ES2225828T3 - Sellantes de tejido suplementados, procedimientos de produccion y uso. - Google Patents

Abstract

ESTA INVENCION PROPORCIONA SELLADORES DE TEJIDO COMPLEMENTADOS Y NO COMPLEMENTADOS (ST), COMO COLA DE FIBRINA, ASI COMO METODOS DE SU PRODUCCION Y USO. EN UNA REALIZACION, ESTA INVENCION PROPORCIONA ST QUE NO INHIBEN LA CURACION DE HERIDAS EN LA PIEL DE GROSOR COMPLETO. ESTA INVENCION TAMBIEN PROPORCIONA ST COMPLEMENTADOS DE FACTOR(ORES) DE CRECIMIENTO Y/O FARMACO(S) Y METODOS DE SU PRODUCCION Y USO. EL FARMACO(S) O FACTOR(ORES) DE CRECIMIENTO PARTICULAR SELECCIONADO ES UNA FUNCION DE SU USO. EN UNA REALIZACION, EL ST ES COMPLEMENTADO CON UN FACTOR(ORES) DE CRECIMIENTO Y PUEDE SER UTILIZADO PARA ESTIMULAR: CURACION DE HERIDAS, COMO LAS DE LA PIEL O HUESO; ENDOTELIALIZACION DE PROTESIS VASCULARES; LA PROLIFERACION Y/O DIFERENCIACION DE CELULAS DE ANIMAL; Y/O LA MIGRACION DIRIGIDA DE CELULAS DE ANIMAL. REALIZACIONES EJEMPLIFICADAS INCLUYEN COLA DE FIBRINA QUE ESTA COMPLEMENTADA CON: FACTOR-1, -2 O -4 DE CRECIMIENTO DE FIBROBLASTO; Y/O PROTEINAS MORFOGENETICAS DE HUESO; Y PRESION DE INJERTOS VASCULARES DE POLITETRAFLUOETILENO DIFUNDIDOS CON COLA DE FIBRINA QUE CONTIENE HBGF-1. EN OTRA REALIZACION EL ST COMPLEMENTADO SE UTILIZA PARA PRODUCIR UNA DISTRIBUCION LOCALIZADA DE UN FACTOR(ORES) DE CRECIMIENTO Y/O FARMACO(S). REALIZACIONES EJEMPLIFICADAS INCLUYEN COLA DE FIBRINA COMPLEMENTADA CON 5-FLUOROURACILO SOLIDO O TETRACICLINA SIN BASE. EN OTRA REALIZACION, ESTA INVENCION PROPORCIONA ST COMPLEMENTADO O TRATADO CON UNA SUSTANCIA, COMO TETRACICLINA SIN BASE O CIPROFLOXACINA HC1, EN DONDE LA DURACION DE LA COLA DE FIBRINA ES AUMENTADA.

Description

Sellantes de tejido suplementados, procedimientos de producción y uso.

Campo de la invención

La presente invención está dirigida a TS suplementados (TS), como cola de fibrina (FG), así como a procedimientos para su producción y uso. En una forma de realización, esta invención está dirigida a TS que no inhiben la curación de heridas de la totalidad del espesor de la piel. La invención está dirigida a TS que se han suplementado con un fárma-
co(s), así como a procedimientos para su producción y uso. El(los) fármaco(s) concreto(s) se selecciona(n) en función de su uso.

Antecedentes de la invención A. Curación de heridas y factores de crecimiento

La curación de heridas, la reparación de lesiones, comienza casi inmediatamente tras producirse el daño. Requiere la función sucesiva y coordinada de diversas células y la estrecha regulación de etapas de degradación y regeneración. La proliferación, diferenciación y migración de las células son importantes procesos biológicos subyacentes a la curación de heridas, que implica también la formación de un coágulo de fibrina, la resorción del coágulo, el remodelamiento del tejido, como fibrosis, la endotelización y la epitelización. La curación de heridas implica la formación de tejido muy vascularizado que contiene numerosos capilares, muchos fibroblastos activos y abundantes fibrillas de colágeno, pero no implica la formación de estructuras especializadas de la piel.

El proceso de curación de heridas puede ser iniciado por la tromboplastina que sale de las células dañadas. La tromboplastina contacta con el factor VII plasmático para formar el activador del factor X, que a continuación, junto con el factor V y en el seno de un complejo con fosfolípidos y calcio, transforma la protrombina en trombina. La trombina cataliza la liberación de fibrinopéptidos A y B del fibrinógeno para producir monómeros de fibrina, que se agregan para forma filamentos de fibrina. La trombina también activa la transglutaminasa, factor XIIIa, que cataliza la formación de puentes isopeptídicos para entrelazar covalentemente los filamentos de fibrina. A continuación, el factor XIII une la alfa_{2}-antiplasmina a los filamentos de fibrina para proteger así los filamentos de la degradación por la plasmina (véase, por ejemplo, Doolittle y col., Ann. Rev. Biochem. 53: 195-229 (1984)).

Cuando se daña un tejido, se liberan factores de crecimiento polipeptídicos, que presentan un conjunto de actividades biológicas, en la herida en la que desempeñan un papel crucial en la curación (véase, por ejemplo, Hormonal Proteins and Peptides (Li. C.H., ed.) Volumen 7, Academic Press, Inc., New York, N. Y. págs. 231-277 (1979) y Brunt y col., Biotechnology 6: 25-30 (1988)). Dichas actividades incluyen el reclutamiento de células, como leucocitos y fibroblastos, en el área dañada y la inducción de proliferación y diferenciación celular. Los factores de crecimiento que pueden participar en la curación de heridas incluyen, pero no están limitados a: factores de crecimiento derivados de plaquetas (PDGF); factor de crecimiento similar a la insulina-1 (IGF-1); factor de crecimiento similar a la insulina-2 (IGF-2); factor de crecimiento epidérmico (EGF); factor de crecimiento transformante-\alpha (TGF-\alpha); factor de crecimiento transformante-\beta (TGF-\beta); factor plaquetario 4 (PF-4) y factores de crecimiento de unión a heparina uno y dos (HBGF-1 y HBGF-2, respectivamente).

Los PDGF están almacenados en los gránulos alfa de las plaquetas circulantes y se liberan en el sitio de la herida durante la coagulación de la sangre (véase, por ejemplo, Lynch y col., J. Clin. Invest. 84: 640-646 (1989)). Los PDGF incluyen: PDGF; factor de angiogénesis derivado de plaquetas (PDAF); TGF-\beta y PF-4, que es un quimioatrayente de neutrófilos (Knighton y col., en Growth Factors and Other Ascpects of Wound Healing: Biological and Clinical Implications. Alan R. Liss, Inc., New York, Nueva York, págs. 319-329 (1988)). El PDGF es un mitógeno, un quimioatrayente y un estimulante de la síntesis de proteínas en células de origen mesenquimal, incluidos fibroblastos y células del músculo liso. EL PDGF también es un quimioatrayente no mitogénico de células endoteliales (véase, por ejemplo, Adelmann-Grill y col., Eur. J. Cell Biol. 51: 322-326 (1990)).

El IGF-1 actúa en combinación con el PDGF para promover la mitogénesis y la síntesis proteica en células mesenquimales en cultivo. La aplicación de PDGF o IGF-1 solos en heridas de la piel no potencia la curación, pero la aplicación de ambos factores conjuntamente parece promover el crecimiento de tejido conectivo y tejido epitelial (Lynch y col., Proc. Natl. Acad. Sci. 76: 1279-1283 (1987)).

El TGF-\beta es un quimioatrayente para macrófagos y monocitos. Dependiendo de la presencia o ausencia de otros factores de crecimiento, el TGF-\beta puede estimular o inhibir el crecimiento de muchos tipos celulares. Por ejemplo, cuando se aplica in vivo, el TGF-\beta aumenta la resistencia a la tensión de heridas dérmicas en curación. El TGF-\beta también inhibe la mitosis de células endoteliales y estimula la síntesis de colágeno y glicosaminoglicanos por los fibroblastos.

Otros factores de crecimiento, como EGF, TGF-\alpha, los HBGF y la osteogenina también son importantes en la curación de heridas. El EGF, que se encuentra en las secreciones gástricas y la saliva, y el TGF-\alpha, fabricado tanto por células normales como por células transformadas, están estructuralmente relacionados y pueden reconocer los mismos receptores. Estos receptores median en la proliferación de células epiteliales. Ambos factores aceleran la reepitelización de las heridas de la piel. El EGF exógeno promueve la curación de heridas estimulando la proliferación de queratinocitos y fibroblastos dérmicos (Nanney y col., J. Invest. Dermatol. 83: 385-393 (1984) y Coffey y col., Nature, 328 :817-820 (1987)). La aplicación tópica de EGF acelera la tasa de curación de heridas espesor parcial en humanos (Schultz y col., Science 235 :350-352 (1987)). La osteogenina, purificada a partir de hueso desmineralizado, parece promover el crecimiento óseo (véase, por ejemplo, Luyten y col., J. Biol. Chem. 264 13377 (1989)). Se ha descrito, además, una fórmula derivada de plaquetas para la curación de heridas, un extracto plaquetario que se encuentra en forma de pomada o ungüento para su aplicación tópica (véase, por ejemplo, Knighton y col., Ann. Surg. 204: 322-330 (1986)).

Los factores de crecimiento de unión a heparina (HBGF), también conocidos como factores de crecimiento de fibroblastos (FGF), que incluyen HBGF ácido (HBGFa, también conocido como HBGF-1) y HBGF básico (HBGFb, también conocido como HBGF-2), son potentes mitógenos para células de linaje mesodérmico y neuroectodérmico, incluidas células endoteliales (véase, por ejemplo, Burgess y col., Ann. Rev. Biochem. 58: 575-606 (1989)). Además, el HBGF es quimiotáctico para células endoteliales y células astrogliales. Tanto el HBGF-1 como el HBGF-2 se unen a la heparina, que los protege de la degradación proteolítica. El conjunto de las actividades biológicas que presentan los HBGF sugiere que éstos desempeñan un papel importante en la curación de heridas.

