KR101678241B1 - 피브리노겐 및 황산화 다당류 기재의 제제 - Google Patents

피브리노겐 및 황산화 다당류 기재의 제제 Download PDF

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박스터 헬쓰케어 에스에이
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Abstract

본 발명은 피브리노겐 및 황산화 다당류를, 1 성분 조성물로서, 또는 피브리노겐 및 황산화 다당류를 분리된 성분으로서 포함하는 부분들의 키트로서 포함하는 제제를 제공한다. 본 발명은 또한, 정의된 방법에 의해 수득될 수 있는 피브린 응괴 유사 구조물, 지혈용 패치, 2-성분 시린지 시스템, 및 상기 제제, 피브린 응괴 유사 구조물 및 패치의 다양한 용도를 제공한다.

Description

피브리노겐 및 황산화 다당류 기재의 제제{PREPARATIONS BASED ON FIBRINOGEN AND SULFATED POLYSACCHARIDES}
본 발명은 피브리노겐 및 황산화(sulfated) 다당류를 포함하는 제제, 그로부터 수득된 피브린-응괴 유사 구조물, 지혈용 패치, 및 이들을 사용하는 방법에 관한 것이다.
피브리노겐 기재의 조직 접착제는 인간 또는 동물 조직 또는 기관 부분의 무봉합선 및/또는 봉합선-지지형 결합, 상처 봉합(sealing), 지혈 및 상처 치유 촉진을 위해 사용된다. 그의 작용 모드는, 즉시 사용가능한 액체 조직 접착제 중에 함유되어 있는 (가용성) 피브리노겐이 트롬빈에 의해 (불용성) 피브린으로 전환된다는 사실에 기초한다. 인자 XIII 또한 액체 조직 접착제 중에 포함될 수 있는데, 여기서, 상기 인자는 트롬빈의 작용에 의해 인자 XIIIa로 활성화된다. 이는 형성된 피브린을 가교 결합시킴으로써 고 MW 중합체를 형성하게 하는데, 이는 조직 접착제의 효능을 개선시킬 수 있다. 필요한 트롬빈 활성은 부착되는 조직 (상처 표면)으로부터 기원하는 것일 수 있거나, 봉합 과정에서 트롬빈 및 Ca2+ 이온-함유 용액의 형태로 조직 접착제에 첨가될 수 있다. 피브리노겐 기재의 조직 접착제는 AT-B-359 653, AT-B-359 652 및 AT-B-369 990으로부터 공지되었다. 피브리노겐 및 인자 XIII 이외에도, 상기 접착제는 또한 단백질, 예컨대 피브로넥틴 및 알부민, 및 임의로 항생제를 추가로 함유할 수 있다. US5,962,405 (젤리히(Seelich); 이뮤노 아게(Immuno AG))에는 간단한 방식으로 신속하게 재구성되고(reconstituted) 액화됨으로써 즉시 사용가능한 피브리노겐 및/또는 조직 접착제 용액을 형성할 수 있는, 동결건조된(lyophilized) 형태, 또는 (급속-냉동된(deep-frozen)) 급속-냉동형 액체 제제로부터 생성되는 형태의 저장-안정성 피브리노겐 제제가 개시되어 있다. 상기와 같은 제제는 박스터 헬스케어 코포레이션(Baxter Healthcare Corporation: 미국 캘리포니아주 소재)에 의해 티젤(Tisseel)? 피브린 실란트(sealant)로서 시판되고 있다.
지혈용 패치, 예컨대 콜라겐으로부터 제조된 것과 같은 지혈용 패치는 다양한 외과 수술에 있어 조직을 봉합하고, 출혈을 조절하기 위해 사용될 수 있다. 이는 조직 접착제, 예컨대 피브린 글루(glue)의 코팅과 함께 사용될 수 있다. 별법으로, 트롬빈 및 피브리노겐으로 코팅처리된 콜라겐 스폰지로부터 제조된 지혈용 패치, 예컨대 타코콤(TachoComb)? 또는 타코실(TachoSil)?(나이코메드(Nycomed))이 이용가능하다.
피브린 실란트 및 지혈용 패치는 안정하게 지혈시킬 수 있고, 상처 및/또는 조직 부위에 씰(seal)을 잘 부착시킬 수 있으며, 고강도로 부착 및/또는 상처 봉합을 할 수 있고, 상처 치유 과정에서 접착제가 완전하게 재흡수될 수 있도록 하며, 상처 치유 촉진 특성을 가질 수 있다. 그럼에도 불구하고, 확실히 응고 피브린 실란트가 주변 조직에 단단하게 부착될 수 있도록 하기 위해서는 보통 봉합된 조직부를 몇분간 원하는 위치에 유지시킬 필요가 있다. 피브린 응괴 형성을 개선시키고/거나, 피브린 응괴 구조를 강화시키는 화합물이 피브린 실란트 및 지혈용 패치를 개선시킬 수 있다. 예를 들어, 응괴가 강화되면 피브린용해(fibrinolysis)는 덜 일어날 것이며, 보다 안정적이고 장기간 지속될 것이다.
본 명세서의 선행 공개 문헌의 기재 또는 논의는, 상기 문헌이 최고 기술 수준의 일부이거나, 통상의 일반적 지식이라는 것을 인정하는 것으로서 간주되어서는 안된다.
본 발명의 요약
제1 측면에서, 본 발명은 피브리노겐 및 황산화 다당류를, 1 성분 조성물로서, 또는 피브리노겐 및 황산화 다당류를 분리된 성분으로서 포함하는 부분들의 키트로서 포함하는 제제를 제공한다.
제2 측면에서, 본 발명은
(a) 본 발명의 제제를 용액으로서 제공하는 단계,
(b) 양이온 함유 용액을, 분리된 성분으로서(임의로는 트롬빈을 함유함), 또는 본 발명의 황산화 다당류 성분과의 용액으로서(임의로는 트롬빈을 함유함) 제공하는 단계,
(c) 임의로는, 트롬빈 용액을 제공하는 단계, 및
(d) (a)와 (b)와 임의로는 (c)를 동시에 또는 순차적으로 임의의 순서로 혼합하여 피브린 응괴 유사 구조물을 수득하는 단계
를 포함하는 방법에 의해 수득될 수 있는 피브린 응괴 유사 구조물을 제공한다.
제3 측면에서, 본 발명은
(1) 담체, 및
(2) 황산화 다당류인 적어도 하나의 지혈제
를 포함하되, 여기서, 담체가 황산화 다당류일 경우, 담체는 지혈제와 동일한 황산화 다당류가 아닌 것인, 지혈용 패치를 제공한다.
제4 측면에서, 본 발명은
(a) 제1 원통(barrel) 중의 제1항의 1 성분 조성물과
(b) 제2 원통 중의, 양이온 함유 제제(임의로는 트롬빈도 함유함),
또는
(a') 제1 원통 중의, 제1항의 분리된 황산화 다당류 및 양이온-함유 제제(임의로는 트롬빈도 함유함)와
(b') 제2 원통 중의 피브리노겐 제제
를 포함하는 2-성분 시린지(syringe) 시스템을 제공한다.
제5 측면에서, 본 발명은 본 발명의 제제, 본 발명의 피브린 응괴 유사 구조물 또는 본 발명의 패치의, 지혈을 증진시키기 위한 용도를 제공한다.
제6 측면에서, 본 발명은 본 발명의 제제, 본 발명의 피브린 응괴 유사 구조물 또는 본 발명의 패치의, 상처 치유를 위한 용도를 제공한다.
제7 측면에서, 본 발명은 본 발명의 제제, 본 발명의 피브린 응괴 유사 구조물 또는 본 발명의 패치의, 약물 전달 시스템으로서 사용하기 위한 용도를 제공한다.
제8 측면에서, 본 발명은 본 발명의 제제, 본 발명의 피브린 응괴 유사 구조물 또는 본 발명의 패치를 상처 표면 상에 적용시키는 것을 포함하는, 조직 봉합 또는 조직 접착(gluing) 방법을 제공한다.
본 발명의 바람직한 실시양태에 대한 상세한 설명
제1 측면에서, 본 발명은 피브리노겐 및 황산화 다당류를, 1 성분 조성물로서, 또는 피브리노겐 및 황산화 다당류를 분리된 성분으로서 포함하는 부분들의 키트로서 포함하는 제제를 제공한다.
피브리노겐 제제는 선행 기술에서 주지되어 있다. 전형적으로는, 피브리노겐 제제는 동결건조된 제제, 또는 냉동 용액이다. 피브리노겐의 가용성을 증가시키고, 농축된 급속-냉동된 피브리노겐 및/또는 조직 접착제 용액의 액화 온도뿐만 아니라 실온에서 그의 점도를 저하시키는 물질이 개시되어 있는 US 5,962,405에 기재되어 있는 바와 같이 적합한 제제를 제조할 수 있다. 그러한 물질은 피브리노겐 1 g당 바람직하게는 0.03 mmol 내지 3 mmol의 양으로, 가장 바람직하게는 0.07 mmol 내지 1.4 mmol의 양으로 벤젠, 피리딘, 피페리딘, 피리미딘, 모르폴린, 피롤, 이미다졸, 피라졸, 푸란, 티아졸, 퓨린 화합물 또는 비타민, 핵산 염기, 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드를 포함한다. 상기 물질 중에는 예를 들어, 벤조산, p-아미노벤조산 (비타민 H'), p-아미노살리실산, 히드록시벤조산, 히드록시살리실산 페닐알라닌, 프로카인, 니아신, 니아신아미드, 피콜린산, 비타민 B6 (피리독신), 히드록시피리딘, 피리딘 디카르복실산, 피리딘 술폰산, 피페리딘 카르복실산 에스테르, 피리미딘, 바르비투르산, 우라실, 우리딘, 우리딘 인산, 티민, 시토신, 시티딘, 히드록시피리미딘, 티아민 (비타민 B1), 모르폴린, 피롤리돈, 이미다졸, 히스티딘, 히단토인, 피라졸 디카르복실산, 페나존, 아데노신, 아데노신 인산, 이노신, 구아노신 인산, α-푸로산 (푸란-2-카르복실산), 아스코르브산 (비타민 C) 및 크산토신이 있다. 특히 바람직한 물질은 히스티딘 및 니아신아미드이다. 조직 접착제 용액에 유용한 다른 성분, 예컨대 본 발명의 제1 측면과 관련하여 논의된 것이 피브리노겐 제제 중에 포함될 수 있다.
