KR101540691B1 - 피브리노겐, 아프로티닌, 리도카인, 에피네프린 및 콜라겐 막을 포함하는 서방성 국소 약물전달체, 키트 및 이를 이용한 골병증 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 피브리노겐, 아프로티닌, 리도카인, 에피네프린 및 콜라겐 막을 포함하는 서방성 국소 약물전달체, 키트 및 이를 이용한 골병증 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 피브리노겐, 아프로티닌, 리도카인, 에피네프린 및 콜라겐 막을 포함하는 서방성 국소 약물전달체는 약리활성물질의 우수한 지연방출효과로 인하여 적은 양으로 지속적인 약리활성 효과를 낼 수 있으며, 혈관재생 및 신생골형성 촉진 등 생체 적합성을 우수하게 나타내므로 장기간의 지속적인 약물방출이 필요한 약리활성 물질의 서방성 국소 약물전달체로서 유용하게 사용될 수 있으며, 상기 국소 약물전달체에 BMP를 적용함으로써 골재형성 부전으로 인해 발생하는 여러 가지 질환의 치료에 유용하게 사용할 수 있다.

Description

피브리노겐, 아프로티닌, 리도카인, 에피네프린 및 콜라겐 막을 포함하는 서방성 국소 약물전달체, 키트 및 이를 이용한 골병증 치료용 조성물{Sustained-release local drug delivery system comprising fibrinogen, aprotinin, lidocaine, epinephrine, and collagen membrane, and composition for treating osteopathia using the same}

본 발명은 피브리노겐, 아프로티닌, 리도카인, 에피네프린 및 콜라겐 막을 포함하는 서방성 국소 약물전달체, 키트 및 이를 이용한 골병증 치료용 조성물에 관한 것이다.

골결손 부위의 골이식법에는 자가골, 동종골, 이종골, 합성골을 이용하는 방법들이 있으며, 이 중 자가골을 이용했을 때 골재생 효과가 가장 우수하고 짧은 치유기간을 보인다. 자가골 이식에 있어서 해면골과 골수는 물리적 안정성은 낮지만 골모세포(osteoblast)가 이식과정에도 살아남아 골형성을 촉진하며, 대조적으로 피질골은 적절한 물리적 안정성은 제공하지만 골유도능이 낮다. 이러한 자가골 이식이 여전히 골이식의 표준으로 여겨지고 있지만 실제 임상에서는 공여부 수술의 필요, 자가골 채취량의 한계, 수술 난이도, 수술 후 합병증 등의 문제로 동종골, 이종골, 또는 합성골과 같은 골대체물질을 이용한 골이식방법이 선호되고 있는 실정이다.

골형성단백질(rh-BMPs, recombinant human-bone morphogenic proteins)은 TGF-β superfamily로서, 이식되었을 때 골전구세포의 집결과 분화를 조절하는 것에 의해 신생골 및 신생연골 형성을 유도하는 물질로, 이 중 rhBMP-2, -4, -5, -6, -7 등이 골유도성이 있다고 알려져있다. 이들 중에서, 포유류 세포(CHO cell)로부터 재조합 DNA 기술로 얻어지는 rh-BMP-2, -7은 골유도능이 가장 우수하다고 보고되어, 이를 이용하여 많은 연구가 이루어졌으며, 현재까지도 주로 이들이 생산되어 연구재료로 사용되고 있을 뿐만 아니라 임상적으로 현재 사용되고 있다. 그러나, rhBMP는 임상적 적용에 있어 몇몇 장애가 존재한다. 첫째로는 BMP는 짧은 반감기로 인해 생물학적 활성이 떨어진다는 것이며, 둘째로는 이식된 BMP 용량의 많은 부분이 확산에 의해 빠르게 소실된다는 것이다. 이러한 한계점 때문에 BMP를 임상적으로 사용하려면 많은 양이 필요하며 이는 고가의 치료비용과 골의 과증식 및 면역반응 등 원치 않은 부작용을 야기한다.

이러한 문제들을 극복하기 위하여 BMP의 적절한 농도를 유지하면서도 오랫동안 방출할 수 있는 새로운 서방성 국소 약물전달체의 개발의 필요성이 요구되고 있는데, 콜라겐 스폰지를 이용하여 BMP-2를 전달하고자 했던 기존의 연구에서는, 콜라겐 스폰지의 BMP-2 초기 방출량이 폭발적이어서 투여한지 14일만에 잔여량이 5% 미만으로 감소하여 충분히 골형성 유도효과를 내지 못하는 한계를 나타내었다.

