KR101114773B1 - 연골조직 수복용 조성물의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 연골조직 수복용 조성물의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명은 이를 위해 (a) 동결 건조된 피브리노겐을 아프로티닌 용액으로 녹이는 단계; (b) 동결 건조된 트롬빈을 안정화 용액으로 용해시키는 단계; (c) 농축된 콜라겐 용액과 트롬빈 및 안정화 용액을 혼합하는 단계; 및 듀얼 키트의 일측에는 상기 피브리노겐 용액(a)을 그리고 타측에는 상기 콜라겐이 함유된 용액(c)을 장착한 후 결손된 연골조직에 혼합하여 주입하는 단계;가 포함됨을 특징으로 구성된다.

상기와 같이 구성된 본 발명은 생체 적합물질인 콜라겐과 피브린 등을 혼합하여 결손된 연골조직에 이식 가능한 형태로 조직 수복을 도모하여 재생을 효과적으로 유도하므로 인간이나 동물에게 수술과 관련한 부담을 덜 주면서 보다 빠르고 효과적으로 연골 수복 및 재생을 유도할 수 있도록 한 것이며, 이로 인해 제품의 품질과 신뢰성을 대폭 향상시켜 소비자인 환자로 하여금 좋은 이미지를 심어줄 수 있도록 한 것이다.

콜라겐, 피브리노겐, 연골조직 수복용 조성물.

Description

연골조직 수복용 조성물의 제조방법{A cartilage repair constituent manufacturing method thereof}

본 발명은 연골조직 수복용 조성물의 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 생체 적합물질인 콜라겐과 피브린 등을 혼합하여 결손된 연골조직에 이식 가능한 형태로 조직 수복을 도모하여 재생을 효과적으로 유도하므로 인간이나 동물에게 수술과 관련한 부담을 덜 주면서 보다 빠르고 효과적으로 연골 수복 및 재생을 유도할 수 있도록 한 것이며, 이로 인해 제품의 품질과 신뢰성을 대폭 향상시켜 소비자인 환자로 하여금 좋은 이미지를 심어줄 수 있도록 한 것이다.

주지하다시피 관절 연골은 골단에 붙어 있는 극도로 미끄럽고, 밝은 빛을 띠는 물질로서 기능은 관절의 운동시 마찰 및 마모 저항을 최소화하여 유지하는 것이다. 관절 연골이 손상되면, 마찰이 증가하며 점차로 마모와 침식(erosion)을 나타내고, 임상적으로 통증과 기능장애를 일으키며, 시간이 지나면서 관절에 생긴 관절 연골손상은 점차로 골성 관절염으로 진행한다. 원인으로는 낙상이나 직접타격 또는 회전력과 같은 외상과 관절염, 골 괴사(Osteonecrosis), 염증성 관절염(inflammatory arthritis)또는 박리성 골연골염(Osteochondritis dissecans)등의 질병이 있으며, 증상으로는 통증, 부종과 잠김(catching) 등이 있다. 관절 연골손상을 치료하기 위하여 지난 수 십년 동안 관절 연골과 그의 생리학적인 재생능력에 대하여 수많은 연구가 이루어져 왔고, 많은 치료방법이 시도되었다.

하지만 지금까지 보고된 연구결과에 따르면, 관절 연골은 손상 후 재생이 되지 않기 때문에 관절 연골결손의 치료는 약물이나 물리치료 등을 이용한 대중적인 치료에 초점이 맞추어져 왔다. 지금까지 시행된 관절연골 결손의 치료를 살펴보면, 크게 비수술적 요법과 수술적 요법으로 나눌 수 있는데, 먼저 비수술적 요법으로서 냉온찜질과 NSAID등의 약물복용, 스테로이드의 관절내 주사 등의 방법이 있다. 이는 주로 증상의 완화를 목적으로 하고 있지만 병의 약화에 효과를 줄 수는 없었다. 수술적 요법으로는 debriment, microfracture, drilling/abrasion arthroplasty, autologous osteochondroal transplantation과 같은 reparative procedure와 연골세포 이식술과 연골관절치환술이 시행되고 있다.

최근 들어 수술적 요법으로 생체적합물질을 연골결손 부위에 적용하고자 하는 시도가 다수 있다.

생체 적합 물질이란, 인간의 몸속에 집어넣어도 거부반응이 일어나지 않는 물질이다. 이러한 생체 적합 물질은 손상된 조직 및 장기를 정상적인 조직으로 대체하거나 재생시키려는 적극적인 시도를 하고 있으며, 이에 따라 체내에 이식가능한 물질에 대한 관심이 높아지고 있다.