El factor de crecimiento de fibroblastos básico (FGF-2) es un potente estimulante de la angiogénesis y la migración y proliferación de fibroblastos (véase, por ejemplo, Gospodarowicz y col., Endo. Rev. 8: 95-114 (1985)). Se ha demostrado que el factor de crecimiento de fibroblastos ácido (FGF-1) es un potente factor angiogénico para células endoteliales (Burgess y col., supra. 1989). Sin embargo, no se ha establecido si alguno de los factores de crecimiento FGF es quimiotáctico para fibroblastos.

Los factores de crecimiento son, por lo tanto, potencialmente útiles para promover específicamente la curación de heridas y la reparación tisular. Sin embargo, su uso para promover la curación de heridas ha reportado resultados contradictorios (véase, por ejemplo, Carter y col., en Growth Factors and Other Aspects of Wound Healing: Biological and Clinical Implications, Alan R. Liss, Inc., New York, New York, págs. 303-317 (1988)). Por ejemplo, PDGF, IGF-1, EGF, TGF-\alpha, TGF-\beta y FGF (también conocido como HBGF), aplicados por separado en heridas estandarizadas en la piel de cerdos, tuvieron poco efecto sobre la regeneración del tejido conectivo o el epitelio en las heridas (Lynch y col., J. Clin. Invest. 84 :640-646 (1989)). De entre los factores ensayados, el TGF-\beta, por sí solo, estimuló la mayor respuesta. Sin embargo, una combinación de factores, como el homodímero PDGF-bb e IGF-1 o TGF-\alpha, produjo un aumento espectacular de la regeneración del tejido conectivo y la epitelización. (Id.) Tsuboi y col. han observado que la aplicación diaria de FGFb en una herida abierta estimula la curación de la herida en ratones con defectos en la curación pero no en ratones normales (J. Exp. Med. 172: 245-251 (1990)). Por otro lado, la aplicación en heridas de piel humana de preparaciones sin refinar de lisados de plaquetas porcinas o bovinas, que presumiblemente contenían factores de crecimiento, aumentó la tasa de cierre de las heridas, el número de células en el área de curación, el crecimiento de vasos sanguíneos, la tasa total de depósito de colágeno y la fuerza del tejido cicatricial (Carter y col., supra).

Se desconocen las razones por las cuales los resultados obtenidos son contradictorios, pero podría ser el resultado de la dificultad de la aplicación de factores de crecimiento a una herida de forma que puedan ejercer su conjunto normal de actividades biológicas. Por ejemplo, se cree ahora que algunos receptores de factores de crecimiento deben ser ocupados durante al menos 12 horas para producir un efecto biológico máximo (Presta y col., Cell Regul. 2: 719-726 (1991) y Rusnati y col., J. Cell Physiol. 154: 152-161 (1993)). Debido a estos resultados contradictorios, el papel desempeñado por los factores de crecimiento, aplicados exógenamente, en la estimulación de la curación de heridas no está claro. Además, no se conoce en la actualidad una manera por la que se puedan aplicar los factores de crecimiento a las heridas dando lugar a un contacto prolongado entre la herida y el(los) factor(es) de crecimiento.

B. TS

Los adhesivos y TS quirúrgicos que contienen proteínas plasmáticas se usan para sellar heridas internas y externas, como heridas en los huesos y la piel, para reducir la pérdida de sangre y mantener la hemostasis. Dichos TS contienen factores de coagulación y otras proteínas de la sangre. La FG, también llamada sellante de fibrina, es un gel similar a un coágulo natural preparado a partir de plasma. Los componentes exactos de cada FG están en función de la fracción de plasma concreta que se usa como material de partida. El fraccionamiento de los componentes del plasma se puede efectuar por procedimientos estándar de purificación de proteínas, como precipitación con etanol, polietilenglicol y sulfato de amonio, cromatografía de intercambio iónico y de exclusión molecular. Generalmente, la FG contiene una mezcla de proteínas que incluye trazas de albúmina, fibronectina y plasminógeno. En Canadá, Europa y posiblemente en otros lugares, la FG disponible en el mercado contiene generalmente también aprotinina como estabilizante.

Las FG se preparan, generalmente, a partir de: (1) un concentrado de fibrinógeno, que contiene fibronectina, factor XIII y factor de von Willebrand; (2) trombina humana o bovina en polvo; y (3) iones calcio. Las FG comerciales contienen, generalmente, componentes bovinos. El concentrado de fibrinógeno se puede preparar a partir de plasma por crioprecipitación seguida de fraccionamiento, para dar una composición que forma un sellante o coágulo cuando se mezcla con trombina y un activador de la trombina, como los iones calcio. Los concentrados de fibrinógeno y trombina se preparan en forma de liofilizados y se mezclan con una solución de cloruro cálcico inmediatamente antes de su uso. Tras mezclarlos, los componentes se aplican a un tejido, en el que coagulan en la superficie del tejido y forman un coágulo que incluye fibrina reticulada. El factor XIII, que está presente en el concentrado de fibrinógeno, cataliza la reticulación.

La Patente australiana 75097/87 describe un adhesivo de un solo componente, que contiene una solución acuosa de fibrinógeno, factor XIII, un inhibidor de la trombina, como antitrombina III, factores protrombínicos, iones calcio y, si es necesario, un inhibidor de la plasmina. Stroetmann, Patentes de Estados Unidos Número 4.427.650 y 4.427.651, describe la preparación de un derivado de plasma enriquecido, en forma de polvo o de preparación pulverizable, para potenciar el cierre y la curación de heridas que contiene fibrinógeno, trombina y/o protrombina, y un inhibidor de la fibrinolisis, y también puede contener otros ingredientes, como extracto plaquetario. Rose y col., Patentes de Estados Unidos Número 4.627.879 y 4.928.603, describen procedimientos para preparar suspensiones crioprecipitadas que contienen fibrinógeno y factor XIII y su uso para preparar FG. El documento JP 1-99565 describe un kit para la preparación de adhesivos de fibrina para la curación de heridas. Alterbaum (Patente de Estados Unidos Número 4.714.457) y Morse y col. (Patente de Estados Unidos Número 5.030.215) describen procedimientos para producir FG autóloga. Además, se han descrito en otras partes sistemas de liberación de FG mejorados (Miller y col., Patente de Estados Unidos Número 4.932.942 y Morse y col., Solicitud PCT WO 91/09641).

IMMUNO AG (Viena, Austria) y BEHRINGWERKE AG (Alemania) (Gibble y col., Transfusion 30:741-747 (1990)) comercializan actualmente FG en Europa y en otros lugares (véanse, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos Número 4.377.572 y 4.298.598, de IMMUNO AG). En Estados Unidos, no hay TS disponibles en el mercado. Sin embargo, la American National Red Cross y Baxter/Hyland (Los Angeles, CA) han desarrollado conjuntamente una FG (ARC/BH FG) que está actualmente en ensayos clínicos.

Los TS que se usan en clínica fuera de los Estados Unidos plantean ciertos riesgos clínicos y no han sido aprobados por la Food and Drug Administration para su uso en Estados Unidos. Por ejemplo, los TS disponibles en Europa contienen proteínas de origen no humano como aprotinina y trombina bovina. Como estas proteínas son de origen no humano, las personas pueden desarrollar reacciones alérgicas a ellas. En Europa se usa la inactivación por calor para inactivar virus que puedan estar presentes en los componentes de las FG. Sin embargo, este procedimiento de inactivación por calor puede dar lugar a la desnaturalización de proteínas de la FG que también pueden ser alergénicas. Además, constituye un motivo de preocupación que este procedimiento de inactivación no inactive los priones que causan la encefalopatía espongiforme bovina, "la enfermedad de las vacas locas", que pueden estar presentes en el TS debido al uso de proteínas bovinas en su composición. Ya que se cree que esta enfermedad ya ha pasado de las ovejas, en las que se llama "scrapie", a las vacas, no es una preocupación insignificante el hecho de que pueda infectar a humanos.

La ARC/BH FG tiene ventajas con respecto a los TS disponibles en Europa porque no contiene proteínas bovinas. Por ejemplo, el ARC/BH TS contiene trombina humana en lugar de trombina bovina y no contiene aprotinina. Ya que la ARC/BH FG no contiene proteínas bovinas debería ser menos alergénica en humanos que los TS disponibles en Europa. Además, los virus de la ARC/BH FG se inactivan con un procedimiento que usa detergentes y disolventes, que produce menos proteínas desnaturalizadas, y de este modo es menos alergénica que las que se encuentran disponibles en Europa. Por lo tanto, la ARC/BH FG posee ventajas con respecto a los TS disponibles en la actualidad en el mercado en otros países.

La FG se formula primariamente para su aplicación clínica tópica y se usa para controlar hemorragias, mantener la hemostasis y promover la curación de heridas. Los usos clínicos de la FG se han revisado recientemente (Gibble y col., Transfusion 30: 741-747 (1990); Lerner y col., J. Surg. Res. 48: 165-181 (1990)). Sellando los tejidos, la FG previene la salida de aire o fluido, induce la hemostasis y puede contribuir indirectamente a la curación de heridas reduciendo o previniendo acontecimientos que puedan interferir con la curación de las heridas como una hemorragia, hematomas, infecciones, etc. Aunque la FG mantiene la hemostasis y reduce la pérdida de sangre, aún no se ha demostrado que posea propiedades reales en la curación de heridas. Puesto que la FG es adecuada tanto para daños internos como externos, como daños en el hueso o la piel, y es útil en el mantenimiento de la hemostasis, es conveniente potenciar sus propiedades de curación de heridas.

La FG con una concentración de fibrinógeno de aproximadamente 39 g/l y una concentración de trombina de 200-600 U/ml ha dado lugar a coágulos con un aumento significativo de la absorción de estrés y energía así como de los valores de elasticidad (Byrne y col., Br. J. Surg. 78: 841-843 (1991)). La implantación subcutánea de cilindros de Teflon perforados y rellenados con un coágulo de fibrina (5 mg/ml) estimuló la formación de tejido de granulación, incluyendo un incremento de la precipitación de colágeno, en comparación con la implantación de cilindros vacíos (Hedelin y col., Eur. Surg. Res. 15: 312 (1983)).

