BR112012009558B1 - método de produção de composição para a reparação de tecidos cartilaginosos e composição para a reparação de tecidos cartilaginosos - Google Patents

Abstract

MÉTODO DE PRODUÇÃO DE COMPOSIÇÃO PARA A REPARAÇÃO DE TECIDOS CARTILAGINOSOS trata-se a presente invenção de uma composição para a reparação de tecidos cartilaginosos e seu método de5 preparação. Para este fim, a presente invenção compreende as seguintes etapas:(a) dissolver o fibrinogênio seco por congelamento em uma solução de aprotinina; (b) dissolver a trombina seca por congelamento em uma solução estabilizante; (c)misturar uma solução de colágeno enriquecido com trombina e a solução estabilizante e; instalar a solução de fibrinogênio (a) em um lado de um kit duplo e 10 a solução (c) contendo a solução de colágeno no outro lado e, em seguida, misturar a solução (a) e a solução (c) e injetar em um tecido cartilaginoso danificado. Na presente invenção, que é constituída conforme descrição acima, os biomateriais, como, por exemplo, colágeno e fibrina, são misturados de modo a permitir que o tecido cartilaginoso danificado seja reparado a um estado que 15 permita o transplante sobre o tecido e a regeneração eficiente seja induzida, tornando, assim, possível reduzir o estresse relacionado à cirurgia em pessoas eanimais, enquanto induz a reparação e a regeneração da cartilagem de forma eficiente e relativamente rápida e, como consequência, possibilita melhorar substancialmente a (...).

Description

Campo da Invenção

[001] Trata-se a presente invenção de uma composição para a reparação de tecidos cartilaginosos e seu método de preparação e, de forma mais específica, de biomateriais, como, por exemplo, colágeno e fibrina, que são misturados de modo a permitir que o tecido cartilaginoso danificado seja reparado a um estado que permita o transplante sobre o tecido e a regeneração eficiente seja induzida, tornando, assim, possível reduzir o estresse relacionado à cirurgia em pessoas e animais, enquanto induz a reparação e a regeneração da cartilagem de forma eficiente e relativamente rápida e, como consequência, possibilita melhorar substancialmente a qualidade e a confiabilidade do produto, bem como dar uma boa impressão para os pacientes.

Fundamentos da Invenção Descrição da Técnica Relacionada

[002] A cartilagem articular encontrada em muitas superfícies articulares é um material extremamente escorregadio e brilhante, que funciona para reduzir o atrito e a resistência ao desgaste das articulações durante as ações das articulações. A fricção da cartilagem articular é aumentada quando a cartilagem articular está danificada, e as cartilagens articulares tornam-se desgastadas e corroídas, causando dor e distúrbio funcional, sendo que os danos na cartilagem na articulação tornam-se osteoartrite. As causas da lesão da cartilagem são traumas, como, por exemplo, queda, batida direta ou força de rotação, ou doenças, como, por exemplo, artrite, osteonecrose, artrite inflamatória ou osteocondrite dissecante, e os sintomas são dor, edema e travamento. Muitos estudos para a regeneração fisiológica da cartilagem articular são realizados há dezenas de anos para tratar danos em cartilagem articular e vários tratamentos têm sido utilizados.

[003] No entanto, de acordo com os relatórios, até agora, um tratamento comum, como, por exemplo, uma terapia física ou um tratamento com medicamentos para o tratamento de danos na cartilagem articular é utilizado porque os tecidos da cartilagem articular não podem ser regenerados. Tratamentos cirúrgicos e não cirúrgicos são utilizados. Compressas quentes e frias e medicamentos, como, por exemplo, anti- inflamatórios não esteroides (AINEs) e injeção intra-articular de esteroides, são exemplos de tratamento não cirúrgico que apenas suaviza os sintomas e não atenua a doença. Procedimentos reparadores, como, por exemplo, desbridamento, microfratura, artroplastia por perfuração/abrasão, transplante osteocondral autólogo, implante de condrócitos e substituição da cartilagem articular são exemplos de tratamentos cirúrgicos.

[004] Recentemente, foram feitas diversas tentativas de um tratamento cirúrgico, no qual biomateriais são aplicados sobre a região do defeito da cartilagem.