따라서, 본 발명자들은 BMP를 비롯한, 보다 장기간의 지속적인 약물방출이 필요한 약리활성 물질을 전달하고자 서방성 국소 약물전달체에 대한 연구를 계속하였고, 임상실험결과 다른 약물운반체와 동일한 용량에서 비교하였을 때 피브리노겐, 아프로티닌, 리도카인, 에피네프린 및 콜라겐 막을 포함하는 국소 약물전달체에서 4주 이상의 지연방출효과(sustained-release effect)가 나타나며, 골결손 부위의 풍부한 혈관생성 및 골형성 능력을 증진시켜, 골 치유력이 증가되는 것을 확인하였고, 상기 국소 약물전달체를 이용하여 BMP-2를 비스포스포네이트 관련 악골괴사증(BRONJ, Bisphosphonate related osteonecrosis of jaw)을 앓고 있는 실제 환자증례에 적용해 본 결과, 염증 및 괴사증이 치료되고 골 결손부가 신생골의 형성으로 채워지는 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 피브리노겐, 아프로티닌, 리도카인, 에피네프린 및 콜라겐 막을 포함하는 서방성 국소 약물전달체, 키트, 및 이를 이용한 골병증 치료용 조성물을 제공하고자 한다.

본 발명은 피브리노겐, 아프로티닌, 리도카인, 에피네프린 및 콜라겐 막을 포함하는 서방성 국소 약물전달체, 키트, 및 이를 이용한 골병증 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 피브리노겐, 아프로티닌, 리도카인, 에피네프린 및 콜라겐 막을 포함하는 서방성 국소 약물전달체는 약리활성물질의 우수한 지연방출효과로 인하여 적은 양으로 지속적인 약리활성 효과를 낼 수 있으며, 혈관재생 및 신생골형성 촉진 등 생체 적합성을 우수하게 나타내므로 장기간의 지속적인 약물방출이 필요한 약리활성 물질의 서방성 국소 약물전달체로서 유용하게 사용될 수 있으며, 상기 국소 약물전달체에 BMP를 적용함으로써 골재형성 부전으로 인해 발생하는 여러 가지 질환의 치료에 유용하게 사용할 수 있다.

도 1은 그룹 1 내지 그룹4의 이식재를 이식한 실험동물의 두개골 결손부를 나타낸 도이다.
도 2는 그룹 1내지 그룹4의 이식재 이식 후 2주, 4주, 및 8주 후의 신생골 부피율(%)을 나타낸 도이다.
도 3은 그룹 1내지 그룹4의 이식재 이식 후 2주, 4주, 및 8주 후의 미세전산 단층촬영 2차 이미지를 나타낸 도이다.
도 4는 그룹 1내지 그룹4의 이식재 이식 후 2주, 4주, 및 8주 후의 미세전산 단층촬영 3차 이미지를 나타낸 도이다.
도 5는 그룹 1내지 그룹4의 이식재 이식 후 2주, 4주, 및 8주 후의 미세전산 단층촬영 2차 이미지를 나타낸 도이다.
도 6은 그룹 1 내지 그룹 4의 이식재 이식 후 2주, 4주, 및 8주 후의 골편의 조직학적 형태를 관찰하기 위하여 골드너 삼색 염색 후 광학현미경으로 관찰한 도이다.
도 7은 그룹 1의 이식재 이식 후 2주 후의 골편을 H&E 염색 후 광학현미경으로 관찰한 도이다.
도 8은 그룹 1의 이식재 이식 후 4주 후의 골편을 H&E 염색 후 광학현미경으로 관찰한 도이다.
도 9는 그룹 1의 이식재 이식 후 8주 후의 골편을 H&E 염색 후 광학현미경으로 관찰한 도이다.
도 10은 그룹 2 내지 그룹 3의 이식재 이식 후, 2주 후의 골편을 H&E 염색 후 광학현미경으로 관찰한 도이다.
도 11은 그룹 2 내지 그룹 3의 이식재 이식 후, 4주 후의 골편을 H&E 염색 후 광학현미경으로 관찰한 도이다.
도 12은 그룹 2 내지 그룹 3의 이식재 이식 후, 8주 후의 골편을 H&E 염색 후 광학현미경으로 관찰한 도이다.
도 13은 실시예 4의 BRONJ 증례 환자의 초기 내원시 구강사진 및 X선 촬영 결과를 나타낸 도이다.
도 14는 실시예 4의 BRONJ 증례 환자의 2차 내원시 구강을 관찰한 도이다.
도 15는 실시예 4의 BRONJ 증례 환자의 2차 내원시 구강에 본 발명의 골재형성 부전 관련 질환의 치료용 약학적 조성물을 적용, 및 봉합한 상태를 나타낸 도이다.
도 16은 실시예 4의 BRONJ 증례 환자에 본 발명의 골재형성 부전 관련 질환의 치료용 약학적 조성물을 적용한 7개월 뒤의 X선 촬영 결과를 나타낸 도이다.

