KR102565364B1 - 자가골 회복 촉진용 조성물을 포함하는 서방성 국소 약물전달체 및 이를 포함하는 약학적 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 피브리노겐을 포함하는 응고제 혼합물에 히알루론산 또는 그 염 및 알긴산 하이드로젤을 포함하는 천연고분자 혼합물을 포함하는 서방성 국소 약물전달체에 관한 것으로, 상기 서방성 국소 약물전달체는 생체적합성이 우수하며, 장기간 생체 내 지속성을 가진다. 또한 약리활성물질의 우수한 지연방출 효과로, BMP(bone morphogenic protein)와 같은 단백질을 첨가할 경우 지속적인 약물방출을 통해 골재형성 부전에 의해 발생하는 여러가지 질환의 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

자가골 회복 촉진용 조성물을 포함하는 서방성 국소 약물전달체 및 이를 포함하는 약학적 조성물{Sustained-release topical drug delivery system containing a composition for accelerating autogenous bone recovery and pharmaceutical composition containing the same}
본 발명은 피브리노겐을 포함하는 응고제 혼합물에 히알루론산 또는 그 염 및 알긴산 하이드로젤을 포함하는 천연고분자 혼합물을 포함하는 서방성 국소 약물전달체에 관한 것으로, 상기 서방성 국소 약물전달체는 생체적합성이 우수하며, 장기간 생체 내 지속성을 가진다. 또한 약리활성물질의 우수한 지연방출 효과로, BMP(bone morphogenic protein)와 같은 단백질을 첨가할 경우 지속적인 약물방출을 통해 골재형성 부전에 의해 발생하는 여러가지 질환의 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
치과영역에서 뼈에 관한 임상적 지식이 나날이 발전하고 있고 분자생물학적 발전과 함께 조직공학적인 뼈 재생분야의 발전으로 인하여 획기적인 치료법이 나날이 발전하고 있다. 그러나 최근 골다공증 치료제, 항혈관화약품, 스테로에드 계열의 면역 억제제, 고지혈증 치료제 등이 장기적으로 사용되면서, 골 괴사증이나 골수염 등 다양한 난치성 질환이 발견되고 있어 치료의 어려움을 겪고 있는 실정이다.
2003년도 알렌드로네이트 주사제에 의한 골 괴사증이 처음 발견된 이래, 국내에서도 2005년도 이후에 골다공증 치료제인 비스포스네이트(bisphosphonate) 계열의 약물성 골괴사증 발견되었으며, 2005년에 미국 식품의약품안전청(FDA)은 모든 비스포스포네이트의 골 괴사 합병증에 대한 광범위한 의약품 경고를 발표한 바 있다.
한편 골괴사의 치료 방법으로는 통증을 없애고 증상을 완화시키는 방법만 있을 뿐 완전히 치유할 수 있는 적절한 치료제는 없는 상황이다. 이에 골괴사가 심할 경우에는 외과적 시술이 주로 이루어지고 있으며, 대표적으로 중심부 감압술, 골이식 등이 이루어지고 있다. 중심부 감압술은 뼈 통증을 완화하기 위하여 뼈 내 압박을 감소하기 위한 작은 구멍을 뚫는 것이다. 골 이식은 뼈의 죽은 부위를 제거하고 다른 신체 부위의 보다 정산적인 뼈로 교체하는 절차이며, 쇠약해진 뼈 부위를 지탱하고, 영향받은 부위에 새로운 살아 있는 뼈가 생성되도록 신체를 자극하는 일을 수행한다.
골이식은 자가골, 동종골, 이종골, 합성골을 이용하는 방법들이 있으며, 이 중 자가골을 이용했을 때 골재생 효과가 가장 우수하고 짧은 치유기간을 보인다. 자가골 이식에 있어서 해면골과 골수는 물리적 안정성은 낮지만 골모세포(osteoblast)가 이식과정에도 살아남아 골형성을 촉진하는 점에서, 자가골 이식이 지금까지도 골이식의 표준으로 여겨지고 있다. 다만, 실제 임상에서는 공여부 수술의 필요, 자가골 채취량의 한계, 수술 난이도, 수술 후 합병증 등의 문제로 동종골, 이종골, 또는 합성골과 같은 골대체물질을 이용한 골이식방법이 고려되고 있으나, 자가골에 비하여 골유도기간이 길고, 형성된 골의 골질이 자가골 대비 좋지 않으며, 면역반응 또는 감염의 위험성이 큰 우려가 존재하는 실정이다. 또한 이러한 뼈 이식 방법들은 공통적으로 시술 후 형태나 공간을 유지하지 못하고 변형되는 문제도 가지고 있다.
최근에는 분자치로(molecular therapy)를 이용하여 손상된 뼈조직을 재생시키고자 하는 방법들이 새롭게 시도되고 있다. 이는 성장인자(growth factors), 신호분자(signaling molecules), 전사인자(transcription factors), 그 밖의 주효인자(other effactors)를 포함하는 기능성 단백질 분자들을 일정기간 손상된 조직부위에 공급하여 조직재생과정의 가속화를 위한 초기단계 활성화를 유도하는 접근방식이다. 특히 성장인자 전달을 통한 조직재생은 조직공학(tissue engineering)적인 관점에서 중요하며, 뼈조직 재생과 관련된 대상 성장인자로는 골형성단백질인 BMP(bone morphogenic protein)가 주로 이용된다. 궁극적으로 BMP를 사용하는 방법은 자가골에 비해 보다 효과적인 골재생 방법으로 예측되고 있다.