[005] Biomateriais são compatíveis com o corpo humano e não mostram qualquer rejeição. Estes biomateriais podem substituir ou regenerar órgãos e tecidos danificados em tecidos normais e órgãos normais. Portanto, são aumentadas as atenções sobre os biomateriais que podem ser utilizados para substituir ou regenerar órgãos e tecidos danificados.

[006] O corpo humano rejeita material estranho em seu corpo. Portanto, a substituição de uma parte de um órgão humano por outros materiais é muito difícil. Os biomateriais contribuem para o progresso da cirurgia médica porque os biomateriais têm afinidade biológica com o corpo humano.

[007] Existem dois tipos de biomateriais, biomateriais sintéticos e biomateriais naturais, que podem ser utilizados para fabricar dispositivos médicos de implante, para diagnóstico e tratamento.

[008] Metais, materiais inorgânicos, cerâmicas, polímeros sintéticos pertencem à classe de biomateriais sintéticos que não apresentam rejeição, mas não têm vitalidade.

[009] Os biomateriais naturais, como, por exemplo, fibrina, colágeno, ácido hialurônico e quitosana, são desenvolvidos e comercializados.

[010] Os materiais que formam o corpo humano e sustentam a vida são polímeros biológicos e células. Os polissacarídeos e proteínas encontrados no corpo humano são exemplos representativos. Se eles não têm rejeição imunológica, eles podem ser um estado semelhante a um estado natural e espera-se a regeneração de órgãos humanos que têm a função de crescimento. Tecidos naturais podem ser utilizados como um biomaterial médico que pode dar funções biológicas a poliméricos sintéticos inorgânicos e materiais. A biocompatibilidade entre os tecidos circundantes e biomateriais inorgânicos transplantados no corpo humano pode ser estabelecida pelos tecidos naturais e, além disso, os tecidos naturais podem dar funções biológicas a biomateriais inorgânicos.

[011] A fibrina biocompatível e biodegradável é utilizada como um adesivo natural e um agente anti-hemorrágico. A fibrina é absorvida em várias semanas durante a cicatrização de feridas. Tem sido relatado que a fibrina não apresenta efeitos secundários, como, por exemplo, inflamação, resposta imune, necrose do parênquima e hipertrofia das fibras.

[012] A fibrina, pelo fato de ter uma forma de suporte natural para célula fibroblasto, tem um papel importante na cicatrização de feridas.

[013] A concepção de produtos de fibrina foi estabelecida em 1970 e o primeiro produto industrial de fibrina foi vendido para a Europa em 1982 e é vendido até os dias de hoje. Estudos recentes provaram que a fibrina pode ser utilizada como um suporte para a engenharia de tecidos, e a otimização é realizada em vários campos da medicina, como, por exemplo, ortopedia, odontologia e neurocirurgia.

[014] O colágeno é um grupo de proteínas e é encontrado na derme, em tendão/ligamento, vasos sanguíneos, ossos e cartilagens. Um terço da proteína total nos mamíferos é colágeno.

[015] Mais de 20 tipos diferentes de colágeno são relatados, entre os quais a quantidade de colágeno do tipo I, que é encontrado na pele, tendão/ligamento e osso, é de aproximadamente 90% de colágeno total.

[016] O colágeno é composto de uma tripla hélice, cujo peso molecular é 300.000 Dalton (100.000 Dalton de cada hélice). O menor aminoácido glicina é encontrado em cada terceira posição (-GXY; X e Y são quaisquer aminoácidos) da molécula do colágeno. Assim, o total de glicina no colágeno é um terço do total dos aminoácidos. O colágeno tem hidroxiprolina e o teor de hidroxiprolina é de 10% do total de aminoácidos. A hidroxiprolina é utilizada para a análise quantitativa de colágeno.

[017] O colágeno é utilizado em vários campos da medicina, como, por exemplo, um estíptico, um curativo para feridas, vascular artificial e agente de melhoria de enrugamento. O primeiro colágeno estíptico Avitene, que tem a forma de pó extraído da pele de bezerro, foi desenvolvido em 1974 e é utilizado até agora.

[018] Existem três formas de utilização de colágeno como uma matéria-prima. São utilizados colágeno puro, colágeno processado, que é processado através de um processo acelular/decelular do tecido, e colágeno alterado.