본 발명은 피브리노겐, 아프로티닌, 리도카인, 에피네프린 및 콜라겐 막을 포함하는 서방성 국소 약물전달체 및 이를 이용한 골병증 치료용 조성물을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 피브리노겐(fibrinogen), 아프로티닌(aprotinin)의 혼합물;

리도카인(lidocaine), 에피네프린(epinephrine)의 혼합용액; 및

콜라겐 막(collagen membrane);을 포함하는 서방성 국소 약물전달체를 제공한다.

또한, 본 발명은 다양한 약리학적 활성물질을 국소적으로 전달하기 위하여, 각각의 용기를 필요시에 개봉하고 각 내용물을 혼합하여 서방성 국소 약물전달체로 만드는 키트로서,

피브리노겐(fibrinogen); 아프로티닌(aprotinin); 리도카인(lidocaine), 에피네프린(epinephrine)의 혼합용액; 및 콜라겐 막(collagen membrane); 을 구성성분으로 포함하며 각각의 1회 투여량을 용기에 분별 충전한 것을 특징으로 하는, 서방성 국소 약물전달체 키트를 제공한다.

본 발명의 서방성 국소 약물전달체의 구성성분인 피브리노겐(fibrinogen)은 척추동물의 혈장 속에 존재하며 혈액응고의 중심적 역할을 하는 단백질로, 혈액이 응고할 때에 트롬빈효소가 피브리노겐에 작용하면 물에 잘 녹지 않는 성질을 갖는 피브린이 만들어지게 된다. 따라서, 피브리노겐은 상처부위의 지혈이나, 조직 접착을 위한 접착제의 구성성분으로 자주 사용된다.

또한, 본 발명의 구성성분인 아프로티닌(aprotinin)은 췌장에서 분비되는 프로틴분해효소의 억제제로서, 총 58개의 아미노산으로 이루어진 폴리펩티드이다. 주로 소의 폐에서 추출되며 혈액 속에서는 피브린의 분해를 저지하여, 지혈작용을 하는 것으로 알려져 있다.

본 발명의 구성성분인 상기 피브리노겐은 약물전달체로 사용시 피브린 네트워크를 형성하고, 상기 아프로티닌은 피브린의 분해를 저해하고, 피브린의 캡슐화상태를 유지함으로써 생체 내에서 천천히 고체화되어 전달하고자 하는 약물의 안정성을 장기간 유지시키는 효과가 있다. 본 발명의 피브리노겐 및 아프로티닌은 시중에서 판매되는 것을 구입하거나, 환자의 혈액을 채취하고, 이로부터 피브리노겐 및 아프로티닌을 분리함으로써 환자 맞춤형 약물전달체를 제조할 수도 있다.

본 발명에서 사용되는 피브리노겐 및 아프로티닌의 혼합비율은 바람직하게는 1:0.1 내지 1:10 (w/w)이고, 더욱 바람직하게는 1:0.5 내지 1:5이나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명의 서방성 국소 약물전달체의 구성성분인 리도카인은 아미드형 국소 마취제, 또는 항부정맥제로서, 피부나 치과 치료에 있어서 염증을 완화하고, 통증을 차단하는 효과가 있으며, 본 발명의 또 다른 구성성분인 에피네프린과 함께 사용할 경우에는 마취부 주위의 혈관을 수축시키는 효과가 있어, 소량의 마취제로 지속적인 효과를 얻을 수 있고 지혈작용이 있다.

본 발명의 서방성 약물전달체는 전달하고자 하는 약리활성 물질의 국소적 적용을 위한 것으로, 구성성분인 리도카인은 조직의 수축작용 및 동통억제작용을 가질 뿐만 아니라, 주변조직의 염증성 단백질의 분비를 억제하는 기능을 가지며, 다른 국소 마취제와 달리 분말형태의 약제를 쉽게 용해시키므로 rhBMP, 항생제를 비롯한 다양한 약제의 용매로서 역할이 가능하다. 본 발명에서 사용되는 리도카인의 농도는 1 내지 3% (w/v)일 수 있으며, 바람직하게는 2% (w/v)이다.

또한, 본 발명의 구성성분인 에피네프린의 농도는 1:50,000 내지 1:200,000 (v/v)이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 1:100,000 (v/v)일 수 있다. 1:50,000 미만의 농도로 사용될 경우는 국소 적용시 수축이 심하여 부작용이 있으며, 1:200,000을 초과할 경우는 수축작용이 부족하여 약리활성 물질의 방출을 지연하는 효과가 감소한다.