한편, 골형성단백질인 BMP는 TGF-β superfamily로서, 골 재생을 가속화시키는 단백질이다. BMP 단백질은 생체내(in vivo) 간엽세포(mesenchymal cell)의 분화에 의해 연골조직의 형성(chondrogenesis, 연골형성) 및 뼈 조직의 형성(osteogenesis, 골 형성)을 유도한다고 공지된 성장 인자 그룹이다. 이들은 세포의 표면에 존재하는 특이적 수용체와 반응함으로써 수용체의 활성화를 유도하며, BMP-2, -4, -5, -6, -7 등이 골유도성이 있다고 알려져있다. 특하 포유류 세포(CHO cell)로부터 재조합 DNA 기술로 얻어지는 rh-BMP(recombinant human-bone morphogenic proteins)인 rh-BMP-2, -7은 골유도능이 가장 우수하다고 보고되면서, rh-BMP-2, -7을 이용한 많은 연구가 이루어지고 있다.
다만, BMP를 이용한 약물 개발 시 다음과 같은 어려움이 존재한다. ① 짧은 반감기를 갖고 빠르게 대사되기 때문에 장기간의 치료 동안 충분한 골 형성을 유도하기 위해서는 상대적으로 고용량의 주입이 필요하다. 이는 환자에게 투여 동안에 면역 반응의 위험성을 증가시키고, 이로 인하여 바람직하지 않은 수준의 독성의 원인이 될 수 있있으며, 고용량 투입을 위한 큰 비용이 소요된다. ② 이식된 BMP 용량의 많은 부분이 확산에 의해 빠르게 소실된다. 이러한 한계점 때문에 BMP를 임상적으로 사용하려면 많은 양이 필요하며, 이는 고가의 치료비용과 골의 과증식 및 면역반응 등 원치않은 부작용을 야기한다
일례로 콜라겐 스폰지를 이용하여 BMP-2를 전달하고자 했던 기존의 연구에서는, 콜라겐 스폰지의 BMP-2 초기 방출량이 폭발적이어서 투여한지 14일만에 잔여량이 5% 미만으로 감소하여 충분히 골형성 유도효과를 내지 못하는 한계가 나타났다. 이러한 문제들을 극복하기 위하여 BMP의 적절한 농도를 유지하면서도 오랫동안 방출할 수 있는 새로운 서방성 국소 약물전달체의 개발의 필요성이 요구되고 있다.
따라서, BMP를 비롯한, 보다 장기간의 지속적인 약물방출이 필요한 약리활성 물질을 전달할 수 있는 서방성 국소 약물전달체의 개발이 필요한 실정이다.
한국 등록특허 제10-1678241호 한국 등록특허 제10-2273121호
본 발명의 목적은 피브리노겐 및 아프로티닌을 포함하는 응고제 혼합물; 히알루론산 또는 그 염, 및 알긴산 하이드로젤을 포함하는 천연고분자 혼합물; 및 트롬빈 용액;을 포함하는 서방성 국소 약물전달체를 제공하고자 한다.
또한, 본 발명은 상기 서방성 국소 약물전달체에 BMP(bone morphogenic protein)를 유효성분으로 포함하는 골재형성 부전으로 인해 유발되는 질환의 치료용 약학적 조성물을 제공하고자 한다.
또한, 본 발명은 상기 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 골재형성 부전으로 인해 유발되는 질환을 치료하는 방법을 제공하고자 한다.
또한, 본 발명은 피브리노겐 및 아프로티닌을 포함하는 응고인자 혼합물; 히알루론산 또는 그 염, 및 알긴산을 포함하는 천연고분자 혼합물; 및 안정화 용액에 용해된 트롬빈을 첨가한 서방성 국소 약물전달체를 손상 조직부위에 주입하여 겔화시키는 단계를 포함하는, 투여 방법을 제공하고자 한다.
본 발명의 일 측면은 피브리노겐 및 아프로티닌을 포함하는 응고제 혼합물; 히알루론산 또는 그 염, 및 알긴산 하이드로젤을 포함하는 천연고분자 혼합물; 및 트롬빈 용액;을 포함하는 서방성 국소 약물전달체로서, 상기 피브리노겐 및 아프로티닌의 혼합비율은 1: 0.05~0.5(w/w)이며, 상기 천연고분자 혼합물은 솔비톨 및 만니톨로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 유기물, 및 리도카인을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 서방성 국소 약물전달체에 관한 것이다.
본 발명에서 “피브리노겐(fibrinogen)”은 척추동물의 혈장 속에 존재하며 혈액응고의 중심적 역할을 하는 단백질로, 혈액이 응고할 때 트롬빈효소가 피브리노겐에 작용하면 물에 잘 녹지 않는 성질을 갖는 피브린이 만들어지게된다. 즉, 응고인자 역할을 하며 상처부위의 지혈이나 조직 접착을 위한 접착제 구성성분으로 자주 사용된다.
