KR100810736B1

KR100810736B1 - 다당류-기능화 나노입자 및 수화젤 담체를 포함하는복합체, 이를 포함하는 서방형 약물전달 제제, 뼈충진제 및이들의 제조방법

Info

Publication number: KR100810736B1
Application number: KR1020060078894A
Authority: KR
Inventors: 태기융; 정용일; 이종호; 박용두
Original assignee: 광주과학기술원
Priority date: 2006-08-21
Filing date: 2006-08-21
Publication date: 2008-03-07
Also published as: KR20080017161A

Abstract

본 발명은 (1) 생분해성 고분자로 이루어진 코어, 생체적합성 고분자 유화제로 이루어진 외부의 수화젤막, 및 상기 코어 및 상기 수화젤막에 물리적으로 고정되어 있는 다당류를 포함하는 다당류-기능화 나노입자; (2) 상기 다당류와 특이적으로 결합하고 있는 단백질; 및 (3) 상기 단백질이 특이적으로 결합되어 있는 나노입자의 담체로서 생체적합성 고분자로 이루어진 수화젤 담체를 포함하는 나노입자-단백질-수화젤 복합체, 이를 포함하는 서방형 약물전달제제, 서방형 뼈충진제 및 이들의 제조방법에 관한 것이다. 나아가, 본 발명에서는 다당류의 함량 및/또는 나노입자의 함량을 변화시킴으로써 단백질 약물의 방출속도를 조절하는 방법도 또한 개시하고 있다.

다당류-기능화 나노입자, 수화젤 담체, 나노입자-단백질-수화젤 복합체, 서방형, 뼈충진제 단백질약물 방출속도 조절

Description

다당류-기능화 나노입자 및 수화젤 담체를 포함하는 복합체, 이를 포함하는 서방형 약물전달 제제, 뼈충진제 및 이들의 제조방법{A composite comprising polysaccharide-functionalized nanoparticle and hydrogel matrix, a drug delivery system and a bone filler for sustained release comprising the same, and the preparation method thereof}

도1은 본 발명의 일 구현예에 따른 서방형 뼈형성단백질(bone morphogenetic protein; 이하 'BMP') 전달제제인 다당류-기능화 나노입자로부터 방출되는 BMP의 누적방출량(%)을 나타낸 그래프이다.

도2는 본 발명의 일 구현예에 따른 서방형 BMP 전달제제인 기능성 나노입자-수화젤 복합체로부터 방출되는 BMP의 누적방출량(%)을 나타낸 그래프이다.

도3은 쥐의 두개골에 결손부가 형성된 모습 및 상기 결손부에 본 발명의 일 구현예에 따른 서방형 뼈충진제를 이식하는 일련의 과정을 보여주는 사진이다.

도4는 본 발명의 일 구현예 및 비교예의 경우에 있어서, 골의 형성능력을 소프트 X-ray 분석을 통하여 비교하여 평가한 결과이다(A: 비교예, B: 본 발명의 일 구현예).

도5는 본 발명의 일 구현예 및 비교예의 경우에 있어서, 골의 형성능력을 결 손부위의 조직학적 분석을 통하여 비교하여 평가한 결과이다(A: 비교예, B: 본 발명의 일 구현예).

본 발명은 나노입자-단백질-수화젤 복합체, 이를 포함하는 서방형 약물전달제제, 서방형 뼈충진제 및 이들의 제조방법에 관한 것이며, 또한 상기 나노입자 단위질량 당 다당류의 함량 및/또는 상기 복합체의 단위질량 당 나노입자의 함량을 변화시켜 단백질 약물의 방출속도를 조절하는 방법에 관한 것이다.

뼈충진제는 부분적으로 손상되어서 없어진 뼈부분을 대체하는 역할을 한다. 단순히 없어진 부분을 보충하는 것이 아니고, 신체 안에서 그 부분으로 새로운 뼈가 자라 들어갈 수 있도록 도와주어야 한다. 이러한 뼈충진제는 정형외과에서 사지 및 척추의 골절 또는 골절 탈구, 불유합 또는 지연 유합, 종양이나 골수염 등을 제거한 후에 남는 골 결손부 등에 골 형성 촉진과 골 조직 결손 치환 등이나, 치과에서 치조골이 결손된 경우에 사용될 수 있다.

현재 일반적으로 사용되고 있는 방법으로는 필요한 뼈형태를 직접 필요한 부분에 이식하는 것인데, 이식재료는 자가골, 동종골 및 이종골, 합성골 등이다. 먼저, 자가골은 환자의 몸에서 얻은 뼈부분을 배양하여 사용하는 것으로, 1) 높은 골형성 혹은 골유도 가능성, 2) 이식된 골의 치유와 생활골로의 빠른 전환, 3) 용도에 따라 다양한 형태로 채취가 가능한 장점이 있으나 [J. Foot Ankle Surg. 1996;35:413-7], 1) 공여돠는 양의 한계, 2) 공여부에서의 2차 수술 및 수술시간의 증가, 3) 공여부에서의 골 결손과 신경손상, 질병 발생 병가능성 등의 합병증 및 연장된 회복기간 등의 단점을 가지고 있다 [Clin. Orthop. 1996;329:300-9, Spine 1995;20:1055-60, J. Bone Joint Surg. Br. 1988;70:431-4, Br. J. Neurosurg 2000;14:476-9, J. South Orthop. Assoc. 2000;9:91-7, Spine 2000;25:2400-2, J. Bone Joint Surg. Br. 1989;71-B:677-80, J. Orthop. Trauma 1989;3:192-5]. 다음으로, 동종골 및 이종골의 사용은 1) 2차적 수술부가 필요없어 빠른 수술시간과 회복기간, 2) 합성골 이식재에 비하여 저렴한 비용 등의 장점이 있으나 [AORN J. 1999;70:660-70, Orthop. Clin. North Am. 1999;30:685-98], 1) 자가골에 비하여 약 2배정도의 골유도기 2) 골화과정에서 많은 양의 흡수, 3)형성된 골의 골질이 좋지 않고, 면역반응 또는 감염의 위험성 등의 단점이 있다 Clin. Orthop. 1972;18:19-27, J. Bone Joint Surg. Am. 1983;65-A:239-46, J. Appl. Biomater. 1991;2:187-208, J. Arthroplasty 2000;15:368-71, J. Bone Joint Surg. Br. 2001;83(1):3-8, J. Bone Joint Surg. Br. 1999;81:333-5, Orthop. Clin. North Am. 1987;18:235-9]. 그 외에, 합성골은 히드록시아파타이트(hydroxyapatite), 트리칼슘포스페이트(tricalcium phosphate), 칼슘 알루미네이트, 플라스틱, 금속 등의 물질을 사용하는데, 1) 동종골 이식재에 비하여 항원반응이 적은 장점이 있으나, 1) 충진제 안으로 뼈 형성이 잘 되지 않고, 2) 독성 및 생체적합성에 문제가 있으며, 3) 자가골과 혼합해 사용하는 재료로서 가장 많이 사용되고 있지만, 흡수가 많이 되며, 골재생의 효과가 적고, 섬유 조직이 개개의 입자를 둘러싸게 되기도 하여 임상적으로 만족할 만한 효과를 보이지 못하고 있다 [Biomaterials 2000;21:2615-21, Clin. Orthop. 1989;240:53-62, Orthop. Clin. North Am. 1999;30:591-8]. 또한, 이러한 뼈이식 방법들은 공통적으로 시술 후 형태나 공간을 유지하지 못하고 변형되는 문제를 가지고 있다.

최근에는 분자치료(molecular therapy)를 이용하여 손상된 뼈조직을 재생시키고자 하는 방법들이 새롭게 시도되고 있다. 이는 성장인자(growth factors), 신호분자(signaling molecules), 전사인자(transcription factors), 그 밖의 주효인자(other effectors)를 포함하는 기능성 단백질 분자들을 일정기간 손상된 조직부위에 공급하여 조직재생과정의 가속화를 위한 초기단계 활성화를 유도하는 접근방식이다. 특히, 성장인자 전달을 통한 조직재생은 조직공학(tissue engineering)적인 관점에서 매우 중요하며 뼈조직 재생과 관련된 대상 성장인자로는 BMP가 주로 이용된다. 궁극적으로 BMP를 사용하는 방법은 자가골에 비해 보다 효과적인 골재생 방법으로 예측되고 있다.

BMP는 골형성에 관여하는 골기질 내 단백질(bone matrix protein)로 Urist [Science 1965; 150: 893-899]에 의해 최초로 언급되었다. 적어도 15가지 이상의 BMP family members [Science 1988; 242: 1528-1534]가 존재하며 이들은 골골격의 형성과 재생에 매우 중요한 역할을 담당하는 TGF-β(transforming growth factor beta) superfamily에 속한다. 이밖에도 BMP는 세포의 분열(cell division), 사멸 (apoptosis), 이동(cell migration) 및 분화(differentiation) 등에 다양하게 관여되고 있으며 [Genes Dev. 1996; 10(13): 1580-94], 배아형성과정(embryogenesis)에서 팔다리싹(limb bud)의 발달 [Mech Dev 1997; 69(1-2): 197-202] 및 이소성 골형성(ectopic bone formation) [Acta Orthop Scand 1996; 67(6): 606-10], 중간엽 전구세포(mesenchymal progenitor cells)의 골모세포(osteoblasts) 혹은 연골세포(chondrocytes)로의 분화 [J. Cell Biochem 1997; 66(3): 394-403, J. Cell Biol 1998; 140(2): 409-18, Bone 1998; 23(3): 223-31, Exp Cell Res 1999; 251(2): 264-74]등에 있어서 중요한 신호분자이다.

대상 성장인자의 선정과 함께 대상 단백질의 방출 및 전달방식의 효율성이 성장인자 전달을 통한 조직재생에 있어 가장 중요한 요소이다. 일반적으로 조직 결손부위의 자연치유 과정 중 결손부위의 가장자리에서는 조직재생을 위한 세포의 증식(proliferation) 및 세포외 기질(extracellular matrix)을 구성하는 분자들이 생성되지만, 신호분자들이 지속적으로 공급되지 않기 때문에 효과가 매우 일시적이고 제한적이 된다 [J. Orthop Sports Phys Ther 1998; 28(4): 192-202]. 이와 같이 성장인자 전달을 통한 조직재생에 있어 지속적인 신호분자의 전달이 가능한 서방형 성장인자 전달시스템의 개발은 매우 중요하다.