본 발명의 서방성 국소 약물전달체에서 피브리노겐 및 아프로티닌의 혼합물, 및 리도카인 및 에피네프린 혼합용액의 혼합 중량비는 1: 0.5~1.5(w/w)인 것이 바람직하다.

본 발명의 약물전달체는 콜라겐 막을 구성성분으로 하여, 피브리노겐, 아프로티닌, 리도카인, 및 에피네프린과 함께 사용시, 전달하고자 하는 약리활성 물질을 유지하는 효과가 우수하며 다양한 형태로 변형이 가능하여, 국소적으로 적용하고자 하는 생체부위의 표면을 덮거나, 결손조직 내에 삽입한 후 봉합, 또는 치조골, 구강악 뿐만 아니라 다양한 골질 내에 직접 주입하는 등 의학적으로 가능한 모든 형태로 이용될 수 있다.

본 발명의 약물전달체는 장기간의 지속적인 약물방출이 필요한 약리활성 물질, 예를 들면, BMP, 항생제, 호르몬제, 면역물질 등의 서방성 국소 약물전달체로서 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명의 일실시예에 의하면, 본 발명의 약물전달체에 BMP-2를 혼합하여 토끼의 두개골 결손부에 적용한 결과, BMP-2의 방출이 4주 이상 지연되어 풍부한 혈관생성 및 골재생 효과를 나타내는 것을 확인할 수 있다. 따라서, 본 발명은 서방성 국소 약물전달 체로서 유용하게 사용할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 서방성 국소 약물전달체에, BMP(bone morphogenic protein)를 유효성분으로 더 포함하는 것을 특징으로 하는 골재형성(bone remodeling) 부전으로 인해 유발되는 질환의 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

상기 골재형성 부전으로 인해 유발되는 질환에는 골괴사증(osteonecrosis), 골수염(osteomyelitis), 골염(osteitis), 골형성장애(osteodystrophy), 골연화증(osteomalacia), 또는 골다공증(osteoporosis) 등이 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

이 중 골다공증은 폐경에 따른 급격한 호르몬의 변화에 의한 파골세포(osteoclast)의 활성화에 따른 골흡수 증가로 나타나는 폐경 후 골다공증과, 노화가 되면서 조골세포(osteoblast)의 기능이 감소하여 골형성이 감소하는 노인성 골다공증으로 분류할 수 있다. 이러한 골다공증으로 인한 골절은 심각한 활동 제한에 이르게 되고, 고관절 골절의 경우 약 15-35%의 높은 사망률과 관련되어 있기 때문에, 골다공증성 골절이 발생하기 이전에 골다공증의 진단과 치료가 중요하다(골다공증 진단 및 치료 지침 2007, 2008). 이러한 골다공증의 기존에 알려진 치료제로는 비스포스포네이트(bisphosphonate)계열의 약물이 있는데, 비스포스포네이트는 골의 무기질 성분에 침착되며, 비스포스포네이트가 침착된 골을 파골세포가 탐식할 경우 가수분해되지 않는 ATP 유사체(analogue)를 형성하여 세포에 독성을 나타내거나 파골세포 내에서 다양한 방식으로 파골세포의 활성 감소 및 아폽토시스(apoptosis)를 초래해 골 흡수를 줄이고 이를 통해 골밀도를 증가시키는 것으로 알려져 있다. 이러한 약물들은 비교적 안전한 것으로 알려져 있으나, 최근 장기간 사용시 정상적인 골 흡수 및 골 형성에 의한 골의 재형성(remodeling)이나 골절 이후 골 재생(healing)과정에 영향을 주어 골의 탄성이 떨어져 오히려 골 강도에 좋지 않은 영향을 줄 수 있다는 우려들이 제기되고 있으며, 실제로 이로 인해 많은 환자에서 피로 골절을 일으킨다는 보고가 있다. 또 다른 부작용으로는 비스포스포네이트 관련 악골 괴사(BRONJ, Bisphosphonate related osteonecrosis of jaw)가 있다. BRONJ는 구강 내 점막이 손실되면서 상악 또는 하악골이 노출되어 구강 내 상처가 치유되지 않아 지속적으로 통증과 종창, 화농성 분비물이 나타나는 것을 임상증상으로 하며, 수술적인 치료 후에도 계속적으로 재발하는 특성이 있어 문제가 된다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, BRONJ의 발생으로 내원한 환자에 노출된 골괴사부위의 괴사조직을 제거하고, 본 발명의 약물전달체에 rhBMP-2를 혼합한 약학적 조성물을 적용한 결과, 7개월 후 구강 내 염증 및 화농소견이 깨끗이 사라지고, CT 스캔결과, 골결손부에 신생골이 형성되어 BRONJ가 치유된 증례를 확인할 수 있다. 따라서, 본 발명의 약학적 조성물은 골괴사증을 비롯한 골재형성 부전으로 인하여 유발되는 질환을 치료하는 효과가 우수하다는 것을 알 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 실험동물, 재료 및 실험 방법

1-1. 실험동물 및 실험재료

본 실험에서는 생후 3개월 이상 된 무게 2.5~3.0 kg의 12마리의 수컷토끼(New Zealand White Male Rabbit)를 사용하였으며, 실험동물 선정 및 관리, 외과적 처치 등을 비롯한 모든 실험절차는 원광대학교 동물실험윤리위원회(Wonkwang university IACUC: WKU11-30)의 지침에 따라 시행하였다.