본 발명에서 “아프로티닌(aprotinin)”은 췌장에서 분비되는 프로틴분해효소의 억제제로서, 총 58개의 아미노산으로 이루어진 폴리펩티드이다. 주로 소의 폐에서 추출되며 혈액 속에서는 피브린의 분해를 저지하여, 지혈작용을 하는 것으로 알려져 있다.
상기 피브리노겐은 약물전달체로 사용 시 피브린 네트워크를 형성하고, 상기 아프로티닌은 피브린의 분해를 저해하고, 피브린의 캡슐화상태를 유지함으로써 생체 내에서 천천히 고체화되어 전달하고자 하는 약물의 안정성을 장기간 유지시키는 효과가 있다. 본 발명의 피브리노겐 및 아프로티닌은 시중에서 판매되는 것을 구입하거나, 환자의 혈액을 채취하고, 이로부터 피브리노겐 및 아프로티닌을 분리할 수 있다.
상기 피브리노겐 및 아프로티닌의 혼합비율은 1: 0.05~0.5(w/w)일 수 있으며, 바람직하게는 1: 0.1~0.5이나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 약물전달체는 '국소용 제제'로서, 상기 국소용 제제는 피브린 응괴 유사 구조물이 대상체의 특정 부위에 국소적으로 적용하기 위한 것으로, 전형적으로는 조직 또는 상처 표면에서 형성된다는 것을 의미한다.
한편, 서방성 국소 약물전달체는 지난 수년간 성장인자의 국소전달을 위한 다양한 서방형 시스템의 개발이 시도되었으나, 현재까지는 이상적인 시스템이 구성되지 못한 상태이다. 최근에는 지지체 기반(matrix-based)의 약물전달시스템이 개발되어 뼈조직 재생 이외의 여러 조직 재생에 적용하기 위한 연구가 이루어지고 있다. 지지체 기반의 시스템을 개발, 적용하기 위해서는 기본적으로 비면역성(non-immunogenic), 무독성(non-toxic), 생체적합성(biocompatible), 생분해성(biodegradable), 용이한 제조(easily manufactured) 등의 조건을 만족해야 하며, 신호분자는 시스템 내에서 안정화되고 방출경향이 조절 가능해야 하며 구조적인 강도가 요구되기도 한다. BMP 전달을 통한 뼈조직 재생과 관련하여 뼈의 주요 구성성분인 hydroxyapatite(HAP, Ca10(PO4)6(OH)2) 등의 무기물 기반 소재, 천연 고분자 재료, 및/또는 합성 고분자 재료가 사용되고 있다.
이 중 천연 고분자 재료로는 콜라겐(collagen), 피브린(fibrin), 알긴산(alginic acid), 히알루론산(hyaluronic acid) 등이 있다.
콜라겐(collagen)은 원료물질을 이종개체로부터 얻지만 면역원성 텔로펩타이드(immunogenic telopeptide)의 제거기술이 발달되어 원료물질에 의한 이물반응을 최소화할 수 있게 되었으며, 스폰지 형태의 구성이 가능하여 현재까지 임상적으로 흔히 적용되는 재료중의 하나이다. 하지만 성장인자의 과다한 초기방출(initial burst)로 인해 고가인 BMP를 과량으로 지지체내에 충진해야 하는 경제적인 부담과, 이식 초기의 과다한 성장인자의 농도에 따른 질병전이의 잠재적인 위험성이 존재한다.
피브린(fibrin)은 피브린 글루(fibrin glue)라는 임상용 접착제로서 사용 중인 고분자소재로 혈액응고(blood coagulation) 과정 중 형성되고 지혈(hemostasis) 및 상처치유(wound healing) 과정에서 중요한 역할을 담당한다. 피브린 수화젤 내에 서방형 시스템을 도입하기 위해 헤파린을 포함하는 피브린 수화젤이 개발되었 으며, 분자 내에 헤파린 결합부위가 있는 성장인자들을 대상으로 서방형 시스템의 구성이 보고되었다. 이 경우 헤파린과 정전기적 상호작용이 가능한 펩타이드를 우선 수화젤 내에 공유결합시키는 방식으로 헤파린을 수화젤 내에 고정시켰다. 일반적으로 피브린 수화젤은 자체로서 서방형 시스템은 아니지만 예외적으로 대상 성장인자가 nonglycosylated BMP-2인 경우에 단백 질의 수화젤 내 용해도가 낮아 서방형 시스템으로 작동할 수 있다는 보고가 있다.
