KR20020084672A - 폴리프럭토오스 또는 그 유도체를 이용한 미소구 및 그제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 폴리프럭토오스인 레반과 그 유도체를 이용한 미소구 및 그 제조방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 강한 친수성인 과당의 폴리머[(2-6)-베타-디-프럭탄]인 레반 및 그 유도체를 염기성 용액에 용해한 후, 이를 유성 역현탁중합법과 가교제 첨가에 의해 폴리프럭토오스 공중합체 미소구를 제조하는 방법 및 상기 제조된 미소구의 용도에 관한 것이다.

본 발명 폴리프럭토오스 공중합체 미소구는 단백질 정제를 위한 겔 여과, 친화성, 이온교환, 소수성 크로마토그래피용 충진제, 효소 및 세포 고정화 담체, 약물전달용 담체, 기타 기능성 화장품원료, 피부 보충제로서 유용하게 사용될 수 있는 뛰어난 효과가 있다.

Description

폴리프럭토오스 또는 그 유도체를 이용한 미소구 및 그 제조방법{A MICROSPHERE AND PROCESS FOR PRODUCTING THEREOF USING POLYFRUCTOSE AND ITS DERIVATIVES}

본 발명은 폴리프럭토오스와 그 유도체를 이용한 미소구 (微少究:microsphere) 및 그 제조방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 친수성인 폴리프록토오스인 레반[(2,6)-베타-디-프럭탄]을 염기성 용액에 용해한 후, 이를 역현탁중합법과 가교제 첨가에 의해 폴리프록토오스 공중합체 미소구와 이를 제조하는 방법 및 상기 제조된 미소구의 용도에 관한 것이다.

(2,6)-베타-디-프럭탄, 레반은 처음 설탕즙액을 오염시킨 미생물에서 생성된 부산물로 설탕제조시 제조액의 점도를 증가시키는 바람직하지 못한 부산물이었다. 레반은 미생물에 의해 생성되지만 식물 자체에서도 생성되는 것으로 보고되고 있다. 1881년, Lippman이 보고할 당시 레불란(Levulan)으로 불렸으나, 현재는 간단히 레반이라 불리고 있다. 화학구조는 과당의 중합체로서 주 결합은 베타 2,6결합으로 이루어져 있으며, 베타 2,1결합에 의해 가지가 생긴다. 식물체에서 생성된 것은 분자량이 크지 않으나 미생물이 생성하는 것은 2×10⁷정도의 고분자량을 갖는다.

레반을 생산할 수 있는 미생물은 아세토박터 파스테리아너스(Acetobacter pasteurianus)외 27종이 보고되었다(Han, Y. W., Advances in Applied Microbiology, 35, 171(1992)). 레반 생산을 위해서는 발효법과 효소합성법이 연구되고 있고, 본 발명에서 사용되어진 것은 지모모나스 모빌리스(Zymmonas mobilis)와 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)의 레반슈크라제 유전자를 대장균에서 발현하여 얻은 각각의 유전자 재조합된 레반슈크라제를 이용하여 얻은 것을 사용하였다.

과당의 호모폴리머인 레반은 혈장대용제(Dodender et al., Bull. Soc. Chim. Biol., 39, 438(1957) ; Schechter etal., J. Lab. Clin. Med., 61, 962(1963)), 콜로이드 안정제, 면역제제, 약리효과 증진제 등으로서 의약품 분야(Leibovici et al., Anticancer Res., 5, 553(1985) ; Stark et al., Br. J. Exp. Path, 67, 141(1986))에, 품질향상제, 안정제 또는 건강식품의 첨가제(Hatcher et al., Bioprocess, Technol., ll, 1(1989)로서 식품분야에, 그리고 인쇄분야 및 화장품분야 등에 다양하게 사용될 수 있는 것으로 보고되고 있다(Whiting et al., J. Inst. Brew., 73, 422(1961);Han, Bioprecess Technol., 12, 1(1990)).