[019] O colágeno puro tem baixa resistência à tensão, portanto, não é recomendado para ser utilizado para sutura, apesar da sua alta estabilidade e pureza. O colágeno tem baixa resistência à tensão e à ruptura do que outros polímeros, de modo que outros materiais como, por exemplo, glicosaminoglicanos (GAG) ou polímeros sintéticos biocompatíveis (poliácido glicólico - PGA, poliácido láctico - PLA) são adicionados ao colágeno para melhorar as suas resistências.

[020] O colágeno tem muitas vantagens, como, por exemplo, baixa antigenicidade, alta biocompatibilidade e bioabsorbilidade, adesão de células, crescimento celular, indução de diferenciação celular, coagulação sanguínea, efeito estíptico e biocompatibilidade com outros polímeros.

[021] No entanto, propriedades físicas e características para manutenção de volume são inferiores e o colágeno puro é caro.

[022] A fibrina tem propriedades moderadas em termos de volume, elasticidade e adesividade, e também tem efeito estíptico. Portanto, a fibrina é um biomaterial eficaz para reparação e regeneração de tecidos cartilaginosos.

[023] A cartilagem articular é avascular e tecido não nervoso, e tem capacidade de autocicatrização muito limitada, ao contrário do outro tecido mesenquimal. Portanto, um dos objetivos da presente invenção consiste em fornecer nutrientes que sejam utilizados para a regeneração do tecido cartilaginoso, por meio da adição de componentes de meio para o cultivo de condrócitos.

[024] Quando o tecido de cartilagem de uma articulação está danificado, ele não pode ser regenerado normalmente no corpo. O paciente fica submetido à vida diária limitada com dor e quando se torna crônica induz a osteoartrite fatal, que torna a vida normal do paciente impossível. Existem mais de 500.000 casos de artroplastia e de cirurgia de substituição de toda articulação nos Estados Unidos e na Europa, respectivamente.

[025] Deste modo, é necessário que haja um procedimento simples para o tratamento da região de defeito na cartilagem por meio do uso ou do transplante de biomateriais, como, por exemplo, colágeno e fibrina. Estes métodos de tratamento da região de defeito na cartilagem são muito eficazes na fase inicial da lesão da cartilagem. E quando tal tratamento é realizado na fase inicial da lesão da cartilagem, o número de pacientes que necessitam de cirurgia de substituição de joelho pode ser diminuído. Por meio deste tratamento preventivo, o número de osteoartrite também será diminuído.

[026] No passado, não foi feita uma descrição de uma composição para a reparação de tecidos cartilaginosos por meio do uso de biomateriais, como, por exemplo, colágeno e cola de fibrina, nem de métodos para aplicá-los para tratamento.

Sumário da Invenção

[027] A presente invenção foi desenvolvida para resolver os problemas da técnica anterior.

[028] O primeiro objetivo da presente invenção consiste em fornecer uma composição para a reparação cartilaginosa composta de solução de aprotinina e fibrinogênio, trombina e uma solução estabilizante, e uma solução de colágeno.

[029] O segundo objetivo da presente invenção consiste na regeneração eficaz do tecido cartilaginoso danificado por uma forma transplantável composta de biomateriais, como, por exemplo, colágeno e fibrinogênio. Este tratamento reduz o estresse relacionado à cirurgia e induz a regeneração e a recuperação da região de defeito da cartilagem.

[030] O terceiro objetivo da presente invenção consiste no fato deste método simplificar o tratamento da região de defeito da cartilagem.

[031] O quarto objetivo da presente invenção consiste na redução do número de pacientes que necessitam de cirurgia de articulações, por meio do tratamento precoce da região de defeito da cartilagem.

[032] O quinto objetivo da presente invenção consiste na redução do número de pacientes que necessitam de cirurgia de articulações, por meio do tratamento preventivo.

[033] O sexto objetivo da presente invenção consiste em oferecer uma composição para a reparação de tecidos cartilaginosos e método de produção da dita composição, de tal modo que a melhoria da qualidade e a confiabilidade do produto proporcionam uma boa imagem aos pacientes.