알긴산(alginic acid)는 미역, 다시마와 같은 갈조류에서 추출되는 천연고분자로, 생체적합성이 뛰어나고 독성이 낮으며 가격이 싼 장점이 있다. 2가 양이온(예: Ca2+)과 결합하여 수화젤을 비교적 쉽게 생성한다. 특히 알긴산의 분자구조는 D-만누론산과 L-글루론산이 블록공중합체 형태를 이루고 있고, L-글루론산 블록이 2가 양이온과 결합하여 하이드로젤을 형성하기 때문에 L-글루론산 블록의 길이가 알긴산 하이드로젤의 물리적인 성질을 결정하는 중요한 요소이다. 한편 알긴산 자체는 생리학적 조건에서 분해가 되지 않아 알긴산 하이드로젤에서 가교제 역할을 하는 2가 양이온이 생체 내에 존재하는 1가 양이온(예: Na+)과 교환반응에 의하여 방출되면서 젤이 붕괴되고 용해될 수 있다. 그러나 상업적으로 시판되는 알긴산은 분자량이 커서 용해된 이후 신장을 통과하여 체외로 배출되기가 어려운 단점이 있으며, 수화젤 내 기공크기가 상대적으로 커서 거대분자가 쉽게 확산되어 나오는 문제가 있다. 알긴산에 분해성을 부여하기 위해 부분 산화(partial oxidation)시키는 방법이 개발되고 있으며, 그 외에도 이온 가교(Ionic Cross-Linking), 공유 가교(Covalent Cross-Linking), 광 가교(Photo-Cross-Linking), 세포 가교(Cell Cross-Linking) 등의 가교 방법을 이용하여 제조된 알긴산 하이드로젤을 의료용 재료 등으로 사용하고 있다.
히알루론산(hyaluronic acid)은 분자량이 5만 내지 1,300만 달톤에 이르는 무색 투명한 점도의 선형 다당류로서, 세포외 기질 내 다수의 단백질을 특이적으로 인식하고 프로테오글리칸과 상호작용을 통해 세포외 기질을 안정화한다. Cell behavior에 영향을 주는 세포표면과의 상호작용이 가능하며 cell mobility 변화에도 관여한다. BMP 국소전달을 목적으로 하는 히알루론산 소재의 지지체는 화학적 교차결합을 이용하는 경우와 소수성 기능기를 도입하는 경우가 보고되었다. 일례로 토론토 대학의 Shoichet 교수 연구진은 물리적/화학적 가교방식을 혼합시킨 하이브리드 메틸셀룰로오스(methylcellulose) 하이드로젤을 이용하여 기저 세포 유래 인자(stromal cell-derived factor; SDF)를 서서히 방출시키는 기술을 개발한 바 있다(신지수; 조정호; 조승우. 기획특집: 의약분야 적용 고분자 소재: 약물전달 및 조직공학적 응용을 위한 기능성 하이드로젤. 공업화학전망, 2015, 18.6: 2-12.). 다만, 소수성 기능기를 도입한 경우 서방형 시스템의 구성이 가능하지만 지지체 내의 계면 상에서 단백질 입체구조가 불안정해지는 단점을 갖는다.
본 발명에서는 피브리노겐을 포함하는 응고인자 혼합물에 세포기질 안정제로서 생체적합성의 천연고분자인 히알루론산 및 알긴산, 및 트롬빈 용액을 국소 부위에서 혼합하거나, 또는 이들을 외부에서 혼합한 후 응괴 형성이 완결되기 이전에 국소 부위로 도입할 수 있는 약물전달체를 제공하고자 한다.
본 발명에서, 상기 “생체적합성”은 생체조직 또는 혈액과 접촉하여 조직을 괴사시키거나 혈액을 응고시키지 않는 조직적합성 및 혈액적합성을 의미하며, “생체적합성 고분자”란 이러한 생체적합성을 갖추고 있는 고분자를 의미한다.
구체적으로, 상기 알긴산은 RGD(arginine-glycine-aspartic acid)의 펩티드를 알긴산 주사슬에 도입하여 하이드로젤화시킨 알긴산 하이드로젤일 수 있다.
구체적으로, 상기 히알루론산 또는 그 염 중 하나의 농도는 0.01 mg/ml 내지 100 mg/ml이고, 상기 히알루론산 또는 그의 염 중 하나의 분자량은 150X104 Da 내지 300X104 Da일 수 있으나, 이에 한정되지 않고 분자량에 상관없이 사용할 수도 있으며, 히알루론산에 특정 잔기가 치환된 히알루론산 유도체 또는 히알루론산의 염 형태로 사용될 수 있다.
상기 천연고분자 혼합물은 히알루론산 또는 그 염, 및 알긴산 하이드로젤의 비율은 2 : 1 내지 4 : 1의 비율일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서 천연고분자 혼합물로서 알긴산 하이드로젤을 첨가할 때 히알루론산 단독일 때 보다 약물의 지연방출 효과가 우수하게 나타남을 확인하였다(도 4).
이때, 알긴산 하이드로젤이 상기 2 : 1의 비율보다 더 첨가될 경우, 생체 내 도입 시 RGD 펩트드가 세포와 상호작용 시 세포들끼리 뭉치며 상분리가 발생할 수 있으며, 4 : 1보다 적은 비율로 첨가될 경우 지연방출의 우수한 효과가 충분히 발휘되지 않을 수 있다. 이에 본 발명에서는 히알루론산 또는 그 염 : 알긴산 하이드로젤은 2 : 1 내지 4 : 1의 비율로 포함하는 것이 바람직할 수 있다.
또한, 상기 천연고분자 혼합물은 유기물 및 리도카인을 포함할 수 있으며, 구체적으로 상기 유기물은 만니톨 및/또는 솔비톨로 이루어진 것 중에 어느 하나일 수 있다.
