptidos superaron el 0,75%. Las composiciones de KLD12 e IEIK13 mostraron una viabilidad celular similar o superior en comparacion con RADA16 en todas las concentraciones ensayadas dentro del intervalo del 0,25% al 1,5%. El orden de la viabilidad celular global entre estas composiciones peptfdicas fue KLD12 > IEIK13 > RADA16. Las composiciones peptfdicas ensayadas con concentraciones del 0,75% o menos mostraron viabilidades celulares superiores al 80%.

Ejemplo 7: Propiedades reologicas de las composiciones de RADA16 con diferentes sales

El presente Ejemplo describe, entre otras cosas, estudios que lograron una mejora mecanica controlada de geles peptfdicos de autoensamblaje mientras aun se mantiene la reversibilidad del gel (por ejemplo, sin comprometer la formacion de gel y su integridad mecanica despues de la perturbacion mecanica). Estos estudios descritos tambien lograron el control de la cinetica de gelificacion a traves de la mezcla de cationes y aniones a las concentraciones seleccionadas en combinacion con diversos peptidos de autoensamblaje, en particular, RADARADARADARADA (o RADA-16).

El presente Ejemplo, particularmente cuando se toma en contexto con la presente memoria descriptiva, confirma que se han definido parametros que permiten que las composiciones peptfdicas se formulen especfficamente para que tengan caracterfsticas materiales y/o reologicas particularmente utiles para ciertas aplicaciones. Por ejemplo, la tecnologfa descrita en el presente documento permite la preparacion de composiciones peptfdicas de autoensamblaje que estan especfficamente disenadas para funcionar tambien como sellantes (que pueden requerir o beneficiarse de, por ejemplo, una rigidez mejorada), lubricantes (que pueden requerir o beneficiarse de, por ejemplo) , una cinetica mejorada), mezclas de farmacos (que pueden requerir o beneficiarse de, por ejemplo, reversibilidad y cinetica mejorada), inyectables (que pueden requerir o beneficiarse de, por ejemplo, reversibilidad), etc. Como alternativa, o adicionalmente, la tecnologfa descrita en el presente documento permite la preparacion de composiciones peptfdicas y/o la seleccion de parametros incluidos o aplicados a ellas, que pueden ayudar en el manejo general y/o fabricacion de composiciones peptfdicas utiles y/o dispositivos que las incluyan.

Por ejemplo, como se demuestra en el presente documento, controlando sistematicamente el tipo, por ejemplo, Na, K y Ca, y/o la concentracion de cation incluida en las composiciones peptfdicas de autoensamblaje, la resistencia mecanica (es decir, la rigidez) se puede ajustar mientras se mantiene la reversibilidad y la cinetica de gelificacion. Como alternativa, o adicionalmente, controlando sistematicamente el tipo, por ejemplo, Cl, SO⁴, PO⁴y/o la concentracion de anion, la cinetica de gelificacion puede controlarse manteniendo la reversibilidad.

Como se demuestra en el presente Ejemplo, en algunas formas de realizacion (y en particular, en formas de realizacion que utilizan un peptido RADA16), Ca permitira una mayor rigidez mejorada en geles peptfdicos en comparacion con Na y K. Ademas, en algunas formas de realizacion (y, en particular, en formas de realizacion que utilizan un peptido RADA16, Cl permitira una cinetica de gelificacion mas rapida en geles peptfdicos en comparacion con SO⁴. Ademas, en algunas formas de realizacion (y en particular, en formas de realizacion que utilizan un peptido RADA16), CaCl²permitira geles reversibles mejorados mecanicamente de manera optima a una concentracion de >0,125 y <0,500 M. En los estudios particulares notificados en este Ejemplo, las concentraciones >0,500 M comprometieron las propiedades mecanicas de ciertos geles, o los dejo inutilizables con respecto a las perturbaciones mecanicas posteriores a la gelificacion.

En general, los hallazgos notificados en el presente Ejemplo demuestran que, a traves del uso de una diversidad de sales y concentraciones de sal, atributos tales como la rigidez, la cinetica de gelificacion y la reversibilidad de la gelificacion pueden determinarse mediante la seleccion de parametros tales como la concentracion de peptido, identidad (por ejemplo, secuencia de aminoacidos) de peptido, concentracion de cationes/aniones, identidad de cation/anion, etc. Se ha observado que tanto el cation como el anion, independientemente y en combinacion, pueden afectar a los atributos. Las ensenanzas proporcionadas por la presente divulgacion, incluyendo el presente Ejemplo, proporcionan un sistema para adaptar mezclas peptfdicas de acuerdo con los atributos deseados (por ejemplo, caracterfsticas de rendimiento), por ejemplo, segun sea apropiado para una aplicacion o situacion particular.