본 발명자들은 단백질 및 펩타이드의 분리정제를 위해 종래 사용되던 덱스트란 겔(유럽특허 제974,054호 및 미국특허 제4,794,177), 아가로스 겔, 폴리아크릴아미드 겔 등의 낮은 기계적 강도와 무기 고분자인 화학 결합형 실리카 겔의 알칼리에 취약한 특성을 가지는 점을 해결하기 위해 연구한 결과, 생분해성이 뛰어나며 값싸고 쉽게 얻을 수 있는 레반 폴리머 미소구를 개발하게 되었다. 바이오폴리머인 레반을 저분자화 시켜 제조한 미소구는 펩타이드 혹은 단백질에 대하여 친화성이 우수하고 고분자간의 강한 공유결합으로 인하여 기계적 강도가 강하고 합성 고분자와는 달리 자연환경에 무해하다는 장점이 있다. 이를 겔 여과, 친화성, 이온교환, 소수성 크로마토그래피용 충진제, 효소 및 세포고정화 담체, 약물전달용 매체, 기능성 화장품원료, 피부 보충제로 사용함으로써 상기 목적을 달성할 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

따라서, 본 발명의 목적은 유성 에멀젼 상에서 폴리프럭토오스를 가교 형성시약인 화학물질과 반응시켜 가교결합(Cross-linkage)을 갖게 하여 다공질의 폴리프럭토오스 공중합체 미소구 및 이를 제조하는 방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 방법에 의해 얻어진 폴리프럭토오스 공중합체를 크로마토그래피용 충진제 및 효소 고정화용 담체로 이용함을 특징으로 하는 폴리프럭토오스 공중합체 미소구의 용도를 제공함에 있다.

본 발명의 상기 목적은 레반 또는 그 유도체를 사용하여 폴리프럭토오스 미소구를 제조하고, 상기 본 발명 미소구의 크로마토그래피용 충진제, 효소 고정화용 담체로서의 용도를 규명함으로써 달성하였다.

이하 본 발명의 구성을 상세히 설명한다.

도 1은 본 발명의 실시예 1의 방법에 의해 제조한 폴리프럭토오스 미소구의 주사전자현미경 사진이다.

도 2는 미소구의 크기가 45 - 150 μm(건조시료 기준)이고, 팽창율이 4 mL/g이며 130 cm/h의 선속도에서 7.0 psi의 압력차를 나타내는 본 발명 폴리프럭토오스 미소구를 이용하여 소혈청알부민(BSA)과 염화나트륨을 분획한 크로마토그램이다.

도 3은 미소구의 크기가 45 - 150 μm(건조시료 기준)이고, 팽창율이 11mL/g이며 80cm/h의 선속도에서 7.0 psi의 압력차를 나타내는 본 발명 폴리프럭토오스 미소구를 이용하여 갑상선글로불린(Thyroglobulin), 소혈청알부민(bovine serum albumin), 시토크롬 C(Cytochrome C)를 분획한 크로마토그램이다.

본 발명은 폴리프럭토오스를 미소구 형태의 친수성 및 다공질성 공중합체로 제조하는 방법이다. 특히 본 발명은 염기성 용액하에서, 폴리프럭토오스의 하이드록시기와 가교제로 쓰인 양작용성(bifunctional organic substance) 유기물질이 반응하여 고분자사이에 에테르 가교를 형성하는 것을 특징으로 한다.

알칼리물질 존재 하에서 양작용성 물질이 하이드록시기를 포함하는 폴리프럭토오스와의 반응을 의미하는 공중합체의 제조방법은 폴리프럭토오스 용액과 이상계(two phase)를 형성할 수 있는 분산매를 충분히 교반함으로써 분산매 안에서폴리프럭토오스 용액이 현탁점적(懸濁點滴)으로 전환되는 것을 특징으로 하고, 젤 구형입자가 형성될 때까지 폴리프럭토오스와 가교제가 반응하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에서 사용되는 폴리프럭토오스 미소구는 레반 또는 그 유도체를 이용하여 제조한 미소구를 일컫는다(이하 '폴리프럭토오스 미소구'로 약칭한다.). 공중합체(Copolymer)라는 용어는 단일분자를 형성하는 수많은 유사 단위체의 화학적 결합에 의한 생성물을 포괄적으로 내포한다.