지난 수년간 성장인자의 국소전달을 위한 다양한 서방형 시스템 개발이 시도되었으나 현재까지는 이상적인 시스템이 구성되지 못한 상태이며, 최근에는 지지체 기반(matrix-based)의 약물전달시스템이 개발되어 뼈조직 재생 이외의 여러 조직재생에 적용되고 있다. 지지체 기반의 시스템을 개발, 적용하기 위해서는 기본적으 로 비면역성(non-immunogenic), 무독성(non-toxic), 생체적합성(biocompatible), 생분해성(biodegradable), 용이한 제조(easily manufactured) 등의 조건을 만족해야 하며, 신호분자는 시스템 내에서 안정화되고 방출경향이 조절 가능해야 하며 구조적인 강도가 요구되기도 한다. BMP 전달을 통한 뼈조직 재생과 관련하여 다음과 같이 다양한 소재를 기반으로 한 성장인자 전달시스템이 개발되었다.

가장 일반적으로 사용되는 무기물 소재로는 뼈의 주요 구성성분인 hydroxyapatite(HAP, Ca₁₀(PO₄)₆(OH)₂)가 있다 [Spine 1999; 15: 1179-1185, J. Biomed. Mater. Res. 2000; 51: 491-499]. 이밖에도 β-tricalcium phosphate(β-TCP, β-Ca₃(PO₄)₂), calcium phosphate-based cement(CPC)와 calcium sulfate, 금속, bioglass 등이 무기물 기반 소재에 포함된다 [In Society for Biomaterials, 6th World Biomaterials Congress 2000: p.1135, J. Orthop Res. 2003; 21(6): 997-1004, J. Biomed. Mat. Res. 1997; 35: 421-432, US 4596574, 4619655].

HAP 자체로만 지지체를 구성하는 경우 골모세포의 세포부착력이 우수하며 조직의 칼슘화가 우수한 장점을 갖지만 HAP와 BMP 상호간의 강한 결합력으로 인해 골유도 결과가 좋지 못하고 지지체로 결손부위를 완전히 메울 수 없고, 또한 깨지기 쉬운 단점이 있다. 이를 보완하기 위해 β-TCP나 collagen과 혼합하여 지지체의 체내 흡수속도를 조절하였으며 다공성 지지체를 구성하여 골유도에 있어 개선된 결과를 얻었다 [Spine 1999; 15: 1179-1185, Clin. Orthop. 1988; 234: 250-254, Int. Orthop.(SICOT) 1996; 20: 321-325, J. Med. Dent. Sci. 1997; 44: 63-70, US 5001169, 5352715].

CPC의 경우, 주사형으로 제조가능하고 골 결손부위를 메울수 있어 기존 시스템의 단점을 개선하였으나 경화되는 과정동안 발생되는 열로 인해 BMP가 비활성화되고. 이에 따른 경감된 효과가 생길 수 있다. 또한, 방사선 비투과성 물질이므로 방사선 촬영을 통한 결과분석이 어렵다 [J. Oral Maxillofac. Surg. 1999; 57: 1122-1126, Biomaterials 2003; 24: 2995-3003].

천연 고분자재료로는 콜라겐(collagen), 피브린(fibrin), 알지네이트(alginate), 히알루론산(hyaluronic acid)등이 적용되었다.

콜라겐의 경우 원료물질을 이종개체로부터 얻지만 면역원성 텔로펩타이드(immunogenic telopeptide)의 제거기술이 발달되어 원료물질에 의한 이물반응을 최소화할 수 있게 되었으며 스폰지 형태의 구성이 가능하여 현재까지 임상적으로 흔히 적용되는 재료중의 하나이다 [J. Bone Jt Surg Am 2002;84-A:2123-34, Spine 2003;28:372-7, J. Bone Jt Surg Br 1999;81:710-8, Spine 2002;27:2654-61, EP 0206801, US 4394370, 4975527]. 하지만 성장인자의 과다한 초기방출(initial burst) 로 인해 고가인 BMP를 과량으로 지지체내에 충진해야 하는 경제적인 부담과 [Trends Biotechnol. 2001;19(7):255- 265], 이식 초기의 과다한 성장인자의 농도에 따른 질병전이의 잠재적인 위험성이 존재한다 [Clin Orthop Relat Res 1990;260:263-79, Nat Med 1998;4:141-4, Nature 1998;391:320-4].

피브린은 피브린 글루(fibrin glue)라는 임상용 접착제로서 사용중인 고분자소재로 혈액응고(blood coagulation)과정 중 형성되고 지혈(hemostasis) 및 상처치 유(wound healing)과정에서 중요한 역할을 담당한다. 피브린 수화젤 내에 서방형 시스템을 도입하기 위해 헤파린을 포함하는 피브린 수화젤이 개발되었으며 분자내에 헤파린 결합부위가 있는 성장인자들을 대상으로 서방형 시스템의 구성이 보고되었다. 이 경우 헤파린과 정전기적 상호작용이 가능한 펩타이드를 우선 수화젤내에 공유결합시키는 방식으로 헤파린을 수화젤 내에 고정시켰다 [J. Control Release 2000; 65(3): 389-402, US 6468731, 6723344]. 일반적으로 피브린 수화젤은 자체로서 서방형 시스템은 아니지만 예외적으로 대상 성장인자가 nonglycosylated BMP-2인 경우에 단백질의 수화젤 내 용해도가 낮아 서방형 시스템으로 작동할 수 있다는 보고가 있다 [J. Orthop Res 22 (2004) 376-381].

다당류에 속하는 알지네이트는 비황산화 음이온성 천연 고분자소재로 L-glucuronic acid와 D-mannuronic acid의 공중합체로서 Ca++ 이온과의 결합을 통해 쉽게 수화젤 형성이 가능하지만, 수화젤 형성시 세포, 단백질, DNA 등의 생물학적 활성의 심각한 상실을 초래하며 수화젤 내 기공크기가 상대적으로 커서 거대분자가 쉽게 확산되어 나오는 문제가 있다 [Adv Drug Deliv Rev 1998; 31(3): 267-85, US 6748954].

히알루론산은 고유의 물리화학적, 생물학적 성질을 갖는 다당류로서 세포외 기질내 다수의 단백질을 특이적으로 인식하고 프로테오글리칸과 상호작용을 통해 세포외 기질을 안정화한다 [J. Intern Med 1997; 242(1): 27-33]. Cell behavior에 영향을 주는 세포표면과의 상호작용이 가능하며 cell mobility 변화에도 관여한다 [FEBS Lett 1998; 440(3): 444-9]. BMP 국소전달을 목적으로 하는 히알루론산 소재의 지지체는 화학적 교차결합을 이용하는 경우와 소수성 기능기를 도입하는 경우가 보고되었다 [J. Control Release 1999; 61(3): 267-79, J. Biomed Mater Res 1999; 47(2): 152-69, J. Biomed Mater Res. 2002; 59(3): 573-84, WO 0128602]. 이중 소수성 기능기를 도입한 경우 서방형 시스템의 구성이 가능하지만 지지체내의 계면 상에서 단백질 입체구조가 불안정해지는 단점을 갖는다.

무기물 소재의 지지체나 천연 고분자소재로 구성된 지지체 이외에도 다양한 합성 고분자소재를 이용한 지지체가 BMP전달을 통한 뼈조직 재생과 관련되어 개발되어 왔다. PLGA(poly(DL-lactide-co-glycolide)), PLA(poly(L-lactide)), PGA(polyglycolide)등의 폴리에스테르 계열의 고분자가 가장 널리 적용되고 있으며 [J. Vet Med Sci 1998;60(4):451-8, Bone 2003;32(4):381-6, J. Bone Joint Surg Am 1999;81(12):1717-29, J. Biomed Mater Res 1999;46(1):51-9, J. Biomed Mater Res 2002;61(1):61-5, J. Biomed Mater Res 2000;50(2):191-8, J. Biomed Mater Res 1999;45(1):36-41, US 4186448, 4563489, 5133755] 이밖에도 polyanhydride, polyphosphazene계열과 polypropylene fumarate, polyethylene glycol-PLA, poloxamer, polyphosphate 고분자 등이 사용되고 있다 [J. Biomed Mater Res 1990;24:901-11, Adv Drug Deliv Rev 2003;55(4):467-82, Clin Orthop 1999;41(367suppl.):S118-29, Clin Orthop 1993;109(294):333-43, Plast Reconstr Surg 2000;105(2):628-37, J. Biomed Mater Res 1997;34:95-104, US 4526909].

합성 고분자재료는 가공하기 쉬운 장점이 있어 지지체의 다공성 조절 및 다양한 형태 구성이 가능하며 체내에서 효소 및 세포작용에 의해 분해될 수 있다. 반면에 분해 시 국소적으로 pH가 낮아져 주변조직에 영향을 주고 과도한 염증반응 및 분자량이 큰 고분자의 경우 분해속도가 느려 만성염증 증상이 관찰되기도 한다. 또한 고분자의 체내 분해양상이 bulk erosion일 경우 서방형 시스템의 구성이 어렵고 [Biomaterials 2000;21:1837-1845, Macromolecules 1987;20:2398-403, J. Control Release 1991;16:15-26] 지지체 내에 BMP가 인트랩(entrap)되었을 때에 단백질의 구조적인 변성이 일어나게 된다.

상기와 같은 종래기술의 문제점을 해결하기 위하여, 본 발명은 나노입자-단백질-수화젤 복합체을 이용함으로써 초기방출이 억제되고 서방출 효과가 현저하게 증진된 서방형 약물전달제제, 서방형 뼈충진제 및 이들의 제조방법을 제공하는데 그 목적이 있다. 나아가, 본 발명에서는 약물의 서방출 거동에 국한하지 않고, 나노입자 단위질량 당 다당류의 함량 및/또는 복합체의 단위질량 당 나노입자의 함량을 변화시킴으로써 단백질 약물의 방출속도를 조절하는 방법의 제공 또한 그 목적으로 하고 있다.

본 발명의 일 측면에 따르면, (1) ① 생분해성 고분자로 이루어진 코어, ② 생체적합성 고분자 유화제로 이루어진 외부의 수화젤막, 및 ③ 상기 코어 및 상기 수화젤막에 물리적으로 고정되어 있는 다당류를 포함하는 다당류-기능화 나노입자; (2) 상기 다당류와 특이적으로 결합하고 있는 단백질; 및 (3) 상기 단백질이 특이적으로 결합되어 있는 나노입자의 담체로서 생체적합성 고분자로 이루어진 수화젤 담체를 포함하는 나노입자-단백질-수화젤 복합체에 관한 것이다.