본 발명에서 “리도카인(lidocaine)”은 아미드형 국소마취제로서, 테트라카인 마취제보다 작용이나 지속시간 측면은 뒤떨어지나 독성이 약하여 일반적으로 많이 사용되고 있는 국소마취제이다. 상기 리도카인은 조직의 수축작용 및 동통억제작용을 가질 수 있으며, 주변조직의 염증성 단백질의 분비를 억제하는 기능을 가질 수 있다. 또한 지용성 단백질 결합능이 높고, 부말형태의 약제를 쉽게 용해시킬 수 있어 BMP, 히알루론산, 콜라겐 등의 단백질과 잘 용해되는 특징을 가지고 있어 용매제로 사용이 가능하다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 응고인자 혼합물에 솔비톨, 만니톨 및 리도카인을 포함하는 천연고분자 혼합물을 첨가한 서방성 국소 약물전달체에서 구조 안정성이 좋고, 특히 천연고분자 혼합물에 만니톨 및 솔비톨을 첨가할 때 히알루론산을 포함한 천연고분자 혼합물의 겔 생성능력을 향상시킴으로써 구조 안정성 및 효소 분해로부터 우수한 저항성을 가짐을 확인하였다(표 1 및 표 2).
본 발명에 따른 상기 서방성 국소 약물전달체는 트롬빈을 첨가할 수 있으며, 구체적으로 염화칼슘(CaCl2)과 같은 안정화 용액에 용해된 트롬빈을 첨가한 것일 수 있다.
본 발명에서 “트롬빈(thrombin)”은 혈액 응고에 관계되는 단백질 분해효소의 일종으로, 혈장 속에서는 프로트롬빈으로 존재하며, 출혈 시에 혈소판이 파괴되어 트롬보플라스틴이 혈장 중에 나오면 혈액의 칼슘이온의 존재 하에 활성화되어 트롬빈이 된다. 또한, 혈액 응고의 본질인 혈액 속의 가용성 피브리노겐을 가수분해하여 불용성인 피브린으로 변화시키는 반응을 촉매한다. 상기 트롬빈은 피브리노겐에 대한 기질 특이성이 매우 높고 피브리노겐의 아르지닌과 글리신 잔기 사이에 4개의 펩티드 결합을 자를 수 있으며, 최적 pH는 중성 또는 약알칼리성 부근이다. 주성분은 단백질로 최소분자량은 8,000이며 중합하기 쉬운 성질을 갖는다.
추가적으로, 상기 서방성 국소 약물전달체는 항균성 부여를 위해 항생제를 추가로 포함할 수 있다. 항생제는 당업계에 세균의 생육과 활성을 저지 또는 억제할 수 있다고 알려진 것이라면 어느 것이나 사용할 수 있으며, 대표적으로는 암피실린(ampicillin), 젠타마이신(gentamicin), 메틸파라벤(methyl paraben), 에틸파라벤(ethyl paraben), 페니실린(penicillin), 세팔로스포린(cephalosporin), 모노박탐(monobactam), 카바페넴(carbapenem), 아미노글리코사이드 (aminoglycoside), 마크롤라이드(macrolide), 테트라사이클린(tetracycline), 클로르암페니콜(chloramphenicol), 퀴놀론(quinolone), 반코마이신(vancomycin), 테이코플라닌(teicoplanin), 린코사미드(lincosamide), 메트로니다졸(metronidazole), 설폰아미드(sulfonamide), 트리메소프림(trimethoprim) 및 이들의 염이 포함되고, 이들은 단독 또는 2종 이상의 혼합물 형태로 사용될 수 있다. 이때 항생제는 각 항생제가 표적으로 하는 세균의 생육 및 활성을 저지하거나 억제하는데 최적으로 알려진 농도를 사용할 수 있다.
또한, 상기 서방성 국소 약물전달체는 단백질 약물을 포함할 수 있다.
본 발명에서 “단백질 약물”은 천연고분자와 특이적 결합이 가능한 모든 단백질 및 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 특히 BMP, VEGF, FGF, PDGF 등과 같은 성장인자, 케모킨, 세포외 기질 단백질 및 안티트롬빈 III(Antithrombin III) 중에서 선택된 하나 이상의 단백질일 수 있다. 구체적으로 본 발명에서는 BMP일 수 있으며, 보다 구체적으로 BMP-2 또는 BMP-7 중 어느 하나일 수 있으며, 재조합 단백질을 포함한다.
본 발명의 다른 일 측면은 상기 서방성 국소약물전달체에, BMP를 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는, 골재형성(bone remodeling) 부전으로 인해 유발되는 질환의 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
상기 골재형성 부전으로 인해 유발되는 질환은 골괴사증(osteonecrosis), 골수염(osteomyelitis), 골염(osteitis), 골형성장애(osteodystrophy), 골연화증(osteomalacia) 및 골다공증(osteoporosis)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상일 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 BMP를 유효성분으로 포함하는 서방성 국소약물전달체 외에 약제학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 이때, 약제학적으로 허용되는 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세 결정성셀룰로스, 폴리비닐피로리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필 히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 시간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있으며, 본 발명의 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명에 다른 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래 의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
구체적으로, 본 발명의 약제학적 조성물의 유효량은 환자의 연령, 성별, 상태, 체중, 체내에 활성 성분의 흡수도, 불활성율 및 배설속도, 질병종류, 병용되는 약물에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로는 체중 1kg 당 0.001 내지 150 mg, 바람직하게는 0.01내지 100 mg을 매일 또는 격일 투여하거나, 1일 1내지 3회로 나누어 투여할 수 있다. 또한, 투여 경로, 골 질환의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 일 측면은, 상기 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 골재형성 부전으로 인해 유발되는 질환을 치료하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에서 "개체"란 질병의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는, 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐(mouse), 개, 고양이, 말 및 소 등의 포유류를 의미한다.
