BRPI0922524A2 - estrutura semelhante a coágulo de fibrina, emplastro hemostático, sistema de seringa de dois componentes, usos de uma estrutura semelhante a coágulo de fibrina, e de uma preparação de uma estrutura semelhante a coágulo de fibrina,e, método para vedar tecido ou colar tecido - Google Patents

Abstract

ESTRUTURA SEMELHANTE A COÁGULO DE FIBRINA, EMPLASTRO HEMOSTÁTICO, SISTEMA, DE SERINGA DE DOIS COMPONENTES, USOS DE UMA ESTRUTURA SEMELHANTE A COÁGUO DE FIBRINA, E DE UMA PREPARAÇÃO DE UMA ESTRUTURA SEMELHANTE A COÁGULO DE FIBRINA A presente invenção fornece uma preparação compreendendo fibrinogênio e um polissacarídeo sulfatado como uma composição de um componente ou como um kit de partes compreendendo fibrinogênio e polissacarídeo sulfatado como componentes separados. A presente invenção também fornece uma estrutura semelhante a um coágulo de fibrina obtida por um processo definido, um emplastro hemostático, um sistema de seringa de dois componentes e vários usos das preparações descritas, estruturas semelhantes a coágulo de fibrina e emplastros.

Description

: “ESTRUTURA SEMELHANTE A COÁGULO DE FIBRINA, . EMPLASTRO HEMOSTÁTICO, SISTEMA DE SERINGA DE DOIS COMPONENTES, USOS DE UMA ESTRUTURA SEMELHANTE A COÁGULO DE FIBRINA, E DE UMA PREPARAÇÃO DE UMA —ESTRUTURA SEMELHANTE A COÁGULO DE FIBRINA”

CAMPO DA INVENÇÃO A invenção se refere às preparações compreendendo fibrinogênio e um polissacarídeo sulfatado, estruturas semelhantes a coágulo de fibrina obtidas destas, emplastros hemostáticos, e seus métodos de uso.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO Os adesivos teciduais com base em fibrinogênio são empregados para ligações sem costura e/ou com apoio de costura do tecido humano ou animal, ou partes de órgãos, para a vedação de feridas, hemostasia e promover a cicatrização de feridas. Seu modo de ação se baseia no fato de queo fibrinogênio (solúvel) contido em um adesivo líquido de tecido pronto para uso é convertido pela trombina em fibrina (insolúvel). O Fator XIII também pode ser incluído no adesivo líquido de tecido, onde é ativado para o Fator XIlla, pela ação da trombina. Este reticula a fibrina formada para formar um polímero de alto MW que pode melhorar a eficácia do adesivo de tecido. A atividade de trombina requerida pode se originar do tecido (a superfície da ferida) para ser aderido ou pode ser adicionado na forma de uma trombina e solução contendo íons de Ca2+ ao adesivo de tecido no curso da vedação. Os adesivos teciduais com base em fibrinogênio são conhecidos da AT-B-359 653, AT-B-359 652 e AT-B-369 990. Com exceção do —fibrinogênio e Fator XIII eles também podem conter outras proteínas tais como a fibronectina e albumina e opcionalmente agentes antibióticos. A US

5.962.405 (Seelichy Immuno AG) divulga os preparativos fibrinogênio estáveis ao armazenamento na forma liofilizada ou uma forma resultante do congelamento das preparações líquidas (congelada), que pode ser reconstituída e liquefeita rapidamente e em uma forma simples formar soluções de fibrinogênio e/ou de adesivo tecidual prontas para uso. Tais preparações são comercializadas como Tisseelº Fibrin Sealant by Baxter —Healtheare Corporation (CA, USA).

Os emplastros hemostáticos, tais como aqueles produzidos de colágeno, podem ser utilizados para a vedação de tecidos e controle de sangramento em uma variedade de procedimentos cirúrgicos. Eles podem ser usados com um revestimento de adesivo tecidual, tal como a cola de fibrina.

— Alternativamente, os emplastros hemostáticos produzidos de uma esponja de colágeno revestida com trombina e fibrinogênio estão disponíveis, tais como TachoComb& ou TachoSilO (Nycomed).

Os selantes de fibrina e emplastros hemostáticos permitem a hemostasia segura, boa aderência da vedação na ferida e/ou áreas de tecido, grande resistência das aderências e/ou vedações de feridas, capacidade de reabsorção completa do adesivo no decurso do processo de cicatrização de feridas, e podem ter propriedades promotoras da cicatrização de feridas. No entanto, é geralmente necessário manter as partes do tecido seladas na posição desejada por vários minutos para garantir que o selante de fibrina de fixação se prenda firmemente ao tecido circundante. Os compostos que melhoram a formação do coágulo de fibrina e/ou reforçam a estrutura de coágulo de fibrina podem melhorar os selantes de fibrina e emplastros hemostáticos. Por exemplo, um coágulo reforçado seriam menos propenso à fibrinólise e seria mais estável e duradoura.

A listagem ou debate de um documento publicado anteriormente neste relatório descritivo não deve ser tomado como um reconhecimento de que o documento faz parte do estado da técnica ou seja de conhecimento geral comum.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Em um primeiro aspecto a presente invenção fornece uma preparação compreendendo fibrinogênio e um polissacarídeo sulfatado como uma composição de um componente ou como um kit de partes compreendendo fibrinogênio e polissacarídeo sulfatado como componentes separados.

Em um segundo aspecto a presente invenção fornece uma estrutura semelhante a coágulo de fibrina obtida por um processo que compreende as etapas de (a) fornecer uma preparação da presente invenção como uma — solução, (b) fornecer uma solução contendo cátion como um componente separado, opcionalmente contendo trombina, ou como uma solução juntamente com o componente de polissacarídeo sulfatado da presente invenção, opcionalmente contendo trombina, (c) opcionalmente fornecer uma solução de trombina, e (d) misturar (a) e (b) e opcionalmente (c) de forma simultânea ou subseqiiente em qualquer ordem de modo que uma estrutura semelhante a coágulo de fibrina seja obtida.

Em um terceiro aspecto a presente invenção fornece um emplastro hemostático que compreende (1) um carreador, e (2) pelo menos um agente hemostático que é um polissacarídeo sulfatado, em que, se o carreador for um polissacarídeo sulfatado, não é o mesmo polissacarídeo sulfatado como o agente — hemostático.

Em um quarto aspecto a presente invenção fornece um sistema de seringa de dois componentes compreendendo (a) a composição de um componente de acordo com a reivindicação 1 no primeiro tambor, e

(b) uma preparação contendo cátion, opcionalmente junto com a trombina no segundo tambor; ou (a') o polissacarídeo sulfatado separado de acordo com a reivindicação | e uma preparação contendo cátion, opcionalmente junto com a trombina no primeiro tambor, e (b) uma preparação de fibrinogênio no segundo tambor.

Em um quinto aspecto a presente invenção fornece o uso de uma preparação da presente invenção, uma estrutura semelhante a coágulo de fibrina da presente invenção, ou um emplastro da presente invenção para intensificar a hemostasia.

Em um sexto aspecto a presente invenção fornece o uso de uma preparação da presente invenção, uma estrutura semelhante a coágulo de fibrina da presente invenção, ou um emplastro da presente invenção para a cicatrização de feridas.

Em um sétimo aspecto a presente invenção fornece o uso de uma preparação da presente invenção, uma estrutura semelhante a coágulo de fibrina da presente invenção, ou um emplastro da presente invenção para uso como um sistema de liberação de medicamento.

Em um oitavo aspecto a presente invenção fornece um método de vedação de tecido ou colagem de tecido que compreende a aplicação em uma superfície da ferida de uma preparação da presente invenção, uma estrutura semelhante a coágulo de fibrina da presente invenção, ou um emplastro da presente invenção.

DESCRIÇÃO “DETALHADA DAS FORMAS DE

REALIZAÇÃO PREERIDAS DA INVENÇÃO Em um primeiro aspecto a presente invenção fornece uma preparação que compreende fibrinogênio e um polissacarídeo sulfatado como uma composição de um componente ou como um kit de partes compreendendo fibrinogênio e polissacarídeos sulfatados como componentes separados.