[034] Para a realização dos objetivos, a presente invenção oferece um método de produção de uma composição para a reparação de tecidos cartilaginosos, que compreende as seguintes etapas: (a) dissolver o fibrinogênio seco por congelamento em uma solução de aprotinina; (b) dissolver a trombina seca por congelamento em uma solução estabilizante; (c) misturar uma solução de colágeno enriquecido com trombina e a solução estabilizante e; instalar a solução de fibrinogênio (a) em um lado de um kit duplo e a solução (c) contendo a solução de colágeno no outro lado e, em seguida, misturar a solução (a) e a solução (c) e injetar em um tecido cartilaginoso danificado.

[035] A presente invenção também oferece a composição para a reparação de tecidos cartilaginosos preparada pelo método acima.

[036] Conforme descrição acima, a presente invenção oferece uma composição para a reparação cartilaginosa composta de fibrinogênio e solução de aprotinina, trombina e uma solução estabilizante, e uma solução de colágeno.

[037] A presente invenção oferece regeneração eficaz de tecidos cartilaginosos danificados por meio de uma forma transplantável composta de biomateriais, como, por exemplo, colágeno e fibrinogênio, e este método reduz o estresse relacionado à cirurgia, induz a regeneração de forma rápida e eficaz e a recuperação da região de defeito da cartilagem.

[038] A presente invenção oferece um método simples para o tratamento da região de defeito da cartilagem.

[039] A presente invenção oferece uma redução no número de pacientes que necessitam de cirurgia de articulações, ao oferecer tratamento precoce da região de defeito da cartilagem.

[040] Além disso, a presente invenção oferece uma redução no número de pacientes que necessitam de cirurgia de articulações, ao oferecer um tratamento preventivo.

[041] A presente invenção oferece melhoria da qualidade e a confiabilidade do produto, que proporcionam uma boa imagem aos pacientes.

Breve Descrição dos Desenhos

[042] A Figura 1 mostra um método de produção de uma composição para a reparação de tecidos cartilaginosos, de acordo com a presente invenção.

[043] A Figura 2 mostra uma fotografia da aplicação do kit duplo contendo a composição para a reparação de tecidos cartilaginosos, de acordo com a presente invenção.

[044] A Figura 3 mostra uma fotografia da aplicação da composição para a reparação de tecidos cartilaginosos, de acordo com a presente invenção, em uma região de defeito da cartilagem de um animal (porco).

[045] A Figura 4 mostra fotografias que mostram observações visuais de resultados experimentais de uma aplicação da composição para a reparação de tecidos cartilaginosos, de acordo com a presente invenção, em uma região de defeito da cartilagem de um animal (coelho).

[046] A Figura 5 mostra fotografias que mostram observações histopatológicas de resultados experimentais de uma aplicação da composição para a reparação de tecidos cartilaginosos, de acordo com a presente invenção, em uma região de defeito da cartilagem de um animal (coelho). Descrição Detalhada da Invenção

[047] A seguir, modalidades da presente invenção serão descritas de forma detalhada, em relação às Figuras em anexo.

[048] Uma composição para a reparação de tecidos cartilaginosos e um método de fazer a composição, de acordo com a presente invenção, e as aplicações das mesmas, são mostrados nas Figuras 1-5.

[049] Quando uma explicação detalhada relativa à técnica conhecida e a configuração técnica confundir desnecessariamente a essência da presente invenção, tal explicação detalhada será omitida.

[050] As definições da presente invenção deverão ser interpretadas a partir do conteúdo da presente invenção, porque os termos podem ser interpretados pela intenção do produtor ou personalizados.

[051] Em primeiro lugar, a presente invenção oferece um material sólido, por meio do uso de biomateriais, como, por exemplo, colágeno e fibrinogênio, e também fornece a produção e a utilização de uma solução estabilizante que oferece nutrição a um ambiente, para a regeneração da cartilagem, e, então, é fornecida uma composição para a reparação de tecidos cartilaginosos, que é feita através de diversas etapas sequenciais.

[052] Para mais detalhes, a preparação de uma composição para a reparação de tecidos cartilaginosos é composta das seguintes etapas: (a) dissolver o fibrinogênio seco por congelamento em uma solução de aprotinina; (b) dissolver a trombina seca por congelamento em uma solução estabilizante; (c) misturar uma solução de colágeno enriquecido com trombina e a solução estabilizante e; instalar a solução de fibrinogênio (a) em um lado de um kit duplo e a solução (c) contendo a solução de colágeno no outro lado e, em seguida, misturar a solução (a) e a solução (c) e injetar em um tecido cartilaginoso danificado.