본 발명의 또 다른 일 측면은, 피브리노겐 및 아프로티닌을 포함하는 응고인자 혼합물; 히알루론산 또는 그 염, 및 알긴산을 포함하는 천연고분자 혼합물; 및 안정화 용액에 용해된 트롬빈을 첨가한 서방성 국소 약물전달체를 손상 조직부위에 주입하여 겔화시키는 단계를 포함하는, 투여 방법에 관한 것이다.
본 발명의 피브리노겐, 아프로티닌, 히알루론산 및 알긴산 하이드로젤을 포함하는 천연고분자, 및 트롬빈을 포함하는 서방성 국소 약물전달체는 생체적합성이 우수하고, 약리활성물질의 지연방출효과로 적은 양의 약물로도 지속적인 약리활성 효과를 가질 수 있다.
또한 본 발명의 서방성 국소 약물전달체는 골 재생에 필요한 세포의 성장을 촉진시키므로, 생체에 이식 시 골 재형성에 우수한 효과를 가진다. 이에 국소 약물전달체에 BMP 등의 약물단백질을 적용함으로써 골재형성 부전으로 인해 발생하는 여러 가지 질환의 치료에 유용하게 사용할 수 있다.
본 발명의 효과는 상기 효과로 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 상세한 설명 또는 청구범위에 기재된 발명의 구성으로부터 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
도 1은 본 발명의 서방성 국소 약물전달체의 세포 독성 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 서방성 국소 약물전달체의 염증반응 유도 여부 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 서방성 국소 약물전달체의 세포 증식 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 서방성 국소 약물전달체의 BMP 서방출 효과의 시험관 내 관찰 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 서방성 국소 약물전달체의 준비 과정을 도식화하여 나타낸 것이다.
이하, 첨부된 도면을 참고하여 본 발명의 실시예에 관하여 상세히 서술하나, 하기 실시예에 의해 본 발명이 제한되지 아니함은 자명하다.
제조예.
제조예 1-1. 응고인자 혼합물 및 트롬빈 용액의 제조
먼저, 동결건조된 피브리노겐 75 mg/mL을 아프로티닌 용액 29,250 KIU/mL에 첨가하여 용해시킨 후 4 cc실린지에 담아두었다. 또한 동결건조된 트롬빈 29.5 IU/mL을 염화칼슘(CaCl2) 0.65 mg/mL에 첨가하여 0.4 cc에 담아두었다.
제조예 1-2. 천연고분자 혼합물의 제조
천연고분자 혼합물의 경우, 250 X 104 Da의 분자량을 갖는 소듐 히알루로네이트(NaHA) 겔 및 알긴산 하이드로젤을 3 : 1의 비율로 첨가하여 총 200 g을 제조하였다.
알긴산 하이드로젤은 RGD-알긴산으로서, 알긴산을 MES 수용액(0.1 M NaCl, pH 6.5)에 용해시켜 1%의 용액을 만든 후 알긴산 1 g당 sulfo-NHS 27.4 mg, EDC 16.7 mg를 첨가하고, RGD 펩타이드를 첨가하였다. RGD 펨타이드는 알긴산 1 g당 50 mg이 되도록 조절하였으며, 24시간 후 반응액을 3일간 투석시켜 미반응물을 제거하였다. 투석이 끝난 후 활성탄(activated charcoal) 처리 및 여과를 거친 후 동결건조하였다. 건조된 알긴산을 FBS가 없는 DMEM 용액에 용해시킨 후 주사기를 이용하여 50 μL의 황산칼슘 현탁액과 혼합하여 하이드로젤을 제조하였다. 형성된 하이드로젤은 지름 8 mm의 원형으로 잘라내어 FBS가 첨가되지 않은 DMEM 용액에 보관하였다. 이후 알긴산 하이드로젤을 얻기 위해 알긴산 농도 1.5%와 황산칼슘농도 0.85 M를 혼합한 하이드로젤을 제조하였다.
이후, 200 g의 천연고분자 혼합물을을 4번의 분획물로 나누었다.
다음과 같이 1~3번 분획물을 pH 7.0, 300 mOsm/kg가 되도록 제조하였다.
1번 분획물: 만니톨 1%, 솔비톨 1.5% 및 리도카인 0.3%를 첨가한 후, 스파툴라를 사용하여 10분 동안 겔을 혼합하였다.
2번 분획물: 글리세롤 1%, 솔비톨 1.5% 및 리도카인 0.3%를 첨가한 후, 스파툴라를 사용하여 10분 동안 겔을 혼합하였다.