As preparações de fibrinogênio são bem conhecidas na técnica anterior. Tipicamente, a preparação de fibrinogênio é uma preparação 5 liofilizadaou uma solução congelada. As preparações adequadas podem ser preparadas como descrito na US 5.962.405, que divulga as substâncias para aumentar a solubilidade do fibrinogênio, diminuir a temperatura de liquefação do fibrinogênio congelado concentrado e/ou soluções adesivas de tecido, assim como a sua viscosidade na temperatura ambiente. Tais substâncias incluem benzeno, piridina, piperidina, pirimidina, morfolina, pirrol, imidazol, pirazol, furano, tiazol, compostos de purina ou vitaminas, bases nucléicas, nucleosídeos ou nucleotídeos, de preferência na quantidade de 0,03 mmol a 3 mmol, mais preferivelmente em uma quantidade de 0,07 mmol e 1,4 mmol, por g de fibrinogênio. Entre estas substâncias estão, por exemplo, ácido benzóico, ácido p-aminobenzóico (vitamina H), ácido p-aminosalicíclico, ácido hidroxibenzóico, fenilalanina hidroxissalicíclica, procaína, niacina, niacinamida, ácido picolínico, vitamina Bs (piridoxina), hidroxipiridinas, ácido piridina dicarboxílico, ácido piridina sulfônico, éster de ácido piperidina carboxílico, pirimidina, ácido barbitúrico, uracila, uridina, fosfato de uridina, timina, citosina, citidina, hidroxipirimidina, tiamina (vitamina B1), morfolina, pirrolidona, imidazol, histidina, hidantoína, ácido pirazol dicarboxílico, fenazona, adenosina, fosfato de adenosina, inosina, fosfato de guanosina, ácido a-furóico (ácido furan-2-carboxílico), ácido ascórbico (vitamina OC) e xantosina. As substâncias particularmente preferidas são histidina e — niacinamida. Outros componentes que são de utilidade na solução de adesivo tecidual, tais como aqueles debatidos em relação ao primeiro aspecto da invenção, podem ser incluídos na preparação de fibrinogênio. Se a preparação de fibrinogênio for liofilizada, deve ser reconstituída. Isto é tipicamente alcançada pela adição de água, tipicamente água para injeção, ou uma solução.

A solução pode fornecer solutos úteis tais como aprotinina, que é um inibidor da fibrinólise.

Aquecimento e/ou agitação ou estimulação podem ser aplicadas para melhorar a reconstituição da solução de adesivo tecidual.

Onde a preparação de fibrinogênio estiver congelada, é típico aquecer a preparação para descongelá-la, quando então ela se torna a solução de adesivo de tecido.

No entanto, o material adicional pode ser acrescentado na preparação de fibrinogênio durante ou após o descongelamento.

As soluções adequadas de fibrinogênio e os métodos de —prepará-las são descritos na US 5.962.405. As soluções de fibrinogênio prontas para uso geralmente contêm de 60 a 120 mg de fibrinogênio por ml.

O componente de fibrinogênio pode opcionalmente ainda incluir o Fator XIII, e opcionalmente fibronectina ou pequenas quantidades de plasminogênio que pode ser vantajoso no curso da cicatrização de feridas.

Um inibidor do ativador de plasminogênio e inibidor de plasmina podem também opcionalmente ser incluídos, tais como aprotinina, inibidor de ax-plasmina, a2z-macroglobulina e outros mais.

De uma forma geral, estes componentes são opcionalmente incluídos na solução de fibrinogênio.

As soluções de fibrinogênio geralmente não contêm fons de cálcio livres, pois eles podem causar a ativação dos vestígios residuais de protrombina e, portanto, a coagulação prematura indesejada.

Tipicamente, um agente de quelação de cálcio é incluído nas soluções de adesivo teciduais para tornar complexos os íons de cálcio residuais.

Adequadamente, o citrato é incluído como um tal agente na forma de um sal fisiologicamente aceitável, tal como o citrato de trissódio.

Consequentemente, a solução de fibrinogênio pronta para uso geralmente contém de 70 a 120 mg de fibrinogênio, opcionalmente de 0,5 a 50 U de Fator XIII, opcionalmente de 0,5 a 15 mg de fibronectina, de O a 150 mg de plasminogênio e de O a 20000 KIU de aprotinina, preferivelmente de 1000 a 15000 KIU de aprotinina, por ml.

Uma solução de adesivo de tecido exemplar é a solução de proteína seladora do selante de fibrina TisseelO (Baxter Healthcare Corporation, CA), que compreende de 67 a 106 mg/ml de fibrinogênio humano, de 2250 a 3750 KIU/ml de inibidor da fibrinólise de aprotinina, albumina humana, 25 mmol/I de citrato de trissódio, histidina, niacinamida, polissorbato 80 e água para injeção.

O termo “polissacarídeo” como aqui utilizado, refere-se a um polímero compreendendo uma pluralidade (isto é, dois ou mais) de resíduos de sacarídeo covalentemente ligados. As ligações podem ser naturais ou artificiais. As ligações naturais incluem, por exemplo, ligações glicosídicas, — enquanto que as ligações artificiais podem incluir, por exemplo, componentes de ligação de éster, amida, ou oxima. Os polissacarídeos podem ter qualquer uma de uma ampla faixa de valores de pesos moleculares médios (MW), mas geralmente são de pelo menos cerca de 300 daltons. Por exemplo, os polissacarídeos podem ter pesos moleculares de pelo menos cerca de 500, — 1000,2000, 4000, 6000, 8000, 10000, 20000, 30000, 50000, 100000, 500000 daltons ou até mais. O peso molecular de um polissacarídeo pode ser determinado por cromatografia de exclusão de tamanho de alto desempenho. Os polissacarídeos podem ter estruturas de cadeia reta ou ramificada. Os polissacarídeos podem incluir fragmentos de polissacarídeos gerados pela degradação (por exemplo, hidrólise) dos polissacarídeos maiores. À degradação pode ser alcançada por qualquer um de uma variedade de meios conhecidos por aqueles versados na técnica, incluindo o tratamento de polissacarídeos com ácido, base, calor ou enzimas para a produção de polissacarídeos “degradados. Os polissacarídeos podem ser alterados — quimicamente e podem ter modificações, incluindo, mas não limitado a estas, sulfatação, polissulfação, esterificação e metilação.

Em princípio, qualquer grupo de hidroxila livre em um componente de monossacarídeo de um polissacarídeo pode ser modificado por sulfatação para produzir um polissacarídeo sulfatado para o uso potencial na prática da invenção.

Por exemplo, tais polissacarídeos sulfatados podem incluir, sem limitação mucopolissacarídeos sulfatados (D-glucosamina e resíduos de ácido D-glucurônico), curdlana (éter carboximetílico, sulfato de hidrogênio, — curdlana — carboximetilado) (Sigma-Aldrich) esquizofilan sulfatados (Itoh et al. (1990) Int.

J.

Inmunopharmacol 12:225-223; Hirata et al (1994) Pharm.

Bull. 17:739-741), glicosaminoglicanos sulfatados, complexo de polissacarídeo-peptidoglicano sulfatoado, malto- oligossacarídeos de alquila sulfatados (Katsuraya et al. (1994) Carbohydr Res. 260:51-61), sulfato de amilopectina, N-acetil-heparina (NAH) (Sigma- — Aldrich), heparina N-acetil-de-O-sulfatada (NA-de-o-SH) (Sigma-Aldrich), heparina de-N-sulfatada (De-NSH) (Sigma-Aldrich), e heparina De-N- sulfatada-acetilada (De-NSAH) (Sigma-Aldrich). Como uma classe, os polissacarídeos sulfatados são caracterizados por um excesso de atividades biológicas com perfil de tolerabilidade frequentemente favorável, em animais e seres humanos.

Estas moléculas polianiônicas são muitas vezes derivadas de tecidos vegetais e animais e abrangem uma ampla faixa de subclasses, incluindo heparinas, glicosaminoglicanos, fucoidanos, carrageninas, polissulfatos de pentosan e sulfatos de dermatan ou dextrano (Toida et al. (2003) Trends in Glycoscience and Glycotechnology 15:29-46). Peso molecular mais baixo, menos heterogêneo, e polissacarídeos sulfatados quimicamente sintetizados foram relatados e têm alcançado vários estágios de desenvolvimento de medicamentos (Sinay (1999) Nature 398:377-378; Orgueira et al. (2003) Chemistry 9:140-169; Williams et al. (1998) Gen.

Pharmacol. 30:337-341). Adequadamente, a preparação compreende de 0,01 ug a 5000 ug de polissacarídeo sulfatado para cada mg de fibrinogênio.

Tipicamente, a preparação compreende 0,01, 0,02, 0,05, 0,10, 0,15, 0,25, 0,5, 1, 2, 5, 10, 20, 50, 100, 200 ou 300 mg de polissacarídeo sulfatado para cada mg de fibrinogênio.

Em um segundo aspecto a presente invenção fornece uma estrutura semelhante a coágulo de fibrina obtida por um processo compreendendo as etapas de (a) fornecer uma preparação da presente invenção como uma solução, (b) fornecer uma solução contendo cátion como um componente separado, opcionalmente contendo trombina, ou como uma solução juntamente com o componente de polissacarídeo sulfatado da presente invenção, opcionalmente contendo trombina, (c) opcionalmente fornecer uma solução de trombina, e (d) misturar (a) e (b) e opcionalmente (c), simultânea ou subseqiientemente em qualquer ordem de modo que uma estrutura semelhante a coágulo de fibrina seja obtida.

O cátion é pelo menos divalente, de preferência do grupo que consiste de cálcio, magnésio, bário e estrôncio, mais preferível cálcio, por exemplo, CaCl,.