[053] A concentração de fibrinogênio varia de 33 a 55 mg/ml, a concentração de aprotinina é de 1.500 KIU/ml, a concentração de trombina é de 29,41 UI/ml, a concentração estabilizante é de 0,65 mg/ml e a concentração de colágeno é de 13,23 mg/ml.

[054] 0,26 mg/ml de cloreto de cálcio são contidos na solução estabilizante. A solução estabilizante reforçada com cloreto de cálcio é preparada por meio da adição de cloreto de cálcio ao meio de cultura DMEM, para a cultura de células de cartilagem, e o meio de cultura DMEM contém sais, aminoácidos e vitaminas.

[055] A concentração final de cloreto de cálcio na solução estabilizante varia de 0,1 a 0,5 mg/ml.

[056] A concentração final de cloreto de cálcio na composição para a reparação de tecidos cartilaginosos varia de 2,78 a 3,12 mg/ml.

[057] O colágeno, cuja concentração é inferior a 5 mg/ml, é esterilizado pelo uso de filtro de 0,22 μm e, em seguida, o colágeno é concentrado sob manipulação asséptica.

[058] A concentração de colágeno varia de 5 a 100 mg/ml.

[059] A produção da solução estabilizante na presente invenção será explicada de forma detalhada, conforme segue abaixo: - O cloreto de cálcio é adicionado ao meio de cultura DMEM utilizado na cultura de condrócitos para fazer a solução estabilizante. O meio de cultura DMEM contém sais, aminoácidos e vitaminas. A concentração de cloreto de cálcio varia de 0,2-6 mg/ml. - A concentração final de cloreto de cálcio no colágeno e na solução estabilizante varia de 0,1 a 0,5 mg/ml. - A concentração de cloreto de cálcio na solução estabilizante é determinada pelo tempo de gelificação e da faixa de tensão máxima. O tempo de gelificação é de 3 minutos e a tensão máxima é superior a 10N. - A faixa mínima da solução estabilizante é a faixa mínima utilizada para a condição de cultura, e 0,5 mg/ml de cloreto de cálcio é a faixa máxima provada para a estabilização. A concentração final de cloreto de cálcio utilizado na cola de fibrina comercial varia de 2,78 a 3,12 mg/ml que afeta as células.

[060] O colágeno concentrado é preparado conforme segue abaixo: - É preferível utilizar colágeno altamente enriquecido. - O colágeno (sob 5mg/ml) é esterilizado por meio do uso de um filtro de 0,22 μm e depois concentrado sob manipulação asséptica. - O peso molecular do colágeno é de aproximadamente 300.000 Dalton, e o comprimento da molécula de colágeno é de aproximadamente 300 nm para que a filtração seja difícil quando a concentração de colágeno for superior a 5 mg/ml. - O colágeno é concentrado na faixa de 5 a 100 mg/ml. - A concentração de colágeno começa a 5 mg/l e é possível continuar até 100 mg/ml (concentração solúvel e mensurável).

[061] A diálise e a diafiltração são utilizadas para a concentração de colágeno, ou é utilizado o método de centrífuga sob um determinado pH e temperatura. O colágeno concentrado é colocado em uma seringa para utilização posterior.

[062] A mistura de colágeno, fibrinogênio e a solução estabilizante é ilustrada na Figura 2. - Dissolver o fibrinogênio seco por congelamento contido em um produto de cola de fibrina em 2 cc de solução de aprotinina e, em seguida, a solução é colocada em uma seringa. - Dissolver a trombina seca por congelamento em 2 cc da solução estabilizante e, em seguida, a solução é colocada em uma seringa de 0,4 cc. - A solução de colágeno concentrado (3%, 3 cc) é misturada com a solução de trombina e, em seguida, a solução é colocada em uma seringa de 2 cc. - A solução de fibrinogênio/aprotinina e a solução de colágeno/trombina são instaladas em um kit duplo e, em seguida, são aplicadas na região do defeito da cartilagem. - Há vários produtos de fibrinogênio (cola de fibrina) vendidos em vários países, e os produtos utilizados na Coréia estão listados na Tabela 1. Tabela 1

[063] Hemassel (Canadá), Quixil (Israel), Bolheal (Japão), Biocol (França) e Vanguard (EUA) também estão disponíveis em outros países.