인간의 신체는 이물질이 들어가면 거부반응을 나타낸다. 이 때문에 기관의 일부를 다른 물질로 치환하는 일은 몹시 어렵다. 생체 적합물질은 신체와의 친화성을 높여 외과의학 진보에 커다란 공헌을 해왔다.

지금까지 진단 또는 치료를 위해 체내에 삽입되어 사용하는 의료기기의 제작에 이용되고 있는 생체적합물질은 크게 인공재료와 천연재료로 구분할 수 있다.

인공재료는 금속이나 무기물, 세라믹, 합성고분자 등이 있고, 이들이 체내에 삽입되어 주위조직과 접촉할 때 비록 이물반응을 일으키지 않는다고 하더라도 그 자체가 생명력을 가지고 있지 못하기 때문이라고 할 수 있다.

천연재료는 피브린, 콜라겐, 히알루론산, 키토산 등 여러 물질들이 연구개발되어 제품화되고 있다.

인체의 구조를 형성하고 생명기능을 유지하는 물질은 대부분의 경우 세포와 생물학적으로 생성된 고분자 형태로 존재한다. 다당류나 단백질은 그 대표적인 물질로서, 이들은 인체 내에 존재하는 물질이기 때문에 만일 인공적으로 이들을 사용할 때에 면역에 의한 거부반응만 없다면 가장 천연상태에 가까운 형태를 부여하는 것은 물론, 생장기능까지 갖춘 인체조직의 재생을 기대할 수 있다. 따라서 천연조직을 의료용 생체재료로 사용하여 무기물이나 합성고분자 등에는 결여되어 있는 생물학적 기능을 제공함으로써 인체내에 삽입된 무생물 생체재료와 주위 조직 사이에 생체적합성을 지니도록 환경을 제공하거나 더 나아가서 천연조직과 같은 생조직의 역할을 할 수 있도록 만드는 것이다.

특히, 피브린은 천연재료 접착제/지혈제로써 응용되어 산업화되어 있으며, 생체적합성 및 생분해성을 가진다. 피브린은 몇 주 내에 일반적으로 상처치유 과정에서 흡수되며, 염증반응, 면역반응, 조직괴사 혹은 섬유비대증 등의 부작용이 없는 것으로 알려져 있다.

또한, 피브린은 섬유아세포를 위한 천연지지체 등의 형태로 상처치료에 중요한 역할을 담당한다.

피브린 제품은 1970년대에 개념이 정립되어 1982년 유럽에서 최초의 제품이 상업화되어 현재까지 사용되고 있다. 최근 많은 연구에서 피브린을 생체 조직공학적 지지체로서 입증되고 있으며, 정형외과, 치과, 신경외과 등 다양한 분야에서 최적화를 위한 노력을 하고 있다.

콜라겐은 구조 단백질 성분인데, 진피(dermis), 건/힘줄(tendon/ligament), 혈관 등 연조직 그리고 뼈, 연골과 같은 경조직을 구성되어, 포유류의 경우, 전체 단백질의 1/3 정도를 차지하고 있다.

콜라겐의 형태는 20가지 이상으로 알려져 있으며, 피부나 건/힘줄, 뼈 등을 구성하는 콜라겐 type I 이 콜라겐 중 90% 정도를 차지하고 있다.

콜라겐의 구조는 3가닥으로 구성된 분자량(molecular weight) 300,000 달톤(Dalton) (한가닥 100,000 Dalton 정도) 의 단백질이고, 아미노산 중 가장 작은 단위(분자량이 가장 작은)인 Glycine 이 반복적으로( - G X Y - ; Glycine은 계속 반복적으로, X, Y 는 달라지는 구성) 연결되어 있다. 따라서, Glycine이 콜라겐 을 구성하는 아미노산에서 1/3 을 차지하고 있다. 그리고 특이적으로 콜라겐에 Hydroxyproline 이라는 아미노산이 약 10% 포함되어 있어, 이 아미노산을 콜라겐 정량분석방법에 활용하고 있다.

콜라겐을 현재 의료용으로 사용하고 있는 분야는 지혈제, 창상피복제, 인공혈관, 주름개선용 등에 사용되고 있으며, 지혈제의 경우엔 1974년 calf skin 에서 추출한 콜라겐 분말형태인 Aviten 이라는 제품이 최초로 개발되어 현재까지도 사용되고 있다.

콜라겐을 원료로 사용하는 방법은 크게 3가지로 구분할 수 있는데, 순수한 콜라겐을 분리하여 제품화하는 방법, 조직 자체를 조직 내의 세포를 제거하는 공정(acellualar / decellular process) 을 통하여 가공하는 방법, 그리고 콜라겐의 특성을 변화시켜 만드는 방법 등을 들 수 있다.