피브리노겐 제제가 동결건조된 것이라면, 이는 재구성되어야 한다. 이는 전형적으로는 물, 전형적으로는 주사용수, 또는 용액을 첨가함으로써 달성된다. 상기 용액은 유용한 용질, 예컨대 피브린용해의 억제제인 아프로티닌을 제공할 수 있다. 가온 및/또는 교반 또는 진탕을 적용함으로써 조직 접착제 용액의 재구성을 개선할 수 있다. 피브리노겐 제제가 냉동된 것일 경우, 제제를 가온시켜 이를 해동시킴으로써, 그 결과로 조직 접착제 용액이 되도록 하는 것이 전형적이다. 그러나, 해동 시에 또는 그 후에 추가 물질을 피브리노겐 제제에 첨가할 수 있다.
적합한 피브리노겐 용액 및 그의 제조 방법은 US 5,962,405에 기술되어 있다. 즉시 사용가능한 피브리노겐 용액은 일반적으로 1 ml당 60 내지 120 mg의 피브리노겐을 함유한다. 피브리노겐 성분은 임의로는 인자 XIII, 및 임의로는 상처 치유 과정에서 유익할 수 있는 피브로넥틴 또는 소량의 플라스미노겐을 추가로 함유할 수 있다. 플라스미노겐 활성인자 억제제 및 플라스민 억제제, 예컨대 아프로티닌, α2-플라스민 억제제, α2-마크로글로불린 등 또한 임의로 포함될 수 있다. 일반적으로, 이러한 성분들이 임의로 피브리노겐 용액 중에 포함된다. 피브리노겐 용액은 일반적으로는 유리 칼슘 이온을 함유하지 않는데, 이는 이것이 미량의 잔류 프로트롬빈을 활성화시킴으로써 조기의 원치 않는 응고를 유발할 수도 있기 때문이다. 전형적으로는, 잔류 칼슘 이온과 착체를 형성할 수 있도록 조직 접착제 용액 중에 칼슘 킬레이팅제가 포함된다. 적합하게는, 시트르산염이 생리학상 허용되는 염, 예컨대 시트르산삼나트륨의 형태로 킬레이팅제로서 포함된다. 따라서, 즉시 사용가능한 피브리노겐 용액은 일반적으로 1 ml당 70 내지 120 mg의 피브리노겐, 임의로는 0.5 내지 50 U의 인자 XIII, 임의로는 0.5 내지 15 mg의 피브로넥틴, 0 내지 150 ㎍의 플라스미노겐 및 0 내지 20,000 KIU의 아프로티닌, 바람직하게는 1,000 내지 15,000 KIU의 아프로티닌을 함유한다. 예시적인 조직 접착제 용액은 67 내지 106 mg/ml의 인간 피브리노겐, 2,250 내지 3,750 KIU/ml의 아프로티닌 피브린용해 억제제, 인간 알부민, 25 mmol/l의 시트르산삼나트륨, 히스티딘, 니아신아미드, 폴리소르베이트 80 및 주사용수를 포함하는, 티젤? 피브린 실란트 (미국 캘리포니아 소재의 박스터 헬스케어 코포레이션)의 실러(sealer) 단백질 용액이다.
본원에서 사용되는 "다당류"라는 용어는 다수 (즉, 2개 이상)의 공유 결합된 당류 잔기를 포함하는 중합체를 지칭한다. 결합은 천연 또는 비천연의 것일 수 있다. 천연 결합은 예를 들어, 글리코시드 결합을 포함하는 반면, 비천연 결합은 예를 들어, 에스테르, 아미드, 또는 옥심 결합 부위를 포함할 수 있다. 다당류는 매우 광범위한 평균 분자량 (MW) 값 중 임의의 것을 가질 수 있지만, 일반적으로는 적어도 약 300 달톤이다. 예를 들어, 다당류의 분자량은 적어도 약 500, 1,000, 2,000, 4,000, 6,000, 8,000, 10,000, 20,000, 30,000, 50,000, 100,000, 500,000 달톤 또는 그보다 더욱 높을 수 있다. 다당류의 분자량은 고성능 크기 배제 크로마토그래피에 의해 측정할 수 있다. 다당류는 직쇄 또는 분지쇄 구조를 가질 수 있다. 다당류는 더 큰 다당류의 분해 (예컨대, 가수분해)에 의해 생성된 다당류의 단편을 포함할 수 있다. 분해는 다당류를 산, 염기, 열 또는 효소로 처리하여 분해된 다당류를 수득하는 것과 같은 수단을 비롯한, 당업자에게 공지된 각종의 수단들 중 임의의 것에 의해 달성될 수 있다. 다당류는 화학적으로 변경될 수 있고, 황산화, 폴리황산화, 에스테르화, 및 메틸화를 포함하나, 이에 한정되지 않는 변형을 가질 수 있다.
원칙적으로, 다당류의 단당류 성분 상에 있는 임의의 유리 히드록실기가 황산화에 의해 변형됨으로써 본 발명의 실시에서 잠재적인 용도로 사용하기 위한 황산화 다당류가 생성될 수 있다. 예를 들어, 그러한 황산화 다당류로는 제한없이, 황산화된 뮤코다당류 (D-글루코사민 및 D-글루쿠론산 잔기), 커들란 (카르복시메틸 에테르, 하이드로겐 술페이트, 카르복시메틸화된 커들란) (시그마-알드리치(Sigma-Aldrich)), 황산화된 시조필란 (문헌 [Itoh et al. (1990) Int. J. Immunopharmacol. 12:225-223]; [Hirata et al. (1994) Pharm. Bull. 17:739-741]), 황산화된 글리코사미노글리칸, 황산화 다당류-펩티도글리칸 복합체, 황산화된 알킬 말토-올리고당 (문헌 [Katsuraya et al. (1994) Carbohydr Res. 260:51-61]), 아밀로펙틴 술페이트, N-아세틸-헤파린 (NAH) (시그마-알드리치), N-아세틸-탈(de)-O-황산화-헤파린 (NA-de-o-SH) (시그마-알드리치), 탈-N-황산화-헤파린 (De-NSH) (시그마-알드리치), 및 탈-N-황산화-아세틸화-헤파린 (De-NSAH) (시그마-알드리치)을 포함할 수 있다.
한 부류로서 황산화 다당류는 대개 동물 및 인간에서 우수한 내성 프로파일을 포함한, 다수의 생물학적 활성을 특징으로 한다. 이러한 폴리음이온 분자는 대개 식물 및 동물 조직으로부터 유래되고, 이는 헤파린, 글리코사미노글리칸, 푸코이단, 카라기닌, 펜토산 폴리술페이트, 및 데르마탄 또는 덱스트란 술페이트를 비롯한, 광범위한 하위부류를 포함한다 (문헌 [Toida et al. (2003) Trends in Glycoscience and Glycotechnology 15:29-46]). 저분자량을 갖고, 이종성이 더 낮은 화학적으로 합성된 황산화 다당류가 보고된 바 있으며, 이는 다양한 약물 개발 단계에 도달하였다 (문헌 [Sinay (1999) Nature 398:377-378]; [Orgueira et al. (2003) Chemistry 9:140-169]; [Williams et al. (1998) Gen. Pharmacol. 30:337-341]).
적합하게, 제제는 피브리노겐 1 mg당 0.01 ㎍ 내지 5,000 ㎍의 황산화 다당류를 포함한다. 전형적으로는, 제제는 피브리노겐 1 mg당 0.01, 0.02, 0.05, 0.10, 0.15, 0.25, 0.5, 1, 2, 5, 10, 20, 50, 100, 200 또는 300 ㎍의 황산화 다당류를 포함한다.
제2 측면에서, 본 발명은
(a) 본 발명의 제제를 용액으로서 제공하는 단계,
(b) 양이온 함유 용액을, 분리된 성분으로서(임의로는 트롬빈을 함유함), 또는 본 발명의 황산화 다당류 성분과의 용액으로서(임의로 트롬빈을 함유함) 제공하는 단계,
(c) 임의로는, 트롬빈 용액을 제공하는 단계, 및
(d) (a)와 (b)와 임의로는 (c)를 동시에 또는 순차적으로 임의의 순서로 혼합하여 피브린 응괴 유사 구조물을 수득하는 단계
를 포함하는 방법에 의해 수득될 수 있는 피브린 응괴 유사 구조물을 제공한다.
양이온은 적어도 2가이며, 바람직하게는 칼슘, 마그네슘, 바륨, 및 스트론튬으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 가장 바람직하게는 칼슘, 예컨대 CaCl2이다.
피브린 응괴 유사 구조물은, 피브린 응괴 유사 구조물이 형성되도록 피브리노겐 용액, 황산화 다당류 용액, 양이온, 예컨대 칼슘 이온 함유 용액을 임의로는 트롬빈 용액과 함께 (동시에 또는 임의의 순서로 순차적으로) 혼합함으로써 수득할 수 있다.
피브린 응괴 유사 구조물은 또한, 피브린 응괴 유사 구조물이 형성되도록 피브리노겐 및 황산화 다당류 함유 용액, 양이온, 예컨대 칼슘 이온 함유 용액을 임의로는 트롬빈 용액과 함께 (동시에 또는 임의의 순서로 순차적으로) 혼합함으로써 수득할 수 있다.