Uma estrutura semelhante a coágulo de fibrina pode ser obtida pela mistura (simultânea ou subsequentemente em qualquer ordem) de uma solução de fibrinogênio, uma solução de polissacarídeo sulfatado, um cátion, — por exemplo, solução contendo fons de cálcio, opcionalmente junto de uma solução de trombina de modo que uma estrutura semelhante a coágulo de fibrina seja formada.

Uma estrutura semelhante a coágulo de fibrina também pode ser obtida pela mistura (simultânea ou subsegiientemente em qualquer ordem) — de uma solução contendo fibrinogênio e polissacarídeo sulfatado, um cátion, por exemplo, solução contendo fons de cálcio, opcionalmente junto de uma solução de trombina de modo que uma estrutura semelhante a coágulo de fibrina seja formada.

Uma estrutura semelhante a coágulo de fibrina também pode ser obtida pela mistura (simultânea ou subsegiientemente em qualquer ordem) de uma solução de fibrinogênio, um polissacarídeo sulfatado e um cátion, por exemplo, solução contendo fons cálcio, opcionalmente junto de uma solução de trombina de modo que uma estrutura semelhante a coágulo de fibrina seja formada.

Uma estrutura semelhante a coágulo de fibrina também pode ser obtida pela mistura (simultânea ou subsequentemente em qualquer ordem) de uma solução de fibrinogênio, uma solução de polissacarídeo sulfatado como soluções separadas ou como uma solução e trombina e cação, por exemplo, solução contendo cálcio de modo que uma estrutura semelhante a coágulo de fibrina seja formada.

A trombina pode ser fornecida como uma preparação liofilizada ou uma solução congelada. Uma preparação liofilizada pode ser reconstituída pela adição de água ou uma solução, com ou sem aquecimento e/ou agitação/estimulação. Tipicamente, os fons de cálcio na forma de um sal fisiologicamente aceitável são incluídos no produto liofilizado, ou incluídos na solução usada para reconstituir a preparação de trombina. Uma solução congelada é tipicamente descongelada para fornecer a solução de trombina, embora substâncias adicionais tais como CaCl, podem ser adicionadas — durante ou após o descongelamento.

Tipicamente, a solução de trombina compreende Ííons de cálcio, adequadamente CaCl,, de preferência em uma concentração de 36 a 44 mmol/ml.

A solução de trombina contendo a atividade da trombina requerida pode originar-se do tecido (superfície da ferida) a ser vedado ou pode ser adicionado exogenamente. As soluções de trombina exógenas apropriadas são conhecidas na técnica. A concentração de trombina ideal de uma solução de trombina usada para formar um selante de fibrina depende da indicação clínica, mas tipicamente varia de 1 a 1000IU/ml. A atividade de trombina de uma solução contendo trombina é hoje em dia comparada com o segundo padrão internacional, que tem por definição 110 IU/ampola (Whitton et al., Thromb Haemost 2005; 93: 261-6). Vários ensaios para a análise da atividade de trombina estão disponíveis, incluindo os testes com base em

— coagulação e cromogênicos (Gaffney and Edgell, Thromb Haemost 1995; 74: 900-3). Para alcançar a hemostasia rápida, altas concentrações de trombina que levam à coagulação praticamente instantânea são usadas.

Exemplos são a solução de trombina de selante de fibrina TisseelO (Baxter Healthcare Corporation, CA), que compreende de 400 a 625IU/ml de trombina humana e a solução de trombina de selante de fibrina QuixilO e Evicel& (Omrix) com 1000IU/ml de atividade de trombina humana.

Se a intenção for usar o selante de fibrina como uma cola (por exemplo, na cirurgia cosmética ou reconstrutiva), concentrações de trombina mais baixas são usadas de modo a permitir ao cirurgião mais tempo para manipulações antes que a coagulação ocorra.

Para tais indicações, uma variante de selante de fibrina contendo uma trombina de 4IU/ml está no mercado em muitos países.

Os selantes de fibrina com concentrações de trombina muito mais baixas (menos do que 1IU/ml)

não foram práticos no passado, porque o tempo de coagulação seria demasiado longo.

No entanto, onde um polissacarídeo sulfatado é incluído de

— acordo com o primeiro aspecto da invenção, pode ser possível usar uma solução de trombina tendo uma concentração de trombina baixa, tal como 1IU/ml.

As soluções de trombina e métodos de sua fabricação são divulgados na US 5.714.370 (Eibl and Linnau; Immuno AG). No método do primeiro aspecto da invenção, os fons de cálcio são tipicamente fornecidos na solução de trombina.

Os fons de cálcio são tipicamente fornecidos como CaCl7, mas outros sais de cálcio solúveis e fisiologicamente compatíveis tais como lactato de cálcio e/ou gluconato de cálcio podem ser utilizados além do CaCl, ou como uma alternativa para ele.

A concentração de cálcio na solução de trombina é tipicamente de cerca de 40 mM.

Por exemplo, o selante de fibrina

TisseelO& (Baxter Healthcare Corporation, CA) contém de 36 a 44 mM de CaCl;. As soluções de trombina e as soluções adesivas de tecido são tipicamente aquecidas antes da mistura, tipicamente a 37ºC.

Uma preparação da presente invenção pode ser usada como uma preparação tópica.

Por “preparação tópica” significa que uma estrutura semelhante a coágulo de fibrina é formada em um sítio particular sobre um objeto, tipicamente um tecido ou superfície da ferida.

Para conseguir isso, uma solução que compreende fibrinogênio e polissacarídeo sulfatado na presença de um cátion, por exemplo, cálcio, e opcionalmente uma solução de —trombina são misturados no local tópico, ou eles são misturados externamente e depois introduzidos no sítio tópico antes que a formação de coágulo esteja completa.

Um exemplo da segunda situação é quando o coágulo de fibrina for utilizado como uma cola para aderir um material como lâmina auto- sustentável de fibrina reticulada em um sítio para evitar ou reduzir a formação de aderências pós-cirúrgicas, como na WO 96/22115 (Baxter International Healthcare, IL). O coágulo não deve ser completamente formado antes que o material semelhante a lâmina seja introduzido no sítio tópica, ou o material não irá aderir ao sítio.

Um coágulo formado in situ pelo método do primeiro aspecto da invenção pode ser utilizado como adjuvante para a hemostasia em cirurgias que envolvem desvio cardiopulmonar e tratamento de lesões no baço devido a trauma abrupto ou penetrante no abdome, ou como um adjuvante no fechamento de uma colostomia.

A estrutura semelhante a coágulo de fibrina pode ser utilizada, por exemplo, como um substrato para o cultivo de células aderentes, — particularmente células de mamífero, para melhorar a hemostasia ou para a colagem ou vedação de tecido.

Em um terceiro aspecto a presente invenção fornece um emplastro hemostático que compreende (1) um carreador, e

(2) pelo menos um agente hemostático que é um polissacarídeo sulfatado, em que, se o carreador for um polissacarídeo sulfatado, não é o mesmo polissacarídeo sulfatado como o agente hemostático.

O carreador é um material biocompatível tal como, por exemplo, selecionado do grupo consistindo de colágeno, gelatina, fibrinogênio, fibrina e um polissacarídeo, ou seus derivados ou misturas dos mesmos. Preferivelmente o colágeno ou um derivativo deste é usado.

Os polissacarídeos incluem, por exemplo, celulose e seus derivados, tais como, por exemplo, metilcelulose, carboximetilcelulose, celulose oxidada, quitina, quitosana, condroitina, ácido hialurônico, amido, etc.

O termo “derivado” inclui substâncias que são química ou fisicamente, por exemplo, pelo tratamento térmico, modificadas.

Preferivelmente, o polissacarídeo sulfatado está presente em uma quantidade de 20 ng a 3 mg por cada cm? de superfície ativa do emplastro hemostático.

O polissacarídeo sulfatado pode estar presente em uma superfície ativa do emplastro hemostático ou é distribuído dentro de uma — matriz do emplastro hemostático.

O emplastro pode ainda compreender trombina e fibrinogênio em uma superfície ativa do emplastro hemostático.