C. Heridas óseas y su reparación

Urist y col. describieron por primera vez la secuencia de inducción ósea usando matriz ósea cortical desmineralizada (Clin. Orthop. Rel. Res. 71: 271 (1970) y Proc. Natl. Acad. Sci. USA 70:3511 (1973)). La matriz ósea cortical desmineralizada, implantada subcutáneamente en receptores alogénicos, libera factores que actúan como mitógenos locales para estimular la proliferación de células mesenquimales (Rath y col., Nature (Lond.) 278: 855 (1979)). La formación de hueso nuevo se produce entre 12 y 18 días tras la implantación. En el día 21 ya se había producido el desarrollo de osículos llenos de linaje de médula hematopoyética (Reddi, A., en Extracellular Matrix Biochemistry (Piez y col., ed.) Elsevier, New York, NY, págs. 375-412 (1984)).

La matriz ósea desmineralizada (DBM) es una fuente de proteínas osteoinductoras conocidas como proteínas morfogenéticas óseas (BMP) y de factores de crecimiento que modulan la proliferación de células óseas progenitoras (véase, por ejemplo, Hauschka y col., J. Biol. Chem. 261: 12665-12674 (1986) y Canalis y col., J. Clin. Invest. 81: 277-281 (1988)). En la actualidad se han identificado ocho BMP y se abrevian como BMP-1 hasta BMP-8. BMP-3 y BMP-7 también son conocidas como osteogenina y proteína osteogénica-1 (OP-1), respectivamente.

Desgraciadamente, los materiales de DBM tienen poco uso clínico a menos que se combinen con un autotrasplante de médula. Existe una cantidad límite de DBM que se puede aplicar quirúrgicamente en el hueso de un receptor para producir un efecto terapéutico. Además, se ha observado que la resorción es al menos del 49% (Toriumi y col., Arch. Otolaryngo. Head Neck Surg. 116: 676-680 (1990)).

La DBM en polvo y la osteogenina pueden ser arrastradas por los fluidos tisulares antes de expresar su potencial osteoinductor. Además, la filtración de los fluidos tisulares a las cavidades óseas llenas de DBM o el colapso del lecho de la herida por los tejidos blandos son dos factores que pueden afectar de forma significativa a las propiedades osteoinductoras de la DBM y la osteogenina. El colapso del lecho de la herida por los tejidos blandos puede inhibir asimismo la adecuada migración de células madre osteocompetentes al lecho de la herida.

Los dentistas americanos usan en la actualidad DBM humana en forma de polvo para rellenar cavidades óseas de la mandíbula creadas durante la cirugía oral. Sin embargo, la DBM en forma de polvo es difícil de usar.

Las BMP purificadas tienen efectos osteoinductores en animales cuando se administran con la ayuda de diversos medios que incluyen FG (Hattori, T., Niponn. Seikeigeka. Gakkai. Zasshi. 64: 824-834 (1990); Kawamura y col., Clin. Orthop. Rel. Res. 235: 302-310 (1988); Schlag y col., Clin. Orthop. Rel. Res. 227:269-285 (1988) y Schwarz y col., Clin. Orthop. Rel. Res. 238: 282-287 (1989)) y coágulos de sangre total (Wang y col., J. Cell. Biochem. 15F: Q20 Resumen (1990)). Sin embargo, Schwatz y col. (supra.) no demostraron un claro efecto, positivo o negativo, de la FG sobre la osteoinducción ectópica o la osteoregeneración dependiente de BMP. Kawamura y col. (supra.) encontraron un efecto sinérgico cuando se ensayó BMP parcialmente purificada en FG en una localización no ósea ectópica. Por lo tanto, estos resultados son contradictorios y confusos.

El TS también puede servir como "andamiaje" que las células pueden usar para moverse en un área dañada para generar nuevos tejidos. Sin embargo, las preparaciones de FG disponibles en el mercado y otros TS son demasiado densos para permitir la migración celular en su interior y a través de los mismos. Esto limita su eficacia para algunos usos in vivo.

En un tipo de herida ósea, llamada defectos óseos por falta de unión, existe un espacio mínimo por encima del cual no se produce formación de hueso nuevo de forma natural. Clínicamente, el tratamiento de estas situaciones es el injerto óseo. Sin embargo, la fuente de autoinjertos óseos está generalmente limitada y el uso de huesos alogénicos implica un elevado riesgo de contaminación viral. Debido a esta situación, el uso de polvos de hueso desmineralizado sometidos a un procedimiento para la inactivación de virus es una solución atractiva.

D. Prótesis vasculares

Las prótesis vasculares artificiales están hechas, con frecuencia, de politetrafluoroetileno (PTFE) y se usan para reemplazar vasos sanguíneos enfermos, en humanos u otros animales. Se han usado varias técnicas para maximizar las tasas de permeabilidad y minimizar la trombogenicidad de las prótesis vasculares incluida la siembra de células endoteliales no autólogas en la prótesis. Se han investigado varios sustratos que se adhieren tanto al injerto vascular como a las células endoteliales como sustrato intermedio para incrementar la adhesión de las células endoteliales. Estos sustratos incluyen sangre precoagulada (Herring y col., Surgery 84: 498-504 (1978)), FG (Rosenman y col., J. Vasc. Surg. 2: 778-784 (1985); Schrenk y col., Thorac. Cardiovasc. Surg. 35: 6-10 (1986); Köveker y col., Thorac. Cardiovasc. Surgeon 34: 49-51 (1986) y Zilla y col., Surgery 105:515-522 (1989)), fibronectina (véase, por ejemplo, Kesler y col., J. Vasc. Surg. 3: 58-64 (1986); Macarak y col., J. Cell Physiol. 116: 76-86 (1983) y Ramalanjeona y col., J. Vasc. Surg. 3: 264-272 (1986)), o colágeno (Williams y col., J. Surg. Res. 38: 618-629 (1985)). Sin embargo, un problema general existente con estas técnicas es que se siembran células no autólogas (véase, por ejemplo, Schrenk y col., supra) generando así la posibilidad de rechazo del tejido. Además, no se suele establecer nunca un endotelio confluente y en caso de llegar a confluir requiere meses. Como resultado de este retraso, existe una elevada tasa de oclusión de las prótesis vasculares (véase, por ejemplo, Zilla y col., supra).

E. Angiogénesis

La angiogénesis es la inducción de nuevos vasos sanguíneos. Algunos factores de crecimiento como HBGF-1 y HBGF-2 son angiogénicos. Sin embargo, su administración in vivo unida a: esponjas de colágeno (Thompson y col., Science 241: 1349-1352 (1988)); bolas (Hayek y col., Biochem. Biophys. Res Commun. 147: 876-880 (1987)); fibras sólidas de PTFE revestidas con colágeno y organizadas en una estructura tipo esponja (Thompson y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 7928-7932 (1989)); o su infusión (Puumala y col., Brain Res. 534: 283-286 (1990)) dio como resultado la generación aleatoria y desorganizada de vasos sanguíneos. Estos factores de crecimiento no se han usado con éxito para dirigir el crecimiento de nuevos vasos sanguíneos, en una localización determinada, in vivo. Además, los geles de fibrina (0,5-10 mg/ml) implantados subcutáneamente en cámaras de plexiglas inducen angiogénesis a los 4 días de su implantación, en comparación con la implantación de cámaras vacías o cámaras llenas de medio de cultivo estéril (Dvorak y col., Lab. Invest. 57: 673 (1987)).

F. Administración de un fármaco dirigida, localizada

Existe una gran necesidad, en diversas áreas de la medicina, de un sistema de administración de un fármaco eficaz y dirigido. Por ejemplo, la administración localizada de fármacos es necesaria en el tratamiento de infecciones locales, como en la periodontitis, en las que la administración sistémica de agentes antimicrobianos es ineficaz. El problema tras la administración sistémica está generalmente en la baja concentración que puede alcanzar el agente antimicrobiano en el sitio diana. Para aumentar la concentración local, un aumento de la dosis sistémica puede ser eficaz pero también puede producir toxicidad, resistencia microbiana e incompatibilidad medicamentosa. Para evitar algunos de estos problemas, se han ideado varios procedimientos alternativos pero ninguno es ideal. Por ejemplo, se ha demostrado que el colágeno y/o el fibrinógeno dispersado en un medio acuoso en forma de masa amorfa, capaz de fluir, y una composición de una matriz proteinácea capaces de posicionarse de forma estable también administran fármacos de forma local (Luck y col., Patente Renovada de Estados Unidos 33.375; Luck y col. Patente de Estados Unidos 4.978.332).

Se ha observado que diversos antibióticos (AB) son liberados a partir de FG, pero solamente en una concentración relativamente baja y durante periodos de tiempo relativamente cortos, que varían entre unas pocas horas y unos pocos días (Kram y col., J. Surg. Res. 50: 175-178 (1991)). La mayoría de los antibióticos se prepararon en formas fácilmente solubles en agua y se añadieron al TS mientras éste se preparaba. Sin embargo, la incorporación de TET HCl y otras formas de AB fácilmente solubles en agua en el FG ha interferido con la polimerización de la fibrina durante la formación de las FG suplementadas con AB (Schlag y col., Biomaterials 4: 29-32 (1983)). Esta interferencia limitó la cantidad y la concentración de TET HCl que se podía alcanzar en la mezcla de AB-FG y pareció depender de la concentración de AB. El tiempo de liberación relativamente corto del AB a partir de la FG puede reflejar la vida relativamente corta de los TS suplementados con AB o la forma y/o cantidad de AB en el AB-TS.

G. Liberación controlada de fármacos a partir de TS

Para algunas aplicaciones clínicas, es conveniente la liberación controlada y localizada de fármacos. Tal como se ha mencionada más arriba, algunos fármacos, especialmente AB, se han incorporado en el interior y se han liberado a partir de TS, como la FG. Sin embargo, existe poco o ningún control sobre la duración de la liberación del fármaco que aparentemente es, al menos parcialmente, un reflejo de la vida relativamente corta de la FG suplementada con un fármaco. Por lo tanto, es necesaria y conveniente una forma de estabilizar la FG y otros TS, para permitir la liberación de fármacos localizada y prolongada, así como lo son nuevas técnicas para la incorporación y la liberación prolongada de otros suplementos a partir de TS.

Resumen de la invención

En un primer aspecto, la invención proporciona una composición de sellante de tejido suplementado que promueve la liberación localizada de al menos un fármaco, que comprende: (i) un sellante de tejido que comprende cola de fibrina, y (ii) al menos un fármaco en forma de sólido, en el que dicho fármaco es un analgésico, un fármaco antiproliferativo/citotóxico, un agente antiinflamatorio, un anticoagulante, un compuesto osteoinductor, un oligonucleótido, un antibiótico, un antiviral, un antifúngico, un agente antiparasitario, un anestésico, un fármaco cardiovascular, un reactivo de terapia génica, vitaminas u otros suplementos nutricionales; en el que dicha composición de sellante de tejido no contiene un factor de crecimiento.