피브린 응괴 유사 구조물은 또한, 피브린 응괴 유사 구조물이 형성되도록 피브리노겐 용액, 황산화 다당류 및 양이온, 예컨대 칼슘 이온 함유 용액을 임의로는 트롬빈 용액과 함께 (동시에 또는 임의의 순서로 순차적으로) 혼합함으로써 수득할 수 있다.
피브린 응괴 유사 구조물은 또한, 피브린 응괴 유사 구조물이 형성되도록, 분리된 용액으로서 또는 하나의 용액으로서의 피브리노겐 용액 및 황산화 다당류 용액, 및 트롬빈 및 양이온, 예컨대 칼슘 함유 용액을 (동시에 또는 임의의 순서로 순차적으로) 혼합함으로써 수득할 수 있다.
트롬빈은 동결건조된 제제로서 또는 냉동 용액으로서 제공될 수 있다. 동결건조된 제제는 가온 및/또는 교반/진탕과 함께 또는 그러한 조작 없이 물 또는 용액을 첨가함으로써 재구성될 수 있다. 전형적으로는, 생리학상 허용되는 염 형태의 칼슘 이온이 동결건조물 중에 포함되거나, 또는 트롬빈 제제를 재구성하는데 사용되는 용액 중에 포함된다. 추가 물질, 예컨대 CaCl2가 해동 동안 또는 그 후에 첨가될 수도 있지만, 전형적으로는, 냉동 용액은 해동됨으로써 트롬빈 용액이 된다.
전형적으로는, 트롬빈 용액은 칼슘 이온, 적합하게는, CaCl2, 바람직하게는 36 내지 44 ㎛ol/mL 농도의 것을 포함한다.
원하는 트롬빈 활성을 갖는 트롬빈 용액은 봉합하고자 하는 조직 (상처 표면)으로부터 기원한 것일 수 있거나, 또는 외부에서 첨가된 것일 수 있다. 적합한 외인성 트롬빈 용액은 당업계에 공지되어 있다. 피브린 실란트를 형성하는데 사용되는 트롬빈 용액의 최적의 트롬빈 농도는 임상 조치에 따라 달라지며, 전형적으로는 1 내지 1,000 IU/ml 범위이다. 요즘, 트롬빈 함유 용액의 트롬빈 활성은, 110 IU/앰플로 정의되는 제2 국제 기준과 비교되고 있다 (문헌 [Whitton et al., Thromb Haemost 2005; 93: 261-6]). 응고 기반 및 발색성 시험을 비롯한, 트롬빈 활성을 분석하는 데에는 수 개의 분석법이 이용가능하다 (문헌 [Gaffney and Edgell, Thromb Haemost 1995; 74: 900-3]). 지혈이 신속하게 이루어질 수 있도록 하기 위해서는, 사실상 즉각적인 응고를 유발하는 고농도의 트롬빈이 사용된다. 예로는 티젤? 피브린 실란트 (미국 캘리포니아 소재의 박스터 헬스케어 코포레이션)의 트롬빈 용액 (400 내지 625 IU/ml의 인간 트롬빈 포함), 및 퀵실(Quixil)? 및 에비셀(Evicel)? 피브린 실란트 (옴릭스(Omrix))의 트롬빈 용액 (1,000 IU/ml 활성의 인간 트롬빈 포함)이 있다. (예컨대, 성형 또는 재건 수술에서) 피브린 실란트를 글루로서 사용하고자 하는 경우, 응고가 일어나기 전 외과의에게 조작을 위한 더 많은 시간을 허용하기 위해서는 보다 저농도의 트롬빈이 사용된다. 상기와 같은 조치를 위해, 4 IU/ml의 트롬빈을 함유하는 피브린 실란트 변형물이 다수의 국가에서 시판되고 있다. 트롬빈 농도가 더욱더 낮은 (1 IU/ml 미만) 피브린 실란트는 과거에는 실용성이 없었는데, 그 이유는 응고 시간이 너무 길기 때문이다. 그러나, 본 발명의 제1 측면에 따라 황산화 다당류를 포함할 경우, 저농도, 예컨대 1 IU/ml의 트롬빈을 포함하는 트롬빈 용액을 사용하는 것이 실행가능성이 있을 수 있다. 트롬빈 용액 및 그의 제조 방법은 US 5,714,370 (아이블 및 린나우(Eibl and Linnau); 이뮤노 아게(Immuno AG))에 개시되어 있다. 본 발명의 제1 측면의 방법에서, 칼슘 이온은 전형적으로는 트롬빈 용액으로 제공된다. 칼슘 이온은 전형적으로는 CaCl2로서 제공되지만, CaCl2에 더하여 또는 그의 대체물로서 다른 가용성의 생리학상 적합성을 띠는 칼슘 염, 예컨대 락트산칼슘 및/또는 글루콘산칼슘이 사용될 수 있다. 트롬빈 용액 중 칼슘 농도는 전형적으로는 약 40 mM이다. 예를 들어, 티젤? 피브린 실란트 (미국 캘리포니아주 소재의 박스터 헬스케어 코포레이션)는 36 내지 44 mM의 CaCl2를 함유한다. 트롬빈 용액 및 조직 접착제 용액을 전형적으로는 혼합 이전에 전형적으로는 37℃로 가온시킨다.
본 발명의 제제는 국소용 제제로서 사용될 수 있다. "국소용 제제"는, 피브린 응괴 유사 구조물이 대상체의 특정 부위에서, 전형적으로는 조직 또는 상처 표면에서 형성된다는 것을 의미하는 것이다. 이를 달성하기 위해, 양이온, 예컨대 칼슘의 존재하에 피브리노겐 및 황산화 다당류를 포함하는 용액, 및 임의로는 트롬빈 용액을 국소 부위에서 혼합하거나, 또는 이들을 외부에서 혼합한 후, 응괴 형성이 완결되기 이전에 국소 부위로 도입할 수 있다. 후자의 일례는, WO 96/22115 (미국 일리노이주 소재의 박스터 인터내셔날 헬쓰케어(Baxter International Healthcare))에서와 같이, 수술 후 부착물이 형성되는 것을 막기 위해 또는 그를 감소시키기 위해 가교 결합된 피브린으로 구성된 자가-지지형 시트-유사 물질을 해당 부위에 부착시키는 글루로서 피브린 응괴를 사용할 때이다. 시트-유사 물질이 국소 부위에 도입되기 이전에는 응괴가 완전하게 형성되지 않아야 하거나, 또는 상기 물질은 상기 부위에 부착되지 않을 것이다. 본 발명의 제1 측면의 방법에 의해 제자리(in-situ) 형성되는 응괴는 심폐우회술을 포함하는 수술 및 복부의 둔기 외상 또는 관통상에 기인한 비장 손상의 치료에서 지혈용 보조물로서, 또는 결장창냄술 봉합에서 보조물로서 사용될 수 있다.
피브린 응괴 유사 구조물은 예를 들어, 부착 세포, 특히 포유동물 세포의 배양용, 지혈 증진용, 또는 조직 접착 또는 봉합용 기질(substrate)로서 사용될 수 있다.
제3 측면에서, 본 발명은
(1) 담체, 및
(2) 황산화 다당류인 적어도 하나의 지혈제
를 포함하되, 여기서, 담체가 황산화 다당류일 경우, 담체는 지혈제와 동일한 황산화 다당류가 아닌 것인, 지혈용 패치를 제공한다.
담체는 생체적합성 물질, 예컨대 콜라겐, 젤라틴, 피브리노겐, 피브린 및 다당류, 또는 이들의 유도체 또는 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이다.
바람직하게, 콜라겐 또는 그의 유도체가 사용된다.
다당류로는 예를 들어, 셀룰로스 및 그의 유도체, 예컨대 메틸셀룰로스, 카르복시메틸셀룰로스, 산화된 셀룰로스, 키틴, 키토산, 콘드로이틴, 히알루론산, 전분 등을 포함한다.
"유도체"라는 용어는 화학적으로 또는 물리적으로, 예컨대 열 처리에 의해 변형된 물질을 포함한다.
바람직하게, 황산화 다당류는 지혈용 패치의 활성 표면 1 ㎠당 20 ng 내지 3 mg의 양으로 존재한다.
황산화 다당류는 지혈용 패치의 활성 표면 상에 존재할 수 있거나, 지혈용 패치의 매트릭스 내에 분포된다.
패치는 추가로 지혈용 패치의 활성 표면 상에 트롬빈 및 피브리노겐을 포함할 수 있다.
"지혈용 패치"란, 상처 표면에 적용되었을 때, 지혈을 촉진시켜 주는 하나 이상의 지혈제를 임의로 포함하는 담체를 의미한다. 본 발명에 따라, 지혈용 패치는 황산화 다당류인 지혈제를 포함한다. "지혈제"란 지혈을 촉진시켜 줄 수 있는 제제, 예를 들어, 항피브린용해제, 또는 응고 촉진제를 의미한다. 담체는 전형적으로는 고체이지만, 별법으로 겔일 수도 있다. 적합한 담체는 US 6,733,774 B2 (스팀메데르(Stimmeder); 나이코메드 파마 AS(Nycomed Pharma AS)) 및 US 7,399,483 B2 (스팀메데르; 나이코메드 파마 AS)에 기술되어 있으며, 이는 콜라겐 스폰지, 및 생체분해성 중합체, 예컨대 폴리히알루론산, 폴리히드록시산, 예컨대 락트산, 글리콜산, 히드록시부탄산, 셀룰로스 또는 젤라틴으로부터 제조된 담체를 포함한다. 그러한 담체는 전형적으로는 가요성이며, 밀도는 1 내지 10 mg/㎤이고, 탄성률은 5 내지 100 N/㎠이다. 특히 바람직한 담체는 수술을 통해 제거될 필요없이, 적용 후 약 4 내지 6개월 이내에 효소적으로 분해되는 것이다. 전형적으로는, 담체는 극세사를 비롯한 섬유, 직물, 발포체 또는 겔 형태일 수 있다. 담체는 황산화 다당류, 예컨대 황산화된 셀룰로스일 수 있다. 그러나, 담체는 황산화 다당류인 지혈제와 동일한 황산화 다당류일 수 있다. 적합하게는, 본 발명의 제3 측면에 따라, 담체가 황산화 다당류를 포함할 경우, 담체는 지혈제와 동일한 황산화 다당류가 아니다.