이상계(two phase) 중에서 연속상(분산매)을 형성하기 위해서는 하이드록시기를 가지는 폴리프럭토오스가 물에 용해되는 경우, 이 물에 대한 용해성이 전혀없는 유기용매로서 지방족과 방향족 탄화수소, 할로겐화 지방족과 방향족 탄화수소인 다이클로로메탄, 1,2-다이클로로에탄, 1,2-다이브로모에탄,o-다이클로로벤젠, 톨루엔, 미네랄 오일인 옥탄, 헵탄, 싸이클로헥산, 헥사데칸, 소이빈 오일 등을 사용한다.

본 발명 미소구를 제조하는데 있어서, 폴리프럭토오스의 농도는 상당히 중요한데 이는, 최종 공중합체의 팽윤능력(수분함유량)을 결정짓기 때문이다. 폴리프럭토오스의 낮은 농도는 높은 농도를 지니는 그것과 비교하면 최종 생산물의 더 높은 팽윤성을 야기한다. 레반 고분자의 농도는 5-70퍼센트(무게비)정도가 가능하며, 10-50퍼센트의 범위에서는 긍정적인 결과를 얻을 수 있다. 그리고 이러한 반응에 적당한 하이드록시기를 갖는 폴리프럭토오스와 이것의 유도체로서는 레반과 메틸레반, 에틸레반, 하이드록시 프로필레반, 아릴 레반 등을 그 예로 들 수 있다.

또한 상기 레반와 그 유도체를 아가로스, 덱스트란, 셀룰로오스, 키틴, 키토산 등의 바이오폴리머와 그 유도체, 합성고분자의 단량체 및 세라믹 물질로 구성된 군에서 선택된 하나 이상과 적당한 비율로 혼합하여 레반 복합체 미소구를 합성할 수 있다.

본 발명에 있어서 가교제로 쓰이는 양(兩)작용성 유기물은 X-R-Z형태를 가진다. R은 3-10개의 탄소원자를 가지는 지방족 잔기를 의미하며, X는 할로겐 혹은 메톡시기를 Z는 에폭시기를 의미한다. 이 반응에서 적합한 양(兩)작용성 물질로는 에피클로로하이드린, 디클로로하이드린, 1,2-3,4디에폭시부탄, 비스-에폭시프로필-에테르, 에틸렌 글리콜-비스-에폭시 프로필 에테르, 1,4-부탄-디올-비스-에폭시-프로필 에테르, 감마-글라이시독시프로필트리메톡시실란 등을 사용할 수 있다. 공중합체의 가교결합을 형성하는 지방족 잔기는 산소원자에 의해 가로막히거나, 하이드록시기와 치환반응을 일으킨다. 양(兩)작용성 유기물과 하이드록시기를 지니는 폴리프록토오스의 분자적 비율은 적어도 1:10이상 되어야 하며, 반응의 효과를 높이기 위해서는, 현탁점적(懸濁點滴)의 원하는 크기를 얻기 위한 교반 조건하에서 폴리프럭토오스와 알칼리 물질의 혼합용액을 이상계 중에서 연속상(분산매) 역할을 하는 액체와 교반하는 것이 바람직하다. 그후에 이상계에 가교제를 첨가한다. 그러나 가교제를 연속상 역할을 하는 액체에 먼저 용해한 후에 반응을 시킬 수도 있다.

본 발명에 의하면, 폴리프럭토오스가 용해되어 있는 용액의 분산을 안정하게 하기 위해서는 안정제를 연속상(분산매)을 형성하는 액체에 첨가한다. 안정제로서는 물에 용해되지 않는 폴리 비닐아세테이트, 폴리스틸렌, 폴리이소부틸렌, 셀룰로오스-아세테이트-부틸레이트, 에틸 셀룰로오스 등의 분자량이 높은 폴리머가 적당하다. 평균적으로 낮은 분자량의 안정제보다 상대적으로 높은 분자량을 가지는 안정제가 여하 같은 조건에서 분산의 안정성에 있어서 효과가 높은 것으로 입증되었다. 적절한 안정제의 양은 연속상의 100ml 기준으로 하면, 0.1-15그램 정도가 가능하고, 되도록 0.5-10그램 정도의 범위에서 긍정적인 결과를 얻을 수 있다. 어떤 조건하에서는 반응물에 계면활성제 형태의 솔비탄 모노레이트, 폴리옥시에틸렌 솔비탄 모노올리트, 솔비탄 세스퀴올리트, 솔비탄 트리올리트, 폴리옥시에틸렌 솔비탄 모노스티레이트, 폴리옥시에틸렌 이소옥틸페닐 에테르와 같은 표면활성 물질을 첨가하는 것도 바람직하다. 이러한 물질은 현탁안정제의 역할을 하지는 않지만, 더 작은 크기의 공(共)중합체를 얻기를 원한다면 사용될 수 있다. 중합과정 중 초기 기간동안, 교반과 안정제의 조건이 분산되는 현탁점적(懸濁點滴)의 크기를 결정한다. 따라서 서로 다른 교반속도에서 실험을 하였을 때에, 원하는 결과를 얻기 위해서 교반속도를 결정해야 한다.