En una forma de realización, el sellante no inhibe la curación de heridas de la piel en todo su espesor.

En otra forma de realización, la concentración total de proteína del sellante es menor de 30 mg/ml.

En otra forma de realización, la concentración total de proteína es menor de 30 mg/ml.

En otra forma de realización, la concentración total de proteína es mayor de 30 mg/ml.

En varios aspectos más, la invención proporciona: un biomaterial tratado con una composición de sellante de tejido suplementado del primer aspecto de la invención; un procedimiento ex vivo para la preparación de un biomaterial tratado, comprendiendo el procedimiento la aplicación de una composición de sellante de tejido suplementado del primer aspecto de la invención a un biomaterial; y el uso de una composición de sellante de tejido suplementado de acuerdo con el primer aspecto de la invención para la preparación de un agente para el tratamiento y/o prevención de infecciones, el tratamiento de neoplasias, la aceleración de la curación de heridas, o el tratamiento y/o la prevención de enfermedades cardiovasculares.

En otro aspecto más, la invención proporciona el uso de una composición de sellante de tejido suplementado del primer aspecto de la invención, en el que el fármaco es un compuesto osteoinductor, para la fabricación de una matriz que proporcione una estructura de andamiaje temporal en un defecto óseo para determinar la forma y la localización de la formación de hueso nuevo, permitiendo de este modo la osteogénesis en la localización del defecto.

La presente invención trata también de un procedimiento para la administración localizada de al menos un fármaco en un tejido, que comprende la aplicación de un TS, que contiene al menos un fármaco, al tejido.

En las formas de realización de esta invención, el TS puede ser FG.

En las distintas formas de realización de la invención, la FG se puede preparar mezclando complejo de fibrinógeno tópico (TFC), trombina humana y cloruro cálcico. La variación de la concentración de TFC tiene el efecto más significativo sobre la densidad de la matriz de FG final. La variación de la concentración de trombina tiene un efecto insignificante sobre la concentración total de proteína de la FG final, pero tiene un efecto marcado sobre el tiempo requerido para la polimerización del componente fibrinógeno del TFC para formar fibrina. Mientras que este efecto es bien conocido, generalmente no se valora que se pueda usar para maximizar la eficacia de la FG cuando se usa sola o suplementada. Debido a este efecto, se puede modificar el tiempo entre la mezcla de los componentes de la FG y la fijación de la FG. De este modo, se puede dejar que la FG fluya más libremente en el interior de las grietas profundas en una herida, permitiendo que rellene la herida completamente antes de la FG se fije. De forma alternativa, se puede permitir que la FG se fije suficientemente rápido como para evitar que salga del sitio de la herida, especialmente si la herida libera fluido a presión (es decir, sangre, linfa, fluido intercelular, etc). Esta propiedad también es importante para impedir que la FG coagule los dispositivos de administración que tienen conductos largos, es decir, catéteres, endoscopios, etc., lo cual es importante para permitir la aplicación de FG o FG suplementada en localizaciones del organismo que solamente son accesibles por cirugía. Este efecto también es importante para mantener los suplementos insolubles en suspensión y evitar que se asienten en el aplicador o en el tejido.

Tal como se usa en este documento, el TFC es una mezcla liofilizada de proteínas de plasma humano que se han purificado y sometido a un procedimiento para la inactivación de virus. Cuando se reconstituye, el TFC contiene:

Proteínas totales: 100-130 mg/ml

Fibrinógeno (como proteína coagulable): 80% de la proteína total (mínimo)

Albúmina (humana): 5-25 mg/ml

Plasminógeno: 5 mg/ml

Factor XIII: 10-40 Unidades/ml

Polisorbato-80: 0,3% (máximo)

pH: 7,1-7,5

El TFC reconstituido también puede contener trazas de fibronectina.

Tal como se usa en esta invención, la trombina humana es una mezcla liofilizada de proteínas de plasma humano, que se han purificado y sometido a un procedimiento para la inactivación de virus. Cuando se reconstituye, contiene:

Potencia de la trombina: 300 \pm 50 Unidades Internacionales/ml

Albúmina (humana): 5 mg/ml

Glicina: 0,3 M \pm 0,05 M

pH: 6,5-7,1

Se añade cloruro cálcico en una cantidad suficiente para activar la trombina. Mientras haya calcio suficiente, su concentración no es importante.

Un uso cosmético para las composiciones de esta invención lo constituye el tratamiento de arrugas y cicatrices en lugar de usar silicona u otros compuestos para hacerlo. En estas formas de realización, por ejemplo, el TS puede contener células adiposas. Los TS de esta invención se pueden usar para ayudar a la integración de un injerto, artificial o natural, en el cuerpo de un animal como, por ejemplo, cuando el injerto está compuesto por tejido natural. Los TS de esta invención se pueden usar para combatir algunos de los problemas principales asociados a ciertas dolencias como la periodontitis, concretamente las infecciones persistentes, la resorción ósea, la pérdida de ligamentos o la reepitelización prematura del alveolo dental.

En otra forma de realización, esta invención proporciona una mezcla de FG, DBM y/o BMP purificadas. Esta mezcla proporciona una matriz que permite que los componentes celulares del cuerpo migren en su interior y se produzca así osteoinducción allí donde es necesaria. La composición de la matriz en cuanto a proteínas (como fibrinógeno y Factor XIII), enzimas (como trombina y plasmina), BMP y DBM y sus concentraciones están adecuadamente formuladas para optimizar la longevidad de esta estructura de andamiaje temporal y la osteoinducción que ha de producirse. Todos los componentes de la FG son biodegradables pero durante la osteogénesis la mezcla proporciona un andamiaje que no se colapsa y que puede determinar la forma y la localización de la formación de hueso nuevo. De este modo se evitará que los tejidos blandos colapsen los defectos óseos por falta de unión, lo que constituye un problema en la cirugía de reconstrucción ósea.

Se puede(n) añadir al TS un fármaco(s) usado(s) en las composiciones de la invención que incluye(n), pero no se encuentra(n) limitado(s) a, DBM y BMP para acelerar la curación de heridas y combatir infecciones, neoplasias y/u otras enfermedades. Estos fármacos pueden incluir, pero no se encuentran limitados a: antibióticos como tetraciclina y ciprofloxacino; fármacos antiproliferativos/citotóxicos, como 5-fluorouracilo (5-FU), taxol y/o taxotere; antivirales como ganciclovir, zidovudina, amantadina, vidarabina, ribavirina, trifluridina, aciclovir, didesoxiuridina y anticuerpos frente a componentes virales o productos génicos; citocinas, como interferón-\alpha o -\beta o -\gamma, factor de necrosis tumoral-\alpha o -\beta e interleucinas; factores estimulantes de colonias; eritropoyetina; antifúngicos, como diflucan, ketoconazol y nistatina; agentes antiparasitarios, como pentamidina; agentes antiinflamatorios, como \alpha-1-anti-tripsina y \alpha-1-antiquimotripsina; esteroides; anestésicos; analgésicos y hormonas. Otros compuestos que se pueden añadir a los TS incluyen, pero no se encuentran limitados a: vitaminas y otros suplementos nutricionales; hormonas; glicoproteínas; fibronectina; péptidos y proteínas; hidratos de carbono (simples y/o complejos); proteoglicanos; antiangiogeninas; antígenos; oligonucleótidos (ADN y/o ARN, sentido y/o antisentido); BMP, DBM; anticuerpos (por ejemplo, frente a agentes infecciosos, tumores, fármacos u hormonas); y reactivos para terapia génica. También se pueden incluir en el TS de esta invención células alteradas genéticamente y/u otras células. Los compuestos osteoinductores que se pueden usar en la práctica de esta invención incluyen, pero no están limitados a: osteogenina (BMP-3); BMP-2A, -2B y -7. Además, se puede añadir al TS de esta invención cualquier cosa que no destruya el TS.

En las composiciones de la invención, se incluye al menos un fármaco en forma de sólido, siendo este fármaco un analgésico, un fármaco antiproliferativo/citotóxico, un agente antiinflamatorio, un anticoagulante, un compuesto osteoinductor, un oligonucleótido, un antibiótico, un antiviral, un antifúngico, un agente antiparasitario, un anestésico, un fármaco cardiovascular, un reactivo de terapia génica, vitaminas u otros suplementos nutricionales. Las composiciones de la invención no contienen un factor de crecimiento.

Los estudios acerca de los que se informa en esta invención demostraron, de forma inesperada, que la inclusión de compuestos como la TET en forma de base libre o ciprofloxacino HCl, en la FG o el tratamiento de la FG confiere una longevidad prolongada a la FG suplementada. Este fenómeno se puede explotar para aumentar la duración de la liberación de un fármaco a partir del TS. De forma alternativa, este fenómeno se puede explotar para modular la liberación de otro(s) fármaco(s) diferente(s) del compuesto usado para estabilizar la FG, que se incorpora(n) también en la TET-FG, y/o para hacer que la FG persista durante un periodo más largo in vivo o in vitro.

En general, las formas de un fármaco poco solubles en agua, como TET en forma de base libre, aumentan más la liberación del fármaco a partir del TS que las formas fácilmente solubles en agua del mismo. Por lo tanto, el fármaco puede estar unido a un vehículo insoluble, como fibrinógeno o carbón activado, en el interior del TS para prologar la administración del fármaco a partir del TS suplementado.

En otra forma de realización, el TS suplementado se puede usar en organoides.

En otra forma de realización, esta invención proporciona una composición que promueve la administración localizada de una forma poco soluble en agua de un antibiótico(s), como TET en forma de base libre, y otro(s) fármaco(s), que comprende un TS y una concentración eficaz de al menos una forma poco soluble en agua de un antibiótico.

La presente invención tiene varias ventajas sobre las composiciones de TS y los procedimientos usados anteriormente. La primera ventaja es que los TS suplementados con fármacos de la presente invención tienen muchas de las características de un vehículo biodegradable ideal, concretamente: se pueden formular para que contengan solamente proteínas humanas, eliminando o minimizando así los problemas de inmunogenicidad y las reacciones de cuerpo extraño; su administración es versátil; y no se requiere su eliminación de los tejidos del huésped porque son degradados por el sistema fibrinolítico natural del propio huésped.