코팅된 담체를 제조하는 방법은 본질적으로 활성 성분들로 이루어진 현탁액을 제조하고, 상기 현탁액을 담체 상에 고르게 분포시키고, 코팅된 담체를 고체 조성물 또는 겔로 건조시켜, 활성 성분을 담체에 고정화시키는 것으로 구성될 수 있다. 현탁액은 전형적으로는 평균 직경이 25 내지 100 ㎛인 입자를 포함한다. 황산화 다당류의 현탁액은 전형적으로는 유기 용매 중에서 제조된다. 현탁액을 담체 상에 고르게 분포시키는 방법은 US 5,942,278 (하게도른 등(Hagedorn et al.), 독일 소재의 나이코메드 아르쯔나이미텔 게엠베하(Nycomed Arzneimittel GmbH))에 개시되어 있다. 담체를 피브리노겐 및 트롬빈으로 코팅하는 방법은 US 6,733,774 B2에 개시되어 있다. 이러한 방법은 황산화 다당류를 포함하는 지혈용 패치를 수득하기 위해 당업자에 의해 쉽게 개조될 수 있다.
별법으로, 황산화 다당류를 지혈용 패치, 예컨대 산화된 셀룰로스 시트의 섬유에 공유 결합시킬 수 있다. 이러한 공유 결합을 수행하는 방법은 당업계에 주지되어 있다. 예를 들어, US 2004/0101546 (골만 및 펜드하카(Gorman and Pendharkar))에는 지혈제를 산화된 알데히드-변형된 셀룰로스 패치에 공유 결합시키는 것이 기술되어 있다.
지혈용 패치의 표면 코팅에 대한 대안으로서, 또는 그에 더하여, 황산화 다당류를 지혈용 패치 전체에 분포시킬 수 있다. 예를 들어, 고체 담체를 황산화 다당류 용액에 침지시킨 후, 건조시킬 수 있다. 별법으로, 황산화 다당류 용액 또는 현탁액을 단량체 용액과 조합한 후, 중합시켜 황산화 다당류가 전체에 고르게 분포되어 있는 고체 담체를 형성할 수 있다. 예를 들어, 황산화 다당류를 pH 2 내지 3에서 산 가용성 콜라겐과 함께 용해시킬 수 있다. 중화 후, 겔의 액체상 중에 황산화 다당류를 함유하는, 콜라겐 섬유 네트워크로 제조된 콜라겐 겔이 형성된다. 콜라겐 겔을 냉동-건조시킨 후, 패드 내에 고르게 분포하는 황산화 다당류를 함유하는 스폰지형 콜라겐 패드를 포함하는 지혈용 패치를 수득하게 된다. 산-가용성 콜라겐 단량체 제조, 및 중성 pH에서의 그의 침전 및 동결건조는 US 6,773,699 (티슈 어드헤시브 테크놀러지스, 인크.(Tissue Adhesive Technologies, Inc))에 기술되어 있다. 콜라겐 막은 문헌 [Bunyaratavej P and Wang HL (2001) J. Periodontol. 72:215-29]에서 논의되어 있다.
대체 담체로는 WO 96/22115 (델모트 및 크랙(Delmotte and Krack); 미국 일리노이주 소재의 박스터 인터내셔날 헬쓰케어)에 개시되어 있는, 가교 결합된 피브린으로 구성된 자가-지지형 시트-유사 물질이 있다. 전형적으로는, 그러한 담체는 내부 외상 병변 치료에서, 특히, 수술 후 합병증으로서 부착물이 형성되는 것을 막기 위해 생체역학 장벽으로서 사용된다. 담체가 본 발명의 제9 측면에 따른 황산화 다당류를 함유할 때, 이는 지혈 특성을 가질 수 있다.
황산화 다당류가 존재하면 지혈면에서 지혈용 패치의 효능은 증가하게 된다. 본원에 기술되어 있는 바와 같이, 황산화 다당류는 피브린 생성을 촉진시키고, 이를 통해 상처 표면에서의 응괴 형성을 촉진시킬 수 있다. 피브리노겐 및 트롬빈은 상처 표면에서 이용가능한 것일 수 있거나, 외부에서 첨가된 것일 수 있다. 적합하게는, 황산화 다당류는 트롬빈 매개 피브린 생성을 촉진시킴으로써 피브린 응괴 형성에 영향을 줄 수 있는 양으로 존재한다. 상기 지혈용 패치는 지혈을 촉진시킨다는 점에 있어서 황산화 다당류가 없으면서 그 외에는 유사한 조성의 지혈용 패치보다 더욱 효과적이다. 지혈용 패치의 지혈면에서의 효능은 동물의 실험상의 상처와 관련하여, 예컨대 US 6,733,774 B2에서 기술된 시험에 따라 시험될 수 있다. 예를 들어, 개에서 지라를 절개 및 천자하거나, 또는 두개 간엽의 끝을 절제한 후 48시간이 경과하였을 때, 검시를 실시할 수 있고, 육안 관찰과 조직학적 조사에 의해 2차 출혈에 대해 밝혀낼 수 있다. 지혈 패치를 돼지의 실험용 비장 병변에 적용하고 출혈이 정지되기까지의 시간을 측정할 수 있다.
전형적으로는, 황산화 다당류는 지혈용 패치의 활성 표면 상에, 전형적으로는 20 ng 내지 3 mg/㎠, 전형적으로는 0.2 내지 300 ㎍/㎠, 예를 들어, 3 내지 300 ㎍/㎠의 양으로 존재한다. 예를 들어, 담체는 황산화 다당류로 코팅될 수 있다. 전형적으로는, 황산화 다당류는 고체 형태이고, 담체 상에 고르게 분포되어 고정되어 있다.
별법으로, 황산화 다당류는 지혈용 패치의 매트릭스 내에, 전형적으로는 지혈용 패치의 활성 표면 1 ㎠당 20 ng 내지 3 mg의 양으로, 전형적으로는 0.2 내지 300 ㎍/㎠, 예를 들어, 3 내지 300 ㎍/㎠의 양으로 분포되어 있다. 지혈용 패치의 "매트릭스"는 활성 표면에서 종료되는 담체의 일부 또는 일부들이다. 매트릭스 깊이가 1 cm일 경우, 황산화 다당류는 전형적으로는 매트릭스에 20 ng/㎤ 내지 3 mg/㎤의 양으로 존재한다. 매트릭스 깊이가 1 mm일 경우, 황산화 다당류는 전형적으로는 매트릭스에 200 ng/㎤ 내지 30 mg/㎤의 양으로 존재한다.
황산화 다당류는 지혈용 패치의 매트릭스 중에 분포될 수 있으며, 또한, 활성 표면 상에 존재할 수도 있다는 것을 이해할 것이다. 그러한 경우, 활성 표면 위 및 매트릭스 내부의 황산화 다당류의 합계량은 전형적으로는 활성 표면 1 ㎠당 20 ng 내지 3 mg, 및 전형적으로는 0.2 내지 300 ㎍/㎠, 예를 들어, 3 내지 300 ㎍/㎠이다.
지혈용 패치는 황산화 다당류 이외의, 어떤 지혈 촉진 제제도 포함하지 않을 수 있다. 별법으로, 하나 이상의 다른 활성제, 예를 들어, 항피브린용해제, 또는 응고를 촉진시키는 제제를 포함할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 지혈용 패치의 활성 표면은 추가로 트롬빈 및 피브리노겐을 포함한다. 적합하게, 트롬빈은 1.0 내지 5.5 IU/㎠의 양으로, 바람직하게는 약 2.0 IU/㎠의 양으로 존재하고, 피브리노겐은 2 내지 10 mg/㎠의 양으로, 바람직하게는 4.3 내지 6.7 mg/㎠의 양으로 존재한다. 트롬빈 및 피브리노겐을 포함하는 지혈용 패치 제조 방법은 US 6,733,774 B2에 개시되어 있다.
추가의 측면에서, 본 발명은 본 발명의 제3 측면에 따른 지혈용 패치를 상처 표면 상에 적용시키는 것을 포함하는, 조직 봉합 또는 조직 접착 방법을 제공한다.
추가의 측면에서, 본 발명은 본 발명의 제3 측면에 따른 지혈용 패치를 출혈 부위 상에 적용시키는 것을 포함하는 지혈 방법을 제공한다.
본 발명의 지혈용 패치는 지혈, 조직 접착 및 조직 봉합, 특히, 위장계, 예컨대 식도, 위, 소장, 대장, 직장에서의 외과적 개입, 실질 기관, 예컨대 간, 비장, 췌장, 신장, 폐, 부신, 갑상샘 및 림프절에서의 외과적 개입, 심장혈관 수술, 기관, 기관지, 또는 폐에 대한 수술을 비롯한 흉부 외과 수술, 치과 수술을 비롯한, 귀, 코, 및 목 (ENT) 부위에서의 외과적 개입, 부인과 수술, 비뇨기과 수술, 뼈 (예컨대, 해면질 절제), 및 응급 수술, 신경계 수술, 림프관루, 담도루, 및 뇌척수액 (CSF)루, 및 흉부 외과 수술 및 폐 수술 시 공기 누출에 특히 유용하다. 따라서, 본 발명은 상기 목적을 위한 본 발명의 제9 측면의 지혈용 패치의 용도에 관한 것이다. 추가로, 지혈용 패치는 실질적으로 액체 밀폐형일 수 있으며, 이로써 출혈이 많이 일어나는 기관, 예컨대 간 및 비장의 수술에서, 및 예컨대 위장관 채널에서의 수술에 매우 유용하다. 본 발명의 지혈용 패치는 전형적으로는 출혈이 통상의 방법으로 조절될 수 없거나, 이러한 방법이 바람직하지 못한 결과를 초래할 수 있을 때에 적용될 것이다.