이러한 반응에서 요구되는 알칼리 물질은 대부분 폴리프럭토오스 용액에 포함되어 있다. 그러나 이상계에서 연속상을 형성하는 분산매에 용해되어진 형태로 알칼리 물질을 사용하는 것도 가능하다. 이론적으로는, 용액상에서 알칼리 특성을 나타내는 어떠한 물질도 이 반응에서 사용할 수 있다. 그러나 수산화나트륨과 같은 알칼리 금속 산화물들이 주로 알칼리 물질로 사용되어진다. 사차암모늄 물질, 알칼리 금속/알칼리 토류 금속 탄산염과 알칼리 토류 산화물과 같은 물질 또한 사용되어진다.

본 발명에 있어서 안정제는 적당한 용매로 후처리함으로써 형성된 겔로부터 제거되어 질 수 있다. 상대적으로 온화한 조건하에서 분자량이 높은 고분자가 가수분해될 수 있는 것과 관련하여, 알칼리 금속 산화물 용액과 같은 가수분해능이 있는 물질로 겔을 우선 처리하고 나서, 이러한 물질들에 대한 용매로 겔을 씻어 줌으로써 가수분해된 물질을 제거한다. 다시 말해 형성된 겔에 잔존하는 폴리비닐아세테이트와 셀룰로오스 아세테이트 부틸레이트와 같은 높은 분자량의 에스테르는 이것의 비누화반응(가수분해)을 야기하는 희석된 알칼리 금속 산화물 수용액으로 처리한다. 비누화반응(가수분해)후 형성된 분자량이 높은 알콜은 적당한 용매로 씻어줌으로써 제거될 수 있다.

한편, 겔이 형성되는 시간은 분산되는 용액 중에 폴리프럭토오스의 함유량과 양(兩)작용성 물질의 양, 온도 등에 의존된다. 그러나 이 반응은 반응이 중지되거나 양(兩)작용성 물질이 전부 소비될 때까지 진행될 것이다. 겔이 형성된 후에는 교반이 더 이상 공중합의 최종입자크기에 영향을 미치지 않는다. 반응온도는 공(共)중합이 발생하는 속도를 결정할 것이다. 가능한 반응온도는 상온에서 90℃정도이고, 30-60℃의 범위에서는 긍정적인 결과를 얻을 수 있다.

상기와 같이 본 발명에 의해 얻어진 겔은 기계적 강도가 우수하고, 친수성이 높기 때문에 수용성의 단백질, 효소, 다당류, 아미노산 및 항생물질 등을 분리, 정제하는데 이용되는 겔 여과 크로마토그래피 등의 충진제로서 매우 효과적이며, 표면에 존재하는 수산기를 이용하여 설폰기, 아민기 및 카르복시기 등의 이온교환기를 도입하여 이온교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 및 효소고정화 담체로도 사용할 수 있다.

또한 본 발명에서는 단백질 분리용 및 효소 고정화용 폴리프럭토오스 미소구에 대한 것을 예시하였으나, 본 발명 미소구의 약물전달용 담체, 기능성 화장품 원료, 피부보충제로서의 응용은 본 발명이 속하는 통상의 지식을 가진자에게 자명할 것이다.

이하, 본 발명을 실시예에 따라 상세히 설명하겠지만, 본 발명의 권리범위가 이들에 의해 한정되는 것은 아니고, 당업자에 의하여 기술적인 수치와 균등물의 변경에까지 미치는 것은 물론이다.