[064] A presente invenção pode ser alterada de várias formas para a aplicação dos componentes acima da presente invenção.

[065] No entanto, a presente invenção não se limita à explicação descrita acima e componentes que são equivalentes e substitutivos das reivindicações estão incluídos na presente invenção.

[066] Modalidades de uma composição para a reparação de tecidos cartilaginosos e um método de produção da mesma são explicados abaixo.

[067] Em primeiro lugar, a presente invenção oferece biomateriais, como, por exemplo, colágeno e fibrina, que são misturados de modo a permitir que o tecido cartilaginoso danificado seja reparado a um estado que permita o transplante no tecido, e a regeneração eficiente seja induzida, tornando, assim, possível reduzir o estresse relacionado à cirurgia em pessoas e animais, enquanto que induz o reparo e a regeneração da cartilagem de forma relativamente rápida e eficiente.

[068] Daqui em diante, modalidades da presente invenção serão descritas de forma detalhada.

Modalidade 1

[069] Método para aplicar colágeno e cola de fibrina em uma região de defeito da cartilagem de um animal (objetivo: confirmar a possibilidade de uma aplicação de colágeno e cola de fibrina em uma região de defeito da cartilagem de um porco). - Depois de uma perna de porco ser fixada a um suporte, a cartilagem é danificada com uma broca (2 x 1,5 cm2). - Thera Fill (colágeno enriquecido) e Greenplast (cola de fibrina) são preenchidos na região de defeito da cartilagem. O método de enchimento compreende as seguintes etapas: i. Abrir o Greenplast e, em seguida, adicionar fibrinogênio a uma solução de aprotinina por meio de injeção. ii. Adicionar uma trombina seca por congelamento a uma solução de cálcio. iii. 0,1 ml da solução de trombina/cálcio é misturado com 1 cc de Thera Encha, por meio do uso de um adaptador. iv. A solução 1) e a solução 3) são instaladas em um kit duplo e, em seguida, são aplicadas na região de defeito da cartilagem.

[070] Após a aplicação, observar a região de defeito da cartilagem durante 15 minutos.

[071] (Resultado: após a aplicação de Thera Fill/cola de fibrina na região de defeito da cartilagem, os materiais sólidos são formados dentro de 10 minutos e os materiais sólidos têm boas características para os médicos. Consulte a Figura 3).

Modalidade 2

[072] Um experimento de aplicação de cola de fibrina e colágeno em uma região de defeito da cartilagem de um coelho (objetivo: confirmar a regeneração da cartilagem do coelho por meio do uso de colágeno e cola de fibrina).

[073] Depois de ser induzido um defeito da cartilagem de 4 mm na região do sulco patelar de um coelho NZW, colágeno e cola de fibrina são aplicados na região do defeito, e, depois, 4 semanas após a aplicação, são realizadas observações microscópicas e a olho nu (Figuras 4 e 5). Colágeno (Thera Fill da Sewoncellontech) e fibrina (Tisseel da Baxter) são utilizados para a experiência.

[074] Hematoxilina-eosina, safranina-O, azul de alcian, tricrômico de Masson e colágeno tipo I/II são utilizados para coloração nas observações microscópicas.

[075] (Resultado: foi confirmado, pela observação a olho nu, que os tecidos da região do defeito são restaurados e, pela observação histopatológica, foi confirmado que os tecidos da região do defeito são regenerados como tecidos de cartilagem)

[076] As propriedades físicas da solução estabilizante, dependendo da concentração de cloreto de cálcio, são medidas e resumidas da seguinte forma: A. Medição do tempo de gelificação e propriedades físicas, de acordo com a concentração de cloreto de cálcio na solução estabilizante. i. Concentração de cloreto de cálcio

ii. Método de Aplicação - Preparar uma solução de colágeno (3%, 3 cc) e uma cola de fibrina (da Greenplast). - Fibrinogênio em Greenplast é misturado com aprotinina (1 cc). - A trombina é misturada com a solução estabilizante (1cc). - A solução de colágeno (3 cc) é misturada com trombina (3 cc) e a solução estabilizante (0,4 cc). - Colocar a solução de fibrinogênio (1 cc) e a solução de colágeno (1cc) em um kit duplo e, em seguida, colocar a mistura em um molde cilíndrico (0 12 x 15 mm) para fazer uma matéria sólida iii. Concentração de cloreto de cálcio/tempo de gelificação e gelificação.