El presente Ejemplo demuestra especfficamente que ciertos tipos particulares de cationes y/o aniones, y/o concentraciones de los mismos, tienen efectos beneficiosos deseados; entre otras cosas, el presente Ejemplo define tales aniones/cationes y concentraciones con respecto a los contextos ilustrados, y ademas proporciona un marco que permite a los expertos en la tecnica hacer lo mismo para otros casos (por ejemplo, otros peptidos, etc.).

El presente Ejemplo identifica particularmente y sorprendentemente un problema con las estrategias actuales para proporcionar composiciones utiles de peptidos de autoensamblaje. Es decir, se ha teorizado que la capacidad de autoensamblaje depende de la cantidad de grupos cargados disponibles para el ataque de las sales ionicas, que es la capacidad de saturacion del peptido [P. Chen. (2005). "Self-assembly of ionic-complementary peptides: a physicochemical viewpoint." Colloids and Surfaces]. Sin embargo, el presente Ejemplo documenta que, al menos en algunos casos, los peptidos no se ven afectados proporcionalmente por la concentracion de sal, y por lo tanto, las propiedades mecanicas y la reversibilidad no aumentan linealmente y no son dependientes de la velocidad.

Las Figuras 41A-41D representan el protocolo usado para seguir la disolucion del peptido y para evaluar los efectos de aniones y/o cationes particulares, y/o su concentracion, en ciertas composiciones de RADA16. Como se muestra, el polvo de peptido en un vial se disolvio en agua desionizada con agitacion vorticial y sonicacion. La composicion peptfdica particular utilizada en este Ejemplo fue una composicion de RADA16 al 1% que se mezclo en una relacion 1:1 con una solucion de sal 2X para obtener una concentracion final de RADA16 al 0,5% y la concentracion molar deseada de sal.

Estudio de la concentracion de sal

Se siguio el protocolo representado en las Figuras 41A-41D para preparar soluciones al 0,5% de RADA16 con diferentes concentraciones de CaCh. Las soluciones mixtas se dejaron reposar durante un periodo de relajacion de aproximadamente 24 horas. Despues, los viales se invirtieron de manera invertida para poder evaluar las propiedades del gel. Si la composicion permanecfa completamente en su lugar al invertir el vial que la contenfa, la

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una composicion IEIK13 que comprende:

un peptido IEIK13 a una concentracion de al menos el 0,25%;

cuya composicion tiene un pH mantenido dentro del intervalo de aproximadamente 2,5 a aproximadamente 4,0.

2. La composicion de la reivindicacion 1, cuya composicion es una solucion.

3. La composicion de la reivindicacion 1, cuya composicion es un gel.

4. La composicion de la reivindicacion 1, en la que la composicion tiene una fuerza ionica dentro del intervalo de aproximadamente 0,0001 M a aproximadamente 0,1 M.

5. La composicion de la reivindicacion 4, en la que la fuerza ionica: (a) se ajusta/se da por sales comunes, en la que las sales comunes se seleccionan del grupo que consiste en NaCl, KCl, MgCh, CaCh y CaSO4; o (b) se da por sales comunes, en la que las sales comunes estan compuestas por uno o mas cationes formadores de sal y uno o mas aniones formadores de sal, en la que los cationes formadores de sal se seleccionan del grupo que consiste en amonio, calcio, hierro, magnesio, potasio, piridinio, amonio cuaternario y sodio, en la que los aniones formadores de sal se seleccionan del grupo que consiste en acetato, carbonato, cloruro, citrato, cianuro, fluoruro, nitrato, nitrito y fosfato.

6. La composicion de la reivindicacion 1, en la que la composicion tiene un modulo de almacenamiento dentro del intervalo de aproximadamente 100 a aproximadamente 10000 Pa a 1 rad/s de frecuencia y 1 Pa de tension de oscilacion.

7. La composicion de la reivindicacion 1, en la que la composicion esta tamponada con hidroxido de sodio, hidroxido de potasio, hidroxido de calcio, carbonato de sodio, acetato de sodio, sulfuro de sodio o DMEM.

8. La composicion de la reivindicacion 1, en la que:

el peptido IEIK13 esta presente a una concentracion inferior al 3% y/o

la composicion tiene un pH dentro del intervalo de aproximadamente 3,0 a aproximadamente 4,0.

9. La composicion de la reivindicacion 8, cuya composicion es un gel que presenta un modulo de almacenamiento de mas de 500 Pa a 1 rad/s de frecuencia y 1 Pa de tension de oscilacion.

10. La composicion de una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, que comprende ademas un agente de ajuste de pH.