실시예 1 : 레반을 이용한 폴리프럭토오스 미소구의 제조

2N 수산화나트륨 용액에 레반 194g을 용해한 다음 상기 용액에 소디움 보로하이드라이드 0.9g 첨가하고 2시간동안 정치하였다. 열 재킷을 가진 3상 패들형 날개의 교반기(2L)를 장치하고, 이 반응기에 안정제인 셀룰로오스 아세테이트 부틸레이트 21g을 넣고, 분산매로서 레반용액에 약 2배 부피의 1,2-다이클로로에탄을 천천히 가한 다음 균일하게 용해하였다. 레반 용액인 수층을 1,2-다이클로로에탄 용액인 유기층에 서서히 교반과 함께 첨가해 주면서 혼합하여 균일한 현탁상 콜로이드 용액을 만들었다. 그후 1시간 이내에 온도를 50℃까지 올려주고, 가교제인 1-클로로-2,3-에폭시프로판을 첨가하였다. 이 온도에서 교반하면서 16∼20시간동안 반응시켰다. 반응 종결후 반응기를 천천히 냉각시켰다. 생성물에 아세톤을 가하고, 형성된 겔로부터 용매만을 상층액으로 분리한 후, 아세톤을 가하고 상층액만 다시분리함으로써 대부분의 셀룰로오스 아세테이트 부틸레이트를 제거하였다. 겔 표면에 있는 안정제 막을 제거하기 위해서 95% 에탄올과 수산화나트륨 수용액이 50:50 비율을 지닌 용액에 약15분간 분산시켰다. 그 다음, 희석된 염산수용액으로 겔을 중화하고, 여과하였다. 여과 후 얻어진 겔을 증류수로 세척하고, 에탄올을 이용하여 탈수과정을 한 후 70℃에서 진공 건조하여 폴리프럭토오스 공중합체 미소구를 얻었다. 도 1 은 실시예 1의 방법에 의해 제조한 본 발명 폴리프럭토오스 미소구의 주사전자현미경 사진이다.

실시예 2 : 레반 함량에 따른 폴리프럭토오스 미소구의 팽윤성

분자체로써 공중합체의 특성을 결정하는 것은 세공크기에 영향을 미치는 기초적인 특성인 가교결합밀도(cross-link density)이고, 이것은 겔 구형 입자 안으로 통과할 수 없는 정도의 분자량으로 표현되는 배제제한(exclusion limit)으로 증명된다. 가교결합밀도와 관련된 것은 팽윤능력(수분함유량)이다. 이것은 건조시료 1g을 물에 팽윤시킨 후, 원심분리하여 회수한 물의 부피로 계산하여 정의되어 질 수 있고, 건조시료 1g을 물에 팽윤시킨 후, 그것이 팽창된 부피인 바닥부피(bed volume)로 정의될 수 있다.

실시예 1에서 제조한 폴리프럭토오스 미소구의 레반 함량에 따른 팽윤성을 아래와 같이 조사하였다. 유리필터가 부착된 직경 0.9㎝, 길이 90㎝의 유리컬럼에 1g의 시료를 채우고 증류수를 가했다. 유리컬럼을 상하로 흔들어 주면서 30분간 팽윤시킨 다음, 정치하여 컬럼의 눈금으로부터 팽윤부피(bed volume)를 구하였다.

실험결과, 하기 표 1 에서 알 수 있듯이, 본 발명이 폴리프럭토오스 미소구는 레반의 함량이 낮아질수록 팽윤성이 급속히 증대하는 것으로 나타났다.

레반 함량에 따른 폴리프럭토오스 미소구의 팽윤성

농도(%)	팽윤성(㎖/g)
35	4-5
30	6-7
25	10-12
20	15-17
15	20-25
10	50-60

실시예 3 : 가교제 함량에 따른 폴리프럭토오스 미소구의 팽윤성

실시예 1 에서 제조한 폴리프럭토오스 미소구 중 레반 함량이 30%인 미소구을 기준으로 하여 1-클로로-2,3-에포시프로판을 가교제로 사용하여 함량을 달리하면서 폴리프럭토오스 미소구를 제조하고, 실시예 2와 동일한 방법에 의해 팽윤성을 측정하였다.

실험결과 하기 표 2에서 알 수 있듯이, 본 발명이 폴리프럭토오스 미소구는 가교제의 함량이 낮아질수록 팽윤성이 증대하는 것으로 나타났다.