- : inclui fase líquida - *: em progresso de gelificação - **: gelificação concluída

[077] Medição das propriedades físicas, dependendo da concentração de cloreto de cálcio. - Reômetro, CR-500DX, é utilizado para medir as propriedades físicas do material sólido. - Itens de medição: tensão máxima, força do gel e resistência à tração. - Distância da entrada: 50% da altura da amostra, 7,5 mm. - Velocidade: 50 mm/min, tensão máxima: 10 kg - Adaptador: No. 1, 0 20 mm.

[078] Método de mistura de colágeno e cola de fibrina com a solução estabilizante na região de defeito da cartilagem, medição das propriedades físicas e confirmação da degradabilidade (objetivo: nutrição é bloqueada quando as cartilagens são danificadas. O meio de cultura DMEM que é utilizado para cultura de células de cartilagem é adicionado para ajudar a restauração da cartilagem, e o produto contendo colágeno mantém a forma durante um longo período de tempo). i. Fazer uma solução estabilizante, isto é, um meio de cultura DMEM reforçado com cloreto de cálcio, que é utilizada para a cultura de células da cartilagem. O meio de cultura DMEM contém sais, aminoácidos e vitaminas. A solução estabilizante é uma solução de cloreto de cálcio reforçada e a concentração varia de 0,2 a 6 mg/ml. ii. A concentração de cloreto de cálcio varia de 0,1 a 0,5 mg/ml na utilização final. iii. Esta experiência é realizada conforme a descrição abaixo. - Preparar a solução de colágeno (3%, 3 cc) e cola de fibrina (Greenplast) - Fibrinogênio em Greenplast é misturado com um aprotinina (1 cc). - A trombina é misturada com a solução estabilizante (1 cc). - A solução de colágeno (3 cc) é misturada com trombina/solução estabilizante (0,4 cc). - A cola de fibrina não contendo colágeno é utilizada para um grupo de comparação. - Colocar a solução de fibrinogênio (1 cc) e a solução de colágeno (1 cc) em um kit duplo e, em seguida, colocar a mistura em um molde cilíndrico (0 12 x 15 mm) para fazer uma matéria sólida. A concentração final de cloreto de cálcio é de 0,26 mg/ml. iv. Medição de propriedades físicas. - Reômetro, CR-500DX, é utilizado para medir as propriedades físicas do material sólido. - Itens de medição: tensão máxima, força do gel e resistência à tração. - Distância da entrada: 50% da altura da amostra, 75 mm. - Velocidade: 50 mm/min, tensão máxima: 10 kg - Adaptador: No. 1, 0 20 mm. - Os resultados são conforme descrito a seguir. Um material sólido contendo colágeno apresenta uma cor opaca semelhante à cor da cartilagem, e um produto de cola de fibrina é um material translúcido sólido.

v. Confirmação da degradabilidade: - O material sólido é colocado no meio de cultura (DMEM) e é observado durante um mês a 37 graus Celsius. - O meio de cultura é alterado todos os dias ou a cada dois dias. - O produto de cola de fibrina não contendo colagem é decomposto em 2 a 3 semanas, mas o material sólido contendo colágeno mantém a sua forma ao longo de um mês.