추가의 측면에서, 본 발명은 담체를 황산화 다당류로 코팅하고/거나, 황산화 다당류를 담체 내에 분포시키는 것을 포함하는, 지혈용 패치 제조 방법을 제공한다. 적합한 방법은 상기 기술된 바와 같다.
제4 측면에서, 본 발명은
(a) 제1 원통(barrel) 중의 제1항의 1 성분 조성물과
(b) 제2 원통 중의, 양이온 함유 제제(임의로는 트롬빈도 함유함),
또는
(a') 제1 원통 중의, 제1항의 분리된 황산화 다당류 및 양이온-함유 제제(임의로는 트롬빈도 함유함)와
(b') 제2 원통 중의 피브리노겐 제제
를 포함하는 2-성분 시린지 시스템을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 제1 원통 중에는 트롬빈 용액을 포함하고, 제2 원통 중에는 피브리노겐 함유 용액을 포함하며, 제3 원통 중에는 황산화 다당류로 구성된 용액을 포함하되, 트롬빈 또는 황산화 다당류 용액 중에 칼슘 이온을 포함하는 것인 시린지를 제공한다.
제5 측면에서, 본 발명은 본 발명의 제제, 본 발명의 피브린 응괴 유사 구조물 또는 본 발명의 패치의, 지혈을 증진시키기 위한 용도를 제공한다.
제6 측면에서, 본 발명은 본 발명의 제제, 본 발명의 피브린 응괴 유사 구조물 또는 본 발명의 패치의, 상처 치유를 위한 용도를 제공한다.
제7 측면에서, 본 발명은 본 발명의 제제, 본 발명의 피브린 응괴 유사 구조물 또는 본 발명의 패치의, 약물 전달 시스템으로서 사용하기 위한 용도를 제공한다.
제8 측면에서, 본 발명은 본 발명의 제제, 본 발명의 피브린 응괴 유사 구조물 또는 본 발명의 패치를 상처 표면 상에 적용시키는 것을 포함하는 조직 봉합 또는 조직 접착 방법을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 방법에 따라 시험관내에서 형성된 응괴로 코팅된 시험관내 표면을 제공한다. 시험관내 표면은 부착 세포, 특히 포유동물 세포의 배양용 기질로서 사용될 수 있다.
US 2006/134093 (론파드(Ronfard); 미국 소재의 DFB 파마슈티칼즈 인크.(DFB Pharmaceuticals Inc.))에는 피브리노겐 및 트롬빈의 혼합물에 의해 형성된 세포 배양용 피브린 세포 지지체가 개시되어 있다. 피브린 세포 지지체는 세포, 예컨대 각질세포의 배양물을 제조하고, 재구성된 조직의 형태로 배양물을 회수하고, 이를 수송하는 데 사용될 수 있다. 재구성된 조직은 특히 피부 이식편으로서 사용하는 데 적합하다. 본 발명의 제7 및 제8 측면의 응괴 및 시험관내 표면은 US 2006/134093에 개시된 바와 같이 사용될 수 있다. 적합한 표면은 하기 물질들 (폴리에스테르, PTFE 또는 폴리우레탄) 중 하나 이상; 하나 이상의 생분해성 중합체 (예컨대, 히알루론산, 폴리락트산 또는 콜라겐); 또는 실리콘 또는 바셀린 거즈 드레싱, 또는 상처 드레싱에 적합한 임의의 다른 물질로부터 제조된 합성 막으로 구성될 수 있다.
본 발명의 임의의 측면에서, 황산화 다당류는 비-항응고성 황산화 다당류 (NASP)인 것이 바람직하다. 본원에서 사용되는 "NASP"는 희석된 프로트롬빈 시간 (dPT) 또는 활성화 부분 트롬보플라스틴 시간 (aPTT) 응고 분석법에서 미분화(unfractional) 헤파린 (MW 범위 8,000 내지 30,000; 평균 18,000 달톤)의 몰 항응고 (응고 시간의 통계학상 유의한 증가) 활성의 1/3 이하, 바람직하게는 1/10 미만의 항응고 활성을 보이는 황산화 다당류를 지칭한다. NASP는 천연 공급원 (예컨대, 갈조류, 나무 껍질, 동물 조직)으로부터 정제되고/거나 변형될 수 있거나, 새로 합성될 수 있으며, 분자량의 범위는 100 달톤 내지 1,000,000 달톤일 수 있다. NASP가 아닌 황산화 다당류에 비한 생체내 항응고 효과 경향성의 감소는 예방 조치로서 바람직하며, 이는 이를 통해 환자에 대한 임의의 항응고 효과 위험이 최소화되기 때문이다. 어떤 경우든, 피브린 실란트 및 지혈용 패치는 오직 국소용으로 사용되는 것으로 하여, 황산화 다당류가 혈관계 내로 누출되는 것을 점진적으로 일어나게 하고, 원치 않는 항응고 효과를 최소화시켜야 한다. 그러므로, 항응고 효과를 갖는 황산화 다당류는, 특히 낮은 농도에서 사용될 수 있다.
NASP는 연구되는 농도 범위에 걸쳐 응고 시간을 현저히 증가시키지 않는다는 점에서 "비-항응고성"이다. 잠재적인 NASP 활성을 갖는 황산화 다당류로는 글리코사미노글리칸 (GAG), N-아세틸 헤파린 (미국 미주리주 세인트루이스 소재의 시그마-알드리치) 및 N-탈황산화된 헤파린 (시그마-알드리치)을 포함하는 헤파린-유사 분자, 술파토이드, 폴리황산화된 올리고당 (문헌 [Karst et al. (2003) Curr. Med. Chem. 10:1993-2031]; [Kuszmann et al. (2004) Pharmazie. 59:344-348]), 콘드로이틴 술페이트 (시그마-알드리치), 데르마탄 술페이트 (미국 오하이오주 신시내티 소재의 켈수스 라보라토리즈(Celsus Laboratories)), 푸코이단 (시그마-알드리치), 펜토산 폴리술페이트 (PPS) (미국 뉴저지주 라리탄 소재의 오르토-맥네일 파마슈티칼즈(Ortho-McNeil Pharmaceuticals)), 푸코피라논 술페이트 (문헌 [Katzman et al. (1973) J. Biol. Chem. 248:50-55]), 및 신규의 술파토이드, 예컨대 GM1474 (문헌 [Williams et al. (1998) General Pharmacology 30:337]) 및 SR 80258A (문헌 [Burg et al. (1997) Laboratory Investigation 76:505]), 및 신규의 헤파리노이드, 및 이들의 유사체를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. NASP는 천연 공급원 (예컨대, 갈조류, 나무 껍질, 동물 조직)으로부터 정제되고/거나 변형될 수 있거나, 새로 합성될 수 있으며, 분자량의 범위는 100 달톤 내지 1,000,000 달톤일 수 있다. 잠재적인 NASP 활성을 갖는 추가의 화합물로는 퍼요오데이트-산화된 헤파린 (POH) (미국 캘리포니아주 샌 리앤드로 소재의 네오파린, 인크.(Neoparin, Inc.)), 화학적으로 황산화된 라미나린 (CSL) (시그마-알드리치), 화학적으로 황산화된 알긴산 (CSAA) (시그마-알드리치), 화학적으로 황산화된 펙틴 (CSP) (시그마-알드리치), 덱스트란 술페이트 (DXS) (시그마-알드리치), 헤파린 유래의 올리고당 (HDO) (미국 캘리포니아주 샌 리앤드로 소재의 네오파린, 인크.)을 포함한다.
바람직한 NASP는 푸코이단 및 펜토산 폴리술페이트이다. 푸코이단은 대개 푸코스의 황산화된 에스테르로 구성된 다당류로서 분지화 정도가 다양하다. 결합은 대개 α(1→2) 또는 α(1→3)일 수 있다. α(1→4) 결합 또한 존재할 수 있다. 푸코스 에스테르는 대개 4번 및/또는 2번 및/또는 3번 위치에서 황산화된다. 탈황산화된 푸코스 또한 존재할 수 있지만, 단일황산화된 푸코스가 지배적이다. 황산화된 푸코스 에스테르 이외에도, 푸코이단은 또한 비-황산화된 푸코스, D-크실로스, D-갈락토스, 우론산, 글루쿠론산 또는 이들 중 1종 초과의 조합물을 함유할 수 있다. F-푸코이단은 >95%의 푸코스의 황산화된 에스테르로 구성된 반면, U-푸코이단은 대략 20% 글루쿠론산이다.
본 발명은 또한 피브리노겐을 포함하는 조직 접착제 용액과 트롬빈 용액을 칼슘 이온 및 황산화 다당류의 존재하에서 혼합하는 것을 포함하는, 피브린 응괴의 제조 방법을 제공한다.
특히, 황산화 다당류가 존재하면 피브린 응괴의 응괴 혼탁도는 증가하게 된다.
바람직한 측면에서, 본 방법은 피브린 응괴로 구성된 국소용 제제를 위한 것이다.
바람직한 측면에서, 조직 접착제 용액은, 황산화 다당류를, 예를 들어 조직 접착제 용액 및 트롬빈 용액을 혼합하였을 때 형성되는 조성물 중 1.2 ㎍/ml 내지 20 mg/ml, 예컨대 0.6 ㎍/ml 내지 10 mg/ml의 농도로 포함한다.
바람직한 측면에서, 조직 접착제 용액 및 트롬빈 용액은 각각 다중-원통형 시린지의 별개의 시린지 원통에 제공된다.
본 발명은 또한 황산화 다당류를 포함하는 피브리노겐 제제를 제공한다.
바람직하게는, 피브리노겐 제제는, 피브리노겐 제제를 포함하는 조직 접착제 용액이 1 ml당 4 IU의 트롬빈 및 40 ㎛ol의 CaCl2를 포함하는 동일 부피의 용액과 혼합하였을 때 37℃에서 10분 이내에 피브린 응괴를 형성할 수 있는 것이다.