가교제의 함량(레반량이 기준)에 따른 폴리프럭토오스 미소구의 팽윤성

함량(%)	팽윤성(㎖/g)
10	19.3
15	13.8
25	9.35
35	5.6
50	4.5
60	4

실시예 4 : 안정제의 종류에 따른 폴리프럭토오스 미소구의 생성양상

실시예 1 에서 제조한 폴리프럭토오스 미소구 중 레반 함량이 30%인 미소구을 기준으로 하여 동일한 방법으로 실시하되, 안정제의 종류에 따른 폴리프럭토오스 미소구의 생성양상을 조사하였다

실험결과 하기 표 3 에서 알 수 있듯이, 안정제로 셀룰로오스-아세테이트-부틸레이트를 사용했을 경우에, 폴리프럭토오스 미소구 생성상태가 가장 양호한 것으로 나타났다.

안정제의 종류에 따른 폴리프럭토오스 미소구의 생성양상

안정제의 종류	미소구 생성상태
셀룰로오스-아세테이트-부틸레이트	++++
폴리이소부틸렌	++
폴리비닐아세테이트	+++
폴리스틸렌	++
솔비탄 모노레이트	+++
폴리옥시에틸렌 솔비탄 모노올리트	+
폴리옥시에틸렌 이소 옥틸페닐에테르	+

실시예 5 : 분산매(유기상)의 종류에 따른 폴리프럭토오스 미소구의 생성양상

실시예 1에서 제조한 폴리프럭토오스 미소구 중 레반 함량이 30%인 미소구을 기준으로 하여 동일한 방법으로 실시하되, 분산매의 종류에 따른 폴리프럭토오스 미소구의 생성양상을 조사하였다

실험결과 하기 표 4에서 알 수 있듯이, 분산매(유기상)로 1,2-다이클로로에탄을 사용했을 경우에, 폴리프럭토오스 미소구 생성상태가 가장 양호한 것으로 나타났다.

분산매의 종류에 따른 폴리프럭토오스 미소구의 생성양상

분산매의 종류	미소구 생성 양상
1,2-다이클로로에탄	++++
1,2-다이브로모에탄	+++
1,2-다이클로로메탄	++
o-다이클로로벤젠	++
톨루엔	++
싸이클로헥산	+

실시예 6 : 레반 유도체를 이용한 폴리프럭토오스 미소구 제조방법

레반 유도체로서 메틸레반, 에틸레반, 하이드로기 프로필레반, 알릴레반을 각각 사용하여 상기 실시예 1과 동일한 방법에 의해 폴리프럭토오스 유도체 공중합체 미소구를 얻었으며, 미소구의 물리화학적 성질은 본 발명 폴리프럭토오스 미소구와 미차가 없음이 확인되었다.

실시예 7 : 겔 여과 크로마토그래피 충진제로서 폴리프럭토오스 미소구의 응용

팽창률이 서로 다른 본 발명 폴리프럭토오스 미소구를 크로마토그래피 충진제로 사용하여 크로마토그래피를 실시하였다.