[079] A seguir, uma experiência sobre a viabilidade celular de células de cartilagem na composição da mistura de colágeno e fibrinogênio (consulte Figura 8). A) Preparação de uma composição de colágeno e fibrinogênio contendo células de cartilagem - Fibrinogênio em cola de fibrina (Tisseel) é dissolvido em uma solução de aprotinina (2cc). - Uma trombina seca por congelamento é dissolvida na solução estabilizante. - A solução de colágeno (preenchimento com Thera, 3 cc) é misturada com a trombina/solução estabilizante (0,4 cc) pó meio uso de um adaptador. - Colocar 1,5 cc da mistura de colágeno/trombina/ solução estabilizante em uma seringa e, em seguida, a solução é misturada com as células da cartilagem (0,5 cc (6,0 X 106 células/0,5 cc)). A concentração final de cloreto de cálcio é de 0,24 mg/ml. - A mistura de 1) e 4) é, respectivamente, instalada em um kit duplo e, em seguida, colocada em uma placa de Petri de 100 mm. B) Uma experiência de confirmação da viabilidade das células da cartilagem na composição. - O produto em gel separado é transferido para uma placa de Petri de 35 mm, e 3 ml do meio de cultura DMEM é adicionado à placa de Petri, e em seguida é feita a incubação com CO2 a 37 graus Celsius. - O meio de cultura é trocado duas vezes por dia e incubado 3 dias. A composição do meio de cultura é composta de DMEM/F12, 1% de gentamicina, 5 mg/ml de ITS+Premix, 50 ug/ml de ácido ascórbico, 1 mM de piruvato de sódio e 100 ng/ml de BMP-2. - O método com calceína-AM é utilizado para uma análise.

Análise com calceína-AM - Método: é preparada uma solução de trabalho de viabilidade das células vivas/mortas contendo 10 ml de PBS, 5 uL de calceína- AM (4mM) e 20 uL de EthD-1 (2mM).

[080] O meio de cultura é removido da composição da incubação, e, em seguida, são adicionados 3 ml de solução de trabalho de viabilidade das células vivas/mortas. É incubado durante uma hora à temperatura ambiente, e, em seguida, é movido para uma lâmina de vidro. Observa-se em microscópio de fluorescência.

[081] As células vivas são coradas em verde e as células mortas são coradas em vermelho. - Resultado: fotos de microscopia de fluorescência de viabilidade das células da cartilagem por análise com calceína-AM. (Esquerda: inicial (40X), Direita: 3 dias de incubação (40X)).

[082] Após 72 horas na composição, a observação confirma que 90% das células estão vivas.

Claims (9)

1. MÉTODO DE PRODUÇÃO DE COMPOSIÇÃO PARA A REPARAÇÃO DE TECIDOS CARTILAGINOSOS, caracterizado pelo fato de compreender as seguintes etapas: (a) dissolver o fibrinogênio seco por congelamento em uma solução de aprotinina; (b) dissolver a trombina seca por congelamento em uma solução estabilizante; (c) misturar uma solução de colágeno enriquecido com trombina e a solução estabilizante e; instalar a solução de fibrinogênio (a) em um lado de um kit duplo e a solução (c) contendo a solução de colágeno no outro lado e, em seguida, misturar a solução (a) e a solução (c) e injetar em um tecido cartilaginoso danificado.

2. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de a concentração de fibrinogênio variar de 35 a 55 mg/l, a concentração da solução de aprotinina ser de 1.500 KIU/ml, a concentração de trombina ser 29,41 UI/ml, a concentração da solução estabilizante ser de 0,65 mg/ml e a concentração de colágeno ser 13,23 mg/ml.

3. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de a solução estabilizante também compreender uma solução contendo 0,26 mg/ml de cloreto de cálcio.

4. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de a solução estabilizante ser preparada por meio da adição de cloreto de cálcio ao meio de cultura DMEM, para a cultura de células de cartilagem, e o meio de cultura DMEM compreender sais, aminoácidos e vitaminas.

5. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de a concentração de cloreto de cálcio na solução estabilizante/fibrinogênio variar de 0,1 a 0,5 mg/ml.

6. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de a concentração final do cloreto de cálcio na composição para a reparação de tecidos cartilaginosos/fibrinogênio variar de 2,78 a 3,12 mg/ml.

7. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de o colágeno, cuja concentração é inferior a 5 mg/ml, ser esterilizado por meio do uso de um filtro de 0,22 μm e, em seguida, o colágeno ser concentrado sob manipulação asséptica.

8. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de a concentração de fibrinogênio/colágeno concentrado variar de 5 a 100 mg/ml.

9. COMPOSIÇÃO PARA A REPARAÇÃO DE TECIDOS CARTILAGINOSOS caracterizada pelo fato de ser preparada pelo método da reivindicação 1.