Por “emplastro hemostático” entende-se um carreador que opcionalmente compreende um ou mais agentes hemostáticos que, quando — aplicados na superfície de uma ferida, promove a hemostasia. De acordo com a presente invenção, o emplastro hemostático compreende um agente hemostático que é um polissacarídeo sulfatado. Por “agente hemostático” significa um agente que pode promover a hemostasia, por exemplo, um agfente antifibrinolítico, ou agente promotor de coágulo. O carreador é tipicamente sólido, mas pode alternativamente ser um gel. Os carreadores adequados são descritos na US 6.733.774 B2 (Stimmeder; Nycomed Pharma AS) e US 7.399.483 B2 (Stimmeder; Nycomed Pharma AS) e incluem as esponjas de colágeno, e os carreadoras produzidos de um polímero — biodegradável tal como ácido poliialurônico, ácido poliidróxi, por exemplo, ácido lático, ácido glicólico, ácido hidroxibutanóico, uma celulose ou gelatina. Tais carreadores são tipicamente flexíveis, têm uma densidade de | a mg/em? e têm um módulo de elasticidade de 5 a 100 N/em?. Os carreadores particularmente preferidos são enzimaticamente degradados 10 — dentro de cerca de 4 a 6 meses após a aplicação, evitando a necessidade de remoção cirúrgica. Tipicamente, o carreador está na forma de uma fibra, incluindo microfibras, um tecido, uma espuma ou um gel. O carreador pode ser um polissacarídeo sulfatado, tal como a celulose sulfatada. No entanto, pode ser o mesmo polissacarídeo sulfatado como o agente hemostático que é um polissacarídeo sulfatado. Adequadamente, de acordo com o terceiro aspecto da presente invenção, se o carreador compreende um polissacarídeo sulfatado, não é o mesmo polissacarídeo sulfatado como o agente hemostático. A preparação de um carreador revestido pode consistir — essencialmente da preparação de uma suspensão de ingredientes ativos, distribuição uniforme da suspensão no carreador, secagem do carreador revestido em uma composição sólida ou gel/fixação do ingrediente ativo no carreador. A suspensão tipicamente compreende partículas tendo um diâmetro médio de 25 a 100 um. As suspensões de polissacarídeos sulfatados são tipicamente preparadas em solventes orgânicos. Um método de distribuir uniformemente uma suspensão em um carreador é divulgado na US 5.942.278 (Hagedom ef a/, Nycomed Arzneimittel GmbH, DE). Um método de revestimento de um carreador com fibrinogênio e trombina é divulgado na US

6.733.774 B2. Estes métodos podem ser facilmente adaptados pela pessoa versada para obter um emplastro hemostático compreendendo um polissacarídeo sulfatado.

Alternativamente, a ligação covalente dos polissacarídeos sulfatados nas fibras de um emplastro hemostáticos, tal como uma lâmina de celulose oxidada, pode ser executada.

Meios de executar esta ligação covalente são bem conhecidos na técnica.

Por exemplo, a US 2004/0101546 (Gorman and Pendharkar) descreve a ligação covalente de agentes hemostáticos para um emplastro de celulose modificado por aldeídos oxidado.

Como uma alternativa, ou além do revestimento superficial do emplastro hemostático, o polissacarídeo sulfatado pode ser distribuído em todo o emplastro hemostático.

Por exemplo, um carreador sólido pode ser embebido em uma solução de polissacarídeo sulfatado e subseqgiientemente secado.

Alternativamente, uma solução ou suspensão do polissacarídeo sulfatado pode ser combinada com uma solução de um monômero, que é depois polimerizada para formar o carreador sólido com o polissacarídeo sulfatado distribuído uniformemente por toda parte.

Por exemplo, um polissacarídeo sulfatado pode ser dissolvido juntamente com o colágeno solúvel em ácido em pH de 2 a 3. Após a neutralização, um gel de colágeno produzido de uma rede de fibras de colágeno, contendo o polissacarídeo sulfatado na fase líquida do gel, é formado.

Após a secagem por congelamento do gel de colágeno, um emplastro hemostático que compreende um tampão de colágeno esponjoso contendo polissacarídeos sulfatados uniformemente distribuídos dentro do tampão é obtido.

A preparação de monômero de colágeno solúvel em ácido, e a sua precipitação em pH neutro e —liofilização são descritos na US 6.773.699 (Tissue Adhesive Technologies, Inc). As membranas de colágeno são revistas em Bunyaratave] P and Wang HL (2001) J.

Periodontal. 72:215-29. Um carreador alternativo é o material como lâmina auto- sustentável de fibrina reticulada divulgado na WO96/22115 (Delmotte and

Krack, Baxter International Healthcare, IL). Tipicamente, um tal tipo de carreador é utilizado como uma barreira bio-mecânica no tratamento de lesões traumáticas internas, particularmente para a prevenção da formação de aderência como uma complicação pós-operatória. Quando o carreador contém um polissacarídeo sulfatado de acordo com o nono aspecto da invenção, pode ter propriedades hemostáticas.

A presença do polissacarídeo sulfatado aumenta a eficácia do emplastro hemostático na hemostasia. Como aqui descrito, os polissacarídeos sulfatados promovem a geração de fibrina, e assim podem promover a formação de coágulo em uma superfície da ferida. O fibrinogênio e a trombina podem estar disponíveis na superfície da ferida, ou podem ser adicionados exogenamente. Adequadamente, o polissacarídeo sulfatado está presente em uma quantidade que afeta a formação de um coágulo de fibrina mediante a promoção da geração fibrina mediada pela de trombina. O emplastro hemostático é mais eficaz na promoção da hemostasia do que é um emplastro hemostático que carece do polissacarídeo sulfatado, mas de outra forma de composição similar. A eficácia do emplastro hemostático na hemostasia pode ser testada em relação às feridas experimentais em animais, tais como de acordo com os testes descritos na US 6.733.774 B2. Por exemplo, 48 horas após a incisão e perfuração do baço ou ressecção da ponta do lobo cranial do fígado em cães, a necropsia pode ser executada e a evidência de hemorragia secundária procurada pela observação grosseira e exame histológico. Um emplastro hemostático pode ser aplicado a uma lesão experimental do baço em suínos, e o tempo de cessação da hemorragia — medido.

Tipicamente, o polissacarídeo sulfatado está presente na superfície ativa do emplastro hemostático, tipicamente em uma quantidade de 20 ng a 3 mg/cn?, tipicamente 0,2 a 300 ug/cm?, por exemplo, de 3 a 300 ugiem?. Por exemplo, o carreador pode ser revestido com o polissacarídeo sulfatado. Tipicamente, o polissacarídeo sulfatado está em uma forma sólida e está uniformemente distribuída e fixada ao carreador. Alternativamente, o polissacarídeo sulfatado é distribuído dentro da matriz do emplastro hemostático, tipicamente em uma quantidade de20nga3 mg por cada cm? de superfície ativa do emplastro hemostático, tipicamente de 0,2 a 300 ug/cm?, por exemplo, de 3 a 300 ug/em?. A “matriz” do emplastro hemostático é a parte ou partes do carreador que termina em uma superfície ativa. Se a matriz tiver uma profundidade de | cm, o polissacarídeo sulfatado está tipicamente presente em uma quantidade de 20 ngomºô a 3 mg/em? da matriz. Se a matriz tiver uma profundidade de 1 mm, o polissacarídeo sulfatado está tipicamente presente em uma quantidade de 200 ng/cmº a 30 mg/cm? da matriz.

Ficará entendido que o polissacarídeo sulfatado pode ser distribuído na matriz do emplastro hemostático, e também presente na superfície ativa. Nesse caso, o polissacarídeo sulfatado combinado na superfície ativa e na matriz é tipicamente de 20 ng a 3 mg por cada cm? de superfície ativa, e tipicamente de 0,2 a 300 ug/em?, por exemplo, de 3 a 300 mg/cm?.

O emplastro hemostático pode não conter nenhum agente que promova a hemostasia diferente do polissacarídeo sulfatado. Alternativamente, pode conter um ou mais de outros agentes ativos, por exemplo, antifibrinolíticos, ou agentes que promovem a coagulação. Em uma forma de realização preferida, uma superfície ativa do emplastro hemostático — ainda compreende trombina e fibrinogênio. Adequadamente, a trombina está presente em uma quantidade de 1,0 a 5,5IU/cm?, de preferência de cerca de 2,0IU/cm”, e o fibrinogênio está presente em uma quantidade de 2 a 10 mg/cnº, preferivelmente de 4,3 a 6,7 mg/em?. Um método para a produção de um emplastro hemostático que compreende a trombina e fibrinogênio é divulgado na US 6.733.774 B2.

Em um outro aspecto a presente invenção fornece um método de vedação de tecido ou colagem de tecido que compreende a aplicação sobre uma superfície de ferida de um emplastro hemostático de acordo com o terceiro aspecto da invenção.

Em um outro aspecto a presente invenção fornece um método de obtenção da hemostasia, que compreende a aplicação em uma área de escapamento de sangue de um emplastro hemostático de acordo com o terceiro aspecto da invenção.

O emplastro hemostático da presente invenção é útil para a hemostasia, colagem de tecido e vedação de tecido, em particular na intervenção cirúrgica no sistema gastrointestinal, tal como o esôfago, estômago, intestino delgado, intestino grosso, reto, em órgãos parenquimatosos, tais como fígado, baço, pâncreas, rins, pulmões, glândulas —supra-renais, tireóide e linfonodos, a cirurgia cardiovascular, cirurgia torácica incluindo cirurgia na traquéia, brônquios e pulmões, intervenções cirúrgicas no nariz, orelha e área (ENT) na garganta, incluindo cirurgia dentária, ginecológica, urológica, óssea (por exemplo, ressecção esponjosa), e cirurgia de emergência, cirurgia neurológica, linfática, biliar e fístulas (CSF) — cefalorraquidianas, e as fugas de ar durante a cirurgia torácica e pulmonar. À presente invenção assim também diz respeito ao uso do emplastro hemostática do nono aspecto da invenção para os propósitos acima. Além disso, o emplastro hemostático pode ser substancialmente líquido escasso, tornando-se muito útil em cirurgias de órgãos que sangram muito tais como o fígado e o —baçoe para cirurgia, por exemplo, no canal gastrointestinal. O emplastro hemostático da presente invenção deve tipicamente ser aplicado quando o sangramento não puder ser controlado com os métodos convencionais ou quando estes métodos produziriam resultados desfavoráveis.