실험재료로는 2% (w/v) 리도카인 및 1:100,000 (v/v)의 에피네프린, 피브리노겐, 아프로티닌, rhBMP(Cowellmed, Korea), 및 콜라겐 막(collagen membrane, Collatape, Zimmer, USA)을 각각 구입하여 하기의 실험에 사용하였다.

1-2. 실험방법

(1) 실험동물의 외과적 처치

먼저, 각각의 토끼에 케타민(Ketamine-HCl, 35mg/kg; Yuhan, Seoul, Korea)과 자일라진(Xylazine, 5mg/kg: Bayer Korea, Seoul, Korea)을 근육주사하여 전신마취를 유도한 다음, 조심스럽게 두개골 부위의 털을 제거하고, 두개부 수술부위를 포비돈(povidone iodine)으로 소독하였다. 다음으로는 2% 리도카인(Lidocaine)으로 수술부위를 국소 침윤마취한 후, 전두골의 전방에서 후방부에 이르기까지 중앙부를 따라 약 5cm의 두피를 절개하고 골막(periosteum)을 박리하여 전두골과 두정골을 노출시켰다. 노출된 두개골은 8mm 트레핀 버(trephine bur)를 이용하여 뇌경막에 손상을 주지 않도록 역회전 드릴모터를 사용하여 4개의 원형 골 결손부를 형성하여 각각의 두개골 결손부에 이식재를 매식하였다. 매식을 완료한 후, 골막과 피하조직은 흡수성 봉합사(5-0 vicryle TM, Ethicon, Somerville, NJ, USA)로 봉합하고, 두피는 4-0 Nylon(4-0 Ethilon TM, Johnson &　Johnson, Edinburgh, UK)으로 봉합하였다. 수술 후 일주일 간 항생제(Gentamicin, 0.1mg/kg, Dae Sung Microb, Korea)를 근육 내로 주사하여 외부 미생물 감염으로 인한 영향을 최소화하였다.

(2) 실험군 및 대조군의 설정

상기 실험동물의 두개골 결손부는 하기와 같이 4개의 그룹으로 나누어 처리하였다.

그룹 1: 음성대조군, 이식재를 넣지 않은 군,

그룹 2: 콜라테이프군, 순수한 제1형 콜라겐 막을 넣은 군,

그룹 3: 리도카인-BMP-콜라테이프군, 2% 리도카인, 1:100,000 에피네프린과 rhBMP-2를 혼합하여 순수한 제1형 콜라겐 막에 적셔서 넣은 군,

그룹 4: 리도카인-피브리노겐-아프로티닌-BMP-콜라테이프군, 2% 리도카인, 1:100,000 에피네프린, 피브리노겐, 아프로티닌, rhBMP-2를 혼합하여 순수한 제1형 콜라겐 막에 적셔서 넣은 군.

상기 각 군의 이식재를 이식한 실험동물은 도 1에 나타내었다.

각 군은 수술 2주, 4주, 및 8주 후 4마리씩 펜토바비탈(phentobarbital, 100mg/kg)을 정맥 내 주사, 모두 12마리를 희생시켜 관찰하였으며, 각각의 동물로부터 희생 후 결손부를 포함한 두개골 절편을 획득하였다. 모든 조직 절편은 분석 시행전 4% 파라포름알데히드 인산완충용액(paraformaldehyde BPS, pH 7.2)으로 일주일 동안 고정하였다.

실시예 2. 미세전산단층 촬영 및 분석

본 발명의 약물전달체의 골 결손부의 신생골의 형성정도를 비교하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.

먼저, 고정된 두개골 시편들을 고해상도 미세전산 단층촬영 시스템(Three-dimensional micro focus computed tomography; micro-CT, Sky-Scan 1172TM, Skyscan^TM, Kontich, Belgium)을 이용하여 스캔 후, 이미지 분석 소프트웨어(CT-analyze, Skyscan^TM, Kontich, Belgium)로 결손부의 조직부피에 대한 골부피의 비율을 계측하여 신생골부피율(% bone volume)을 측정하고, 이로부터 2차 및 3차 영상이미지를 생성하였다.