만드는 방법에 따라서 특장점이 있을 수 있겠지만, 순수한 콜라겐으로 만드는 제품의 경우에는 물성(인장강도, tensile strength) 가 약하여 봉합하는 수술에는 사용하기에 다소 어려움이 있으나, 제품의 안전성과 순도에 있어서는 우수한 제품이라고 할 수 있다. 콜라겐은 다른 고분자보다 인장강도나 찢김강도가 약하기 때문에 다른 물질(GAG 나 합성고분자(biocompatible synthetic polymer, PGA/PLA 등)과 같이 혼합하는 제품도 있다.

이러한, 콜라겐은 낮은 항원성 / 높은 생체적합성 및 생체흡수성 / 세포의 부착, 성장 및 분화 유도 / 혈액 응고 / 지혈 효과 / 다른 고분자와의 적합성 등의 장점을 가지고 있다.

하지만, 물성 특성 및 부피 유지하는 특성이 부족하고 순수한 콜라겐는 가격이 비싸다는 단점이 있다.

이에, 피브린 글루가 가지고 있는 부피/탄성/점착성의 적절한 물성과 자체가 가지고 있는 지혈 효과를 통하여 연골 수복 및 재생에 탁월한 효과를 발휘할 수 있는 생체 적합 물질이다.

또한, 관절연골은 무혈관성, 무신경성 조직이며 다른 중간엽계통의 조직들과는 달리 매우 제한된 자가치료능력을 가지고 있다. 따라서, 연골세포 배양에 사용되는 배지 구성 성분을 포함시켜 연골 조직 재생에 사용되는 영양분이 공급되는 환경을 조성하는데 목적이 있다.

한편, 상기와 같은 관절의 연골 조직은 한번 손상되게 되면 정상적으로는 생체 내에서 재생되지 않는 것으로 알려져 있다. 관절 연골이 손상될 경우, 심한 통증과 함께 일상 활동에 제한받게 되며 만성화된 경우 치명적인 퇴행성 관절염을 유발하게 되어 정상적인 생활이 어렵게 된다. 미국에서는 매년 500,000 건 이상의 관절성형술 및 전체 관절 대체술이 행해지고 있으며, 대략적으로 유럽에서도 비슷한 시술 건수가 진행되고 있다고 보고되고 있다.

따라서, 연골 결손을 위한 간단한 시술 방법이 요구되고 있으며, 콜라겐과 피브린 글루 등 생체적합물질을 활용/이식할 수 있는 새로운 방법이 필요하다. 이러한 연골 결손 치료 방법은 관절 손상의 초기 단계에서 가장 유용하며, 이 단계에서 수행됨으로써 인공 관절 수술을 필요로 하는 환자들의 수를 감소시킬 수 있다. 이러한 예방적인 치료방법에 의해서, 골관절염이 발생하는 환자수가 또한 감소할 것으로 판단된다.

그러나 종래에는 상기한 콜라겐과 피브린 글루 등의 생체 적합물을 활용하여 연골조직에 이식하는 조성물 및 쉽게 적용할 수 있는 방법이 없다는 커다란 문제점으로 지적되었다.

본 발명은 상기와 같은 종래 기술의 제반 문제점을 해소하기 위하여 안출한 것으로, 피브리노겐과 아프로티닌 용액, 트롬빈과 안정화 용액 그리고 콜라겐 용액에 의해 연골조직 수복용 조성물이 구비됨을 제1목적으로 한 것이고, 본 발명의 제2목적은 상기한 기술적 구성에 의해 생체 적합물질인 콜라겐과 피브린 등을 혼합하여 결손된 연골조직에 이식 가능한 형태로 조직 수복을 도모하여 재생을 효과적으로 유도하므로 인간이나 동물에게 수술과 관련한 부담을 덜 주면서 보다 빠르고 효과적으로 연골 수복 및 재생을 유도할 수 있도록 한 것이며, 제3목적은 연골 결손을 간단한 시술로 가능하도록 한 것이고, 제4목적은 연골 결손 치료가 초기에 가능하므로 관절수술을 필요로 하는 환자들의 수를 감소시킬 수 있도록 한 것이며, 제5목적은 상기한 예방적인 치료방법에 의해 골관절염이 발생하는 환자수가 감소하는 효과를 제공하게 되고, 제6목적은 이로 인해 제품의 품질과 신뢰성을 대폭 향상시켜 소비자인 환자로 하여금 좋은 이미지를 심어줄 수 있도록 한 연골조직 수복용 조성물의 제조방법을 제공한다.