Em um outro aspecto a presente invenção fornece um método de produção de um emplastro hemostático de acordo com a presente invenção, compreendendo o revestimento de um carreador com um polissacarídeo sulfatado e/ou a distribuição de um polissacarídeo sulfatado dentro de uma carreador. Os métodos adequados são como descritos acima. Em um quarto aspecto a presente invenção fornece um sistema de seringa de dois componentes que compreende (a) a composição de um componente de acordo com a reivindicação 1 no primeiro tambor, e (b) uma preparação contendo cátion, opcionalmente junto de trombina, no segundo tambor; ou (a) o polissacarídeo sulfatado separado de acordo com a reivindicação | e uma preparação contendo cátion, opcionalmente junto da trombina no primeiro tambor, e (b) uma preparação de fibrinogênio no segundo tambor.

Em um outro aspecto a presente invenção fornece uma seringa compreendendo uma solução de trombina em um tambor, uma solução contendo fibrinogênio em um segundo tambor e uma solução de polissacarídeo sulfatado em um terceiro tambor e fons de cálcio na trombina ou na solução de polissacarídeo sulfatado.

Em um quinto aspecto a presente invenção fornece o uso de uma preparação da presente invenção, uma estrutura semelhante a coágulo de fibrina da presente invenção, ou um fragmento da presente invenção para o reforço da hemostasia.

Em um sexto aspecto a presente invenção fornece o uso de uma preparação da presente invenção, uma estrutura semelhante a coágulo de fibrina da presente invenção, ou um emplastro da presente invenção para a cicatrização de feridas.

Em um sétimo aspecto a presente invenção fornece o uso de uma preparação da presente invenção, uma estrutura semelhante a coágulo de fibrina da presente invenção, ou um emplastro da presente invenção para uso como um sistema de liberação de medicamento.

Em um oitavo aspecto a presente invenção fornece um método de vedação de tecido ou colagem de tecido que compreende a aplicação sobre uma superfície da ferida de uma preparação da presente invenção, uma estrutura semelhante a coágulo de fibrina da presente invenção, ou um emplastro da presente invenção.

Em um outro aspecto a presente invenção fornece uma superfície in vitro revestida com um coágulo formado in vitro de acordo com o método da presente invenção. A superfície in vitro pode ser utilizada como um substrato para o cultivo de células aderentes, particularmente células de mamíferos.

A US 2006/134093 (Ronfard; DFB Pharmaceuticals Inc, US) divulga suportes de célula de fibrina para culturas de célula formadas pela mistura de fibrinogênio e trombina. Os suportes de célula de fibrina podem ser utilizados para preparar uma cultura de células tais como queratinócitos, que recupera a cultura na forma de um tecido reconstituído e a transporta. O tecido reconstituído é particularmente adequado para uso como um enxerto de pele. O coágulo e a superfície in vitro do sétimo e oitavo aspectos da invenção — podem ser utilizados conforme divulgado na US 2006/134093. As superfícies adequadas podem consistir de uma membrana sintética produzida de um ou mais dos seguintes materiais (poliéster, PTFE ou poliuretano); de um ou mais polímeros biodegradáveis (por exemplo, ácido hialurônico, ácido poliláctico ou colágeno); ou um curativo de gaze de silicone ou vaselina, ou qualquer — outro material adequado para o curativo de ferimentos.

Em qualquer um dos aspectos da invenção, é preferível que o polissacarídeo sulfatado seja um polissacarídeo sulfatado não anticoagulante (NASP). O “NASP” como aqui utilizado refere-se a um polissacarídeo sulfatado que apresenta atividade anticoagulante em um ensaio de coagulação de tempo de protrombina diluída (dPT) ou tempo de tromboplastina parcial ativada (aPTT) que não é mais do que um terço e, de preferência menos do que um décimo, da atividade de anticoagulante molar (aumento estatisticamente significativo no tempo de coagulação) da heparina não fracionada (faixa de MW de 8.000 a 30.000; média 18.000 daltons). Os NASPs podem ser purificados e/ou modificados a partir de fontes naturais (por exemplo, algas marrons, casca de árvore, tecido de animais) ou podem ser sintetizados de novo e podem variar no peso molecular de 100 daltons a

1.000.000 daltons. Uma tendência reduzida com respeito a um efeito anti- —coagulante in vivo, em comparação com os polissacarídeos sulfatados que não são NASPs, é desejável como uma medida de precaução, visto que qualquer risco de um efeito anti-coagulante para um paciente é assim minimizado. Em qualquer caso, selantes de fibrina e emplastros hemostáticos são destinados apenas para uso tópico, e assim o vazamento do polissacarídeo sulfatado no sistema arterial deve ser gradual, minimizando os efeitos indesejáveis anti- coagulantes. Portanto, os polissacarídeos sulfatados tendo efeitos anti- coagulantes podem ser utilizados, particularmente em baixas concentrações. Os NASPs são “não-anticoagulantes”, em que eles não aumentam significativamente os tempos de coagulação em toda a faixa de — concentrações estudadas. Os polissacarídeos sulfatados com atividade NASP potencial incluem, mas não estão limitados a estes, glicosaminoglicanos (GAGs), moléculas semelhantes a heparina incluindo a Nr-acetil heparina (Sigma-Aldrich, St. Louis, Mo) e heparina N-dessulfatada (Sigma-Aldrich), sulfatóides, oligossacarídeos polissulfatados (Karst et al. (2003) Curr. Med. Chem. 10:1993-2031 ; Kuszmann et al. (2004) Pharmazie. 59:344-348), sulfato de condroitina (Sigma-Aldrich) sulfato de dermatan (Celsus Laboratórios Cincinnati, Ohio), fucoidan (Sigma-Aldrich), polissulfato de pentosan (PPS) (Ortho-McNeil Pharmaceuticals, Raritan, N.J.), sulfatos de fucopiranon (Katzman et al (1973) J. Biol. Chem. 248:50-55), e novos sulfatóides tais como GM1474 (Williams et al. (1998) General Pharmacology 30:337) e SR 80258A (Burg et al. (1997) Laboratory Investigation 76:505), e novos heparinóides, e seus análogos. Os NASPs podem ser purificados e/ou modificados a partir de fontes naturais (por exemplo, algas marrons, casca de árvore, tecido de animais) ou podem ser sintetizados de novo e podem variar no peso molecular de 100 daltons a 1.000.000 daltons. Compostos adicionais com atividade de NASP potencial incluem a heparina penodato-oxidada (POH) (Neoparin, Inc., San Leandro, Calif.), laminarina quimicamente sulfatada (CSL) (Sigma-Aldrich), ácidos algínico quimicamente sulfatado (CSAA) (Sigma-Aldrich), pectina quimicamente sulfatada (CSP) (Sigma- Aldrich), sulfato de dextrano (DXS) (Sigma-Aldrich), oligossacarídeos derivados de heparina (HDO) (Neoparin, Inc., San Leandro, Calif.).

Os NASPs preferidos são polissulfato de fucoidan e pentosana. O fucoidan é um polissacarídeo composto principalmente de ésteres —sulfatados de fucose, com um grau variável de ramificação. As ligações podem ser predominantemente a(1—>2) ou a(1—-3). As ligações a(1—>4) também podem estar presentes. Os ésteres de fucose são predominantemente sulfatados na posição 4 e/ou 2 e/ou 3. As fucoses monossulfatadas dominam, embora a fucose dessulfatada também possa estar presente. Além de ésteres de fucose sulfatado, o fucoidan também pode conter fucose não sulfatada, D-xilose, D-galactose, ácido urônico, ácido glicurônico ou combinações de mais de um destes. O F-fucoidan é > 95% composto de ésteres sulfatados de fucose, enquanto que o Fucoidan é de aproximadamente 20% de ácido glucurônico.

A presente invenção também fornece um método de preparação de um coágulo de fibrina compreendendo a mistura de uma solução adesiva de tecido compreendendo fibrinogênio com uma solução de trombina na presença de fons de cálcio e um polissacarídeo sulfatado.

Em especial, a presença do polissacarídeo sulfatado provoca um aumento na opacidade do coágulo do coágulo de fibrina.

Em um aspecto preferido o método é para uma preparação tópica de um coágulo de fibrina.

Em um aspecto preferido a solução adesiva de tecido compreende polissacarídeo sulfatado, por exemplo, em uma concentração entre 1,2 ug/ml e 20 mg/ml, tal como entre 0,6 ug/ml e 10 mg/ml em uma composição formada após a mistura da solução de adesivo tecidual e da solução de trombina.