3번 분획물: 만니톨 1%, 솔비톨 1.5%를 첨가한 후, 스파툴라를 사용하여 10분 동안 겔을 혼합한다.
실시예 및 비교예
실시예 1.
제조예 1-1의 응고인자 혼합물 4 cc, 트롬빈 용액 0.4 cc 및 제조예 1-2의 1번 분획물 2 cc를 첨가하여 혼합하였다.
비교예 1.
제조예 1-1의 응고인자 혼합물 4 cc, 트롬빈 용액 0.4 cc 및 제조예 1-2의 2번 분획물 2 cc를 첨가하여 혼합하였다.
비교예 2.
제조예 1-1의 응고인자 혼합물 4 cc, 트롬빈 용액 0.4 cc 및 제조예 1-2의 3번 분획물 2 cc를 첨가하여 혼합하였다.
비교예 3.
제조예 1-1의 응고인자 혼합물 4 cc, 트롬빈 용액 0.4 cc 및 제조예 1-2의 1번 분획물 2 cc를 첨가하여 혼합하였다. 다만, 제조예 1-2는 알긴산 하이드로젤을 포함하지 않으며, 소듐 히알루로네이트(NaHA)겔 100%로 이루어진 조성물에 만니톨 1% 및 솔비톨 1.5%를 첨가하여 혼합한 것이다.
실험예 1. 서방성 국소 약물전달체 조성물의 구조 안정성 확인
실험예 1-1. 구조 안정성 확인
상기 실시예 1, 비교예 1 내지 3의 조성물의 유동학적 차이 및 구조적 차이를 관찰하기 위하여 유동 측정(주파수 스위프 - 0.01 내지 100 Hz)을 수행하였다. 1Hz에서 G' (= 탄성 계수), G” (= 점성 계수) 및 Tanδ (= G”/G') 값들을 비교하였다.
구분 G'(1Hz) (Pa) G”(1Hz) (Pa) Tanδ(1Hz)
실시예 1 140 60 0.429
비교예 1 108 60 0.556
비교예 2 105 62 0.590
비교예 3 78 49 0.628
상기 표 1에서와 같이, 실시예 1, 비교예 1 내지 3에서 유동학적 차이 및 구조적 차이가 현저하게 나타났으며, 만니톨, 솔비톨 및 리도카인을 첨가한 실시예 1의 조성물에서 G'값이 높고 Tanδ은 낮게 나타나 우수한 탄성을 가짐을 확인하였다. 또한, 이와 같은 탄성계수는 약물전달체에 정상적인 세포의 생존, 증식 및 분화가 가능함을 시사한다.
실험예 1-2. 효소 분해에 대한 저항성 확인
상기 실시예 1, 비교예 1 내지 3의 효소 분해에 대한 저항성을 비교하기 위한 효소 분해 실험은 플레이트 형상 40 mm 및 간격 1,000 μm인 AR2000 레오미터 (TA instruments)를 사용하여 수행하였다. 시험 겔에 히알루로니다아제(hyaluronidase) 용액을 첨가하고, 1분 동안 스파튤라를 사용하여 균질화하고, 전체를 37℃의 온도에 두고 0.3%의 변형을 가하여 분해 시험을 수행한다. t=5분, t=30분 시점에 1Hz에서 파라미터 G'의 값을 측정한다.
구분 G'(1Hz) (Pa)
t=5분		 G'(1Hz) (Pa)
t=30분		 △G'(1Hz)
실시예 1 120 75 -37.5%
비교예 1 99 50 -49.5%
비교예 2 100 52 -48.0%
비교예 3 68 30 -55.9%
상기 표 2에서와 같이, 본 발명의 실시예 1에서 △G'의 절대값이 가장 낮게 나타남으로써, 효소 분해로부터 우수한 저항성을 가짐을 확인하였다.
실험예 2. 약물전달체의 세포 독성시험 및 염증 반응 유도 가능성 테스트
실험예 2-1. 세포 독성시험 확인
상기 실시예 1의 세포 독성 가능성을 골수간엽줄기세포에서 MTT(Microculture Tetrazolium) assay로 평가하였다. 골수간엽줄기세포(1X104 cells/well)을 96-웰(well) 플레이트에 배양하고 1, 10, 100, 100nM의 실시예 1, 비교예 1 내지 3의 서방성 약물전달체를 각각 처리하였다. 1, 4, 7일 후 50 μL의 MTT(Microculture Tetrazolium) 용액을 처리하고 3시간 배양한 후, MTT 용액을 제거하였으며, 150 μL의 DMSO 용액을 분주하고 10분 동안 반응시킨 후 570nm에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 일주일 동안 1nM, 10nM, 100nM의 서방성 국소 약물전달체를 세포에 처리하였을 때, 세포 독성이 없는 것을 확인하였다(도 1).
실험예 2-2. 염증 반응 유도 가능성 확인
상기 실시예 1의 세포 내 염증반응 유도 가능성을 염증성 사이토카인(cytokine)인 IL-6의 분비량 측정을 통하여 확인하였다. 연골 세포 (1×105 cells/well)를 6-웰(well) 플레이트에 배양하고 Lipopolysaccharide(LPS), 서방성 국소 약물전달체 1μg/well를 처리하였다. 시간별로 배양액을 수거하여 분비된 IL-6를 enzyme-linked immunoabsorbent assay (ELISA)로 정량하였다.