Una segunda ventaja es que la presente invención proporciona una buena vía para administrar fármacos de forma eficaz durante un periodo de tiempo prolongado a una herida interna o externa. Se cree ahora que algunos receptores de factores de crecimiento deben ser ocupados durante al menos 12 horas para producir un efecto biológico máximo.

Una tercera ventaja de la presente invención es que células animales pueden migrar en el interior y a través del TS de la presente invención y crecer en él. Esto ayuda al injerto de dichas células en tejidos y prótesis vecinos. Basándose en la composición de los TS disponibles en Europa, se espera que esto no sea posible con estas formulaciones. En lugar de ello, las células animales deben migrar alrededor o digerir el TS disponible en el mercado. Ya que la importación a los Estados Unidos de TS disponibles en el mercado en Europa es ilegal (su uso no ha sido aprobado en Estados Unidos por la U.S. FDA) los solicitantes no pueden comprobar este hecho con facilidad.

Una cuarta ventaja es que debido a su naturaleza líquida inicial, el TS de la presente invención puede cubrir superficies mejor y de forma completa que otros muchos sistemas de administración disponibles anteriormente. Esto es especialmente importante para el uso de la presente invención en el revestimiento de biomateriales y en la endotelización de prótesis vasculares porque la FG suplementada recubrirá el interior, el exterior y los poros de la prótesis vascular. Como resultado de esto, más la capacidad de las células endoteliales para migrar en el interior y a través del TS, el revestimiento por células endoteliales autólogas se producirá a lo largo de toda la longitud de la prótesis vascular, disminuyendo así su trombogenicidad y su antigenicidad. Con los TS usados anteriormente, el revestimiento comenzaba en los extremos de la prótesis vascular y avanzaba, si lo hacía, hacia el interior de la misma, dando así más tiempo para que se desarrollase trombogenicidad y antigenicidad. Los TS usados anteriormente para prótesis vasculares también se sembraban primero con células no autólogas que podían ser rechazadas por el cuerpo y que podían ser fácilmente retiradas por la fuerza del flujo sanguíneo que pasa a través de la prótesis.

Una quinta ventaja es que el TS suplementado de esta invención se puede moldear y, de este modo, se puede hacer por encargo con casi cualquier forma conveniente. Por ejemplo, el TS como la FG se puede suplementar con BMP y/o DBM y se puede hacer por encargo con la forma necesaria para tratar de la manera más adecuada una herida ósea. Esto no se puede hacer con los polvos de DBM solos porque los polvos de DBM no mantendrán su forma.

Una sexta ventaja es que la FG suplementada con AB de esta invención, como TET-FG, ha aumentado de forma inesperada la longevidad y la estabilidad de la FG en comparación con las de la FG no suplementada. Este aumento de la estabilidad permanece incluso cuando ya han salido cantidades considerables de AB de la FG. Por ejemplo, el hecho de empapar un coágulo de FG recién formado en una solución saturada de TET, generada a partir TET en forma de base libre, o en una solución de CIP HCl, da lugar a un coágulo de FG que es estable y se preserva incluso después de que sustancialmente toda la TET o el CIP hayan salido del coágulo de FG. Sin querer estar ligado a ninguna teoría en cuanto a cómo se produce este efecto, se cree que el AB, como TET o CIP, inhibe el plasminógeno que está en el TFC y que rompe la FG. Una vez que se inhibe el plasminógeno, su inhibición continuada no parece depender de la persistencia de considerables cantidades de TET o CIP en la FG. Como resultado de este efecto estabilizante, uno podría esperar un aumento del tiempo de durabilidad de almacenamiento del TS y, posiblemente, un aumento de su persistencia in vivo.

La séptima ventaja de la presente invención es un resultado directo de la longevidad y la estabilidad prolongadas del TS. Como resultado de este inesperado aumento de la estabilidad del TS, la FG suplementada con AB se puede usar para dar lugar a la administración localizada y a largo plazo de un fármaco(s). Esta administración continuará incluso después de que el fármaco estabilizante, como TET o CIP, haya salido sustancialmente del TS. La inclusión de una forma sólida, preferentemente una forma poco soluble en agua, de un fármaco como base libre, en un TS que se ha estabilizado con, por ejemplo, TET o CIP, permite entonces al TS estabilizado administrar el fármaco localmente durante un periodo de tiempo prolongado. Algunas formas de los fármacos, como TET en forma de base libre, permite tanto la estabilización del TS como la administración prolongada de fármacos. Otros fármacos pueden hacer una cosa o la otra, pero no las dos. Hasta donde alcanza el conocimiento de los Solicitantes, nadie más ha usado un compuesto para estabilizar un TS con objeto de producir la administración localizada y prolongada de un fármaco.

Una octava ventaja de la invención de los Solicitantes es que permite que se produzca una angiogénesis dirigida in vivo. Mientras que otros han demostrado una angiogénesis localizada no específica, supra, hasta donde alcanza el conocimiento de los Solicitantes, nadie más ha demostrado una angiogénesis dirigida.

Breve descripción de las figuras

La Fig. 1 muestra técnicas de hibridación tipo Western de geles en los que las muestras que contenían HBGF-1\beta se incubaron con 250 U/ml de trombina en presencia de concentraciones crecientes de heparina. Las soluciones que contenían HBGF-1\beta (10 \mug/ml), trombina (250 \mug/ml) y concentraciones crecientes de heparina (0, 0,5, 5, 10, 20 y 50 unidades/ml) se incubaron a 37ºC durante 72 horas. Se recogieron periódicamente alícuotas de cada mezcla incubada y se cargaron en geles de poliacrilamida-SDS al 8% que se prepararon y corrieron tal como describió Laemmli (Nature 227: 680 (1970)). El gel se transfirió a continuación sobre una membrana de nitrocelulosa y se identificó la banda que correspondía a HBGF-1\beta usando un antisuero policlonal de conejo purificado por afinidad frente a HBGF-1\beta.

Las concentraciones de heparina en las mezclas incubadas fueron: panel A) 0 unidades/ml; panel B) 0,5 U/ml; panel C) 5 U/ml; panel D) 10 U/ml; panel E) 20 U/ml; y panel F) 50 U/ml. En los geles representados en cada uno de los paneles A-F, cada carril contiene lo siguiente: el carril 1 contiene patrones de bajo peso molecular para SDS-PAGE; el carril 2 contiene patrones biotinilados; el carril 3 contiene 10 \mug/ml de HBGF-1\beta; el carril 4 contiene 250 U/ml de trombina; y los carriles 5-13 contienen muestras recogidas de cada mezcla incubada a tiempo 0, 1, 2, 4, 6, 8, 24, 48 y 72 horas.

La Fig. 2 muestra la incorporación de timidina-^{3}H en función de la concentración relativa de HBGF-1\beta. Se incubaron muestras de HBGF-1\beta, tal como se describe en la Figura 1 y el Ejemplo 2, en presencia de 250 U/ml de trombina y 5 U/ml de heparina durante 0, 24 ó 72 horas. Se añadieron diluciones de estas muestras a células NIH 3T3, que se plaquearon tal como se describe en el Ejemplo 3. Se representa CPM frente a la concentración de HBGF-1.

Fig. 3. Patrón típico de células endoteliales de vena umbilical humana tras crecer durante 7 días sobre FG suplementada con 100 ng/ml de FGF-1 salvaje activo. Nótese el gran número de células y su forma alargada. Comparar con la escasez de células que han crecido sobre FG no suplementada (Figura 5).

Fig. 4. Patrón típico de células endoteliales de vena umbilical humana tras crecer durante 7 días sobre FG suplementada con 10 ng/ml de FGF-1 salvaje activo. Nótese el gran número de células y su forma alargada. Comparar con la escasez de células que han crecido sobre FG no suplementada (Figura 5).

Fig. 5. Patrón típico de células endoteliales de vena umbilical humana tras crecer durante 7 días sobre FG no suplementada. Nótese el escaso número de células comparado con el número de células en las Figuras 3 y 4, lo que indica una tasa de proliferación más lenta.

Fig. 6. Patrón típico de células endoteliales de vena umbilical humana tras crecer durante 7 días sobre FG suplementada con 100 ng/ml de FGF-1 mutante inactivo. Nótese el escaso número de células comparado con el número de células en las Figuras 3 y 4, que indica una tasa de proliferación más lenta.

Fig. 7. Patrón típico de células endoteliales umbilicales humanas 24 horas tras haber sido embebidas en FG, a una concentración de 10^{5} células por ml de FG. Las concentraciones de proteína y trombina de la FG fueron 4 mg/ml y 0,6 unidades NIH/ml, respectivamente. Nótese su morfología alargada, múltiples lamelipodios y que formaron una red celular en la que se pusieron en contacto unas con otras. Comparar con la morfología en empedrado de células similares crecidas sobre fibronectina (Fig. 9).

Fig. 8. Patrón típico de células endoteliales umbilicales humanas 48 horas tras haber sido embebidas en FG, a una concentración de 10^{5} células por ml de FG. Las condiciones de cultivo fueron como las que se han descrito en la Fig. 7. Nótese la morfología alargada y los múltiples lamelipodios más acentuados y un mayor desarrollo de redes celulares. Comparar con las células de morfología en empedrado crecidas sobre fibronectina (Fig. 10) y nótese la ausencia de una red celular en esta última.

Fig. 9. Patrón típico de células endoteliales umbilicales humanas 24 horas tras ser cultivadas sobre una superficie recubierta con fibronectina. Nótese la forma de empedrado de las células y la ausencia de redes celulares. Compárese con la Figura 7.

Fig. 10. Patrón típico de células endoteliales umbilicales humanas 48 horas tras ser cultivadas sobre una película de fibronectina que se usa con frecuencia. Nótese la morfología en empedrado de las células y la ausencia de redes celulares. Comparar con la Figura 8.

Fig. 11. Micrografías de secciones transversales de injertos vasculares de PTFE que se explantaron de perros tras 7 días (paneles A, C, E) o 28 días (paneles B, D, F). Antes de la implantación, los injertos no se trataron (A y B), se recubrieron con FG sola (paneles C y D) o bien se recubrieron con FG suplementada con heparina y HBGF-1 (E y F).