본 발명의 다른 측면에 따르면, 상기 복합체 및 성장인자, 케모킨, 세포외 기질 단백질, 안티트롬빈 III 중에서 선택된 하나 이상의 단백질 약물 유효량을 포함하는 서방형 약물전달제제에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 상기 단백질 약물 중에서도 BMP나 변형 성장인자(transforming growth factor-beta, 이하 TGF-beta)를 포함하고, 그 외에도 혈관내피증식인자(vascular endothelial growth factor, 이하 'VEGF'), 선유아세포증식인자(fibroblast growth factor, 이하 'FGF'), 혈소판조직성장인자(platelet－derived growth factor, 이하 'PDGF') 중에서 선택된, 뼈 형성에 관여하는 성장인자에 대한 서방형 성장인자 전달제제에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 본 발명의 다양한 구현예에 따른 서방형 성장인자 전달제제를 포함하는 서방형 뼈충진제에 관한 것이다.

상기 측면의 바람직한 일 구현예에 따르면, 본 발명의 서방형 성장인자 전달제제는 (1) ① 폴리(D,L-락티드-co-글리콜리드) (이하 'PLGA'), 폴리(락트산), 폴리(글리콜산), 폴리(ε-카프로락톤), 폴리(δ-발레로락톤), 폴리(β-하이드록시부티레이트) 또는 폴리(β-하이드록시발러레이트) 중에서 선택된 하나 이상의 생분해성 고분자로 이루어진 코어, ② 폴락사머(poloxamer), 폴락사민(poloxamine), 폴리(비닐 알코올), 또는 알킬 알콜의 폴리에틸렌 글리콜 에테르 중에서 선택된 하나 이상의 생체적합성 고분자 유화제로 이루어진 수화젤막, 및 ③ 상기 코어 및 상기 수화젤막에 물리적으로 고정되어 있는 헤파린, 알지네이트, 히알루론산, 키토산 중에서 선택된 하나 이상의 다당류를 포함하는 다당류-기능화 나노입자; 및 (2) 상기 다당류와 특이적으로 결합하고 있는 유효량의 성장인자로서, BMP나 TGF-beta를 포함하고, 그 외에 VEGF, FGF, PDGF 중에서 선택된 성장인자; 및 (3) 상기 성장인자가 특이적으로 결합되어 있는 나노입자의 담체로서 폴리(에틸렌 글리콜), 폴락사머, 폴리(오르가노포스파젠), 올리고(폴리(에틸렌 글리콜)푸마레이트), 콜라겐, 젤라틴, 피브린, 히알루론산, 알지네이트 중에서 선택된 하나 이상의 생체적합성 고분자로 이루어진 수화젤 담체를 포함하는 것이 바람직하다.

다른 바람직한 일 구현예에 따르면, 본 발명의 서방형 뼈충진제는 (i) 세포를 없앤 자가골, 동종골, 이종골; (ii) HAP, 트리칼슘 포스페이트, 칼슘 알루미네이트, β-TCP, CPC, 칼슘 설페이트, 바이오글래스를 추가로 포함하는 것이 골형성 작용을 증진시키는 측면에서 바람직하다. 또한 (iii) 이식초기 뼈충진제에 뼈세포의 친밀성을 증진시켜 이물에 대한 거부감을 줄이고 뼈형성을 증강시킨다는 측면에서 세포부착 단백질를 추가하는 것이 더욱 바람직하며, 최종적으로 인체조직만 남도록 수화젤 분해를 가속화시키는 측면에서 분해성 펩티드 링커를 추가로 포함시키는 것이 바람직하다. 이러한 본 발명의 서방형 뼈충진제는 골다공증, 골절, 골절탈구, 불유합, 지연유합, 골 결손, 치조골 결손 중에서 선택된 하나 이상의 질병의 치료 또는 예방용으로 사용될 수 있다.

본 발명에 있어서, "생분해성 고분자"는 pH가 6-8인 생리적 용액(physiological solution)에 노출되었을 때 분해할 수 있는 고분자를 의미하며, 바람직하게는 생체 내에서 체액 또는 미생물 등에 의해서 분해될 수 있는 고분자를 의미한다.

본 발명에서 사용가능한 생분해성 고분자의 대표적인 예에는 화학식1의 폴리(락티드-co-글리코리드), 폴리(락트산), 폴리(글리콜산), 폴리(ε-카프로락톤), 폴리(δ-발러로락톤), 폴리(β-히드록시부티레이트), 폴리(β-히드록시발러레이트) 또는 이들의 조합이 포함될 수 있으나, 이에 한정되지 않으며, 특히 다당류가 첨가된 유화제 수용액에 첨가되어 다당류로 기능화된 나노입자를 제조하기에 충분하기만 하면 위에 예시한 고분자에 한정되지 않는다. 다만, 이 중에서도 미국 FDA에서 생체 내 독성이 없는 것으로 승인을 받은 폴리(락티드-co-글리콜리드)를 사용하는 것이 바람직하다.

본 발명에 있어서, 올리고머 또는 고분자들의 "조합"이란 열거된 각 고분자의 용융상 또는 액상 혼합물(blend)뿐만 아니라, 이들의 모든 종류의 공중합체의 의미를 포함하며, 또한 단량체들의 "조합"이란 이러한 단량체에 의한 호모올리고머 또는 호모고분자(homopolymer)들의 조합을 의미한다.

생분해성 고분자의 분자량이 5,000 미만이면 나노입자를 형성하는데 분자 자체의 응집이 어려워 수율이 감소하며 입자내에 다당류가 불안정하게 고정되는 문제가 발생하므로 생분해성 고분자는 중량평균 분자량이 5,000-100,000이 바람직하며, 특히 10,000-20,000이 더욱 바람직하다.

본 발명에 있어서, "생체적합성"은 생체조직 또는 혈액과 접촉하여 조직을 괴사시키거나 혈액을 응고시키지 않는 조직적합성(tissue compatibility) 및 혈액적합성(blood compatibility)을 의미하며, "생체적합성 고분자"란 이러한 생체적합성을 갖추고 있는 고분자를 의미한다.

본 발명에 있어서, "생체적합성 고분자 유화제"란 생체적합성을 지니면서, 분리된 2개 이상의 상을 혼화시키는 유화성을 함께 지닌 고분자를 의미한다.

본 발명에서 사용가능한 생체적합성 고분자 유화제의 대표적인 예에는 폴락사머, 폴락사민, 폴리(비닐 알코올), 알킬 알콜의 폴리에틸렌 글리콜 에테르 또는 이들의 조합이 포함될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 그 중에서도 생체 내 독성이 없는 것으로 미국 FDA가 승인한 폴락사머를 사용하는 것이 바람직하다.

본 발명의 생체적합성 고분자 유화제는 중량평균분자량이 바람직하게는 5,000- 100,000, 더욱 바람직하게는 10,000-20,000이며, 친수성부분이 이중 60-80%를 구성하도록 선택하며 상기 범위를 벗어나는 경우 나노입자의 불안정한 분산으로 인한 수득율 감소 및 기능성 다당류의 고정화가 어려운 문제점이 발생할 수 있다.

본 발명에 있어서, "다당류-기능화 나노입자" 또는 "기능성 나노입자" 또는 이와 동일한 의미로 사용되고 있다고 해석되는 용어에 대해서는, 본 발명의 제조예 에서 예시한 바와 같이 다당류를 통해서 단백질과 물리적 결합을 할 수 있는 기능성을 부여한 나노입자를 의미한다.

한편, 본 발명에 있어서, "생체적합성 고분자로 이루어진 수화젤 담체", "생체적합성 고분자 수화젤 담체", "수화젤 담체 제조용 생체적합성 고분자" 및 이와 동일한 의미로 사용되고 있다고 해석되는 용어에 대해서는, 본 발명에서 예시하고 있는 생체적합성 고분자에 한정되지 않고 종래에 수화젤 담체로 사용되고 있는 모든 종류의 생체적합성 고분자를 사용할 수 있으며, 합성고분자인지 또는 천연고분자인지를 불문한다.

그 중에서도, 본 발명에서 사용될 수 있는 수화젤 담체 제조용 생체적합성 고분자의 대표적인 예에는 폴리(에틸렌 글리콜), 폴락사머, 폴리(오르가노포스파젠), 올리고(폴리(에틸렌 글리콜)푸마레이트)과 같은 합성고분자; 및 콜라겐, 젤라틴, 피브린, 히알루론산, 알지네이트과 같은 천연고분자; 및/또는 이들의 조합이 포함되나 이에 한정되지 않는다.

특히, 하기 실시예에서는 이러한 수화젤 담체 제조용 생체적합성 고분자로서, 고분자 내에 세포 결합자리와 당아미노글라이칸 결합자리가 공존하고 수화젤 제조가 용이하며 조직접합 및 국소지혈제로서 임상적 적용이 일반화된 피브린을 사용하여 실험을 진행하였으나 반드시 이에 한정되지 않으며, 본 발명이 목적하는 효과인 서방출 효과 및 약물방출 조절효과를 달성할 수 있고 또한 생체적합성을 지니고 있기만 하다면 그 종류에 상관없이 사용가능하다.

본 발명에 있어서, 상기 생체적합성 고분자로 이루어진 수화젤 담체는 이식초기에 이식된 공간을 채우는 충진제의 역할 뿐만 아니라 뼈 조직이 자라서 들어오는 담체로서도 작용을 한다. 또한, 상기 복합체 내에 충진된 단백질 또는 단백질 약물은 1차적으로 나노입자 내의 다당류와 특이적 결합을 형성하여 안정화되고, 나아가서 수화젤 담체 내에서 부가적으로 안정화될 수 있는 역할을 본 발명의 수화젤 담체가 담당하기도 한다.

본 발명에 있어서, 다당류가 코어 및/또는 수화젤막에 "물리적으로 고정"되어 있다는 것은 "'화학반응을 통한 화학결합' 이외의 방식에 의해 고정"되어 있다는 의미이며, 따라서 흡착(adsorption), 응집(coheison), 사슬엉킴(entanglement), 잡힘(entrapment) 등과 같은 물리적 고정뿐만 아니라, 수소결합 또는 반데르발스결합과 같은 전기적 상호작용이 그 단독으로 또는 상기 물리적 고정과 함께 작용하여 발생되는 비화학적 고정을 포함하는 개념이다.

본 발명에서는, 다당류가 코어 및/또는 수화젤막에 물리적으로 고정되고 별도의 화학적 반응을 통한 구조 및 물성의 변화가 발생하지 않기 때문에, 그 각 구성성분이 생체적합성을 가지고 있다면 본 발명에 따른 복합체, 서방형 약물전달시스템, 서방형 뼈충진제 역시 생체적합성을 지니고 있다는 장점이 있다.