실험예 1: 팽창율이 4 mL/g인 미소구를 이용한 겔 여과 크로마토그래피

실시예 1에서 준비한 폴리프럭토오스 미소구를 사용하여 겔 여과 크로마토그래피의 응용인 단백질과 무기염의 분리를 위한 탈염 크로마토그래피 실험을 수행하였다. 본 실험에 사용된 폴리프럭토오스 미소구는 45 - 150 μcm(건조시료 기준)의 크기를 가지며 팽창율이 4 mL/g이고 130 cm/h의 높은 선속도에서도 매우 낮은 압력차 (7.0 psi)를 보이는 특징을 가지고 있다. 실험에 사용된 컬럼(Amicon, 미국)은 1.1 cm (D) × 25 cm (H)이며 사용된 미소구의 양은 15.7 ml이었다. 단백질과 무기염인 염화나트륨(NaCl)의 분리성능을 살펴보기 위하여 다양한 크기의 세가지 단백질 히루딘(hirudin), 리소자임(lysozyme), 소혈청알부민(bovine serum albumin)을 사용하여 테스트하였다. 각각의 단백질을 컬럼에 400 μL(5 mg-단백질/mL-buffer + 0.5 N NaCl 수용액)의 시료를 주입한 후 완충용액(pH 7.0, 50 mM Tris-HCl buffer)의 유량을 1.0 mL/min으로 유지하면서, 자외선 검출기(UV@280) 및 전도도 측정기(conductivity detector)를 사용하여 단백질 및 염화나트륨의 거동을 살펴보았다. 도 2 에서 볼 수 있는 바와 같이 약10.5분 부근에서 단백질인 BSA가 우선적으로 분획되었고, 분자크기가 매우 작은 염화나트륨은 약 19분이 되어서야 용출이 시작되었다. 단백질의 크기가 상대적으로 작은 히루딘의 경우에 있어서는 단백질 밴드의 끝부분에 있어서 테일링(tailing)이 관찰되었고, 단백질 분자크기가 클수록 무기염과 보다 확실하게 분리할 수 있었다. 따라서, 단백질의 크기에 따라 적당한 기공크기를 갖는 미소구를 선택하게되면 무기염 외의 불순물로부터 목적 단백질의 분리정제에 응용할 수 있다.

실험예 2 : 팽창율이 11mL/g인 미소구를 이용한 겔 여과 크로마토그래피

실시예 1과 같은 방법으로 레반의 농도와 가교제의 함량을 조절함으로써 제조한 폴리프럭토오스 미소구를 단백질의 분리를 위한 겔 여과 크로마토그래피 실험을 실행하였다.

본 실험에서 사용된 폴리프럭토오스 미소구는 45 - 150 μm(건조시료 기준)의 크기를 가지며 팽창율이 11mL/g이고, 80cm/h의 높은 선속도에서도 매우 낮은 압력차 (7.0 psi)를 보이는 특징을 가지고 있다. 실험에 사용된 컬럼(Sigma, 미국)은 1.0 cm (D) × 60 cm (H)이며, 사용된 미소구의 양은 45.5mL이었다. 단백질과 단백질의 분리성능을 살펴보기 위하여 다양한 크기의 세가지 단백질 갑상선 글로불린(Thyroglobulin), 소혈청알부민(Bovine Serum Albumin), 시토크롬C(Cytochrome C)를 테스트하였다. 각각의 단백질을 컬럽에 600μL(5 mg-단백질/mL-buffer)의 시료를 주입한 후 완충용액(pH 7.0, 50 mM Tris-HCl /10mM NaCl buffer)의 유량을 0.13mL/min으로 유지하면서, 자외선 검출기(UV@280)를 사용하여 단백질들의 거동을 살펴보았다. 도 3에서 볼 수 있는 바와 같이 약 1.7시간 부근에서 Thyloglobulin(분자량 669000)이 우선적으로 분획되었고, 그 다음 분자크기인 BSA가 약 2.05시간 부근에서 분리가 되었다. 그리고 약 3.8시간 후에 Cytochrome C가 분리되었다. 단백질 분자크기 순으로 분리할 수 있었다. 따라서, 단백질의 크기에 따라 적당한 기공크기를 갖는 미소구를 선택하게 되면 단백질 외의 불순물로부터 목적 단백질의 분리정제에 응용할 수 있다.