이러한 목적 달성을 위하여 본 발명은 (a) 동결 건조된 피브리노겐을 아프로티닌 용액으로 녹이는 단계; (b) 동결 건조된 트롬빈을 안정화 용액으로 용해시키는 단계; (c) 농축된 콜라겐 용액과 트롬빈 및 안정화 용액을 혼합하는 단계; 및 듀얼 키트의 일측에는 상기 피브리노겐 용액(a)을 그리고 타측에는 상기 콜라겐이 함유된 용액(c)을 장착한 후 결손된 연골조직에 혼합하여 주입하는 단계;가 포함됨을 특징으로 하는 연골조직 수복용 조성물의 제조방법을 제공한다.

또한 본 발명은 상기한 각 단계의 방법을 거쳐 최종 연골조직 수복용 조성물을 제공한다.

상기에서 상세히 살펴본 바와 같이 본 발명은 피브리노겐과 아프로티닌 용액, 트롬빈과 안정화 용액 그리고 콜라겐 용액에 의해 연골조직 수복용 조성물이 구비되도록 한 것이다.

본 발명은 상기한 기술적 구성에 의해 생체 적합물질인 콜라겐과 피브린 등을 혼합하여 결손된 연골조직에 이식 가능한 형태로 조직 수복을 도모하여 재생을 효과적으로 유도하므로 인간이나 동물에게 수술과 관련한 부담을 덜 주면서 보다 빠르고 효과적으로 연골 수복 및 재생을 유도할 수 있도록 한 것이다.

그리고 본 발명은 연골 결손을 간단한 시술로 가능하도록 한 것이다.

아울러 본 발명은 연골 결손 치료가 초기에 가능하므로 관절수술을 필요로 하는 환자들의 수를 감소시킬 수 있도록 한 것이다.

더하여 본 발명은 상기한 예방적인 치료방법에 의해 골관절염이 발생하는 환자수가 감소하는 효과를 제공하게 된다.

본 발명은 상기한 효과로 인해 제품의 품질과 신뢰성을 대폭 향상시켜 소비 자인 환자로 하여금 좋은 이미지를 심어줄 수 있도록 한 매우 유용한 발명인 것이다.

이하에서는 이러한 효과 달성을 위한 본 발명의 바람직한 실시 예를 첨부된 도면에 따라 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명에 적용된 연골조직 수복용 조성물의 제조방법은 도 1 내지 도 5 에 도시된 바와 같이 구성되는 것이다.

하기에서 본 발명을 설명함에 있어, 관련된 공지 기능 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명은 생략할 것이다.

그리고 후술되는 용어들은 본 발명에서의 기능을 고려하여 설정된 용어들로서 이는 생산자의 의도 또는 관례에 따라 달라질 수 있으므로 그 정의는 본 명세서 전반에 걸친 내용을 토대로 내려져야 할 것이다.

먼저, 본 발명은 생체 적합 물질인 콜라겐과 피브리노겐을 이용한 고형물을 이용하는 것이고, 연골 재생의 환경을 조성하기 위한 영양 성분인 안정화 용액을 적용하는 제조 및 사용방법을 제공하는 것으로, 이하의 각 단계를 거쳐 연골조직 수복용 조성물을 제조하게 된다.

즉, (a) 동결 건조된 피브리노겐을 아프로티닌 용액으로 녹이는 단계를 거친 다.

(b) 이후 동결 건조된 트롬빈을 안정화 용액으로 용해시키는 단계를 거치게 된다.

(c) 그리고 농축된 콜라겐 용액과 트롬빈 및 안정화 용액을 혼합하는 단계를 거치게 된다.

이어서 듀얼 키트의 일측에는 상기 피브리노겐 용액(a)을 그리고 타측에는 상기 콜라겐이 함유된 용액(c)을 장착한 후 결손된 연골조직에 혼합하여 주입하는 단계;를 거쳐 연골조직 수복용 조성물을 제조하게 된다.

이때 본 발명에 적용된 상기 피브리노겐은 35～55 mg/mL, 아프로티닌 용액은 1,500 KIU/mL, 트롬빈은 29.41 IU/mL, 안정화 용액은 0.65 mg/mL, 콜라겐 용액은 13.23 mg/mL이 포함됨을 특징으로 한다.

그리고 본 발명에 적용된 상기 안정화 용액에는 염화칼슘 0.26 mg/mL이 포함된다.

또한 본 발명에 적용된 상기 안정화 용액은 연골세포 배양에 사용되는 배지인 DMEM 배지에 염화칼슘을 보강한 안정화 용액을 제조하되, 상기 DMEM 배지는 염성분, 아미노산, 비타민이 포함된다.

아울러 본 발명에 적용된 상기 안정화 용액의 염화칼슘의 농도는 최종 사용시에 0.1～0.5 mg/mL임을 특징으로 한다.