신생골 부피율의 계측 결과는 표 1 및 도 2 에 나타내었으며, 미세전산 단층촬영으로부터 구성한 2차 및 3차 영상이미지는 도 3 내지 도 5에 나타내었다.

	2주 후	4주 후	8주 후
그룹 1 (음성대조군)	1.82 ± 0.21	3.32 ± 0.71	7.04 ± 0.88
그룹 2 (콜라테이프군)	1.72 ± 0.31	8.21 ± 0.75	14.56 ± 0.91**
그룹 3 (리도카인-BMP-콜라테이프군)	5.33 ± 0.29*	17.22 ± 0.82*	29.24 ± 0.98*
그룹 4 (리도카인-피브리노겐-아프로티닌-BMP-콜라테이프군)	5.21 ± 0.25*	19.34 ± 0.95*	35.12 ± 1.08**

각 칼럼은 평균 ± 표준편차(* P<0.05, **P<0.01)를 나타냄

표 1 및 도 2에 나타낸 바와 같이, 미세전산 단층촬영 분석에 의한 결손부 조직부피에 대한 골부피의 비율인 신생골 부피율(% bone volume)은 매식 2주 후에 그룹 1과 그룹 2에서는 거의 차이가 없었으나, 그룹 3 및 그룹 4에서는 그룹 1과 그룹 2에 비해 골형성 비율이 높았으며, 유의한 차이를 보였다. 매식 4주 후에서는 그룹 1, 그룹 2에 비하여 그룹 3, 그룹 4에서 현격하게 증가된 신생골 부피율을 보였다. 매식 8주 후의 그룹 4는 가장 활발한 신생골 형성을 보이며 통계학적으로 유의한 증가율을 보였다.

도 3 내지 도 5에 나타낸 바와 같이, 매식 2주 후의 결손부내 형성된 신생골의 2D와 3D이미지에서 모든 대조군을 포함한 모든 실험군에서 결손부의 경계에서부터 형성되고 있는 신생골이 관찰되었다. 특히, 그룹 4의 리도케인-피브리노겐-아프로티닌-BMP-콜라테이프군의 경우, 매식 4주, 8주 후에 뚜렷한 신생골 형성이 관찰되었고 매식 8주 후에는 결손 중앙부에서 두껍게 형성된 신생골을 관찰할 수 있었으며, BMP를 함유한 그룹 3도 비슷한 양상을 보였지만 그룹 4보다는 약간 골형성이 유의하게 적은 양상을 보였다.

실시예 3. 조직형태학적 관찰

Micro-CT 촬영이 끝난 시편들은 8% 염산/개미산(8% HCl: 8% Formic acid =1:1) 혼합 용액에서 5일간 탈회시킨 후 통상적인 방법에 따라 파라핀 조직 포매하였다. 포매가 완료된 표본은 5μm(HM 315: Microme, Walldorf, Germany) 두께로 절삭하였고, 시편의 정중앙 부위를 선택하여 매 5장마다 1장씩 무작위로 취하여 H-E 염색(Hematoxylin/Eosin staining) 및 골드너 삼색 염색(Goldner's trichrome staining) 후 광학 현미경 하에서 조직형태학적 관찰을 수행하였다.

(1) 그룹 1

그룹 1의 결과는 도 7 내지 도 9에 나타내었다.

도 7에 나타낸 바와 같이, 수술 2주 후에 결손 경계부에서 만성 염증세포의 침윤과 골모세포의 활성에 따른 발달된 신생골을 볼 수 있었으며, 얇고 성긴 섬유성 결합조직 내에 혈관이 분포되어 있었다. 결손 중앙부 역시 불규칙한 성긴 섬유성 결합조직과 모세혈관을 볼수 있었지만 신생골은 관찰되지 않았다.

또한, 도 8에 나타낸 바와 같이, 수술 4주 후의 결손 경계부에서는 성숙된 신생골이 기존골과 융합된 양상으로 관찰되며, 중앙부에서는 거의 신생골이 관찰되지 않으며 조밀한 섬유성 결합조직과 지방조직 등이 산재되어 있는 것을 관찰할 수 있었다.

또한, 도 9에 나타낸 바와 같이, 수술 8주 후의 결손 경계부에서는 좀 더 성숙한 신생골이 기존골과 융합된 양상으로 관찰되었지만, 중앙부에서는 결손부위가 그대로 남아 있고 조밀한 섬유성 결합조직이 관찰되었다. 수술 4주에 비해 더욱 성숙된 신생골의 골수강의 형태를 보이고 있지만 중앙부는 결손부로 나타났다.

(2) 그룹 2

그룹 2의 결과는 도 10 내지 도 12에 나타내었다.