Los controles no tratados (A y B) mostraron un crecimiento mínimo de tejido mesenquimal, con ambos intersticios rellenos con el mismo, y sus superficies luminales revestidas con un coágulo de fibrina. Los injertos tratados con FG mostraron un crecimiento de tejido mesenquimal solamente en la mitad externa de los intersticios de los injertos, estando relleno el resto con un coágulo de fibrina. Había muy pocos capilares intersticiales. Por el contrario, los injertos tratados con FG que contenía FGF-1 mostraron un crecimiento intersticial más abundante y, al cabo de 28 días, mostraron numerosos capilares, miofibroblastos y macrófagos, con cápsulas internas que consistían en varias capas de miofibroblastos debajo de capas de células endoteliales confluentes. Los resultados de injertos similares tras 128 días de implantación fueron parecidos, con un número mayor de capilares en el grupo FG + FGF-1 (datos no mostrados).

Fig. 12. Micrografías por microscopía electrónica de barrido del revestimiento interno de los injertos vasculares descritos en la Figura 11, 28 días tras la implantación. Los injertos no se trataron (G), se recubrieron con FG sola (H) o bien se recubrieron con FG suplementada con heparina y HBGF-1 (I). Los injertos control no tratados (G) mostraron escasas áreas recubiertas con células endoteliales entre áreas trombosadas que contenían glóbulos rojos sanguíneos, plaquetas y áreas expuestas de material PTFE del injerto (visibles en el centro y en la parte superior de la imagen). Los injertos recubiertos con FG sola (H) mostraron islas de células endoteliales entre áreas de coágulo de fibrina. Por el contrario, los injertos tratados con FG + FGF-1 mostraron células endoteliales confluentes orientadas a lo largo, en la dirección del flujo sanguíneo.

Fig. 13. Preparación de implantes en forma de disco de 1 mm de espesor y 8 mm de diámetro usando un molde de aluminio.

Fig. 14. Esquema que ilustra un bioensayo intramuscular para la inducción de la formación de hueso en ratas por DBM sola, por implantes de FG o por DBM-FG.

Fig. 15. Esquema que ilustra la inducción de la formación de hueso en implantes de bóveda craneal por DBM-FG.

Fig. 16. Datos de radio-opacidad en el día 28 del postoperatorio, tras la colocación de implantes intramusculares de DBM-FG, DBM o FG.

Fig. 17. Datos de la radioopacidad en implantes de bóveda craneal de DBM-FG (30 mg/ml) en el día 28 y en los meses 3 y 4 del postoperatorio.

Fig. 18. La Figura 18A es la fotografía de la localización de una craneotomía, a los 28 días de la cirugía, en un animal tratado.

La Figura 18B es una fotografía de la herida en la bóveda craneal de un control no tratado en el día 28 del postoperatorio. Nótese que solamente se ha desarrollado tejido conectivo fibroso a través de la herida de craneotomía.

Fig. 19. Fotografía de las heridas de craneotomía de animales que se trataron solamente con partículas de DBM.

Fig. 20. Fotografía de hueso nuevo formado en el sitio de la craneotomía en respuesta a DBM-FG (15 mg/ml).

Fig. 21. Fotografía de hueso nuevo formado en el sitio de la craneotomía en respuesta a DBM-FG (15 mg/ml). Nótese que, en general, se formó más médula ósea en las heridas de craneotomía en las que se habían implantado discos de DBM-FG que en las que se habían implantado DBM sola.

Fig. 22. Liberación de TET a partir de discos de 3 x 6 mm de diámetro de FG a 37ºC. La concentración de TET liberada se determinó por espectrofotometría en 2 ml de PBS sobrenadante que se habían cambiado a diario. Dos de estos experimentos "estáticos" in vitro se llevaron a cabo con resultados idénticos. Los resultados de uno de ellos se muestran en la presente memoria descriptiva.

Fig. 23. Liberación de TET a partir de discos de 3 x 6 mm de diámetro de FG a 37ºC. Los discos contenían 100 mg/ml de TET y se situaron en recipientes cerrados, con 2 ml de PBS. La concentración de TET se midió por espectrofotometría en el efluente de PBS que se había cambiado continuamente, a una tasa de 3 ml/día. El volumen de PBS sobrenadante se mantuvo constante en aproximadamente 2 ml. Los datos son la media de dos experimentos.

Fig. 24. Liberación de TET a la saliva a partir de discos de 3 x 6 mm de diámetro que contenían 50 ó 100 mg de TET/ml de FG a 37ºC. La concentración de TET se midió por espectrofotometría en 0,75 ml de sobrenadante de saliva que se había repuesto diariamente. La saliva usada en estos experimentos era una mezcla procedente de diez donantes; esta mezcla se centrifugó, se filtró y se mantuvo a 4ºC.

Fig. 25. Aumento de la estabilidad de FG suplementada con TET en comparación con la de FG control. Fotografías de matrices de FG de 3 x 6 mm de diámetro sin TET y con 50 y 100 mg/ml de TET, a lo largo de un periodo de 15 días. Los discos se mantuvieron en 0,75 ml de saliva, que se cambió a diario. La saliva era una mezcla procedente de 10 donantes. A continuación, dicha mezcla se centrifugó, se filtró y se almacenó a 4ºC antes de usarla en estos experimentos. Nótese que a los nueve días, la matriz de FG que no contenía TET estaba más deteriorada que las matrices que contenían 50 o 100 mg/ml de TET. Nótese también que a los 15 días, la matriz de FG que no contenía TET estaba casi totalmente deteriorada, mientras que las matrices de FG que contenían 50 ó 100 mg/ml de TET permanecieron prácticamente sin cambios. Por lo tanto, la inclusión de 50 ó 100 mg/ml de TET prolongó de forma espectacular la longevidad de las matrices de FG inmersas en saliva in vitro.

Fig. 26. Actividad antibacteriana de la liberación de TET a partir de FG suplementada con TET. Se repusieron a diario 2 ml del PBS que rodeaba a los discos de 3 x 6 mm de diámetro de FG suplementada con TET. Para ensayar la actividad antimicrobiana de la TET liberada, se incubaron discos de papel de 6 mm, impregnados en los eluatos recogidos, durante 18 horas a 37ºC, en placas de agar que contenían E. coli. A continuación se midió el diámetro de la zona de inhibición.

Fig. 27. Liberación de ciprofloxacino, amoxicilina y metronidazol a partir de matrices de FG. Se sumergieron discos individuales de 3 x 6 mm de diámetro, que contenían 100 mg/ml de los antibióticos respectivos, en 2 ml de tampón fosfato salino a 37ºC. El sobrenadante se repuso a diario y la concentración de antibiótico se midió por espectrofotometría a 275, 274 y 320 nm, respectivamente.

Fig. 28. La liberación de TET a partir de discos de FG suplementada con TET fue proporcional a la temperatura del PBS en el que bañaban los discos de FG-TET.

Fig. 29. Efecto de la concentración proteica de la FG sobre la liberación de TET a partir de FG-TET. Nótese que concentraciones proteicas de la FG mayores dieron como resultado una tasa de liberación más lenta de TET a partir de la FG-TET.

Fig. 30. La liberación de 5-FU a partir de FG suplementada con 5-FU se prolongó mediante el uso de formas sólidas de 5-FU.

Fig. 31. Relación dosis-respuesta de la respuesta quimiotáctica de fibroblastos NIH 3T3 a fibronectina. Se aplicó un gradiente progresivo de concentraciones crecientes de fibronectina a los pocillos inferiores de cámaras de Boyden modificadas. Los datos se expresan como la media \pm D.T. de células que han migrado por campo de gran aumento y demuestran que, en función de la dosis, la fibronectina indujo la quimiotaxis de las células NIH 3T3 hacia ella.

Fig. 32. Relación dosis-respuesta de la respuesta quimiotáctica de fibroblastos NIH 3T3 a FGF-1. Se aplicó un gradiente progresivo de concentraciones crecientes de FGF-1 a los pocillos inferiores de cámaras de Boyden modificadas en presencia de heparina. Los datos se expresan como la media \pm D.T. de células que han migrado por campo de gran aumento y demuestran que, en función de la dosis, el FGF-1 indujo la quimiotaxis de fibroblastos hacia él.

Fig. 33. Relación dosis-respuesta de la respuesta quimiotáctica de fibroblastos NIH 3T3 a FGF-2. Se aplicó un gradiente progresivo de concentraciones crecientes de FGF-2 a los pocillos inferiores de cámaras de Boyden modificadas. Los datos se expresan como la media \pm D.T. de células que han migrado por campo de gran aumento y demuestran que, en función de la dosis, el FGF-2 indujo la quimiotaxis de fibroblastos hacia él.

Fig. 34. Relación dosis-respuesta de la respuesta quimiotáctica de fibroblastos NIH 3T3 a FGF-4. Se aplicó un gradiente progresivo de concentraciones crecientes de FGF-4 a los pocillos inferiores de cámaras de Boyden modificadas en presencia de heparina. Los datos se expresan como la media \pm D.T. de células que han migrado por campo de gran aumento y demuestran que, en función de la dosis, el FGF-4 indujo la quimiotaxis de fibroblastos hacia él.

Fig. 35. Relación dosis-respuesta de la respuesta quimiotáctica de fibroblastos dérmicos humanos (HDF) a FGF-1. Se aplicó un gradiente progresivo de concentraciones crecientes de FGF-1 a los pocillos inferiores de cámaras Boyden modificadas, en presencia de heparina. Los datos se expresan como la media \pm D.T. de células que han migrado por campo de gran aumento y demuestran que, en función de la dosis, el FGF-1 indujo la quimiotaxis de los HDF hacia él.

Fig. 36. Relación dosis-respuesta de la respuesta quimiotáctica de HDF a FGF-2. Se aplicó un gradiente progresivo de concentraciones crecientes de FGF-2 a los pocillos inferiores de cámaras Boyden modificadas. Los datos se expresan como la media \pm D.T. de células que han migrado por campo de gran aumento y demuestran que, en función de la dosis, el FGF-2 indujo la quimiotaxis de HDF hacia él.

Fig. 37. Relación dosis-respuesta de la respuesta quimiotáctica de HDF a FGF-4. Se aplicó un gradiente progresivo de concentraciones crecientes de FGF-4 en los pocillos inferiores de cámaras Boyden modificadas. Los datos se expresan como la media \pm D.T. de células que han migrado por campo de gran aumento y demuestran que, en función de la dosis, el FGF-4 indujo la quimiotaxis de HDF hacia él.