더하여 본 발명에 적용된 상기 연골조직 수복용 조성물에 사용되는 염화칼슘의 최종 농도는 2.78～3.12 mg/mL 임을 특징으로 한다.

또한 본 발명에 적용된 상기 콜라겐은 무균적으로 콜라겐을 준비하되, 5 mg/mL 이하의 콜라겐을 0.22 um 필터를 이용하여 멸균처리하고 무균조작을 통하여 콜라겐을 농축함을 특징으로 한다.

마지막으로 본 발명에 적용된 상기 콜라겐의 농축은 5～100 mg/mL 농도임을 특징으로 구성된다.

상기 본 발명에 적용된 안정화 용액 제조를 보다 상세히 설명하면 다음과 같다.

- 연골세포 배양에 사용되는 배지인 DMEM 배지에 염화칼슘을 보강한 안정화 용액을 제조한다. DMEM 배지는 염성분, 아미노산, 비타민 등이 포함된 성분이다. 안정화 용액은 염화칼슘을 보강한 용액으로, 농도는 0.2 - 6 mg/mL 이하로 한다.

- 콜라겐과 안정화 용액의 염화칼슘의 농도는 최종사용에서 0.1 - 0.5 mg/mL 으로 한다.

- 안정화 용액의 염화칼슘 농도는 겔화정도의 시간 및 겔의 최대 응력의 범위로서 결정하였으며, 겔화 시간은 3분 내에 완료되는 범위와 겔의 최대 응력이 10 N 이상을 보이는 농도로서 결정하였다.

- 안정화 용액의 최소 범위는 연골세포 배양 조건에 사용되는 최소농도이며, 0.5 mg/mL 은 안정화를 위해 확인된 최대 범위이다. 상용되고 있는 피브린 글루 제품에 사용되는 염화칼슘의 최종농도는 2.78 - 3.12 mg/mL 로 세포에 영향을 줄 수 있는 농도이다.

또한 본 발명에 적용된 농축 콜라겐 제조를 보다 상세히 설명하면 다음과 같 다.

사용되는 콜라겐은 바람직하게, 고농도의 농축된 콜라겐을 이용한다.

무균적으로 콜라겐을 준비하기 위해서, 5 mg/mL 이하의 콜라겐을 0.22 um 필터를 이용하여 멸균처리하고 무균조작을 통하여 콜라겐을 농축한다.

필터를 위한 농도 조건은 콜라겐이 300,000 dalton의 분자량을 가지고 있으며, 콜라겐 분자의 길이가 약 300 nm 이므로, 5 mg/mL 이상의 농도에서는 필터링이 어렵다.

콜라겐의 농축은 5 - 100 mg/mL 농도 범위이다.

콜라겐의 농축은 필터링이 가능한 5 mg/mL 로부터 용액으로서 측정가능하고 다룰 수 있는(용해 및 측정 가능한) 농도인 100 mg/mL 까지 진행가능하다.

콜라겐을 농축하는 방법은 Dialysis나 Diafiltration 또는 pH와 온도 조건을 이용하여 원심분리 등을 사용한다. 농축된 콜라겐은 프리필드 실린지에 담아 준비한다.

상기와 같은 콜라겐과 피브리노겐 및 안정화 용액 혼합은 도 2 와 같다.

- 피브린 글루 제품 내 포함된, 동결건조된 피브리노겐을 아프로티닌 용액 (2 cc) 에 녹인 후, 실린지에 담아둔다.

- 동결건조된 트롬빈에 안정화 용액 (2 cc)을 용해시킨 후, 0.4 cc 실린지에 담아둔다.

- 농축된 콜라겐(3%, 3 cc) 용액과 트롬빈 용액을 혼합한 후, 2 cc 실린지에 담아둔다.

- 준비된 피브리노겐/아프로티닌 용액과 콜라겐/트롬빈 용액을 듀얼키트(Dual kit)에 장착하여 연골 결손 부위에 적용한다.

- 본 조성에 사용되는 피브리노겐 (피브린 글루) 제품은 국가별로 다양하게 사용되고 있으며, 국내에서 사용되는 제품은 다음 표와 같다.

표

또한, Hemassel(Canada), Quixil(Israel), Bolheal(Japan), Biocol(France) Viguard(USA) 등의 제품이 국가별로 사용가능하다.

한편 본 발명은 상기의 구성부를 적용함에 있어 다양하게 변형될 수 있고 여러 가지 형태를 취할 수 있다.