본 발명에 있어서, 단백질 또는 단백질 약물 등이 나노입자, 구체적으로는 다당류에 "특이적으로 결합"되어 있다는 것은 단백질 또는 단백질 약물이 나노입자에 존재하는 다당류의 특수한 구조에 기초하여 결합되어 있는 것으로, 수용체-리간 드의 특이적 결합 또는 항원-항체의 특이적 결합과 같이 서로 상보적인 화학구조에 기초하여 결합되어 있음을 의미한다. 이러한 특이적 결합은 공유결합 또는 비공유 결합을 모두 포함하며, 특히 단백질의 3차원 구조를 유지하고 생물학적 활성을 증가시키며 가수분해를 저해하여 단백질을 안정화시키는 다당류-단백질 간의 상호작용을 포함하는 개념이다.

또한, 이러한 특이적 결합은 본 발명의 복합체가 생체조건에서 상대적으로 안정한 상태로 유지될 수 있는 정도의 최소한의 결합력과 분리되어 서방출 효과를 나타낼 수 있는 정도의 분리가능한 결합력을 가지고 있어야 한다는 점은 본 발명의 목적에 비추어 자명하다고 할 것이다. 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자라면 "Eur. J. Biochem. 1996;237:295-302" 또는 "Biochem Soc Trans. 2006;34:458-6" 등의 선행기술에 기초하여 명확히 이해될 수 있는 의미이다. 이러한 단백질 약물과 다당류 간의 상호작용은 단백질 약물의 초기방출을 크게 줄여 서방출 효과를 증진시키는 역할을 하게 된다.

본 발명에 있어서 '다당류'는, 성장인자, 케모킨, 세포외 기질 단백질, 안티트롬빈 III 등과 같은 다양한 단백질 또는 펩타이드와 특이적 결합을 하며 이를 통해 단백질의 3차원 구조를 유지하고 생물학적 활성을 증가시키며 가수분해를 저해하여 단백질을 안정화시키는 역할을 할 수 있는 모든 다당류가 사용될 수 있다. 다만, 상기 복합체 내에서 코어 및 수화젤막과 충분한 물리적 결합력을 얻고 또한 제조된 나노입자의 안정성 측면에서 다당류의 분자량이 바람직하게는 3,000-100,000, 더욱 바람직하게는 8,000-15,000의 분자량을 가지는 것이 좋다.

본 발명에서 사용가능한 다당류의 대표적인 예에는 아래 화학식2의 헤파린, 알지네이트, 히아루론산, 키토산 또는 이들의 조합이 포함될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 그 중에서도 생체 내 독성이 없는 것으로 미국 FDA가 승인한 음이온성 다당류인 헤파린을 사용하는 것이 바람직하다.

본 발명에서 사용되는 '단백질 약물'은 다당류와 특이적 결합이 가능한 모든 단백질 및 폴리펩티드를 포함하며, 특히 BMP, VEGF, FGF, PDGF 등과 같은 성장인자, 케모킨, 세포외 기질 단백질, 및 안티트롬빈 III(Antithrombin III) 중에서 선택된 하나 이상의 단백질이 바람직하다. 바람직한 일 구현예에 따르면, 성장인자 중에서도 골유도 효과를 보이는 BMP-2, BMP-4, BMP-6, BMP-7, BMP-8, BMP-9 중에서 선택된 하나 이상의 BMP를 사용할 수 있다.

본 발명의 서방출 성장인자 전달제제 및 서방출 뼈충진제 있어서, 상기 다당류는 상기 나노입자 1 mg 당 2-100 μg이 포함되는 것이 바람직한데, 상기 범위를 벗어나는 경우에 각각 단분산성의 나노입자 수득이 어려운 문제점 및 나노입자의 서방출 효과가 감소하는 문제점이 발생할 수 있기 때문이다. 또한, 방출경향 및 약물의 국소적 유효량을 고려하여 상기 나노입자 1 mg 당 0.01-5 μg의 상기 성장 인자가 포함되는 것이 바람직하다.

본 발명의 일 구현예에 따른 서방형 약물전달시스템 및 서방형 뼈충진제 내에 존재하는 나노입자는 최종제품의 멸균과정을 멸균필터를 사용하여 간단하게 처리할 수 있다는 측면에서 직경이 400 nm 이하인 것이 바람직하고, 또한, 나노입자의 표면전하는 대상 단백질에 따라 결정되며 효과적인 충진을 고려하여 +20 mV 이상인 것과 -40 mV 이하인 것이 바람직하다. 또한, 특히 다분산 지수는 0.1 미만인 것이 바람직하며, 이는 일반적으로 다분산 지수가 0.1 미만인 경우 안정적인 단분산 분포를 갖는 나노입자로 간주하기 때문이다. 또한, 본 발명의 일 구현예에 따른 서방형 성장인자 전달제제는 복합체에 포함된 세포의 정상적인 생존, 증식 및 분화가 가능하도록 수화젤이 완전히 형성된 후 관찰된 탄성계수(elastic modulus, G')가 200-20,000 Pa 사이의 범위에서 값을 갖도록 하는 것이 바람직하며, 이는 하기에 설명된 생체적합성 고분자 수용액 농도 및 가교인자의 제공정도를 변화시켜 조절할 수 있다.

본 발명은 상기한 복합체, 서방형 약물전달제제, 서방형 뼈충진제의 제조방법도 개시하고 있다.

이에 따른 일 측면에 의하면, (a) ① 생분해성 고분자를 저농도에서 세포독성이 없는 유기용매에 용해하여 유기용액을 수득하는 단계, ② 다당류 및 생체적합성 고분자 유화제를 물에 녹여 수용액을 수득하는 단계, 및 ③ 상기 유기용액을 상기 수용액에 첨가하여 분산시키는 단계를 포함하는 다당류-기능화 나노입자의 제조 단계; (b) 상기에서 제조된 다당류-기능화 나노입자에 단백질을 충진함으로써 단백질이 충진된 다당류-기능화 나노입자를 제조하는 단계; (c) 수화젤 담체 제조용 생체적합성 고분자 수용액에 상기에서 제조된 단백질이 충진된 다당류-기능화 나노입자를 분산시키는 단계; 및 (d) 상기 (c)단계에서 제조된 분산액에 가교제, 가교활성제, 물리적 가교인자 중에서 선택된 하나 이상의 가교인자를 제공하여 상기 수화젤 담체 제조용 생체적합성 고분자를 가교시키는 단계를 포함하는 나노입자-단백질-수화젤 복합체의 제조방법에 관한 것이다.

이에 따른 다른 측면에 의하면, 상기 복합체의 제조방법에 있어서 성장인자, 케모킨, 세포외 기질 단백질, 안티트롬빈 III 중에서 선택된 하나 이상의 단백질 약물 유효량을 충진하는 단계를 포함하는 서방형 약물전달제제의 제조방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 상기 단백질 약물 중에서도 BMP, VEGF, FGF, PDGF 중에서 선택된 하나 이상의 성장인자를 유효량 충진하는 단계를 포함하는 서방형 성장인자 전달제제의 제조방법에 관한 것이다.

이에 따른 또 다른 측면에 의하면, 본 발명의 다양한 구현예에 따른 서방형 약물전달제제를 골 또는 치조골의 결손부에 적합하도록 주형을 이용하여 성형하는 단계를 포함하는 서방형 뼈충진제의 제조방법에 관한 것이다.

상기 측면의 바람직한 일 구현예에 따르면, 본 발명의 복합체 제조방법은 (a) ① 폴리(D,L-락티드-co-글리콜리드), 폴리(락트산), 폴리(글리콜산), 폴리(ε-카프로락톤), 폴리(δ-발레로락톤), 폴리(β-하이드록시부티레이트) 또는 폴리(β- 하이드록시발러레이트) 중에서 선택된 하나 이상의 생분해성 고분자를 저농도에서 세포독성이 없는 유기용매에 용해하여 유기용액을 수득하는 단계, ② (i) 헤파린, 알지네이트, 히알루론산, 키토산 중에서 선택된 하나 이상의 다당류 및 (ii) 폴락사머(poloxamer), 폴락사민(poloxamine), 폴리(비닐 알코올), 또는 알킬 알콜의 폴리에틸렌 글리콜 에테르 중에서 선택된 하나 이상의 생체적합성 고분자 유화제를 물에 녹여 수용액을 수득하는 단계, 및 ③ 상기 유기용액을 상기 수용액에 첨가하여 분산시키는 단계를 포함하는 다당류-기능화 나노입자의 제조단계; (b) 상기에서 제조된 다당류-기능화 나노입자에 BMP나 TGF-beta를 포함하고, 그 외에 VEGF, FGF, PDGF 중에서 선택된 성장인자를 유효량 충진함으로써 성장인자가 충진된 다당류-기능화 나노입자를 제조하는 단계; (c) 폴리(에틸렌 글리콜), 폴락사머, 폴리(오르가노포스파젠), 올리고(폴리(에틸렌 글리콜)푸마레이트), 콜라겐, 젤라틴, 피브린, 히알루론산, 알지네이트 중에서 선택된 하나 이상의 수화젤 담체 제조용 생체적합성 고분자의 수용액에 상기에서 제조된 성장인자가 충진된 다당류-기능화 나노입자를 분산시키는 단계; 및 (d) 상기 (c)단계에서 제조된 분산액에 글루타르알데히드, 디에폭사이드, 카르보디이미드 중에서 선택된 가교제; 트롬빈, 혈액응고인자 XIII, 이들의 혼합물 중에서 선택된 가교활성제; 온도, pH, 분자 간 특이적 결합(specific interaction) 중에서 선택된 물리적 가교인자 중에서 선택된 하나 이상의 가교인자를 제공함으로써 상기 수화젤 담체 제조용 생체적합성 고분자를 가교시키는 단계를 포함하는 것이 바람직하다.

우선 상기 (a)단계에 있어서, 상기 ①단계의 상기 유기용액은 나노입자 제조단계 시 생분해성 고분자의 응집으로 인한 손실을 최소화하는 측면에서 농도가 0.5-2.0%(w/v)인 것이 바람직하고; 상기 ②단계의 상기 수용액은 입자 외부에 형성되는 수화젤막의 두께, 효율적인 입자형성을 위한 수용액의 점도를 고려하여 생체적합성 고분자 유화제의 농도가 0.01-5%(w/v)인 것이 바람직하다.

생분해성 고분자가 녹아있는 유기용매는 이후에 다당류가 첨가된 생체적합성 고분자 유화제가 용해된 수용액에 분산되어 다당류-기능화 나노입자를 형성시키는데, 이때 생체적합성 고분자 유화제가 용해된 수용액에 첨가되는 다당류의 양은 나노입자의 다분산 지수(polydispersity)와 수득률을 고려하여 수용액 상의 생체적합성 고분자 유화제 질량 대비 10% 이하를 유지하는 것이 바람직하다.