그 결과, 양성 대조군으로서, 세균의 Lipopolysaccharide (LPS)를 처리한 그룹이 높은 IL-6의 분비를 유도한 반면, 실시예 1의 서방성 국소 약물전달체를 처리한 그룹은 아무것도 처리하지 않은 음성대조군과 마찬가지로 IL-6 분비가 거의 없음을 확인하였다. 이에, 본 발명은 약물전달체로 활용 시 염증반응을 유도하지 않아 뛰어난 생체적합성을 가짐을 보여준다(도 2).
실험예 3. 약물전달체의 세포 증식에 미치는 영향 확인
본 발명의 세포의 성장을 측정하기 위하여, 조골 세포(MG63)를 사용하여,
각 시간에 따라 20 ul의 MTS 용액(CellTiter96®Aqueous solution kit, Promega)을 첨가한 후, 37℃, 5% 이산화탄소 조건에서 4시간 동안 실시예 및 비교예와 반응시킨 다음, ELISA leader(SpectraMAX M3, Molecular Devices)를 이용하여 490nm에서 흡광도를 측정하여 성장율을 측정하였다. 세포의 성장은 미토콘드리아 활성에 기초하는 MTS 어세이를 통해 관찰하였다.
그 결과, 실시예 1의 피브리노겐, 천연고분자 혼합물(히알루론산 및 알긴산 하이드로젤) 및 트롬빈 용액을 혼합한 약물전달체에서 배양 5일 후부터 세포의 성장이 유의성있게 증가함을 보였으며, 비교예 3과 현저한 차이가 나는 것은 아니지만, 세포 성장이 약간 높게 나타나면서, 피브리노겐이 세포의 부착과 퍼짐을 유도하고, 천연고분자의 생체적합성의 향상에 따라 세포 증식의 증가에 영향을 준 것으로 판단된다(도 3).
실험예 4. 약물단백질의 서방출 효과 및 안정화 효과 확인
본 발명의 서방성 국소 약물전달체의 서방출과 안정화 효과를 확인하기 위한 실험을 수행하였다.
먼저 상기 실시예 및 비교예 1 내지 3의 조성물을 고속 원심분리하여 PBS 용액에 재분산시킨 후 BMP-2(Peprotech, cat# 120-02)를 충진하였으며, 실시예 및 비교예 1 mg 당 20 ng의 BMP를 섞고 가볍게 교반하면서 4℃에서 하루정도 인큐베이션을 수행하였다. 이후 투석용 튜브(dialysis, MWCO 500K)에 넣은 후, 무한 희석조건을 만족하는 과량의 PBS 용액을 이용하여 방출된 BMP를 회수하고, 회수된 BMP 양은 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)를 이용하여 정량하였다. PBS 용액은 매일 새로운 용액으로 교체하였고, 단백질 정량시까지 회수된 샘플은 -30℃ 이하에서 보관하였다.
그 결과, 히알루론산만 첨가된 경우 5일 이내이 충진량의 15%가 방출된 반면, 히알루론산 및 알긴산을 모두 첨가한 약물전달체는 초기 약물방출없이 16일까지 충진된 BMP의 약 20%가 지속적으로 방출되었다(도 4). 이와 같은 실험 결과를 통해, 본 발명의 약물전달체가 서방형 국소 약물전달체로서 효과가 우수함을 확인하였다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다.
본 발명의 범위는 후술하는 청구범위에 의하여 나타내어지며, 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (9)

  1. 피브리노겐 및 아프로티닌을 포함하는 응고제 혼합물;
    히알루론산 또는 그 염 : 알긴산 하이드로젤이 2 : 1 내지 4 : 1의 중량비율로 혼합된 천연고분자 혼합물; 및
    트롬빈 용액;을 포함하는 서방성 국소 약물전달체로서,
    상기 피브리노겐 및 아프로티닌의 혼합비율은 1: 0.05~0.5(w/w)이며,
    상기 알긴산 하이드로젤은 RGD(arginine-glycine-aspartic acid) 펩티드가 결합된 알긴산 및 황산칼슘을 혼합한 것이며,
    상기 천연고분자 혼합물은 솔비톨, 만니톨 및 리도카인이 1 : 1.5 : 0.3의 중량비로 혼합된 것이고,
    유효성분으로서 BMP-2(bone morphogenic protein)가 탑재되는 것을 특징으로 하는, 서방성 국소 약물전달체.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 제1항에 있어서,
    상기 서방성 국소 약물전달체는 항생제를 추가로 포함하는 것인, 서방성 국소 약물전달체.
  6. 삭제
  7. 제1항의 서방성 국소약물전달체에, BMP-2(bone morphogenic protein)를 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는,
    골재형성(bone remodeling) 부전으로 인해 유발되는 골괴사증(osteonecrosis), 골수염(osteomyelitis), 골염(osteitis), 골형성장애(osteodystrophy), 골연화증(osteomalacia) 및 골다공증(osteoporosis)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상 질환의 치료용 약학적 조성물.
  8. 삭제
  9. 삭제
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