그리고 본 발명은 상기의 상세한 설명에서 언급되는 특별한 형태로 한정되는 것이 아닌 것으로 이해되어야 하며, 오히려 첨부된 청구범위에 의해 정의되는 본 발명의 정신과 범위 내에 있는 모든 변형물과 균등물 및 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

상기와 같이 구성된 본 발명 연골조직 수복용 조성물의 제조방법의 실시예를 설명하면 다음과 같다.

우선, 본 발명은 생체 적합물인 콜라겐과 피브린 등을 혼합하여 연골조직을 이식 가능한 형태로 조직 수복을 도모하여 재생을 효과적으로 유도하므로 인간이나 동물에게 수술과 관련한 부담을 덜 주면서 보다 빠르고 효과적으로 연골 수복 및 재생을 유도할 수 있도록 한 것으로, 이하에서 실시 예를 들어 설명하면 다음과 같다.

[실시예 1]

콜라겐 및 피브린 글루 제품을 이용하여 동물의 연골 결손 부위에 적용하는 방법(목적:돼지 연골 결손 부위에 콜라겐과 피브린 글루 제품의 적용 가능성 확인)

- 돼지 다리를 거치대에 고정한 후, 드릴을 이용하여 약 3 cm2 (2 X 1.5 cm2)의 연골을 결손시킨다.

- 테라필(농축콜라겐)과 그린플라스트(피브린 글루) 제품을 이용하여 연골 결손부위를 채운다. 방법은 다음과 같다.

1) 그린플라스트를 개봉하여 피브리노겐을 아프로티닌 용액에 주입하여 용해시킨다.

2) 구성품 중, 동결건조되어 있는 트롬빈을 칼슘용액에 주입하여 용해시킨 다.

3) 용해된 트롬빈/칼슘 용액, 0.1 cc를 테라필, 1 cc와 어댑터를 이용하여 혼합한다.

4) 각각 혼합된 1)과 3) 은 Dual 장치에 장착하여 연골결손 부위에 적용한다.

5) 적용 후, 15 분간 관찰한다.

(결과: 연골 결손 부위에 테라필/피브린 글루 제품을 적용한 후, 10 분내에 고형물이 채워져 시술자가 선호할 정도의 물성을 보였다. 도면. 3 참조)

[실시예 2]

콜라겐과 피브린 글루를 토끼 연골 결손 부위에 적용한 실험(목적: 콜라겐과 피브린 글루 제품을 사용하여 토끼 모델을 이용하여 연골재생여부를 확인한다.)

- NZW rabbit의 patellar groove 부위에 4 mm 연골 결손을 유발하여 콜라겐과 피브린 글루를 적용하여 4주 후에 육안 및 조직병리 관찰 (도면 4 과 5)하였다. 콜라겐은 세원셀론텍의 테라필을 사용하였으며, 피브린 글루 제품은 박스터사의 티씰을 사용하였다.

- 조직병리는 Hematoxylin-eosin, Safranin-O, Alcian-blue, Masson's trichrome, Colllagen type I / II 등의 염색 방법을 사용하였다.

(결과: 연골결손부위에 콜라겐/피브린 글루 제품 적용한 육안 관찰 결과, 결손부위 조직이 수복된 것을 확인할 수 있었으며, 조직염색 결과, 연골 조직으로의 재생되고 있음을 확인할 수 있었다.)

한편, 본 발명 안정화 용액의 염화칼슘 농도에 따른 물성 비교는,

안정화 용액의 염화칼슘의 농도에 따른 겔화 시간 및 물성 측정

1)염화칼슘의 농도

2) 적용방법

- 콜라겐(3%, 3 cc) 용액과 피브린 글루(그린플라스트) 제품을 준비한다.

- 그린플라스트에 포함된 피브리노겐과 아프로티닌 (1 cc)을 혼합한다.

- 트롬빈과 안정화 용액 (1 cc) 을 혼합한다.

- 콜라겐 용액 (3 cc) 과 트롬빈/안정화 용액 (0.4 cc)을 혼합한다.

- 피브리노겐 용액과 콜라겐이 혼합된 용액을 각각 1 cc씩 Dual 장치에 장착하여 원기둥 모양 (Ø 12 X 15 mm) 의 주형에 담아 고형물을 제작한다.

3) 염화칼슘 농도 / 시간에 따른 겔화 정도

* : 액상 포함

** : 겔화 진행

*** : 겔화 완료

4) 염화칼슘 농도에 따른 물성 측정

- 제작된 고형물은 물성측정기 (Rheo meter, CR-500DX)를 이용하여 물성측정한다. 조건은 다음과 같다.