또한, 상기 ③단계에서 유기용액과 수용액의 함량비율은 특별한 한정을 요하는 것은 아니지만 나노입자 내 유기용매의 잔류와 이로 인한 세포독성을 고려하여, 유기용액의 부피를 수용액 부피 대비 10% 이하로 하는 것이 바람직하다.

또한, 상기 (b)단계는 (b') 상기 다당류-기능화 나노입자를 분산매에 재분산시키는 단계 및 (b'') 상기 재분산액에 상기 성장인자 수용액을 첨가하여 유효량을 충진하는 단계를 포함하도록 수행하는 것이 더욱 바람직하다.

상기 (b')단계에 있어서, 상기 다당류-기능화 나노입자 재분산액은 최종 이식제의 부피 및 강도를 고려하여 농도가 25%(w/v)이상인 것이 바람직하고, 상기 (b'')단계에서 상기 성장인자의 용액은 단백질 입체구조의 안정성 측면에서 PBS(phosphate buffered saline), PB(phosphate buffer), 트리스(Tris), 헤페스 (Hepes) 버퍼 중에서 선택된 하나 이상의 용매를 사용하여 제조되는 것이 바람직하고, 또한 농도도 최종 이식제의 부피 및 강도를 고려하여 0.01-0.5%(w/v)로 하는 것이 바람직하다.

또한, 상기 (c)단계에 있어서 수화젤 담체의 제조는 (i) 상기 (c)단계에서 기재하고 있는 바와 같이, 폴리(에틸렌 글리콜), 폴락사머, 폴리(오르가노포스파젠), 올리고(폴리(에틸렌 글리콜)푸마레이트), 콜라겐, 젤라틴, 피브린, 히알루론산, 알지네이트 중에서 선택된 하나 이상의 수화젤 담체 제조용 생체적합성 고분자의 수용액에 상기에서 제조된 성장인자가 충진된 다당류-기능화 나노입자를 분산시킬 수도 있으나, 이에 한정되지 않고, (ii) 상기 열거한 생체적합성 고분자의 단량체 또는 이의 올리고머의 수용액에 나노입자를 분산시키고 나서 상기 단량체 또는 올리고머를 중합 및/또는 가교시킬 수도 있다.

또한, 상기 (d)단계에서 수화젤 담체 제조용 생체적합성 고분자를 가교시키기 위한 가교제, 가교활성제 및 온도, pH, 분자간 특이적 결합(specific interaction)등과 같은 화학적, 물리적 가교인자의 제공정도는 복합체에 포함된 세포의 정상적인 생존, 증식 및 분화가 가능하도록 수화젤이 완전히 형성된 후 관찰된 탄성계수가 200-20,000 Pa 사이의 범위에서 값을 갖도록 조절하는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명의 일 구현예에 따른 서방형 뼈충진제의 제조방법은 (e) 골다공증, 골절, 골절탈구, 불유합, 지연유합, 골 결손, 치조골 결손 중에서 선택된 하 나 이상의 질병으로 인하여 형성된 골 또는 치조골의 결손부에 적합하도록 상기 성장인자 전달제제를 주형을 이용하여 성형하는 단계를 포함하는 것이 바람직하다.

또한, 상기 (e)단계를 수행함에 있어서는 (e)단계의 수행 전 및/또는 수행 후 및/또는 (e)단계의 수행과 동시에 (f) ① 세포를 없앤 자가골, 동종골, 이종골, ② HAP, 트리칼슘 포스페이트, 칼슘 알루미네이트, β-TCP, CPC, 칼슘 설페이트, 바이오글래스, 및 ③ 세포부착 단백질, 분해성 펩티드 링커 중에서 선택된 하나 이상의 성분을 첨가하는 단계를 추가로 수행하는 것이 바람직하다.

본 발명에 있어서, "저농도에서 세포독성이 없는 유기용매"란 나노입자 내에 잔류할 수 있는 정도의 저농도에서 세포독성이 없다고 보고된 유기용매를 의미한다. 바람직하게는 10%(w/w) 미만의 농도에서 세포독성이 없다고 보고된 디메틸술폭사이드(이하, 'DMSO') 또는 테트라글리콜이 바람직하나, 이에 한정되지는 아니한다.

또한 본 발명에 있어서, '수용액'의 용매로서의 '물'은 특별한 독성 등을 나타내지 않는 생체 내 적합성을 보이는 것이라면 모두 사용가능하며, 특별히 증류수 등에 한정되지 않는다.

또한, 유기용액을 수용액에 첨가하여 분산시키는 등과 같이 본 발명에서 사용된 분산방법은 통상적으로 당업계에서 사용되는 분산방법이면 모두 사용가능하다.

본 발명에 있어서, "유효량"이란 통상적인 분석방법에 의하여 본 발명의 다 양한 구현예에 따른 단백질 약물이 본 발명이 목적하는 치료 또는 예방효과를 낼 수 있도록 하는 최소한의 양을 의미하며, 특히 골다공증의 개선, 정형외과에서의 사지 및 척추의 골절 또는 골절 탈구, 불유합 또는 지연 유합, 종양 또는 골수염 등을 제거한 후에 남는 골 결손부 등에서의 골 형성 촉진, 골 조직 결손 치환이나 치과에서 치조골이 결손된 경우에 뼈를 재생시키거나 생성을 유도하여 이를 개선 또는 치료하는 효과를 낼 수 있는 최소한이 양을 의미한다.

이러한 유효량은 본 발명이 속한 당업계의 당업자라면 해당 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효 성분 및 다른 성분의 종류 및 함량, 제형의 종류 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 기초하여 용이하게 결정할 수 있다.

나아가, 본 발명은 위에서 살펴본 바와 같은 서방형 약물전달제제 및 이의 제조방법을 제공하고 있을 뿐만 아니라, 필요에 따라서 방출거동을 크게 변화시켜 단백질 약물의 방출속도를 다양하게 조절하는 방법 또한 제공하고 있다.

특히, 상기에서 설명한 상기 서방형 약물전달제제의 제조방법에 있어서, (A) (i) 상기 (a)②단계에서 상기 수용액 내의 다당류의 농도를 변화시키거나, 또는 (ii) 상기 (a)③단계에서 상기 유기용액 및 수용액의 혼합비율을 변화시킴으로써, 상기 나노입자 단위질량당 다당류의 함량을 변화시키는 방법; (B) 상기 (c)단계의 상기 수화젤 담체 제조용 생체적합성 고분자 수용액에서, 상기 다당류-기능화 나노 입자 및 상기 수화젤 담체 제조용 생체적합성 고분자의 농도비를 변화시킴으로써 상기 복합체 단위질량 당 나노입자의 함량을 변화시키는 방법; 또는 상기 (A)방법 및 상기 (B)방법을 병용하여 수행함으로써 단백질 약물의 방출속도를 조절할 수 있다.

또한, 하기의 실시예에서는 이러한 약물 방출속도를 조절하는 구체적인 실험 절차에 대해서 기재하고 있지는 않지만, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자라면 본 발명의 상기 단락의 기재내용에 기초하여 충분히 용이하게 다당류의 농도 또는 유기용액 및 수용액의 혼합비율을 변화시켜 나노입자 단위질량 당 다당류의 함량을 변화시킬 수도 있으며, 또한 기능성 나노입자와 수화젤 담체 제조용 생체적합성 고분자의 농도비를 변화시켜 복합체 단위질량 당 나노입자의 함량을 변화시킬 수도 있을 것이라는 점은 자명하다.

실시예

이하 본 발명의 내용을 실시예를 통해 구체적으로 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 설명하기 위한 것으로 본 발명의 권리범위를 한정하는 것은 아니다.

A. 1단계: 나노입자 제조단계

1. 비교제조예: 친수화된 수화젤막을 갖는 나노입자의 제조

PLGA 40 mg를 디메틸술폭사이드 2 mL에 완전히 용해시킨 다음, 5% 폴락사머 수용액 30 mL에 천천히 첨가하여 나노입자를 제조하였다. 나노입자 용액 중 입자생성에 참여하지 않은 폴락사머와 디메틸술폭사이드는 고속 원심분리 후 상층액을 분리하는 방식으로 제거되었으며 회수된 나노입자는 증류수 혹은 PBS(phosphate buffered saline, pH 7.4)용액에 재분산 되었다.

2. 제조예1-5: 헤파린-기능화 나노입자의 제조

헤파린이 각각 10, 30, 60, 120, 240 mg 포함된 5% 폴락사머 수용액 30 mL에 PLGA 40 mg가 용해된 디메틸술폭사이드 2 mL을 천천히 첨가하여 나노입자를 제조하였다. 나노입자 용액에 존재하는 과량의 헤파린, 폴락사머와 디메틸술폭사이드는 고속 원심분리 후 상층액을 분리하는 방식으로 제거되었으며 증류수 혹은 PBS 용액을 이용하여 회수된 나노입자를 재분산시켰다.

3. 제조실험예: 헤파린-기능화 나노입자의 입자크기, 표면전하, 구성성분 질량비, 다분산 지수 관찰

오츠카 전자(Otsuka Electronics Co.)의 ELS-8000을 사용하여 동적 광산란법에 의해 제조된 나노입자의 크기를 측정하였으며 전기영동 광산란법을 이용하여 입자의 표면 전하를 측정하였다.

폴락사머 수용액 상의 헤파린 양을 증가시킴에 따라 합성된 나노입자의 표면전하는 -26.0±1.1 에서 -44.4±1.2 mV로 증가하였으며 크기는 123.1±2.0에서 188.1±3.9로 변화하였다. 헤파린이 강한 음전하를 띤 물질이므로, 음의 값으로 증가하는 표면전하는 생성된 입자의 표면에 더 많은 헤파린이 존재함을 나타낸다.

입자를 구성하는 각 성분의 질량비를 얻기 위해 우선 나노입자 용액을 동결 건조하여 나노입자의 건조 무게를 계산하였다. 입자 상태로 anti-factor Xa 분석(C. Chauvierre et al., Biomaterials 25 (2004) 3081-3086)을 통해 입자 표면층에 존재하는 헤파린의 내의 헤파린 양을 계산하였고, 입자를 녹여 전체 헤파린을 수거한 후 anti-factor Xa 분석을 통하여 입자내 전체 헤파린 양을 계산하였다. 최종적으로 ¹H NMR 분석을 통해 입자 내 PLGA와 폴락사머의 비를 계산하여 각 성분의 질량비를 결정하였다(표1).