Em um aspecto preferido a solução de adesivo de tecido e a solução de trombina são cada uma fornecida em um tambor de seringa separada de uma seringa de múltiplos tambores.

A presente invenção também fornece uma preparação de fibrinogênio compreendendo um polissacarídeo sulfatado.

De preferência a preparação de fibrinogênio é aquela em que uma solução de adesivo de tecido que compreende a preparação de fibrinogênio é capaz de formar um coágulo de fibrina em não mais que 10 minutos a 37ºC quando misturada com um volume igual de uma solução compreendendo 4 IU de trombina e 40 umol de CaCl, por ml.

A preparação de fibrinogênio da presente invenção — compreende preferivelmente de 0,01 ug a 300 ug de polissacarídeo sulfatado para cada mg de fibrinogênio.

A presente invenção também fornece uma preparação de trombina compreendendo um polissacarídeo sulfatado.

A preparação de trombina é preferivelmente aquela em que uma solução de trombina compreendendo a preparação de trombina é capaz de fazer com que uma solução adesiva de tecido compreendendo 50 mg/ml de fibrinogênio forme um coágulo de fibrina em não mais que 10 minutos a 37ºC após a mistura com um volume igual da solução de adesiva de tecido, em que a solução compreende fons de cálcio, de preferência a preparação de trombina compreende de 1,2 ng a 20 mg de polissacarídeo sulfatado para cada IU de trombina.

Em um outro aspecto a preparação de fibrinogênio ou a preparação de trombina da presente invenção é uma preparação liofilizada ou uma solução congelada.

A presente invenção também fornece uma seringa compreendendo uma solução de adesivo de tecido que compreende a preparação de fibrinogênio da presente invenção em um tambor.

A seringa preferivelmente compreende um outro tambor que — compreende uma solução de trombina.

Em outro aspecto a presente invenção fornece uma seringa compreendendo uma solução de trombina em um tambor, uma solução de adesivo tecidual em um segundo tambor e uma solução de polissacarídeo sulfatado em um terceiro tambor.

A presente invenção também fornece um coágulo formado de acordo com o método descrito acima.

A presente invenção ainda fornece uma superfície in vitro revestida com um coágulo formado de acordo com o método da presente invenção.

A presente invenção também fornece - um método de vedação de tecido ou colagem de tecido que compreende a aplicação sobre uma superfície da ferida de um emplastro hemostático de acordo com a presente invenção; - um método de obtenção da hemostasia, que compreende a aplicação em uma área de escapamento de sangue de um emplastro hemostático da presente invenção, - um método de produzir o emplastro hemostático da presente invenção que compreende o revestimento de um carreador com um polissacarídeo sulfatado e/ou distribuição de um polissacarídeo sulfatado dentro de um carreador, - a utilização de um polissacarídeo sulfatado para fornecer uma função hemostática em um emplastro hemostático, por exemplo, um emplastro como da presente invenção, De preferência, o polissacarídeo sulfatado nas preparações acima, no emplastro acima e pelos métodos e usos, é um polissacarídeo sulfatados não anticoagulante (NASP).

DESCRIÇÃO DAS FIGURAS: Figura 1: Turbidez e aparência de agregados semelhantes a —coágulo obtidos na concentração de fibrinogênio constante (50 mg/ml) e várias concentrações de fucoidans e fons Ca**.

Figura 2: Ultraestutura de materiais semelhantes a gel obtidos da mistura de fibrinogênio, fucoidan/pentosanpolissulfato e íons Ca”. Concentrações: fibrinogênio, 50 mg/ml; Ca**, 20 mm; Pentosanpolissulfato (A), 200 um; A. nodosum LMW fucoidan (B), 200 uM; Fucus vesiculosus fucoidan (C), 20 uM. A barra representa 5 uM.

Figura 3: Efeito hemostático de um tampão de colágeno contendo A. nodosum fucoidan/CaCl, (B) em comparação com o tampão de colágeno puro (Matristypt& (A) em um modelo de abrasão da superfície — hepática em coelhos submetidos a heparina. As fotos são tiradas 15 minutos após as aplicações de tampão no sangramento da ferida.

Figura 4: Influência da fucoidans sobre a turbidez durante a formação do coágulo de fibrina. Concentração durante a formação do coágulo: Fibrinogênio (Tisseel VH S/D diluído): 2,5 mg/ml; Trombina 0,125IU/ml. PPS - pentosanpolissulfato, 10 uM; FAN - fucoidan A. nodosum, LMW: 10 uM, HMW: 0,1 uM; FLJ - fucoidan Laminaria japonica, 0,1 uM; FFV - fucoidan Fucus vesiculosus, 1 um.

Figura 5: Microscopia eletrônica de varredura de coágulos de fibrina obtidas de selante de fibrina Tisseel VH S/D diluída sem fucoidan adicionado (A) e com um | uM de fucoidan Fucus vesiculosus (B). Concentrações: fibrinogênio de 2,5 mg/ml; trombina 0,125IU/ml.

A presente invenção será ainda ilustrada nos seguintes exemplos sem qualquer limitação com estes. Exemplo 1: Surpreendentemente observamos que a concentração de fibrinogênio elevada, na presença de fucoidans e fons Ca* macroscopicamente agregados como gel são rapidamente formados. Todos estes trêê compostos são necessários para obter esses agregados de auto- montagem. À consistência do material obtido em uma concentração de fibrinogênio de 50 mg/ml altera de opalescência clara à aparência como coágulo com aumento de fucoidan e concentração de íon Ca?** (Figura 1). Nas experiências 0,5 ml de solução de proteína seladora Tisseel VH S/D com a concentração designada de fucoidan é primeiro colocado na placa de cultura celular de 24 reservatórios. 0,5 ml de uma solução de CaCl, é adicionado para atingir as concentrações finais indicadas na Figura | e rapidamente misturado com a solução de fibrinogênio. A turbidez e a consistência da mistura obtida são avaliadas. Na concentração de fibrinogênio constante de 50 mg/ml, a turbidez da mistura é crescente com o aumento da concentração de fucoidan — ou pentosanpolissulfato. Entretanto, este aumento é fortemente dependente do íon Ca2*. É baixa na concentração de 1 mM Caº**, mas pronunciada na concentração de 20 mM Ca?**. As misturas obtidas nas concentrações elevadas de fucoidanos/pentosanpolifosfato e Ca?** são como gel e se aderem nas paredes das placas de cultura celular, enquanto que aquelas obtidas com as — concentrações baixas têm a consistência de fluidos viscosos. Tanto o fucoidan/pentosanpolissulfato quanto os íons Ca?** são necessários em concentrações mais elevadas, a fim de obter um material como gel. A falta de homogeneidade da mistura obtida nas concentrações mais elevadas de fucoidan/pentosanpolissulfato e íon Ca?* pode ser explicada pela fraca mistura devido a um estabelecimento muito rápido por auto-montagem e as inclusões de bolhas de ar.

Exemplo 2: A estrutura dos materiais como gel obtidos nas concentrações —mais elevadas de fucoidan/pentosanpolissulfato e íons Ca** no exemplo 1 (acima à direita na Figura 1 A, Be O), é analisada por microscopia eletrônica de varredura (SEM). Após o tempo de formação do coágulo de 1,5 hora a 37 ºC os coágulos são transferidos em uma solução de fixação que consiste de 2,5% glutaraldeído com tampão de cacodilato 0,1 em pH 7,3. A relação de — peso do coágulo para solução de fixação é de 1:10. Após 12 horas a 4ºC, os coágulos são lavados 3 vezes com tampão de cacodilato 0,1 M pH 7,3 usando a mesma relação de peso como antes.

A pós-fixação é realizada em tetróxido de ósmio a 0,5% contendo 1% ferrocianeto de potássio durante 2 horas.

Os coágulos são lavados em água destilada e desidratados com 2,2 dimetoxipropano.

As amostras são transferidas em acetona e quebradas em nitrogênio líquido.

As amostras são quimicamente secadas com hexametildissilazana montada em cepas e revestida com uma liga de paládio- ouro.

As imagens obtidas são mostradas na Figura 2. É evidente que o novo material semelhante a gel obtido pela combinação de fibrinogênio, fucoidan/pentosanpolissulfato e fons Ca** possui uma organização muito diferente em comparação com os coágulos de fibrina mostrados na Figura 5A.

No rápido e espontâneo processo de auto montagem, que começa com a junção dos três compostos, uma estrutura tridimensional de vesículas de — aderência é formada.