-측정항목: 최대응력, 겔강도, 인장강도

-진입거리: 샘플높이의 50%, 7.5 mm

-스피드 : 50 mm/min, 최대응력 : 10 kg

-아답터 : No. 1, Ø 20 mm

또한 연골 결손 부위에 콜라겐과 피브린 글루 및 안정화 용액 혼합하는 방법 및 물성 / 분해성 확인 실험(목적: 연골은 한번 손상되면 영양 공급이 차단되는 상태이다. 연골세포 배양에 사용되는 DMEM 성분을 첨가하여 연골 수복에 도움을 주며, 콜라겐이 포함된 제품은 오랜 시간 형태를 유지시켜 준다.)

1) 연골세포 배양에 사용되는 배지인 DMEM 배지에 염화칼슘을 보강한 안정화 용액을 제조한다. DMEM 배지는 염성분, 아미노산, 비타민 등이 포함된 성분이다. 안정화 용액은 염화칼슘을 보강한 용액으로, 농도는 0.2 - 6 mg/mL 으로 한다.

2) 콜라겐과 안정화 용액의 염화칼슘의 농도는 최종사용에서 0.1 - 0.5 mg/mL 으로 한다.

3) 본 실험은 다음과 같이 진행되었다.

- 콜라겐(3%, 3 cc) 용액과 피브린 글루(그린플라스트) 제품을 준비한다.

- 그린플라스트에 포함된 피브리노겐과 아프로티닌 (1 cc)을 혼합한다.

- 트롬빈과 안정화 용액 (1 cc) 을 혼합한다.

- 콜라겐 용액 (3 cc) 과 트롬빈/안정화 용액 (0.4 cc)을 혼합한다.

- 콜라겐이 포함되지 않은 피브린 글루 제품을 대조군을 사용하였다.

- 피브리노겐 용액과 콜라겐이 혼합된 용액을 각각 1 cc씩 Dual 장치에 장착하여 원기둥 모양 (Ø12 X 15 mm) 의 주형에 담아 고형물을 제작한다. 칼슘용액의 최종농도는 0.26 mg/mL 이다.

4) 물성 측정 실험

- 제작된 고형물은 물성측정기 (Rheo meter, CR-500DX)를 이용하여 물성측정한다. 조건은 다음과 같다.

-측정항목: 최대응력, 겔강도, 인장강도

-진입거리: 샘플높이의 50%, 7.5 mm

-스피드 : 50 mm/min, 최대응력 : 10 kg

-아답터 : No. 1, Ø 20 mm

- 결과는 다음과 같다. 제작된 콜라겐이 포한된 고형물은 불투명의 연골과 유사한 빛깔을 띄고 있으며 피브린 글루 제품은 반투명한 고형물이 만들어 졌다.

5) 분해성 확인 실험

- 제작된 고형물을 배지(DMEM)에 포함시켜, 37도 조건에서 1 달간 관찰한다.

- 배지교환은 1-2일 단위로 진행한다.

- 콜라겐이 포함되지 않은 피브린 글루는 2- 3 주일 내에 분해되지만, 콜라겐이 포함된 고형물은 1달 이상 유지되는 것을 확인할 수 있었다.

또한 콜라겐/피브리노겐 조성물에서의 연골세포의 세포생존률 실험 (도면 8 참조)

가. 연골세포가 포함된 콜라겐/피브리노겐 조성물 제조

1) 피브린 글루 제품 (티씰) 를 개봉하여 피브리노겐을 아프로티닌 용액(2 cc)으로 용해시킨다.

2) 구성품 중, 동결건조되어 있는 트롬빈을 안정화용액으로 용해시킨다.

3) 용해된 트롬빈/안정화 용액 (0.4 cc) 을 콜라겐(테라필, 3 cc)와 어댑터를 이용하여 혼합한다.

4) 혼합된 콜라겐/트롬빈/안정화 용액을 실린지에 1.5 cc 담아서 준비된 연 골세포, 0.5 cc (6.0 X 10^6 cells/0.5 cc)와 혼합한다. 칼슘용액의 최종농도는 0.24 mg/mL 이다.

5) 각각 혼합된 1)과 4)를 Dual 적용 장치에 장착하여 100 mm 배양접시에 담는다.

나. 조성물 내에서 연골세포의 생존률 확인 실험

1) 형성된 겔은 Blade로 조심스럽게 떼어 내어 35 mm 배양 접시로 옮기고, DMEM 배지 3 mL를 포함시켜, 37도의 온도 조건으로 CO2 배양 진행한다.

2) 배지는 1일 2회 배지 교환 진행하고, 3 일간 배양한다. 배지조성은 DMEM/F12, 1% gentamycin, 5 mg/mL ITS+Premix, 50 ug/mL ascorbic acid, 1 mM sodium pyruvate, 100 ng/mL BMP-2 이다.