도 10의 A-1, A-2에 나타낸 바와 같이, 수술 2주 후의 결손 경계부는 성숙된 골조직의 그룹 4에서 그룹 2보다 많이 관찰되었으며 특히 결합조직의 치밀도와 혈관화가 증가되는 양상을 관찰할 수 있었다. 혈병과 함께 모세혈관이 관찰되었으며 이식재 잔여물질이 결합조직형태로 남아 있지만 염증세포의 침윤이 있는 것을 볼 수 있었다.

또한, 도 11의 A-1, A-2에 나타낸 바와 같이, 수술 4주 후에는 결손 경계부와의 구분이 불분명한 형태로 골모세포 및 대식세포가 활발히 활동하는 조직 모습을 보이며 층판의 형태를 보이는 성숙한 신생골이 관찰되었다. 또한, 중앙부에서 섬유성 결합조직이 조밀한 형태로 발달되었으며 이식재 잔여물질은 흡수되어 있었다. 일부 조밀한 섬유성 결합조직 내 미성숙 골 형태의 신생골이 관찰되었다.

또한, 도 12의 A-1, A-2에 나타낸 바와 같이, 수술 8주 후에는 결손부의 모든 영역에서 염증세포의 개재 없이 정상적인 치유상태를 보였으나, 중앙부에서는 약간의 결손부위가 관찰되었다. 완벽한 골판상 구조를 보이지는 않으며 신생골의 침윤은 증가되어 있는 것으로 관찰되었다. 그러나 중앙부에 연접한 부위에서는 염증세포의 증식이 관찰되었다.

(3) 그룹 3

그룹 3의 결과는 도 10 내지 도 12에 나타내었다.

도 10의 B-1, B-2에 나타낸 바와 같이, 수술 2주 후 결손 경계부에서 미성숙 신생골의 증식이 활발하게 관찰되었고, 성긴 섬유성 결합조직 내에 많은 침윤성 염증세포가 다량 확인되었으며 혈관조직의 분포가 급격하게 증가한 양상을 나타내었다. 특히 혈병과 함께 풍부한 모세혈관이 관찰되었으며 콜라겐의 흡수가 늦어져 남아 있는 잔여물질이 중앙부위에서 간혹 관찰되었다. 염증세포와 대식세포 등의 다양한 세포들이 유주해 있으며 결손 중앙부에서 골화증가가 다른 그룹 1과 그룹 2보다 높게 나타났다. 약간의 신생골 결손이 중앙부위에서 관찰되었다.

또한, 도 11의 B-1, B-2에 나타낸 바와 같이, 수술 4주후의 결손경계부에서 뚜렷한 층판 형태의 성숙 신생골이 기존과 융합되어 구분이 어렵게 관찰되었다. 중앙부에서는 넓고 발달된 섬유성 결합조직 내 성숙된 신생골과 미성숙골이 혼재되어 침착되었다.

또한, 도 12의 B-1, B-2에 나타낸 바와 같이, 수술 8주 후의 소견에서는 결손경계부에서 성숙한 신생골과 기존골과의 구분의 거의 어렵게 융합되어 있는 양상을 자주 관찰할 수 있다. 신생골이 충분히 관찰되며 골수강 형태를 볼수 있다.

(4) 그룹 4

그룹 4의 결과는 도 10 내지 도 12에 나타내었다.

도 10의 C-1, C-2에 나타낸 바와 같이, 수술 2주 후의 결손 경계부에서 혈관화가 활발하게 이루어지고 염증성 세포 증식이 활발히 이루어진 것을 관찰할 수 있었다. 혈관조직의 활발한 확장으로 인한 염증성 세포의 이주를 특징으로 하고 있었으며, 혈관화가 활발히 이루어져 염증성 세포 증식에 의한 감염의 증상이 높아지는 대신에 골화의 방향이 활발히 이루어지는 것을 관찰할 수 있었다.

또한, 도 11의 C-1, C-2에 나타낸 바와 같이, 수술 4주 후의 결손 경계부에서는 골화작용으로 인하여 결손부위의 위치를 파악하기 힘든 상태였다. 중앙부에서는 넓게 발달된 조밀 섬유성 결합조직 내 성숙된 신생골과 미성숙골의 양이 적은 형태로 혼재되어 침착된 것을 관찰할 수 있었다.

또한, 도 12의 C-1, C-2에 나타낸 바와 같이, 수술 8주 후의 소견에서는 결손부의 모든 영역에서 염증세포의 개재 없이 정상적인 치유상태를 보였으며, 결손 중앙부도 완벽하게 골화가 촉진된 상태로 층판골의 두께 또한 증가된 양상을 보였다. 그룹 4에서는 두꺼워진 골수강 형태를 나타내었으며, 가장 두껍게 발달된 신생골로 채워져 있었다.