Exemplo 3: Devido às propriedades observadas de fucoidans em combinação com íons Ca** para formar um material semelhante a gel juntamente com fibrinogênio, um tampão hemostático com base em colágeno é preparado. A idéia por trás é que estes aditivos contidos no tampão de colágeno podem interagir com o fibrinogênio do sangue e, assim, melhorar as propriedades hemostáticas do tampão de colágeno. Uma esponja de colágeno de 2 mm de espessura (Matristypt&, Dr. Suwelack, Germany), é embebida comuma solução contendo A. nodosum LMW fucoidan e CaCl, e secada por congelamento. A solução que embebe contém os ingredientes em uma concentração tal que após a secagem por congelamento, concentrações de 0,3 mg/em? A. nodosum LMW fucoidan e 0,9 mg/em? CaCl, são obtidos no tampão. O tampão é aplicado em um modelo de hemostasia de coelho para — avaliar suas propriedades hemostáticas. Os coelhos são submetidos a heparina com 1000IU/kg de peso corporal. Com uma ferramenta rotativa de moagem um sangramento circular (1,8 cm de diâmetro) é determinado pela abrasão da cápsula do fígado. Esta ferida é tratada com o tampão descrito acima. O tampão seco é aplicado sobre a ferida que sangra. O tampão é pressionado contra a ferida com o auxílio de uma gaze embebida de soro fisiológico durante 2 minutos. Como um controle Matristypt& é aplicado em outro lobo hepático do mesmo animal da mesma maneira. As experiências são executadas em duplicata com um segundo animal. O resultado é o mesmo em ambos os animais e é exemplarmente demonstrado por um animal na Figura3. Como pode ser observado da Figura 3, o sangue embebido no tampão de colágeno contendo fucoidan e CaCl, parece mais escuro do que no controle. Isso pode ser explicado pela coagulação mais rápida na tampão motivada pela ação dos ingredientes.

Exemplo 4: A influência dos fucoidans sobre os cinéticos de aumento da turbidez durante a formação de coágulo de fibrina catalisada por trombina e a turbidez final dos coágulos obtidos é adicionalmente confirmada usando o selante de fibrina diluída Tisseel VH S/D (Baxter) como substrato de fibrinogênio. A solução de proteína seladora Tisseel VH S/D é diluída 1/20

(correspondente a uma concentração de fibrinogênio de 5 mg/ml) e as concentrações de fucoidan ajustadas para 20 uM (pentosanpolissulfato, Ascophyllum nodosum LMW), 2 uM (Fucus vesiculosus), e 0,2 uM (Ascophyllum nodosum HMW, Laminaria japonica). 100 ul destas soluções de Tisseel VA S/D diluídas (contendo fibrinogênio, fibronectina e fator XIII) são misturados em reservatórios de uma microplaca de 96 reservatórios com 100 ul 0,25IU/ml solução de trombina (Baxter), contendo 40 mM CaCbh. À medida de aumento da turbidez durante a formação do coágulo a 37ºC é registrada em 630 nm durante um período de 1,5 hora após a mistura. Os — resultados são mostrados na Figura 4. Observa-se que alguns fucoidanos, mas também pentosanpolissulfato, podem acelerar a reação de formação de coágulo catalisada por trombina e influenciar a formação de coágulos de fibrina com um aumento da turbidez.

Exemplo 5: O aumento da turbidez dos coágulos de fibrina está associado com os coágulos “grosseiros”, isto é, os coágulos de fibrina com um diâmetro de fibra aumentado (Oenick MD Studies on fibrin polymerization and fibrin structure - a retrospective. Biophys Chem. 2004 Dec 20;112(2-3):187-92).

Os coágulos de fibrina com o fucoidan de Fucus vesiculosus e — sem fucoidan são preparados conforme descrito no exemplo 4. A preparação das amostras para SEM é executada como descrito no Exemplo 2.

Exemplo 6: Um ensaio para estudar a formação de fibrina mediada por trombina e o efeito de polissacarídeos sulfatados sobre este processo foi — desenvolvido. Resumidamente, a formação do coágulo é iniciada em uma solução contendo fibrinogênio pela adição de trombina e seguido espectrofotometricamente. A absorbância a 405 nm é indicativa de opacidade do coágulo, que depende da quantidade e/ou qualidade do coágulo de fibrina.

À cada reservatório de uma micro-placa de 96 reservatórios

(poliestireno, fundo F; Greiner Bio-One GmbH, Kremsmuenster, Austria), 55 ul de fibrinogênio humano (plasminogênio, fibronectina, fator XIII esgotado, American Diagnostica Inc., Stamford, CT, USA) diluídos em tampão de diluição (25 mM Hepes pH 7,35, 175 mM NaCl, 2,5 mM CaCLb, 5 mg/mlHSA) são adicionados.

A concentração final de fibrinogênio em um volume de ensaio de 100 ul é de 2,5 mg/ml. 10ul da amostra de teste de polissacarídeo sulfatado diluídos em tampão de diluição (ou tampão de diluição isoladamente) são adicionados à mistura e incubados durante 15 minutos a 37ºC em uma incubadora de micro-placa.

A formação do coágulo de fibrina é iniciada pela adição de 35 uL de trombina humana pré-aquecida (Enzyme Research Laboratories, South Bend, IN,USA) diluídos em tampão de diluição (ou tampão de diluição isoladamente), pré-aquecidos para 37ºC.

O micro-placa é transferida imediatamente para a leitora de microplaca pré- aquecida (37ºC) (leitora de microplaca Safire?"; Tecan Trading AG,CH) e a formação do coágulo é seguida a 405 nm durante 60 minutos mediante a leitura a cada 30 segundos.

Em cada momento as leituras de absorbância de cada reservatório de amostra são corrigidas pela subtração das leituras dos reservatórios contendo apenas fibrinogênio.

Em uma experiência inicial, a concentração de trombina é variada de 0,1 a 8 nM e polissacarídeos sulfatados não são incluídos no ensaio.

A absorbância a 405nm aumenta rapidamente no início, mas alcança um platô entre cerca de 20 e 30 minutos.

À Aos em 60 minutos é registrada para cada uma das concentrações de trombina.

Os resultados são apresentados na Tabela 1 abaixo.

Tabelal As concentrações representam a concentração final no ensaio Existe uma conexão aproximadamente linear entre a concentração de trombina e As em 60 minutos para concentrações de trombina de O a 0,5 nM.

O aumento da concentração de trombina ainda não resulta em um aumento comparável na Aº” em 60 minutos.

Conseqientemente, uma concentração de 0,5nM trombina é escolhida para outras experiências.

Exemplo 7: A influência de diferentes concentrações de cada uma dos 6 polissacarídeos sulfatados sobre a formação de coágulo de fibrina mediada por trombina é examinada de acordo com o método descrito no Exemplo 6. Os detalhes dos polissacarídeos sulfatados são apresentados na Tabela 2 abaixo.

Tabela2 Polissacarídeo sulfatado MW (kDa) Pentosan polissulfato de sódio (PPS) CF Pharma Ltd. (Budapest, Hungary) Fucoidan LMW, Ascophyllum nodosum Kraeber GmbH & Co (Ellerbek, Germany) Fucoidan, Fucus vesiculosus - 115,5 F6531; Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Taufkirchen, Germany) Fucoidan, Undaria pinnatifida Kraeber GmbH & Co (Ellerbek, Germany) Fucoidan HMW, Ascophyllum nodosum Kraeber GmbH & Co (Ellerbek, Germany) > 1000 Kraeber GmbH & Co (Ellerbek, Germany) Nesta experiência, a concentração de trombina é 0,5 nM e Aos é registrada em 60 minutos.

Para cada polissacarídeo testado, as concentrações baixas geralmente possuem pouco efeito sobre a A.os em 60 minutos.

Elevar a concentração geralmente resulta em um grande aumento na A4os em 60 minutos.

A concentração em que se observa o aumento varia entre diferentes polissacarídeos.

Por exemplo, o fucoidan de L. japonica provoca um grande aumento na A,1Ҽs em 60 minutos a 100 nM.

Em contraste, pentosan polissulfato de sódio a 100 nM possui um efeito insignificante, mas um grande efeito em 10000 nM.

Os resultados são apresentados na Tabela 3 abaixo.

Tabela 3 Concentração niMD* | o ] 1 | 1 |] 10 [| 100 10 000 PPS o 0037 0,064 0,429 A. nodosum LMWW | 0043 0037 LF. vesiculosus =| 0043 | | 0048 0,058 0237 | | |U. pinnarifita — == | 0043 | | 004 oos8 pp) A. nodosum HMW 0,042 0,040 og po] 0,042 0,054 otw3 | pp “As concentrações representam a concentração final no ensaio

Embora a concentração nM em que os polissacarídeos sulfatados estimulam a formação de coágulo de fibrina varie amplamente, as concentrações em mg/ml que causam a A,109s em 60 minutos em pelo menos o dobro no ensaio em comparação com o ensaio na ausência de polissacarídeos sulfatados são aproximadamente comparáveis entre os diferentes polissacarídeos.

Os resultados são apresentados na Tabela 4 abaixo.