Fig. 38. Relación dosis-respuesta de la respuesta quimiotáctica de HDF a FGF-4 en solución y en FG. El FGF-4 se incorporó a la FG y se situó en el pocillo inferior de cámaras de quimiotaxis. La cantidad de FGF en la FG fue suficiente como para encontrarse en las concentraciones indicadas cuando se distribuye uniformemente por toda la FG y el medio en la cámara inferior. Los controles negativos incluyeron medio solo y FG sin FGF. Como control positivo se usó medio que contenía FGF-4 a una concentración de 10 ng/ml en la cámara inferior. Los datos se expresan como la media \pm D.T. de células que han migrado por campo de gran aumento y demuestran que, en función de la dosis, el FGF-4 liberado a partir de la FG indujo la quimiotaxis de HDF hacia la FG.

Fig. 39. Esquema de un vendaje de heridas con TS incorporados.

Descripción de las formas de realización preferidas Definiciones

A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos usados en este documento tienen el mismo significado que entiende comúnmente un experto en la materia a la que pertenece esta invención. Todas las patentes y documentos mencionados en esta solicitud se incorporan como referencia.

Tal como se usa en este documento, una herida incluye el daño de cualquier tejido en un organismo vivo. El tejido puede ser un tejido interno, como el revestimiento del estómago o un hueso, o un tejido externo, como la piel. De este modo una herida puede incluir, pero no se encuentra limitada a, una úlcera del tracto gastrointestinal, un hueso roto, una neoplasia o un corte o raspado en la piel. Una herida puede localizarse en tejidos blandos, como el bazo, o en tejidos duros, como el hueso. La herida puede haber sido causada por cualquier agente, incluido un traumatismo, una infección o una intervención quirúrgica.

Tal como se usa en este documento, un TS es una sustancia o composición que, tras su aplicación sobre una herida, sella la herida, disminuyendo así la pérdida de sangre y manteniendo la hemostasis. Tal como se usa en este documento, la FG es una composición, preparada a partir de proteínas recombinantes o plasmáticas que, tras su aplicación sobre una herida, forma un coágulo sellando así la herida, disminuyendo la pérdida de sangre y manteniendo la hemostasis. FG, supra, es una forma de TS.

Tal como se usa en este documento, un TS suplementado incluye cualquier TS que, sin una modificación sustancial, puede servir como vehículo para la administración de un factor de crecimiento, un fármaco u otro compuesto, o mezclas de los mismos, y que, en virtud de sus propiedades adhesivas o adsortivas, puede mantener un contacto con la zona durante un tiempo suficiente como para que el TS suplementado produzca su efecto deseado, por ejemplo, que promueva la curación de heridas.

Tal como se usa en este documento, un TS suplementado con un factor de crecimiento es un TS al que se ha añadido al menos un factor de crecimiento, a una concentración a la que es eficaz para su propósito establecido. El factor de crecimiento puede, por ejemplo, acelerar, promover o mejorar la curación de heridas o la (re)generación de tejidos. Los TS suplementados con factores de crecimiento también pueden contener componentes adicionales, incluidos fármacos, anticuerpos, anticoagulantes u otros compuestos que: 1) potencien, estimulen o medien en la actividad biológica del(de los) factor(es) de crecimiento del TS; 2) disminuyan las actividades de componentes del TS suplementado con factores de crecimiento que pudieran inhibir o destruir las actividades biológicas del(de los) factor(es) de crecimiento del sellante; o 3) permitan la administración prolongada de los suplementos a partir del TS, 4) tengan otras propiedades convenientes.

Tal como se usa en este documento, un compuesto potenciador es un compuesto que media en o aumentan de otra manera la actividad biológica de un factor de crecimiento en el TS. La heparina es el ejemplo de un compuesto que potencia la actividad biológica del HBGF-1.

Tal como se usa en este documento, un compuesto inhibidor es un compuesto que inhibe, interfiere con, o destruye de otra manera una actividad perjudicial de un componente del TS que interferiría con o inhibiría la actividad biológica de un factor o factores de crecimiento del TS. Los compuestos inhibidores pueden ejercer su efecto protegiendo al factor de crecimiento de su degradación. Sin embargo, un compuesto inhibidor no inhibe cualquiera de las actividades que son esenciales para las propiedades deseadas, como, por ejemplo, la curación de heridas, del TS suplementado con factores de crecimiento. Un ejemplo de un compuesto inhibidor es la heparina.

Tal como se usa en este documento, un factor de crecimiento incluye cualquier factor soluble que regula o media en la proliferación celular, la diferenciación celular, la regeneración de tejido, la atracción celular, la reparación de heridas y/o cualquier proceso de desarrollo o proliferación. El factor de crecimiento se puede generar de cualquier manera adecuada, incluida su extracción a partir de fuentes naturales, la producción por síntesis química, la producción mediante el uso de técnicas de ADN recombinante y cualquier otra técnica, incluido el material liberado a partir de plaquetas rico en factor(es) de crecimiento, sometido a un procedimiento para la inactivación de virus, conocida por los expertos en la materia. El término factor de crecimiento se supone que incluye cualquier precursor, mutante, derivado u otras formas de los mismos que posean una actividad(es) biológica(s) similar(es), o un subconjunto de las mismas, a la(s) del factor de crecimiento del que derivan o están relacionados de otra manera.

Tal como se usa en este documento, HBGF-1, también conocido por los expertos en la materia por nombres alternativos, como factor de crecimiento de células endoteliales (ECGF) y FGF-1, hace referencia a cualquier forma biológicamente activa del HBGF-1, incluido el HBGF-1\beta, que es precursor del HBGF-1\alpha, y otras formas truncadas, como FGF. La Patente de Estados Unidos Número 4.868.113 de Jaye y col., incorporada en este documento como referencia, expone las secuencias de aminoácidos de cada forma de HBGF. Así, HBGF-1 incluye cualquier péptido biológicamente activo, incluidos precursores, formas truncadas u otras formas modificadas, o mutantes de los mismos que presentan las actividades biológicas, o un subconjunto de las mismas, de HBGF-1.

Otros factores de crecimiento también pueden ser conocidos por los expertos en la materia con una nomenclatura alternativa. Por lo tanto, la referencia en este documento a un factor de crecimiento en concreto por un nombre también incluye cualquier otro nombre por el que el factor es conocido por los expertos en la materia e incluye también cualquier derivado o precursor, mutante truncado, o formas modificadas de otra manera de los mismos, biológicamente activos.

Tal como se usa en este documento, actividad biológica hace referencia a una o todas las actividades que se asocian a un factor de crecimiento concreto in vivo y/o in vitro. Generalmente, un factor de crecimiento presenta varias actividades, incluyendo una actividad mitogénica (la capacidad para inducir o mantener la proliferación celular) y también actividades no mitogénicas, incluyendo la capacidad para inducir o mantener la proliferación y/o desarrollo. Además, los factores de crecimiento son capaces de reclutar o atraer células concretas a partir de las cuales avanzan los procesos de proliferación y desarrollo. Por ejemplo, en condiciones apropiadas, HBGF-1 puede reclutar células endoteliales y, de ahí dirigir la formación de vasos. En virtud de esta actividad, el TS suplementado con factores de crecimiento puede proporcionar así una manera de mejorar el flujo sanguíneo y de nutrientes a lugares específicos.

Tal como se usa en este documento, longevidad prolongada significa un aumento de al menos dos veces la vida útil in vitro de un TS y que se puede observar de forma visual.

Tal como se usa en este documento, matriz ósea desmineralizada (DBM) significa la matriz orgánica del hueso que queda después de descalcificar el hueso con ácido clorhídrico u otro ácido.

Tal como se usa en este documento, proteínas morfogenéticas óseas (BMP) significa un grupo de proteínas relacionadas, identificadas originalmente por su presencia en extractos de DBM inductores de hueso. Se ha identificado al menos 8 miembros relacionados y se denominan BMP-1 hasta BMP-8. Las BMP también son conocidas con otros nombres. BMP-2 también es conocida como BMP-2A. BMP-4 también es conocida como BMP-2B. BMP-3 también es conocida como osteogenina. BMP-6 también es conocida como Vgr-1. BMP-7 también es conocida como OP-1. Se supone que las proteínas morfogenéticas óseas incluyen, pero no se encuentran limitadas a, BMP-1 hasta BMP-8.

Tal como se usa en este documento, aumento significa usar un TS suplementado o no suplementado para cambiar el contorno de la superficie interna o externa de un componente del cuerpo de un animal.

Tal como se usa en este documento, un hueso dañado es un hueso roto, fracturado, al que le falta una porción del mismo, o un hueso que de otra manera, no es sano, normal.

Tal como se usa en este documento, un hueso deficiente es un hueso que tiene una forma o un volumen inadecuado para realizar su función.

Tal como se usa en este documento, el hueso o la DBM que se va a usar para suplementar un TS puede estar en forma de polvos, suspensión, tiras o bloques y otras formas necesarias para realizar su función deseada.

Tal como se usa en este documento, organoide significa una estructura que puede estar compuesta por elementos naturales, artificiales, o una combinación de elementos naturales y artificiales, que reemplaza totalmente o en parte la función de un órgano natural. Un ejemplo sería un páncreas artificial, que consiste en una red de capilares rodeados de células transfectadas con un vector de expresión que contiene el gen de la insulina. Dicho organoide funcionaría para liberar insulina al torrente sanguíneo de un paciente con diabetes tipo I.

Preparación de un TS suplementado

Como primera etapa, cuando se pone en práctica cualquiera de las formas de realización de la invención descrita en este documento, se deben seleccionar el TS y el suplemento. El TS y el suplemento se pueden preparar siguiendo procedimientos conocidos por los expertos en la materia, se pueden obtener de un proveedor de los mismos, o se pueden preparar de acuerdo con los procedimientos de esta solicitud. En una forma de realización preferida, la FG suplementada con DBM o fármacos se prepara.

En cualquiera de las formas de realización de la presente invención, el suplemento se puede añadir al(a los) componente(s) de fibrinógeno, trombina, calcio y/o agua antes de que se mezclen para formar el TS. De forma alternativa, el(los) suplemento(s) se puede(n) añadir a los componentes mientras se están mezclando para formar el TS.