실시예 4. 실제 BRONJ(Bisphosphonate related osteonecrosis of jaw) 증례 적용례

골다공증을 앓고 있는 62세 남성 환자가 발치 후 지속적인 염증 및 농의 형성을 주소견으로 내원하였다. 환자는 내원 전 4년 동안 비스포스포네이트계 약물인 Fosamax를 처방받아왔다. 환자의 상태는 괴사된 구강악골이 노출 및 감염되어 통증과 발적이 있는 상태로 화농이 배출되고 있는 2단계의 BRONJ로 진단되었다.

환자의 내원시 구강 내부사진 및 구강악 부위의 X선 촬영결과는 도 13에 나타내었다.

도 13에 나타낸 바와 같이, 환자의 구강 내부에는 발적, 부종, 및 화농소견을 나타내었으며, X선 촬영결과 우측 하악부에 불규칙적인 변연의 방사선 투과병변(radiolucent lesion)이 관찰되었다.

한달 뒤 내원한 환자의 상태는 염증을 동반한 골괴사증이 상당히 진행되어 동통이 매우 심하였으며, 구강의 누공 및 골융해 소견을 나타내는 3단계의 BRONJ로 진단되었다.

한달 뒤 내원한 환자의 구강 내부사진은 도 14에 나타내었다.

내원한 환자의 노출된 골괴사부위의 괴사조직을 제거하고, 본 발명의 리도카인, 에피네프린, 피브리노겐, 아프로티닌, 및 콜라겐 막을 포함하는 약물전달체에 rhBMP-2를 혼합한 약학적 조성물을 골 결손부위에 적용하고 봉합하였다.

본 발명의 약학적 조성물을 환자에 적용한 사진은 도 15에 나타내었다.

7개월 후 내원한 환자의 구강 내에는 염증 및 화농소견이 깨끗이 사라지고, X선 촬영결과, 골결손부에 신생골이 형성되어 결손부가 신생골로 채워진 것을 확인할 수 있었다. 따라서, 본 발명의 약학적 조성물은 BRONJ와 같은 골괴사증을 비롯한 골재형성 부전으로 인하여 유발되는 질환을 치료하는 효과가 우수하다는 것을 알 수 있다.

Claims (9)

1. 피브리노겐(fibrinogen), 및 아프로티닌(aprotinin)의 혼합물; 및
   약물의 용매로서의 리도카인(lidocaine), 및 에피네프린(epinephrine)의 혼합용액;이 함침된 콜라겐 막(collagen membrane);을 포함하는 서방성 국소 약물전달체로서,
   상기 리도카인의 농도는 1~3% (w/v)이고;
   상기 에피네프린의 농도는 1:50,000~200,000 (v/v)인 것인, 약물 전달체.
   
2. 제1항에 있어서, 상기 피브리노겐 및 아프로티닌의 혼합비율은 1: 0.1~10(w/w)인 것을 특징으로 하는, 서방성 국소 약물전달체.
   
3. 삭제
4. 삭제
5. 제1항에 있어서, 상기 피브리노겐 및 아프로티닌의 혼합물, 및
   상기 리도카인 및 에피네프린 혼합용액의 혼합 중량비는 1: 0.5~1.5(w/w)인 것을 특징으로 하는, 서방성 국소 약물전달체.
   
6. 제1항의 서방성 국소 약물전달체에, BMP(bone morphogenic protein)를 유효성분으로 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 골재형성(bone remodeling) 부전으로 인해 유발되는 질환의 치료용 약학적 조성물.
   
7. 제6항에 있어서, 상기 BMP는 BMP-2 또는 BMP-7인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
   
8. 제6항에 있어서, 상기 골재형성 부전으로 인해 유발되는 질환은 골괴사증(osteonecrosis), 골수염(osteomyelitis), 골염(osteitis), 골형성장애(osteodystrophy), 골연화증(osteomalacia), 및 골다공증(osteoporosis)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
   
9. 각각의 용기를 필요시에 개봉하고 각 내용물을 혼합하여 서방성 국소 약물전달체로 만드는 키트에 있어서,
   피브리노겐(fibrinogen), 및 아프로티닌(aprotinin)의 혼합물; 및
   약물의 용매로서의 리도카인(lidocaine), 및 에피네프린(epinephrine)의 혼합용액;이 함침된 콜라겐 막(collagen membrane);을 구성성분으로 포함하며 각각의 1회 투여량을 용기에 분별 충전한 것을 특징으로 하는, 서방성 국소 약물전달체 키트로서,
   상기 리도카인의 농도는 1~3% (w/v)이고;
   상기 에피네프린의 농도는 1:50,000~200,000 (v/v)인 것인, 약물 전달체 키트.
   

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