Tabela 4 Concentração em que Aos, 60 minutos é pelo menos o dobro na presença em comparação com a ausência de polissacarídeo Polissacarídeo sulfatado Conc (nM) Conc (ug/ml) 000 A. nodosum LMW 10 000 1000 |U. pinmarifida | A. nodosum HMW Altas concentrações do polissacarídeos sulfatados, isto é, na faixa de cerca de 50 a 100 mg/ml, geralmente causam um aumento da 10 — opacidade do coágulo em uma concentração de trombina de 0,5 nM, que é maior do que o aumento que se observa no Exemplo 6, pelo uso de 8 nM trombina.

Os resultados, portanto, sugerem que a opacidade do coágulo (e, consequentemente, a geração de fibrina e/ou qualidade do coágulo) pode ser melhorada através de polissacarídeos sulfatados de uma forma que não pode ser simulada pelo aumento da concentração de trombina.

Exemplo 8: Os polissacarídeos sulfatados podem ser incluídos em selantes de fibrina, a fim de melhorar a geração de fibrina dependente de trombina.

Um selante de fibrina adequado que pode ser modificado pela inclusão de — polissacarídeos sulfatados é o selante de fibrina Tisseel8& da Baxter Healthcare Corporation (CA, USA). Esta é a forma de realização mais preferida da invenção.

A solução de proteína selante é preparada pela dissolução do concentrado de proteína selante na solução de inibidor de fibrinólise a 37 ºC — usando um dispositivo de aquecimento e agitação tal como FibrinothermO& na forma habitual. Entretanto, uma quantidade de polissacarídeo sulfatado pode ser incluída no concentrado de proteína selante ou solução de inibidor de fibrinólise, para dar uma concentração final na solução de proteína selante na faixa de 100 a 200 ug/ml. A trombina é reconstituída em solução de CaCl, para produzir a solução de trombina da maneira usual. Cada uma das soluções é arrastada para um dos dois corpos de seringa da seringa Duploject& pronta para uso. O selante de fibrina pode ser preparado e pronto para uso por outros métodos, por exemplo, pode ser armazenado como uma seringa pré-carregada congelada e descongelada pronta para uso. Qualquer um dos métodos apropriados para a preparação de selante de fibrina Tisseel8& é apropriado.

O selante de fibrina pronto para uso pode ser usado por um profissional de saúde, por exemplo, para controlar o sangramento. Após a mistura das soluções durante a expulsão da seringa DuplojectO, o polissacarídeo sulfatado estará presente na mistura em uma faixa de concentração de 100 a 200 ug/ml, a fim de melhorar a geração de fibrina. O selante de fibrina pode ser aplicado como uma fina camada em uma superfície da ferida seca e as partes seladas mantidas ou fixadas na posição desejada durante cerca de três a cinco minutos.

O selante de fibrina pode ser utilizado em qualquer indicação paraaqualo selante de fibrina TisseelO& é adequado. Por exemplo, pode ser usado como adjunto da hemostasia em cirurgias que envolvam o desvio cardiopulmonar e tratamento de lesões no baço devido ao trauma abrupto ou penetrante no abdome. Alternativamente, pode ser usado como adjunto no fechamento de uma colostomia.

Como uma alternativa para incluir o polissacarídeo sulfatado no componente da solução de proteína selante, ele pode ser incluído na solução de trombina.

O selante de fibrina Tisseel8& geralmente contém aprotinina para impedir a fibrinólise prematura. No entanto, alguns indivíduos são hipersensíveis à aprotinina. Pode ser possível incluir polissacarídeo sulfatado no selante de fibrina Tisseel8O e omitir a aprotinina para uso em tais indivíduos.

A geração aumentada de fibrina melhorou a qualidade do coágulo mediada pelo polissacarídeo sulfatado, podendo tornar o uso de aprotinina desnecessário.

Exemplo 9: Os polissacarídeos sulfatados podem ser incluídos dentro de um emplastro hemostático, a fim de melhorar a geração de fibrina dependente —detrombina.

Por exemplo, o material como lâmina auto-sustentável da fibrina reticulada divulgada na WO96/22115 (Delmotte and Krack, Baxter International Healthcare, IL) pode ser embebido em uma solução de polissacarídeo sulfatado, tipicamente em uma concentração de 100 a 200 ug/ml. A lâmina de fibrina é deixada secar em sob condições estéreis e é armazenada para uso futuro.

A lâmina de fibrina pode ser subsequentemente utilizada por um cirurgião para tratar uma lesão traumática interna, tal como uma lesão de baço, mediante a aplicação da lâmina de fibrina na superfície da ferida, — opcionalmente com uma camada de selante de fibrina Tisseel& entre a lâmina de fibrina e a superfície da ferida. O polissacarídeo sulfatado irá promover a formação de coágulo, reduzindo assim a hemorragia, e a lâmina de fibrina impede o desenvolvimento de aderências.

Claims (7)

1. REIVINDICAÇÕES . 1. Estrutura semelhante a coágulo de fibrina caracterizada pelo fato de que contem fibrinogênio, um polissacarídeo sulfatado e cátions obtenível por um processo, compreendendo as etapas de (a) fornecer uma preparação compreendendo fibrinogênio e opcionalmente um polissacarídeo sulfatado como uma solução, (b) fornecer uma solução contendo cátion como um componente separado, opcionalmente contendo trombina, ou como uma solução juntamente com o componente de polissacarídeo sulfatado no caso do —polissacarídeo sulfatado não seja provido na etapa 1), opcionalmente conter trombina, (c) opcionalmente fornecer uma solução de trombina, e (d) misturar (a) e (b) e opcionalmente (c) de forma simultânea ou subseqiiente em qualquer ordem de modo que uma estrutura semelhante a —coágulo de fibrina seja obtida.
2. 2. Emplastro hemostático, caracterizado pelo fato de que compreende (1) um material biocompatível como um carreador em que o carreador e selecionado de um grupo consistindo de colágeno, gelatina, fibrinaeumpolissacarídeo, ou derivados ou misturas dos mesmos, e (2) pelo menos um agente hemostático que é um polissacarídeo sulfatado, em que, se o carreador for um polissacarídeo sulfatado, não é o mesmo polissacarídeo sulfatado como o agente hemostático.
3. 3. Sistema de seringa de dois componentes, caracterizado pelo fato de que compreende (2) um polissacarídeo sulfatado a uma preparação contendo cátion, opcionalmente juntamente com trombina no primeiro tambor, e (b”) uma preparação de fibrinogêneo no segundo tambor.
4. 4. Uso de uma estrutura semelhante a coágulo de fibrina como . definida na reivindicação 1, ou um emplastro como definido na reivindicação 2 caracterizado pelo fato de ser para intensificação da hemostasia.
5. 5. Uso de uma preparação de uma estrutura semelhante a — coágulo de fibrina como definida na reivindicação 1, ou um emplastro como definido na reivindicação 2 caracterizado pelo fato de ser para a cicatrização de feridas.
6. 6. Uso de uma estrutura semelhante a coágulo de fibrina como definida na reivindicação 1, ou um emplastro como definido na reivindicação 2 caracterizado pelo fato de ser como um sistema de liberação de medicamento.
7. 7. Estrutura semelhante a coágulo de fibrina, de acordo com a reivindicação 1, um emplastro homostático de acordo com a reivindicação 2, um sistema de seringa de dois componentes de acordo com a reivindicação 3 caracterizados pelo fato de que o polissacarídeo sulfatado é selecionado de um grupo consistindo de glicosaminoglicanos (GAGs), moléculas semelhante a heparina, heparina de N-acetil e heparina de-N-sulfatada especialmente (Sigma-Aldrich), sulfatóides, oligossacarídeo polisultadados, sultatos de condroitina, sulfato de dermatan, fucoidan, polisulfato de pentosana (PPS), sultafos de focupiranon, sulfatóides, M1474 e SR 80258A especialmente [apenas para ser incluido, se a fórmula química for disponível], heparinóide, heparina de periodato oxidado (POH), laminarina sulfatada (SL), ácido algínico sulfatado (SAA), pectina sulfatada (SP), sulfato de dextrano (DXS), e oligossacarídeos derivados de heparina (HDO).

   Figura 1

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   SIS Figura 5 MA aa AS A e RESUMO : “ESTRUTURA SEMELHANTE A COÁGULO DE FIBRINA, EMPLASTRO HEMOSTÁTICO, SISTEMA DE SERINGA DE DOIS COMPONENTES, USOS DE UMA ESTRUTURA SEMELHANTE A COÁGULO DE FIBRINA, E DE UMA PREPARAÇÃO DE UMA ESTRUTURA SEMELHANTE A COÁGULO DE FIBRINA”

   A presente invenção fornece uma preparação compreendendo fibrinogênio e um polissacarídeo sulfatado como uma composição de um componente ou como um kit de partes compreendendo fibrinogênio e

   —polissacarídeo sulfatado como componentes separados.

   A presente invenção também fornece uma estrutura semelhante a um coágulo de fibrina obtida por um processo definido, um emplastro hemostático, um sistema de seringa de dois componentes e vários usos das preparações descritas, estruturas semelhantes a coágulo de fibrina e emplastros.