3) 분석방법은 Calcein-AM 법을 사용하였다.

Calcein-AM 분석

- 방법: Live/Dead cell viability working solution을 제조한다. 조성은 10 mL PBS, 5uL 4mM calcein-AM, 20 uL 2 mM EthD-1을 혼합한다.

배양 중인 조성물에서 배지를 제거하고 3 mL Live/Dead cell viability working solution을 넣어 1시간 동안 상온에서 배양한 후, 유리 슬라이드로 옮겨 형광 현미경으로 관찰한다.

살아있는 세포는 초록빛을, 죽은 세포는 붉은 빛으로 염색되어 확인한다.

- 결과 : 가. Calcein-AM 분석방법을 통한 연골세포의 생존률 형광현미경 사진 (좌: 최초 (40X), 우: 3일 배양(40X))

조성물 내에서 72시간 후, 관찰 결과, 90% 이상 생존하는 것으로 판단된다.

본 발명 연골조직 수복용 조성물의 제조방법의 기술적 사상은 실제로 동일결과를 반복 실시 가능한 것으로, 특히 이와 같은 본원발명을 실시함으로써 기술발전을 촉진하여 산업발전에 이바지할 수 있어 보호할 가치가 충분히 있다.

도 1 은 본 발명에 적용된 연골조직 수복용 조성물의 제조방법을 나타낸 구

성도.

도 2 는 본 발명에 적용된 연골조직 수복용 조성물을 듀얼 키트에 적용한 사

용하는 사진.

도 3 은 본 발명에 적용된 연골조직 수복용 조성물을 동물(돼지) 연골 결손

부위에 적용한 사진.

도 4 는 본 발명에 적용된 연골조직 수복용 조성물을 동물(토끼) 연골 결손

부위에 적용한 실험의 육안 관찰 결과 사진.

도 5 는 본 발명에 적용된 연골조직 수복용 조성물을 동물(토끼) 연골 결손

부위에 적용한 실험의 조직 병리 관찰 결과 사진.

Claims (9)

1. (a) 동결 건조된 피브리노겐을 아프로티닌 용액으로 녹이는 단계;

   (b) 동결 건조된 트롬빈을 안정화 용액으로 용해시키는 단계;

   (c) 농축된 콜라겐 용액과 트롬빈 및 안정화 용액을 혼합하는 단계; 및

   듀얼 키트의 일측에는 상기 피브리노겐 용액(a)을 그리고 타측에는 상기 콜라겐이 함유된 용액(c)을 장착한 후 결손된 연골조직에 혼합하여 주입하는 단계;가 포함됨을 특징으로 하는 연골조직 수복용 조성물의 제조방법.
2. 청구항 1 에 있어서,

   상기 피브리노겐은 35～55 mg/mL, 아프로티닌 용액은 1,500 KIU/mL, 트롬빈은 29.41 IU/mL, 안정화 용액은 0.65 mg/mL, 콜라겐 용액은 13.23 mg/mL이 포함됨을 특징으로 하는 연골조직 수복용 조성물의 제조방법.
3. 청구항 2 에 있어서,

   상기 안정화 용액에는 염화칼슘 0.26 mg/mL이 더 포함됨을 특징으로 하는 연골조직 수복용 조성물의 제조방법.
4. 청구항 1 에 있어서,

   상기 안정화 용액은,

   연골세포 배양에 사용되는 배지인 DMEM 배지에 염화칼슘을 보강한 안정화 용액을 제조하되, 상기 DMEM 배지는 염성분, 아미노산, 비타민이 포함됨을 특징으로 하는 연골조직 수복용 조성물의 제조방법.
5. 청구항 1 에 있어서,

   상기 안정화 용액의 염화칼슘의 농도는 최종 사용시에 0.1～0.5 mg/mL임을 특징으로 하는 연골조직 수복용 조성물의 제조방법.
6. 청구항 1 에 있어서,

   상기 연골조직 수복용 조성물에 사용되는 염화칼슘의 최종 농도는 2.78～3.12 mg/mL 임을 특징으로 하는 연골조직 수복용 조성물의 제조방법.
7. 청구항 1 에 있어서,

   상기 콜라겐은,

   무균적으로 콜라겐을 준비하되, 5 mg/mL 이하의 콜라겐을 0.22 um 필터를 이용하여 멸균처리하고 무균조작을 통하여 콜라겐을 농축함을 특징으로 하는 연골조직 수복용 조성물의 제조방법.
8. 청구항 7 에 있어서,

   상기 콜라겐의 농축은 5～100 mg/mL 농도임을 특징으로 하는 연골조직 수복용 조성물의 제조방법.
9. 삭제

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