본 발명의 피브리노겐 제제는 바람직하게 피브리노겐 1 mg당 0.01 ㎍ 내지 300 ㎍의 황산화 다당류를 포함한다.
본 발명은 또한 황산화 다당류를 포함하는 트롬빈 제제를 제공한다.
트롬빈 제제는, 트로빈 제제를 포함하는 트롬빈 용액이 동일 부피의 조직 접착제 용액과 혼합하였을 때 50 mg/ml의 피브리노겐을 포함하는 조직 접착제 용액으로 하여금 37℃에서 10분 이내에 피브린 응괴를 형성할 수 있게 하는 것이며, 이때, 어느 하나의 용액은 칼슘 이온을 포함하고, 바람직하게는 트롬빈 제제는 트롬빈 1 IU당 1.2 ng 내지 20 mg의 황산화 다당류를 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명의 피브리노겐 제제 또는 트롬빈 제제는 동결건조된 제제 또는 냉동 용액이다.
본 발명은 또한 하나의 원통 중에 본 발명의, 피브리노겐 제제를 포함하는 조직 접착제 용액을 포함하는 시린지를 제공한다.
상기 시린지는 바람직하게 트롬빈 용액을 포함하는 추가의 원통을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 제1 원통 중에 트롬빈 용액을, 제2 원통 중에 조직 접착제 용액을, 및 제3 원통 중에 황산화 다당류 용액을 포함하는 시린지를 제공한다.
본 발명은 또한 상기 기술된 방법에 따라 형성된 응괴를 제공한다.
본 발명은 추가로 본 발명에 따라 형성된 응괴로 코팅된 시험관내 표면을 추가로 제공한다.
본 발명은 또한
- 본 발명에 따른 지혈용 패치를 상처 표면 상에 적용시키는 것을 포함하는 조직 봉합 또는 조직 접착 방법;
- 본 발명의 지혈용 패치를 출혈 부위 상에 적용시키는 것을 포함하는 지혈 방법;
- 담체를 황산화 다당류로 코팅하고/거나, 황산화 다당류를 담체 내에 분포시키는 것을 포함하는 본 발명의 지혈용 패치의 제조 방법;
- 지혈용 패치, 예컨대 본 발명의 패치에 지혈 기능을 제공하기 위한 황산화 다당류의 용도를 제공한다.
바람직하게는 상기 기술된 제제, 상기 기술된 패치, 및 방법 및 용도를 위한 황산화 다당류는 비-항응고성 황산화 다당류 (NASP)이다.
도 1: 피브리노겐 농도가 (50 mg/ml로) 일정할 때, 다양한 농도의 푸코이단 및 Ca2+-이온하에서 수득된 응괴-유사 응집물의 탁도 및 외관.
도 2: 피브리노겐, 푸코이단/펜토산 폴리술페이트 및 Ca2+-이온의 혼합물로부터 수득된 겔-유사 물질의 초미세구조. 농도: 피브리노겐, 50 mg/ml; Ca2+, 20 mM; 펜토산 폴리술페이트 (A), 200 μM; A. 노도숨(A. nodosum) LMW 푸코이단 (B), 200 μM; 푸커스 베시쿨로수스(Fucus vesiculosus) 푸코이단 (C), 20 μM. 막대는 5 ㎛를 나타낸다.
도 3: 헤파린으로 처리된 토끼의 간 표면 찰과상 모델에서 순수한 콜라겐 패드 (마트리스타입트(Matristypt)?)(A)와 비교한, A. 노도숨 푸코이단/CaCl2-함유 콜라겐 패드 (B)의 지혈 효과. 패드를 출혈 상처에 적용시킨 후 15분이 경과하였을 때 촬영한 사진이다.
도 4: 피브린 응괴 형성 동안 푸코이단이 탁도에 미치는 영향. 응괴 형성 동안의 농도: 피브리노겐 (희석된 티젤 VH S/D): 2.5 mg/ml; 트롬빈 0.125 IU/ml. PPS - 펜토산 폴리술페이트, 10 μM ; FAN - 푸코이단 A. 노도숨, LMW: 10 μM, HMW: 0.1 μM; FLJ - 푸코이단 라미나리아 자포니카(Laminaria japonica), 0.1 μM ; FFV - 푸코이단 푸커스 베시쿨로수스, 1 μM.
Figure 112011052281802-pct00001

도 5: 푸코이단이 첨가되지 않은 희석된 티젤 VH S/D 피브린 실란트 (A) 및 1 μM 푸커스 베시쿨로수스 푸코이단이 첨가된 희석된 티젤 VH S/D 피브린 실란트 (B)로부터 수득된 피브린 응괴에 대한 주사 전자 현미경 영상. 농도: 피브리노겐 2.5 mg/ml; 트롬빈 0.125 IU/ml
본 발명은 하기 실시예에서 추가로 설명될 것이지만, 어느 방식으로든 그로 제한되는 것은 아니다.
실시예 1:
놀랍게도 본 발명자들은 피브리노겐 농도가 고농도일 때, 푸코이단 및 Ca2+-이온의 존재하에서 육안으로 보이는 겔-유사 응집물이 빠르게 형성되는 것을 관찰하게 되었다. 이들의 자가 조립 응집물을 수득하기 위해서는 상기 3가지 화합물 모두가 필요하다. 피브리노겐 농도 50 mg/ml에서 수득된 물질의 점조도(consistency)는 푸코이단 및 Ca2+-이온 농도가 증가함에 따라 옅은 유백색에서부터 응괴-유사 외관으로 변하였다 (도 1). 본 실험에서는 먼저 지정된 농도의 푸코이단을 포함하는 0.5 ml의 티젤 VH S/D 실러 단백질 용액을 24 웰 세포 배양 플레이트의 웰에 놓았다. CaCl2 용액 0.5 ml를 첨가함으로써 도 1에 명시되어 있는 최종 농도에 도달하도록 하고, 신속하게 피브리노겐 용액과 혼합하였다. 수득된 혼합물의 탁도 및 점조도를 평가하였다. 피브리노겐 농도가 50 mg/ml로 일정할 때, 혼합물의 탁도는 푸코이단 또는 펜토산 폴리술페이트 농도가 증가함에 따라 증가하였다. 그러나, 이러한 증가는 Ca2+-이온에 강력하게 의존하였다. 1 mM Ca2+-농도에서는 낮게 일어났지만, 20 mM Ca2+-농도에서는 현저하게 일어났다. 푸코이단/펜토산 폴리포스페이트 및 Ca2+가 고농도일 경우에 수득된 혼합물은 겔-유사성을 띠고, 세포 배양 플레이트의 벽에 대한 부착성을 띤 반면, 저농도일 경우에 수득된 혼합물은 점성 유체의 점조도를 가졌다. 겔-유사 물질을 수득하기 위해서는 고농도의 푸코이단/펜토산 폴리술페이트 및 Ca2+-이온, 둘 모두가 필요하다. 푸코이단/펜토산 폴리술페이트 및 Ca2+-이온이 고농도일 경우에 수득된 혼합물의 균질성이 부족한 것은 자가-조립 및 기포의 포함에 의해 매우 빠르게 일어난 응고에 기인하여 혼합이 잘 이루어지지 않는 것으로 설명될 수 있다.
실시예 2:
실시예 1에서 최고 농도의 푸코이단/펜토산 폴리술페이트 및 Ca2+-이온에서 수득된 겔-유사 물질의 구조물 (도 1의 A, B, 및 C에서 우측 상단)을 주사 전자 현미경 (SEM)에 의해 분석하였다. 37℃에서 1.5시간의 응괴 형성 시간이 경과한 후, 응괴를, 0.1 카코딜레이트 완충액 (pH 7.3) 중의 2.5% 글루타르알데히드로 구성된 고정액으로 옮겼다. 응괴 대 고정액의 중량비는 1:10이었다. 4℃에서 12시간이 경과한 후, 이전과 동일한 중량비를 사용하여 0.1 M 카코딜레이트 완충액 (pH 7.3)으로 3회에 걸쳐 응괴를 세척하였다. 1% 페로시안화칼륨을 함유하는 0.5% 4산화오스뮴 중에서 2시간 동안 고정 후처리를 수행하였다. 응괴를 증류수 중에서 세척하고, 2.2 디메톡시프로판을 사용하여 탈수시켰다. 샘플을 아세톤으로 옮기고, 액체 질소 중에서 분쇄시켰다. 샘플을 헥사메틸디실라잔으로 화학적으로 건조시키고, 스터브(stub) 상에 탑재시키고, 팔라듐-금 합금으로 코팅하였다.
수득한 영상은 도 2에 제시되어 있다. 피브리노겐, 푸코이단/펜토산 폴리술페이트 및 Ca2+-이온의 조합에 수득된 신규의 겔-유사 물질은 도 5의 A에 제시되어 있는 피브린 응괴와 비교하였을 때 매우 다른 구조를 갖는다는 것이 분명하게 나타났다. 3가지 화합물을 함께 조합함으로써 시작되는 빠른 자발적 자가 조립 과정에서 부착성 소포체(vesicle)의 3차 구조물이 형성되었다.