표1에 나타내었듯이, 물리적으로 고정화된 헤파린은 대부분 입자표면층에 존재하고, 또한, 제조된 입자에서 강하게 결합되지 않은 헤파린과 폴록사머는 고속 원심분리에 의해서 제거되었으므로, 헤파린이 PLGA 나노입자 내에 물리적 방법에 의해 고정화되었으며 대부분 폴락사머로 구성된 입자 표면층내에 존재한다는 것을 알 수 있었다. 수화젤층을 만드는 폴록사머는 폴록사머의 소수성부분과 역시 소수성인 PLGA와의 인력에 의해서 입자제조시 안정화되는 것으로 생각되고, 헤파린의 카르복실그룹이 폴록사머의 친수성부분인 폴리에틸렌글리콜부분과의 인력에 의해서 입자생성 중 헤파린이 표면층에 고정화되는 것으로 생각된다.

비교제조예, 제조예2, 제조4에 의해 제조된 나노입자를 구성하는 각 성분의 질량비를 표1에 나타내었다.

나노입자 내 각 성분의 질량비

수용액 내 헤파린(mg)	PLGA(mg)	폴락사머(mg)	입자 표면층의 헤파린(mg)	입자 내 전체 헤파린(mg)
0	36.8±1.6 (72.7%)	13.8±0.6 (27.3%)	0.0 (0.0)	0.0 (0.0)
30	34.7±0.9 (70.6%)	13.3±0.4 (27.0%)	0.94±0.04 (1.9%)	1.20±0.04 (2.4%)
120	29.0±1.8 (66.9%)	12.3±0.8 (28.4%)	1.71±0.09 (4.0%)	2.01±0.10 (4.7%)

표1에 나타난 바와 같이, 폴락사머 수용액 내에 용해된 헤파린의 양이 증가할수록 입자 표면의 수화젤에 존재하는 헤파린의 양도 따라서 증가하는 결과를 보였다. 그러나, 나노입자의 다분산 지수와 수득률을 고려하여 폴락사머 수용액내에 첨가되는 헤파린의 양은 120 mg 이하를 유지 하는 것이 바람직하다. 특히, 폴락사머 수용액 내 헤파린 양이 0, 30, 120 mg인 조건에서 제조한 나노입자의 경우에 각각 0, 2.4, 4.7 중량%의 헤파린이 포함된 나노입자가 만들어졌다.

B. 2단계: 단백질충진 나노입자 제조단계

1. 비교제조예: 모델단백질 라이소자임이 충진된 나노입자의 제조

1단계 비교제조예에서 제조한 나노입자를 고속 원심분리를 통해 분리하여 PBS 용액에 재분산시킨 후 모델 단백질인 라이소자임 1 mg을 충진하였다.

2. 제조예1-2: 모델단백질 라이소자임 충진 헤파린-기능화 나노입자의 제조

1단계 제조예 2, 4에서 각각 제조한 나노입자를 고속 원심분리를 통해 분리하여 PBS 용액에 재분산시킨 후 모델 단백질인 라이소자임 1 mg을 충진하였다.

3. 제조예3-4: VEGF 충진된 헤파린-기능화 나노입자의 제조

1단계 제조예4에서 제조한 나노입자를 이용하여 위 2단계 제조예1-2과 동일한 방법으로 VEGF를 충진하였다. 나노입자 1 mg 당 각각 15.6 ng 및 156 ng의 VEGF를 충진하였다.

4. 제조예5 : BMP 충진된 헤파린-기능화 나노입자의 제조

1단계 제조예4에서 제조된 나노입자를 이용하여, 나노입자 용액에 존재하는 과량의 헤파린, 폴락사머와 DMSO는 고속 원심분리 후 상층액을 분리하는 방식으로 제거되었다. 그리고 나서, 40 μL의 PBS를 이용하여 회수된 나노입자를 재분산시킨 후에 BMP-2(Peprotech, cat# 120-02)를 충진하였으며, 나노입자 1 mg 당 156 ng의 BMP를 섞고 가볍게 교반하면서 4℃에서 하루정도 인큐베이션을 수행하였다.

5. 제조실험예2: 모델단백질 라이소자임 서방출 효과 및 안정화 효과의 시험관 내 관찰

상기 2단계 비교제조예, 제조예1-2에서 제조한 약물이 충진된 나노입자에 대해서 단백질 약물의 서방출과 안정화 효과를 확인하기 위하여, 다음과 같은 시험관 내 조건으로 방출양상을 측정하였다.

라이소자임이 충진된 나노입자 분산용액을 투석용 튜브(dialysis tube, MWCO 500k)에 넣은 후, 무한 희석조건을 만족하는 과량의 PBS 용액을 이용하여 방출된 라이소자임을 회수하고 그 양을 Micro BCA 단백질 정량법을 이용하여 정량하였다. 라이소자임 회수에 사용되는 PBS 용액은 매일 새로운 PBS 용액으로 교체되었고 단백질 정량 시까지 샘플은 4℃에서 보관되었다.

헤파린이 포함되지 않은 나노입자의 경우에는 3일 이내에 충진량의 2/3가 방출되었으며 나노입자 내 고정화된 헤파린 양이 증가함에 따라 단백질의 서방출 형태가 관찰되었다. 반면, 헤파린 함량이 4.7 중량%인 나노입자의 경우 초기 약물방출 없이 최대 19일까지 방출이 진행되었다.

또한, 헤파린으로 기능화된 나노입자로부터 방출된 라이소자임의 생물학적 활성을 측정하였으며, 이를 통해 나노입자의 수화젤막내에 고정화된 헤파린에 의해 충진된 단백질이 안정화됨을 확인하였다.

6. 제조실험예2: BMP의 서방출 효과의 시험관 내 관찰

상기 2단계 제조예5에서 제조한 약물 충진 나노입자에 대해서 다음과 같이 시험관 조건 하에서 BMP의 방출양상을 측정하였다. BMP가 충진된 나노입자 분산용액을 투석용 튜브(MWCO 500k)에 넣은 후에, 무한 희석조건을 만족하는 과량의 PBS 용액을 이용하여 방출된 BMP를 회수하고, 회수된 BMP 양은 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)를 이용하여 정량하였다. PBS 용액은 매일 새로운 용액으로 교체하였고 단백질 정량 시까지 회수된 샘플은 -30℃ 이하에서 보관하였다.

헤파린 함량이 4.7 중량%인 1 mg의 나노입자 당 BMP 156 ng을 충진한 경우, 초기방출이 관찰되지 않았으며 15일까지 충진된 BMP의 24%가 지속적으로 방출되었다(도 1). 이로써 서방형 BMP 전달을 위한 헤파린-기능화 나노입자의 활용가능성을 확인하였다.

C. 3단계: BMP 충진 헤파린-기능화 복합체(약물전달제제)의 제조단계

1. 실시예1: BMP 충진 헤파린-기능화 복합체(약물전달제제)의 제조

상기 2단계 제조예4에서 회수된 나노입자를 재분산시킨 후에 BMP를 충진하고 나서 얻어진 최종 분산액 중에서 26 μL를 농도가 7-12%(w/v)인 피브리노겐 용액 70 μL와 균일하게 혼합한 후 가교활성제인 트롬빈 용액을 피브리노겐 용액과 동일부피로 추가 혼합함으로써 나노입자 수화젤 복합체를 제조하였다.

상기 피브리노겐 수용액은 피브리노겐(71.5-126.5 mg), 혈액응고인자 XIII(44-88 U)과 아프로티닌(1,100 KIU)을 주성분으로 하며, 동결건조된 피브리노겐을 나머지 구성성분을 포함하는 수용액으로 녹여 제조하였으며, 최종 농도는 수용액 1 mL 당 65-115 mg의 피브리노겐, 40-80 U의 혈액응고인자, 및 1000 KIU의 아프로티닌으로 조절하였다.

상기 트롬빈 용액은 트롬빈(400-600 IU)이 용해된 염화칼슘 용액이며, 동결건조된 트롬빈을 나머지 구성성분을 포함하는 수용액으로 녹여 제조하였으며, 최종 농도는 400-600 IU의 트롬빈이 1.2 mL의 0.6%(w/v) 염화칼슘 용액에 용해되어 있도록 조절하였다. 또한, 최종적으로 두 용액을 섞은 후에 실온에서 30분 동안 인큐베이션시켰다.

2. 실험예1: BMP의 서방출 효과의 시험관 내 관찰

상기 실시예1에서 제조한 복합체(약물전달제제)에 대해서 다음과 같이 시험관 조건 하에서 BMP의 방출양상을 측정하였다.

BMP가 충진된 헤파린-기능화 복합체를 제작하여 방출용기에 넣은 후에, 무한 희석조건을 만족하는 과량의 PBS 용액을 이용하여 방출된 BMP를 회수하고, 회수된 BMP 양은 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)를 이용하여 정량하였다. PBS 용액은 매일 새로운 용액으로 교체하였고 단백질 정량 시까지 회수된 샘플은 -30℃ 이하에서 보관하였다.

실시예1에서 제조한 바와 같이, 헤파린 함량이 4.7 중량%인 1mg의 나노입자 당 156ng의 BMP를 충진한 경우, 초기방출이 관찰되지 않았으며 15일까지 충진된 BMP의 23%가 지속적으로 방출되었다(도2). 이로써 서방형 BMP 전달을 위한 헤파린-기능화 복합체의 활용가능성을 확인하였다.

D. 4단계: BMP 충진 헤파린-기능화 뼈충진제의 제조단계

1. 실시예1: 단백질충진 헤파린-기능화 복합체를 포함하는 뼈충진제의 제조

상기 3단계의 실시예1에서 제조한 복합체를 주형 내에서 성형하였으며, 특히 시스템을 쥐 두개골 결손모델에 적용하기 위해 지름 8 mm, 높이 2.1 mm 규격의 원반형으로 준비하였다.

2. 실험예 및 비교실험예: 서방형 BMP 뼈충진제 및 수화젤 담체 각각에 대한 생체 내 골 형성능 평가

실험예로서, 쥐 두개골 결손모델을 사용하여 서방형 BMP 뼈충진제의 생체 내 골 형성능 평가하였다. 상기 실시예1에서 제조한 뼈충진제를 쥐 12마리의 골결손부에 이식하였다(도3).

또한 비교실험예로서, 동일한 조건에서 쥐 12마리의 골결손부에 대해 이식을 수행하였으나, 다만 상기 뼈충진제 대신에 수화젤 담체만을 이식하였다. 다만, 예비실험을 통해 두개골 결손 제작 시 발생하는 출혈문제가 골형성을 지연시킬 수 있다고 판단되어 출혈문제가 최소화되도록 노력하였다.