실시예 9 : 효소 고정화용 담체로써 폴리프럭토오스 미소구의 응용

폴리프럭토오스 미소구(10g)를 증류수로 세척하고 유리여과기를 이용하여 세척한 증류수를 걸렀다. 0.6M 수산화나트륨(10mL)과 20mg 소디움 보로하이드라이드에 세척한 미소구를 현탁시킨 다음, 1,4-부탄-디올-비스-에폭시-프로필에테르(10mL)를 첨가한 후, 상온에서 서서히 8시간동안 교반하였다. 그리고나서 유리여과기를 이용하여 증류수 5L로 세척하였다. 이와같은 방법으로 효소와 폴리프럭토오스 미소구를 공유결합으로 연결하여 효소를 미소구 표면에 안정적으로 결합시킬 수 있는 에폭시기 (epoxy group)를 도입하였다. 이와 같이 연결하면 미소구와 효소사이에 매우 안정적인 C-N 결합이 형성되어 미소구 표면의 비이온성 잔기가 형성될 여지가 없고 비선택적 물리흡착의 가능성이 줄어드는 장점이 있다. 에폭시기를 가진 폴리프럭토오스 미소구는 1,4-부탄-디올-비스-에폭시-프로필 에테르를 첨가하여 한편의 에폭시기는 미소구 표면의 하이드록실기와 반응하여 결합하고 반대편의 에폭시기는 고정화용 효소와 반응하여 결합할 수 있게 하여 준비하였다. 본 실험에 사용된 효소는 상업용으로 널리 쓰이고 있는 두 가지 종류의 리파제 효소인 Lipase-OF (Meito Sangyo Co., 일본)와 Lipase VII (Sigma Chemical Co., 미국)이었다. 두 종류의 리파제 2 g을 완충용액 (pH 6.0와 pH 8.5, 1 M potassium phosphate buffer) 40 mL에 녹인 후 에폭시기를 가진 미소구 1 g을 첨가하였다. 효소와 고정화 담체인 미소구 사이에서의 충분한 반응을 위해 상온에서 3일간 고정화 반응을 시킨 후 미소구 표면의 미반응 효소를 제거하기 위하여 완충용액으로 5회 씻어주었다. 실험에 사용된 효소의 활성을 조사하기 위하여 (R,S)-케토프로펜 에틸 에스터(ketoprofen ethyl ester)를 기질로 사용하였다. 고정화후 효소 활성은 초기 활성의 80% 이상을 유지하였고 두 종류의 리파제가 가지고 있는 광학선택성도 그대로 유지하고 있는 것을 확인할 수 있었다.

본 실시예는 작용기로 에폭기만을 예시하였으나, 적절한 용도에 맞게 아미노기, 브로모시안기, 카르복실기, 알데히드기, 티올기등 다양한 작용기를 도입하는 것은 본 발명이 속하는 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게는 자명한 사실일 것이다.

이상 상기 실시예 및 실험예에서 명백한 바와 같이, 본 발명 폴리프럭토오스 및 그 유도체 미소구는 폴리프럭토오스와 유도체의 함량 및 가교제로서 팽윤능력을 조절할 수 있고, 안정제에 따라 미소구의 특성을 개질시킬 수 있으며, 아미노기, 브로모시안기, 카르복실기, 알데히드기, 티올기등 다양한 작용기의 도입으로 탈염, 겔여과, 친화성 및 이온교환 크로마토그래피용 충진제, 효소 및 세포 고정화용, 약물전달용 담체, 기능성 화장품 원료, 피부 보충제 등으로서 매우 유용하게 사용할 수 있는 효과가 있다. 또한, 펩티드에 대하여 친화성이 우수하고 고분자간의 강한 고유결합으로 인하여 비교적 강도가 강하고 합성고분자와는 달리 자연환경을 오염시키지 않는 뛰어난 효과가 있다.

Claims (4)

1. 하기의 용도를 갖는 폴리프럭토오스 미소구 또는 폴리프럭토오스 유도체 미소구:

   (a) 단백질, 펩타이드 또는 생리활성 물질의 분리를 위한 담체;

   (b) 효소 또는 세포의 고정화용 담체;

   (c) 약물전달용 매개체;

   (d) 피부보충제
2. 다음의 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리프럭토오스 또는 그 유도체의 미소구 제조방법:

   (a) 알칼리성 용액에 폴리프럭토오스 또는 그 유도체를 용해시키는 단계;

   (b) 안정제 및 분산매를 첨가·혼합하여 균질한 현탁상 콜로이드 용액을 제조하는 단계;

   (c) 상기 콜로이드 용액을 가열하고, 가교제를 첨가하여 반응시킨 후, 냉각하여 미소구를 제조하는 단계; 및

   (d) 상기 미소구로부터 안정제를 제거하는 단계.
3. 제 2항에 있어서, 아가로스, 덱스트란, 셀룰로오스, 키틴, 키토산 및 그 유도체, 합성고분자의 단량체, 세라믹 물질로 구성된 군에서 선택된 하나 이상을 제 2항의 (a)단계에 첨가하여 미소구를 제조하는 것을 특징으로 하는 방법.
4. 제 2항에 있어서, 작용기(functional group)를 도입하는 단계를 추가로 포함하는 미소구의 제조방법.