실시예 3:
피브리노겐과 함께 겔-유사 물질을 형성하는, Ca2+-이온과 조합된 푸코이단의 관찰된 특성에 기인하여 콜라겐 기재의 지혈용 패드를 제조하였다. 배후에 깔린 아이디어는, 콜라겐 패드 중에 함유되어 있는 이 첨가제들이 혈액 피브리노겐과 상호작용을 할 수 있고, 이로써 콜라겐 패드의 지혈 특성을 증진시킬 수 있다는 점이다. 두께가 2 mm인 콜라겐 스폰지 (마트리스타입트?, 독일 소재의 독토르 수베락(Dr. Suwelack))를, A. 노도숨 LMW 푸코이단 및 CaCl2를 함유하는 용액에 침지시키고, 냉동 건조시켰다. 침지 용액은 냉동 건조 이후에 패드 중 A. 노도숨 LMW 푸코이단의 농도가 0.3 mg/㎠, 및 CaCl2의 농도가 0.9 mg/㎠가 되도록 하는 농도로 성분들을 함유하였다. 패드를 토끼 지혈 모델에 적용시켜 그의 지혈 특성을 평가하였다. 1,000 IU/kg 체중으로 토끼를 헤파린으로 처리하였다. 회전식 분쇄 도구를 사용하여 간 피막에 찰과상을 입힘으로써 원형의 출혈부 (직경 1.8 cm)를 갖도록 만들었다. 상기 상처를 상기 기술된 패드로 처리하였다. 건식 패드를 출혈 상처 상에 적용시켰다. 염수에 침지시킨 거즈를 사용하여 상처에 대해 패드를 2분 동안 압착시켰다. 대조군으로서는 마트리스타입트?를 동일한 방식으로 같은 동물의 또 다른 간엽 상에 적용시켰다. 제2의 동물을 사용하여 상기 실험을 중복 수행하였다. 결과는 상기 두 동물 모두에서 동일하였고, 일례로 도 3에 한 동물의 결과를 제시하였다. 도 3으로부터 관찰할 수 있는 바와 같이, 푸코이단 및 CaCl2를 함유하는 콜라겐 패드에 흡수된 혈액이 대조군에서의 것보다 더 진하게 보였다. 이는 성분들의 작용에 의해 패드 중에서 더 빠르게 응고가 일어났다는 것으로 설명될 수 있다.
실시예 4:
피브리노겐 기질로서 희석된 피브린 실란트 티젤 VH S/D (박스터)를 사용함으로써 트롬빈으로 촉매화된 피브린 응괴 형성시 탁도 증가의 속도론과 수득된 응괴의 최종 탁도에 대해 푸코이단이 미치는 영향을 추가로 확인하였다. 티젤 VH S/D 실러 단백질 용액을 1/20으로 희석시키고 (5 mg/ml의 피브리노겐 농도에 상응), 푸코이단 농도를 20 μM (펜토산 폴리술페이트, 아스코필룸 노도숨(Ascophyllum nodosum) LMW), 2 μM (푸커스 베시쿨로수스), 및 0.2 μM (아스코필룸 노도숨 HMW, 라미나리아 자포니카)로 조정하였다. 이들 희석된 티젤 VH S/D 용액 (피브리노겐, 피브로넥틴 및 인자 XIII 함유) 100 ㎕를 96 웰 마이크로플레이트의 웰 중에서 40 mM CaCl2를 함유하는 100 ㎕의 0.25 IU/ml 트롬빈 용액 (박스터)과 혼합하였다. 혼합한 후, 1.5시간이라는 기간에 걸쳐 630 nm에서 37℃에서의 응괴 형성 동안의 탁도 증가의 측정치를 기록하였다. 결과는 도 4에 제시되어 있다. 약간의 푸코이단 뿐만 아니라, 펜토산 폴리술페이트가 트롬빈으로 촉매화된 응괴 형성 반응을 가속화시킬 수 있고, 탁도를 증가시키면서 피브린 응괴 형성에 영향을 줄 수 있다는 것이 관찰되었다.
실시예 5:
피브린 응괴의 탁도 증가는 "조립성(coarse)" 응괴, 즉, 섬유 직경이 증가된 피브린 응괴와 관련이 있었다 (피브린 중합 및 피브린 구조물에 관한 오엔니크 MD(Oenick MD) 연구-회고록 [Biophys Chem. 2004 Dec 20;112(2-3):187-92]).
푸커스 베시쿨로수스로부터 유래된 푸코이단을 포함하는 피브린 응괴, 및 푸코이단을 포함하지 않는 피브린 응괴를 실시예 4에 기술된 바와 같이 제조하였다. SEM을 위한 샘플을 실시예 2에 기술된 바와 같이 제조하였다.
실시예 6:
트롬빈 매개 피브린 형성 및 상기 과정에 대해 황산화 다당류가 미치는 효과를 연구하는 분석법을 개발하였다. 간략하게 말하면, 트롬빈을 첨가하여 피브리노겐을 함유하는 용액 중에서 응괴 형성이 개시될 수 있도록 한 후, 분광 광도 분석을 수행하였다. 405 nm에서의 흡광도가 응괴의 혼탁도를 나타내는데, 이는 피브린 응괴의 양 및/또는 품질에 따라 다르게 나타난다.
96 웰 마이크로플레이트 (폴리스티렌, F-바닥; 오스트리아 크렘스뮌스터 소재의 그라이너 바이오-원 게엠베하(Greiner Bio-One GmbH))의 각 웰에, 희석 완충액 (25 mM Hepes, pH 7.35, 175 mM NaCl, 2.5 mM CaCl2, 5 mg/ml HSA) 중에 희석된 55 ㎕의 인간 피브리노겐 (플라스미노겐, 피브로넥틴, 인자 XIII은 제거, 미국 코네티컷주 스탬퍼드 소재의 아메리칸 다이아그노스티카 인크.(American Diagnostica Inc.))을 첨가하였다. 100 ㎕의 분석 부피 중 피브리노겐의 최종 농도는 2.5 mg/ml였다. 희석 완충액 중에 희석된 10 ㎕의 황산화 다당류 시험 샘플 (또는 희석 완충액만 단독으로)을 혼합물에 첨가하고, 마이크로플레이트 인큐베이터 상에서 15분 동안 37℃에서 인큐베이션시켰다. 37℃로 미리 가온된 희석 완충액 중에 희석된 35 ㎕의 미리 가온된 인간 트롬빈 (미국 인디애나주 사우스벤드 소재의 엔자임 리서치 라보라토리즈(Enzyme Research Laboratories)(또는 희석 완충액만 단독으로)을 첨가하여 피브린 응괴 형성이 개시될 수 있도록 하였다. 마이크로플레이트를 미리 가온된 (37℃) 마이크로플레이트 판독기 (사파이어(Safire)2™ 마이크로플레이트 판독기; 스위스 소재의 테칸 트레이딩 아게(Tecan Trading AG))로 바로 옮기고, 응괴 형성을 진행하며, 60분 동안 매 30초마다 405 nm에서 판독하였다. 매 시점마다 피브리노겐만을 함유하는 웰의 판독값을 차감하여 각 샘플 웰의 흡광도 판독값을 보정하였다.
최초 실험에서 트롬빈의 농도는 0.1에서 8 nM까지 변화시킨 반면, 황산화 다당류는 본 분석에서는 포함되지 않았다. 405 nm에서 흡광도는 초기에는 신속하게 증가하였지만, 약 20 내지 30분 사이에 평탄역(plateau)에 도달하였다. 각 트롬빈 농도에 대한 60분째의 A405를 기록하였다. 결과는 하기 표 1에 제시하였다.
트롬빈 (nM)* 0 0.1 0.5 2 8
60분째의 A405 0.0000 0.012 0.034 0.045 0.053
*농도는 분석에서의 최종 농도를 나타낸다.
0 내지 0.5 nM의 트롬빈 농도에서는, 트롬빈 농도와 60분째의 A405 사이에 대략적으로 선형인 관계가 있었다. 추가로 트롬빈 농도를 증가시켰을 때, 60분째의 A405에서의 유사한 증가는 일어나지 않았다. 따라서, 0.5 nM 트롬빈 농도를 추가 실험을 위해 선택하였다.
실시예 7:
트롬빈 매개 피브린 응괴 형성에 대해 상이한 농도를 갖는 6개의 황산화 다당류 각각이 미치는 영향에 대하여 실시예 6에 기술된 방법에 따라 조사하였다. 황산화 다당류에 대한 상세한 설명은 하기 표 2에 기재되어 있다.
황산화된 다당류 MW (kDa) 공급원
펜토산 폴리술페이트 나트륨 (PPS) 5.9 CF 파마 리미티드(CF Pharma Ltd.: 헝가리 부다페스트 소재)
푸코이단 LMW, 아스코필룸 노도숨 7.5 크레버 게엠베하 & 컴퍼니(Kraeber GmbH & Co: 독일 엘레르베크 소재)
푸코이단, 푸커스 베시쿨로수스 ~115.5 F6531: 시그마-알드리치 케미 게엠베하(Sigma-Aldrich Chemie GmbH: 독일 타우프키르첸 소재)
푸코이단, 운다리아 핀나티피다
(Undaria pinnatifida)		 ~127 크레버 게엠베하 & 컴퍼니 (독일 엘레르베크 소재)
푸코이단 HMW, 아스코필룸 노도숨 ~600 크레버 게엠베하 & 컴퍼니 (독일 엘레르베크 소재)
푸코이단, 라미나리아 자포니카 >1,000 크레버 게엠베하 & 컴퍼니 (독일 엘레르베크 소재)
본 실험에서, 트롬빈 농도는 0.5 nM이었고, 60분째의 A405를 기록하였다. 시험된 각 다당류의 경우, 저농도는 전반적으로 60분째의 A405에 대해 거의 영향을 미치지 않았다. 전반적으로 농도를 증가시키면 60분째의 A405는 크게 증가하였다. 증가가 관찰된 농도는 상이한 다당류 간에 상이하게 나타났다. 예를 들어, L. 자포니카(L. japonica)로부터 유래된 푸코이단은 100 nM에서 60분째의 A405를 크게 증가시켰다. 대조적으로, 100 nM의 펜토산 폴리술페이트 나트륨은 극히 미미한 효과를 나타낸 반면, 10,000 nM일 때에는 큰 효과를 발휘하였다. 결과를 하기 표 3에 나타내었다.