4주째 동물을 희생시키고 소프트 x-ray를 촬영하였다(30KVP, 1.5mA, 거리: 52cm, 노출: 90초). 실험예2의 12마리에서는 모두 골형성이 관찰되었으며, 일부 시편에서는 두개골 결손을 완전히 재생시키지는 않았으나 비교실험예에 비해서는 현격히 양호한 골형성이 이루어졌다(도4).

또한, 조직학적 분석을 위하여 EDTA를 이용하여 탈회 후 MT염색을 통하여 골형성을 관찰하였다. 실험예2의 재생 골 조직 사진에서는 콜라겐 및 콜라겐 안쪽에 고립되어 있는 골세포(osteocyte), 골수세포, 콜라겐과 골수세포 영역의 경계부분에 있는 골아세포(osteoblast)와 용골세포(osteoclast)를 포함하는 완전한 골형성을 관찰할 수 있었으며, 비교실험예에서는 골결손부 변연으로부터 일부 골형성이 되었으나, 실험예2에 비하여 현저하게 떨어졌다(도5). 위의 결과로부터 본 발명의 뼈충진제의 골형성 능력을 확인하였다.

상기에서 보는 바와 같이, 본 발명에 따른 복합체를 포함하는 서방형 약물전달제제 및 서방형 뼈충진제는 기존의 골형성 유도법에 비해 시스템의 제조공정이 간단하고, 환자의 경제적 부담 및 골형성 효과를 획기적으로 개선시킬 수 있는 장점을 지닐 뿐만 아니라, 나노입자-수화젤 복합체 시스템은 조직공학에서 중요한 다른 성장인자 전달시스템으로도 적용이 가능하여 다른 조직의 복원에도 쉽게 응용이 가능하다. 이와 같은 서방형 BMP 전달시스템을 이용한 뼈충진제는 정형외과, 성형외과, 치과 등에서 광범위하게 적용될 수 있는 기술로서, 본 시스템의 장점을 이용하면 기존에 형성되어 있는 의료시장 외에 신규로 훨씬 큰 시장규모가 발생할 수 있을 것으로 기대된다.

Claims

(1) ① 생분해성 고분자로 이루어진 코어,

② 생체적합성 고분자 유화제로 이루어진 외부의 수화젤막, 및

③ 상기 코어 및 상기 수화젤막에 물리적으로 고정되어 있는 다당류를 포함하는 다당류-기능화 나노입자;

(2) 상기 다당류와 특이적으로 결합하고 있는 단백질; 및

(3) 상기 단백질이 특이적으로 결합되어 있는 나노입자의 담체로서 생체적합성 고분자로 이루어진 수화젤 담체를 포함하는 나노입자-단백질-수화젤 복합체.
(1) ① 생분해성 고분자로 이루어진 코어,

② 생체적합성 고분자 유화제로 이루어진 외부의 수화젤막, 및

③ 상기 코어 및 상기 수화젤막에 물리적으로 고정되어 있는 다당류를 포함하는 다당류-기능화 나노입자;

(2) 상기 다당류와 특이적으로 결합하고 있는 유효량의 단백질 약물로서, 성장인자, 케모킨, 세포외 기질 단백질, 안티트롬빈 III 중에서 선택된 하나 이상의 단백질 약물; 및

(3) 상기 성장인자가 특이적으로 결합되어 있는 나노입자의 담체로서 생체적합성 고분자로 이루어진 수화젤 담체를 포함하는 서방형 약물전달제제.
(1) ① 폴리(D,L-락티드-co-글리콜리드), 폴리(락트산), 폴리(글리콜산), 폴리(ε-카프로락톤), 폴리(δ-발레로락톤), 폴리(β-하이드록시부티레이트) 또는 폴리(β-하이드록시발러레이트) 중에서 선택된 하나 이상의 생분해성 고분자로 이루어진 코어,

② 폴락사머(poloxamer), 폴락사민(poloxamine), 폴리(비닐 알코올), 또는 알킬 알콜의 폴리에틸렌 글리콜 에테르 중에서 선택된 하나 이상의 생체적합성 고분자 유화제로 이루어진 수화젤막, 및

③ 상기 코어 및 상기 수화젤막에 물리적으로 고정되어 있는 헤파린, 알지네이트, 히알루론산, 키토산 중에서 선택된 하나 이상의 다당류를 포함하는 다당류-기능화 나노입자; 및

(2) 상기 다당류와 특이적으로 결합하고 있는 유효량의 성장인자로서, BMP나 TGF-beta를 포함하고, 그 외에 VEGF, FGF, PDGF 중에서 선택된 성장인자; 및

(3) 상기 성장인자가 특이적으로 결합되어 있는 나노입자의 담체로서 폴리(에틸렌 글리콜), 폴락사머, 폴리(오르가노포스파젠), 올리고(폴리(에틸렌 글리콜)푸마레이트), 콜라겐, 젤라틴, 피브린, 히알루론산, 알지네이트 중에서 선택된 하나 이상의 생체적합성 고분자로 이루어진 수화젤 담체를 포함하는 서방형 성장인자 전달제제.
제3항에 있어서, 상기 생분해성 고분자는 폴리(D,L-락티드-co-글리콜리드)이고, 상기 생체적합성 고분자 유화제는 폴락사머이고, 상기 다당류는 헤파린이고, 상기 성장인자는 BMP-2, BMP-4, BMP-6, BMP-7, BMP-8, BMP-9 중에서 선택된 하나 이상의 BMP나 TGF-beta를 포함하고, 그 외에 VEGF, FGF, PDGF 중에서 선택된 성장인자, 상기 수화젤 담체는 피브린인 것을 특징으로 하는 서방형 성장인자 전달제제.
제4항에 있어서, 상기 생분해성 고분자 및 상기 생체적합성 고분자 유화제는 동일하게 5,000-100,000의 중량평균 분자량을 가지고;

상기 다당류 및 상기 성장인자는 상기 나노입자 1 mg 당 각각 2-100 μg 및 0.01-5 μg이 포함되고;

상기 나노입자는 400 nm 이하의 직경, +20 mV 이상 또는 -40 mV 이하의 표면전하, 0.1 미만의 다분산 지수를 가지며;

상기 서방형 성장인자 전달제제는 200-20,000 Pa의 탄성계수를 가지는 것을 특징으로 하는 서방형 성장인자 전달제제.
제3항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 서방형 성장인자 전달제제를 포함하는 서방형 뼈충진제.
제6항에 있어서, 상기 서방형 뼈충진제는 골다공증, 골절, 골절탈구, 불유합, 지연유합, 골 결손, 치조골 결손 중에서 선택된 하나 이상의 질병의 치료 또는 예방용인 것임을 특징으로 하는 서방형 뼈충진제.
제7항에 있어서, 상기 서방형 뼈충진제는 (i) 세포를 없앤 자가골, 동종골, 이종골; (ii) HAP, 트리칼슘 포스페이트, 칼슘 알루미네이트, β-TCP, CPC, 칼슘 설페이트, 바이오글래스; 및 (iii) 세포부착 단백질, 분해성 펩티드 링커 중에서 선택된 하나 이상의 성분을 추가로 포함하는 것임을 특징으로 하는 서방형 뼈충진제.
(a) ① 생분해성 고분자를 저농도에서 세포독성이 없는 유기용매에 용해하여 유기용액을 수득하는 단계, ② 다당류 및 생체적합성 고분자 유화제를 물에 녹여 수용액을 수득하는 단계, 및 ③ 상기 유기용액을 상기 수용액에 첨가하여 분산시키는 단계를 포함하는 다당류-기능화 나노입자의 제조단계;

(b) 상기에서 제조된 다당류-기능화 나노입자에 단백질을 충진함으로써 단백질이 충진된 다당류-기능화 나노입자를 제조하는 단계;

(c) 수화젤 담체 제조용 생체적합성 고분자 수용액에 상기에서 제조된 단백질이 충진된 다당류-기능화 나노입자를 분산시키는 단계; 및

(d) 상기 (c)단계에서 제조된 분산액에 가교제, 가교활성제, 물리적 가교인자 중에서 선택된 하나 이상의 가교인자를 제공하여 상기 수화젤 담체 제조용 생체적합성 고분자를 가교시키는 단계를 포함하는 나노입자-단백질-수화젤 복합체의 제조방법.
(a) ① 생분해성 고분자를 저농도에서 세포독성이 없는 유기용매에 용해하여 유기용액을 수득하는 단계, ② 다당류 및 생체적합성 고분자 유화제를 물에 녹여 수용액을 수득하는 단계, 및 ③ 상기 유기용액을 상기 수용액에 첨가하여 분산시키는 단계를 포함하는 다당류-기능화 나노입자의 제조단계;

(b) 상기에서 제조된 다당류-기능화 나노입자에 성장인자, 케모킨, 세포외 기질 단백질, 안티트롬빈 III 중에서 선택된 하나 이상의 단백질 약물을 유효량 충진함으로써 단백질 약물이 충진된 다당류-기능화 나노입자를 제조하는 단계;

(c) 수화젤 담체 제조용 생체적합성 고분자 수용액에 상기에서 제조된 단백질이 충진된 다당류-기능화 나노입자를 분산시키는 단계; 및

(d) 상기 (c)단계에서 제조된 분산액에 가교제, 가교활성제, 물리적 가교인자 중에서 선택된 하나 이상의 가교인자를 제공하여 상기 수화젤 담체 제조용 생체적합성 고분자를 가교시키는 단계를 포함하는 서방형 약물전달제제의 제조방법.
(a) ① 폴리(D,L-락티드-co-글리콜리드), 폴리(락트산), 폴리(글리콜산), 폴리(ε- 카프로락톤), 폴리(δ-발레로락톤), 폴리(β-하이드록시부티레이트) 또는 폴리(β-하이드록시발러레이트) 중에서 선택된 하나 이상의 생분해성 고분자를 저농도에서 세포독성이 없는 유기용매에 용해하여 유기용액을 수득하는 단계,

② (i) 헤파린, 알지네이트, 히알루론산, 키토산 중에서 선택된 하나 이상의 다당류 및 (ii) 폴락사머(poloxamer), 폴락사민(poloxamine), 폴리(비닐 알코올), 또는 알킬 알콜의 폴리에틸렌 글리콜 에테르 중에서 선택된 하나 이상의 생체적합성 고분자 유화제를 물에 녹여 수용액을 수득하는 단계, 및

③ 상기 유기용액을 상기 수용액에 첨가하여 분산시키는 단계를 포함하는 다당류-기능화 나노입자의 제조단계;

(b) 상기에서 제조된 다당류-기능화 나노입자에 BMP나 TGF-beta를 포함하고, 그 외에 VEGF, FGF, PDGF 중에서 선택된 성장인자를 유효량 충진함으로써 성장인자가 충진된 다당류-기능화 나노입자를 제조하는 단계;