Figure 112011052281802-pct00002
황산화 다당류가 피브린 응괴 형성을 자극하는 농도 (nM)는 광범위하게 다르지만, 본 분석에서의 60분째의 A405를, 황산화 다당류의 부재하에서 진행된 분석에서의 측정값에 비해 적어도 2배로 증가시킨 농도 (㎍/ml)는 상이한 다당류 간에 대략적으로 유사하였다. 결과를 하기 표 4에 나타내었다.
다당류 존재하에서 60분째의 A405가 다당류의 부재하에서의 것에 비해 적어도 2배로 증가하게 되는 농도
황산화 다당류 농도 (nM) 농도 (㎍/ml)
PPS 10,000 59
A. 노도숨 LMW 10,000 75
F. 베시쿨로수스 1,000 116
U. 핀나티피다 - -
A. 노도숨 HMW 100 60
L. 자포니카 100 100
고농도, 즉, 약 50 내지 100 ㎍/ml 범위의 황산화 다당류는 전반적으로 트롬빈 농도 0.5 nM에서의 응괴 혼탁도 증가량을 8 nM의 트롬빈을 사용하여 수행된 실시예 6에서 관찰된 증가량보다 더 크게 만들었다. 그러므로, 본 결과는, 응괴 혼탁도 (및 따라서, 피브린 생성 및/또는 응괴의 질)는 트롬빈 농도 증가에 의해서는 모사될 수 없는 방식으로 황산화 다당류에 의해 개선될 수 있다는 것을 시사한다.
실시예 8:
트롬빈 의존성 피브린 생성을 개선시키기 위해 황산화 다당류를 피브린 실란트에 포함시킬 수 있었다. 황산화 다당류를 포함함으로써 변형될 수 있는 적합한 피브린 실란트는 박스터 헬스케어 코포레이션 (미국 캘리포니아주 소재)으로부터 입수한 티젤? 피브린 실란트였다. 이것이 본 발명의 가장 바람직한 실시양태이다.
일반적인 방식으로 가온 및 교반 장치, 예컨대 피브리노썸(Fibrinotherm)?을 사용하여 37℃에서 피브린용해 억제제 용액 중에 실러 단백질 농축물을 용해시킴으로써 실러 단백질 용액을 제조하였다. 그러나, 실러 단백질 용액의 최종 농도 범위가 100 내지 200 ㎍/ml가 되도록 실러 단백질 농축물 또는 피브린용해 억제제 용액 중에 정량의 황산화 다당류를 포함시킬 수 있었다. 일반적인 방식으로 CaCl2 용액 중에서 트롬빈을 재구성하여 트롬빈 용액을 제조하였다. 즉시 사용가능한 두플로젝트(Duploject)? 시린지의 2개의 시린지 본체 중 하나의 본체 안으로 각 용액을 뽑아 담았다. 다른 방법에 의해 즉시 사용가능한 피브린 실란트를 제조할 수 있는데, 예를 들면, 미리 충진시킨 냉동 시린지로서 보관한 후, 사용하기 위해 해동시킬 수 있다. 티젤? 피브린 실란트를 제조하는데 적절한 방법들 중 임의의 방법이 적절하다.
즉시 사용가능한 피브린 실란트는 예를 들어, 출혈을 조절하기 위해 건강 관리 전문가에 의해 사용될 수 있다. 두플로젝트? 시린지로부터 방출시키는 동안 용액을 혼합시킬 때, 피브린 생성을 개선시키기 위하여 황산화 다당류는 상기 혼합물 중에 100 내지 200 ㎍/ml의 농도 범위로 존재하게 할 것이다. 피브린 실란트를 박층으로서 건조시킨 상처 표면에 적용시킬 수 있고, 봉합부를 약 3 내지 5분 동안 원하는 위치대로 유지 또는 고정시킬 수 있다.
피브린 실란트는 티젤? 피브린 실란트가 적합한 임의의 조치에도 사용될 수 있다. 예를 들어, 심폐우회술을 포함하는 수술 및 복부의 둔기 외상 또는 관통상에 기인한 비장 손상의 치료에서 지혈용 보조물로서 사용될 수 있다. 별법으로, 결장창냄술 봉합에서 보조물로서 사용될 수 있다.
실러 단백질 용액 성분 중에 황산화 다당류를 포함하는 것에 대한 대안으로서, 트롬빈 용액에 포함될 수도 있다.
티젤? 피브린 실란트는 보통 조기 피브린용해를 방지하기 위해 아프로티닌을 함유한다. 그러나, 일부 개체들은 아프로티닌에 대해 과민한 반응을 나타낸다. 티젤? 피브린 실란트 중에 황산화 다당류를 포함할 수 있고, 상기와 같은 개체에서 사용하기 위해서는 아프로티닌을 생략시킬 수 있다. 황산화 다당류에 의해 매개되는 피브린 생성의 증가 또는 응괴 품질의 개선을 통해 아프로티닌의 사용이 필요하지 않을 수 있다.
실시예 9:
트롬빈 의존성 피브린 생성을 개선시키기 위해 황산화 다당류를 지혈용 패치에 포함시킬 수 있다.
예를 들어, WO 96/22115 (델모트 및 크랙; 미국 일리노이주 소재의 박스터 인터내셔날 헬쓰케어)에 개시되어 있는 가교 결합된 피브린으로 구성된 자가-지지형 시트-유사 물질을 전형적으로는 100 내지 200 ㎍/ml의 농도로 황산화 다당류 용액 중에 침지시킬 수 있다. 피브린 시트를 멸균 조건하에서 건조시키고, 추후 사용을 위해 보관하였다.
이어서, 외과 의사는 임의로는 피브린 시트와 상처 표면 사이에 티젤? 피브린 실란트 층과 함께, 피브린 시트를 상처 표면에 적용시킴으로써 내부 외상 병변, 예컨대 비장 병변을 치료하기 위해 피브린 시트를 사용할 수 있다. 황산화 다당류는 응괴 형성을 촉진시킴으로써 출혈을 감소시킬 것이며, 피브린 시트는 부착물의 발생을 방해할 것이다.

Claims (14)

  1. 피브리노겐, 황산화 다당류 및 칼슘 양이온을 함유하고, 부착성 소포체(vesicle)의 자가 조립된 3차 구조물로 조직된, 육안으로 보이는 겔-유사 응집물을 제공하는 방법이며, 상기 방법은
    (a) 피브리노겐 60 내지 120 mg/ml 및 황산화(sulfated) 다당류를 포함하는 제제를 용액으로서 제공하는 단계,
    (b) 칼슘 양이온 함유 용액을 제공하는 단계, 및
    (c) (a)와 (b)를 혼합하여 피브리노겐 1 mg 당 0.01 ㎍ 내지 300 ㎍의 황산화 다당류를 함유하는 육안으로 보이는 겔-유사 응집물을 수득하는 단계
    를 포함하고,
    상기 육안으로 보이는 겔-유사 응집물이 피브린 및 트롬빈을 포함하지 않는 것인, 육안으로 보이는 겔-유사 응집물을 제공하는 방법.
  2. 피브리노겐, 황산화 다당류 및 칼슘 양이온을 함유하고, 부착성 소포체(vesicle)의 자가 조립된 3차 구조물로 조직된, 육안으로 보이는 겔-유사 응집물을 제공하는 방법이며, 상기 방법은
    (a) 피브리노겐 60 내지 120 mg/ml를 포함하는 제제를 제공하는 단계,
    (b) 칼슘 양이온 및 황산화 다당류를 함유하는 용액을 제공하는 단계, 및
    (c) (a)와 (b)를 혼합하여 피브리노겐 1 mg 당 0.01 ㎍ 내지 300 ㎍의 황산화 다당류를 함유하는 육안으로 보이는 겔-유사 응집물을 수득하는 단계
    를 포함하고,
    상기 육안으로 보이는 겔-유사 응집물이 피브린 및 트롬빈을 포함하지 않는 것인, 육안으로 보이는 겔-유사 응집물을 제공하는 방법.
  3. 피브리노겐, 황산화 다당류 및 칼슘 양이온을 함유하고, 부착성 소포체(vesicle)의 자가 조립된 3차 구조물로 조직된, 육안으로 보이는 겔-유사 응집물을 제공하는 방법이며, 상기 방법은
    피브리노겐 60 내지 120 mg/ml를 함유하는 피브리노겐 용액, 황산화 다당류 용액, 및 칼슘 양이온 함유 용액을 동시에 또는 순서에 상관없이 순차적으로 혼합하여 피브리노겐 1 mg 당 0.01 ㎍ 내지 300 ㎍의 황산화 다당류를 함유하는 육안으로 보이는 겔-유사 응집물을 형성하는 단계를 포함하고,
    상기 육안으로 보이는 겔-유사 응집물이 피브린 및 트롬빈을 포함하지 않는 것인, 육안으로 보이는 겔-유사 응집물을 제공하는 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 황산화 다당류가 글리코사미노글리칸 (GAG), N-아세틸 헤파린, N-탈황산화된 헤파린, 술파토이드, 폴리황산화된 올리고당, 콘드로이틴 술페이트, 데르마탄 술페이트, 푸코이단, 펜토산 폴리술페이트 (PPS), 푸코피라논 술페이트, 헤파리노이드, 퍼요오데이트-산화된 헤파린 (POH), 황산화된 라미나린 (SL), 황산화된 알긴산 (SAA), 황산화된 펙틴 (SP) 및 덱스트란 술페이트 (DXS)로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 수득될 수 있는, 피브리노겐, 황산화 다당류 및 칼슘 양이온을 함유하고, 부착성 소포체(vesicle)의 자가 조립된 3차 구조물로 조직되고, 피브린 및 트롬빈을 포함하지 않는, 육안으로 보이는 겔-유사 응집물.
  6. 제5항에 있어서, 지혈 증진에 사용하기 위한 육안으로 보이는 겔-유사 응집물.
  7. 제5항에 있어서, 상처 치유에 사용하기 위한 육안으로 보이는 겔-유사 응집물.
  8. 제5항에 있어서, 약물 전달 시스템에 사용하기 위한 육안으로 보이는 겔-유사 응집물.
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