(c) 폴리(에틸렌 글리콜), 폴락사머, 폴리(오르가노포스파젠), 올리고(폴리(에틸렌 글리콜)푸마레이트), 콜라겐, 젤라틴, 피브린, 히알루론산, 알지네이트 중에서 선택된 하나 이상의 수화젤 담체 제조용 생체적합성 고분자의 수용액에 상기에서 제조된 성장인자가 충진된 다당류-기능화 나노입자를 분산시키는 단계; 및

(d) 상기 (c)단계에서 제조된 분산액에 글루타르알데히드, 디에폭사이드, 카르보디이미드 중에서 선택된 가교제; 트롬빈, 혈액응고인자 XIII, 이들의 혼합물 중에서 선택된 가교활성제; 온도, pH, 상호작용 중에서 선택된 물리적 가교인자 중에서 선택된 하나 이상의 가교인자를 제공함으로써 상기 수화젤 담체 제조용 생체적합성 고분자를 가교시키는 단계를 포함하는 서방형 성장인자 전달제제의 제조방법.
제11항에서, 상기 (b)단계는 (b') 상기 다당류-기능화 나노입자를 분산매에 재분산시키는 단계 및 (b'') 상기 재분산액에 상기 성장인자를 용액을 첨가하는 단계를 포함하는 것임을 특징으로 하는 서방형 성장인자 전달제제의 제조방법.
제12항에 있어서, 상기 (a)단계에 있어서, 상기 ①단계의 상기 유기용액은 농도가 0.5-2.0%(w/v)이고; 상기 ②단계의 상기 수용액은 농도가 0.01-5%(w/v)이고, 상기 다당류는 상기 생체적합성 고분자 유화제 양의 10 중량% 이하로 사용하고; 상기 ③단계의 상기 유기용액은 상기 수용액 양의 10 부피% 이하로 사용하고;

상기 (b')단계에 있어서, 상기 다당류-기능화 나노입자 재분산액은 농도가 25%(w/v)이상이고; 상기 (b'')단계에서 상기 성장인자의 용액은 PBS, PB, Tris, Hepes buffer 중에서 선택된 하나 이상의 용매를 사용하여 제조되고, 농도가 0.01-0.5%(w/v)의 범위에서 결정됨을 특징으로 하는 서방형 성장인자 전달제제의 제조방법.
제13항에 있어서, 상기 생분해성 고분자는 폴리(D,L-락티드-co-글리콜리드)이고, 상기 생체적합성 고분자 유화제는 폴락사머이고, 상기 다당류는 헤파린이고, 상기 성장인자는 BMP-2, BMP-4, BMP-6, BMP-7, BMP-8, BMP-9 중에서 선택된 하나 이상의 BMP나 TGF-beta를 포함하고, 그 외에 VEGF, FGF, PDGF 중에서 선택된 성장인자이며, 상기 수화젤 담체는 피브린인 것을 특징으로 하는 서방형 성장인자 전달제제의 제조방법.
제14항에 있어서, 상기 생분해성 고분자, 상기 생체적합성 고분자 유화제 및 상기 다당류는 각각 5,000-100,000, 5,000-100,000 및 3,000-100,000의 중량평균 분자량을 가지고;

상기 다당류 및 상기 성장인자는 상기 나노입자 1 mg 당 각각 2-100 μg 및 0.01-5 μg이 포함되고;

상기 나노입자는 400 nm 이하의 직경, +20 mV 이상 또는 -40 mV 이하의 표면전하, 0.1 미만의 다분산 지수를 가지며;

상기 서방형 성장인자 전달제제는 200-20,000 Pa의 탄성계수를 가지는 것을 특징으로 하는 서방형 성장인자 전달제제의 제조방법.
제11항 또는 제15항에 따라서 서방형 성장인자 전달제제를 제조하는 단계; 및

(e) 공다공증, 골절, 골절탈구, 불유합, 지연유합, 골 결손, 치조골 결손 중에서 선택된 하나 이상의 질병으로 인하여 형성된 골 또는 치조골의 결손부에 적합하도록 상기 성장인자 전달제제를 주형을 이용하여 성형하는 단계를 포함하는 서방형 뼈충진제의 제조방법.
제16항의 뼈충진제의 제조방법에 있어서, 상기 (e)단계는 ① 세포를 없앤 자가골, 동종골, 이종골, ② HAP, 트리칼슘 포스페이트, 칼슘 알루미네이트, β-TCP, CPC, 칼슘 설페이트, 바이오글래스, 및 ③ 세포부착 단백질, 분해성 펩티드 링커 중에서 선택된 하나 이상의 성분을 첨가하는 단계를 포함하는 것임을 특징으로 하는 서방형 뼈충진제의 제조방법.
단백질 약물의 방출속도를 조절하는 방법에 있어서, 상기 단백질 약물의 방출속도 조절방법은

(a) ① 생분해성 고분자를 저농도에서 세포독성이 없는 유기용매에 용해하여 유기용액을 수득하는 단계, ② 다당류 및 생체적합성 고분자 유화제를 물에 녹여 수용액을 수득하는 단계, 및 ③ 상기 유기용액을 상기 수용액에 첨가하여 분산시키는 단계를 포함하는 다당류-기능화 나노입자의 제조단계;

(b) 상기에서 제조된 다당류-기능화 나노입자에 성장인자, 케모킨, 세포외 기질 단백질, 안티트롬빈 III 중에서 선택된 하나 이상의 단백질 약물을 충진함으로써 단백질 약물이 충진된 다당류-기능화 나노입자를 제조하는 단계;

(c) 수화젤 담체 제조용 생체적합성 고분자 수용액에 상기에서 제조된 단백질이 충진된 다당류-기능화 나노입자를 분산시키는 단계; 및

(d) 상기 (c)단계에서 제조된 분산액에 가교제, 가교활성제, 물리적 가교인자 중에서 선택된 하나 이상의 가교인자를 제공하여 상기 수화젤 담체 제조용 생체적합성 고분자를 가교시키는 단계를 포함하는 제조방법에 의해서 나노입자-단백질-수화젤 복합체를 제조함에 있어서,

(A) (i) 상기 (a)②단계에서 상기 수용액 내의 다당류의 농도를 변화시키거나, 또는 (ii) 상기 (a)③단계에서 상기 유기용액 및 수용액의 혼합비율을 변화시킴으로써, 상기 나노입자 단위질량 당 다당류의 함량을 변화시키는 방법; 또는

(B) 상기 (c)단계의 상기 수화젤 담체 제조용 생체적합성 고분자 수용액에서, 상기 다당류-기능화 나노입자 및 상기 수화젤 담체 제조용 생체적합성 고분자의 농도비를 변화시킴으로써 상기 복합체 단위질량 당 나노입자의 함량을 변화시키는 방법; 또는

상기 (A)방법 및 상기 (B)방법을 병용하여 수행함으로써 단백질 약물의 방출속도를 조절하는 방법.
단백질 약물의 방출속도를 조절하는 방법에 있어서, 상기 단백질 약물의 방출속도 조절방법은

(a) ① 폴리(D,L-락티드-co-글리콜리드), 폴리(락트산), 폴리(글리콜산), 폴리(ε-카프로락톤), 폴리(δ-발레로락톤), 폴리(β-하이드록시부티레이트) 또는 폴리(β-하이드록시발러레이트) 중에서 선택된 하나 이상의 생분해성 고분자를 저농도에서 세포독성이 없는 유기용매에 용해하여 유기용액을 수득하는 단계,

② (i) 헤파린, 알지네이트, 히알루론산, 키토산 중에서 선택된 하나 이상의 다당류 및 (ii) 폴락사머(poloxamer), 폴락사민(poloxamine), 폴리(비닐 알코올), 또는 알킬 알콜의 폴리에틸렌 글리콜 에테르 중에서 선택된 하나 이상의 생체적합성 고분자 유화제를 물에 녹여 수용액을 수득하는 단계, 및

③ 상기 유기용액을 상기 수용액에 첨가하여 분산시키는 단계를 포함하는 다당류-기능화 나노입자의 제조단계;

(b) 상기에서 제조된 다당류-기능화 나노입자에 BMP나 TGF-beta를 포함하고, 그 외에 VEGF, FGF, PDGF 중에서 선택된 성장인자를 유효량 충진함으로써 성장인자가 충진된 다당류-기능화 나노입자를 제조하는 단계;

(c) 폴리(에틸렌 글리콜), 폴락사머, 폴리(오르가노포스파젠), 올리고(폴리(에틸렌 글리콜)푸마레이트), 콜라겐, 젤라틴, 피브린, 히알루론산, 알지네이트 중에서 선택된 하나 이상의 수화젤 담체 제조용 생체적합성 고분자의 수용액에 상기에서 제조된 성장인자가 충진된 다당류-기능화 나노입자를 분산시키는 단계; 및

(d) 상기 (c)단계에서 제조된 분산액에 글루타르알데히드, 디에폭사이드, 카르보디이미드 중에서 선택된 가교제; 트롬빈, 혈액응고인자 XIII, 이들의 혼합물 중에서 선택된 가교활성제; 온도, pH, 상호작용 중에서 선택된 물리적 가교인자 중에서 선택된 하나 이상의 가교인자를 제공함으로써 상기 수화젤 담체 제조용 생체적합성 고분자를 가교시키는 단계를 포함하는 제조방법에 의해서 나노입자-단백질-수화젤 복합체를 제조함에 있어서,

(A) (i) 상기 (a)②단계에서 상기 수용액 내의 다당류의 농도를 변화시키거나, 또는 (ii) 상기 (a)③단계에서 상기 유기용액 및 수용액의 혼합비율을 변화시킴으로써, 상기 나노입자 단위질량 당 다당류의 함량을 변화시키는 방법; 또는

(B) 상기 (c)단계의 상기 수화젤 담체 제조용 생체적합성 고분자 수용액에서, 상기 다당류-기능화 나노입자 및 상기 수화젤 담체 제조용 생체적합성 고분자의 농도비를 변화시킴으로써 상기 복합체 단위질량 당 나노입자의 함량을 변화시키는 방법; 또는

상기 (A)방법 및 상기 (B)방법을 병용하여 수행함으로써 단백질 약물의 방출속도를 조절하는 방법.
제19항에 있어서, 상기 단백질 약물은 BMP, VEGF, bGFG, FGF, PDGF 중에서 선택된 성장인자; 케모킨; 세포외 기질 단백질; 및 안티트롬빈 III 중에서 선택된 하나 이상의 약물임을 특징으로 하는 단백질 약물의 방출속도를 조절하는 방법.