En formas de realización de la presente invención, el calcio y/o la trombina se pueden suministrar por vía endógena a partir de fluidos corporales como, por ejemplo, los que existen en una herida.

Preparación de TS

En algunas formas de realización de esta invención como, pero no limitadas a, prótesis vasculares, y en aumentos de hueso y cartílago, se usa preferentemente un TS que permita que las células migren en su interior o a través del mismo.

En algunas formas de realización de esta invención, se puede usar cualquier TS, como la FG disponible en el mercado. Por ejemplo, las FG que son bien conocidas por los expertos en la materia (véanse, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos Número 4.627.879; 4.377.572 y 4.298.598, incorporadas todas ellas en este documento como referencia) se pueden adquirir de proveedores o fabricantes de las mismas, como IMMUNO AG (Viena, Austria) y BEHRINGWERKE AG (Alemania). Para estos usos, como la administración localizada de fármacos, la composición concreta del TS seleccionado no es crítica, siempre y cuando funcione como se desea. Las FG disponibles en el mercado se pueden suplementar con antibióticos y/u otros fármacos para su uso en las formas de realización de esta invención incluyendo, pero no limitados a: proliferación y/o diferenciación celular in vitro; administración de fármacos; etc.

Para los experimentos ilustrados en este documento, la FG se preparó a partir de crioprecipitados de plasma fresco congelado. Los componentes de la FG que se usaron incluyeron: concentrado de fibrinógeno, trombina e iones calcio.

En una forma de realización preferida de esta invención, la concentración de proteína total en la FG preparada está entre aproximadamente 0,01 y 500 mg/ml de FG. En formas de realización más preferidas, la concentración de proteína total en la FG preparada está entre aproximadamente 1 y 20 mg/ml de FG. En la forma de realización más preferida, la concentración de proteína total en la FG preparada está entre aproximadamente 4 y 30 mg/ml de FG.

En una forma de realización preferida de esta invención, la concentración de fibrinógeno usada para preparar la FG está entre aproximadamente 0,009 y 450 mg/ml de solución. En una forma de realización más preferida, la concentración de fibrinógeno en esta solución preliminar está entre aproximadamente 0,9 y 110 mg/ml. En la forma de realización más preferida, la concentración de fibrinógeno en esta solución preliminar está entre aproximadamente 3 y 30 mg/ml.

En formas de realización preferidas, la concentración de trombina usada para preparar la FG es de 0,01-350 U/ml. En una forma de realización más preferida, la concentración de trombina es de 1-175 U/ml. En la forma de realización más preferida, la concentración de trombina es de 2-4 U/ml.

Es importante que la concentración de ion calcio sea suficiente como para permitir la activación de la trombina. En una forma de realización preferida, la concentración de cloruro cálcico USP es de 0-100 mM. En una forma de realización más preferida, la concentración de cloruro cálcico USP es de 1-40 mM. En la forma de realización más preferida, la concentración de cloruro cálcico USP es de 2-4 mM. En algunas formas de realización de esta invención, el calcio lo puede suministrar el tejido o los fluidos corporales como, por ejemplo, en las formas de realización de vendajes de heridas.

En la preparación de los TS se debería usar agua estéril para inyección.

Aunque la(s) concentración(ones) de fármacos y otros compuestos variará(n) dependiendo del objetivo deseado, las concentraciones deben ser suficientemente elevadas como para permitirles ser eficaces para cumplir con el propósito establecido. En una forma de realización preferida de esta invención, la concentración de TET o CIP está entre 0,01 y 300 mg/ml de FG. En una forma de realización más preferida de esta invención, la concentración de TET o CIP es de 0,01-200 mg/gl. En la forma de realización más preferida de esta invención, la concentración de TET o CIP es de 1-150 mg/ml. Un experto en la materia puede determinar empíricamente la cantidad de los suplementos a añadir, ensayando varias concentraciones y seleccionando aquella que sea eficaz para el propósito que se pretende y la localización de la aplicación.

Preparación de factores de crecimiento para su uso en los ejemplos comparativos descritos en otras partes en este documento.

El(Los) factor(es) de crecimiento, o una mezcla de los mismos, se puede(n) preparar siguiendo cualquier procedimiento conocido por los expertos en la materia o se puede(n) adquirir en el mercado. Se puede seleccionar cualquier factor de crecimiento incluidos, pero no limitados a, por ejemplo, factores de crecimiento que estimulan la proliferación y/o la atracción de ciertos tipos celulares, como células endoteliales, fibroblastos, células epiteliales, células del músculo liso, hepatocitos y queratinocitos, y/o factores que crecimiento que inhiben el crecimiento de los mismos tipos celulares y células del músculo liso. Dicha selección puede depender de la localización del tejido concreto en el que se aplicará el TS suplementado con un factor de crecimiento y/o del tipo de efecto deseado. Por ejemplo, se puede preferir un TS suplementado con EGF para su aplicación sobre heridas en el ojo y para tratar úlceras gástricas, mientras que se puede preferir un TS suplementado con osteogenina para su aplicación en fractures óseas o roturas óseas para promover la curación de las mismas.

En un ejemplo, el HBGF-1\beta se preparó y se añadió a la FG. El HBGF-1\beta, o el HBGF-1\alpha, o cualquier otra forma activa del HBGF-1, se puede purificar a partir de fuentes naturales, a partir de células modificadas por ingeniería genética que expresan HBGF-1 o un derivado del mismo, o por cualquier procedimiento conocido por los expertos en la materia.

El HBGF-1\beta se preparó usando tecnología de ADN recombinante (Jaye y col., Patente de Estados Unidos Número 4.868.113, Jaye y col., J. Biol. Chem. 262: 16612-16617 (1987)). En resumen, el ADN que codifica el HBGF-1\beta se clonó en un vector de expresión procariota, un derivado de pUC9, y se expresó intracelularmente en E. coli. El péptido expresado se liberó de las células por presión, usando un desintegrador celular que funciona mediante ciclos de compresión-descompresión. Tras la disrupción, los restos celulares se eliminaron por filtración y el HBGF-1\beta se purificó a partir del sobrenadante usando procedimientos estándar para la purificación de proteínas incluyendo la cromatografía de afinidad en heparina Sepharosa® seguida de cromatografía de intercambio iónico en CM-Sepharosa®.

Además del HBGF-1, descrito más arriba, otros factores de crecimiento que se pueden añadir a la FG incluyen, pero no están limitados a, HBGF-2, IGF-1, EGF, TGF-\beta, TGF-\alpha, cualquier factor de crecimiento o extracto derivado de plaquetas, BMP y mezclas de factores de crecimiento cualquiera. Por ejemplo, los extractos derivados de plaquetas, que sirven como ricas fuentes de factores de crecimiento, se pueden añadir al TS además de o en lugar de otros factores de crecimiento, como HBGF-1.

En otro ejemplo, un extracto derivado de plaquetas, preparado por cualquier procedimiento conocido por los expertos en la materia, se añade a un TS. Dicho extracto, se preparó a partir de plaquetas derivadas de plasma para su uso con FG.

Se puede preparar PDWHF y añadir a FG (Knighton y col., Ann. Surg. 204: 322-330 (1986)). En resumen, para preparar PDWHG, se extrae sangre en una solución anticoagulante y se prepara plasma rico en plaquetas por centrifugación en frío. Las plaquetas se aíslan y se estimulan con trombina, que libera los contenidos de los gránulos alfa. Las plaquetas se eliminan y se añade una concentración eficaz del extracto restante a un TS.

Componentes adicionales de un TS suplementado con un factor de crecimiento.

Ya que son esencialmente fracciones del plasma, los TS contemplados para su uso con factores de crecimiento contienen numerosos componentes, algunos de los cuales pueden interferir con la actividad biológica del(de los)
factor(es) de crecimiento seleccionado(s). Por ejemplo, la trombina, que es un componente esencial de la FG, puede actuar como enzima proteolítica y escindir específicamente el HBGF-1\beta. Por lo tanto, puede ser necesario incluir compuestos adicionales, como inhibidores de proteasas u otros inhibidores, que protejan al(a los) factor(es) de crecimiento seleccionado(s) de la acción de otros componentes del TS que interfieran con o destruyan la actividad biológica
del(de los) factor(es) de crecimiento.

La selección del(de los) compuesto(s) inhibidor(es) concreto(s) se puede determinar empíricamente usando procedimientos, mencionados más abajo, que calculan la actividad biológica del(de los) factor(es) de crecimiento del TS. Los procedimientos para calcular la actividad biológica son conocidos por los expertos en la materia.

Además, para que ciertos factores de crecimiento exhiban sus actividades biológicas, puede ser necesario incluir compuestos que potencien o medien en la actividad deseada. Por ejemplo, la heparina potencia la actividad biológica del HBGF-1 in vivo (véase, por ejemplo, Burgess y col., Annu. Rev. Biochem. 58:575-606 (1989)).

TS suplementados con fármacos

Los TS suplementados con fármacos de la presente invención contienen al menos un fármaco en forma de sólido, tal como se ha descrito en otras partes en este documento. También contienen otros fármacos, sustancias químicas y proteínas. Éstos pueden incluir, pero no se encuentran limitados a, antibióticos como TET, ciprofloxacino, amoxicilina o metronidazol, anticoagulantes, como proteína C activada, heparina, prostaciclina (PGI_{2}), prostaglandinas, leucotrienos, antitrombina III, ADPasa y activador del plasminógeno; esteroides, como dexametasona, inhibidores de la prostaciclina, prostaglandinas, leucotrienos y/o cininas para inhibir la inflamación; fármacos cardiovasculares, como bloqueantes de los canales del calcio; quimioatrayentes; anestésico locales, como bupivacaína; y fármacos antiproliferativos/antitumorales como 5-fluorouracilo (5-FU), taxol y/o taxotere. Estos compuestos suplementarios también pueden incluir anticuerpos policlonales, monoclonales o quiméricos, o derivados o fragmentos funcionales de los mismos. Pueden ser anticuerpos que, por ejemplo, inhiban la proliferación del músculo liso, como anticuerpos frente a PDGF, y/o TGF-\beta, o la proliferación de otros tipos celulares indeseables dentro y alrededor del área tratada con el TS. Estos anticuerpos también pueden ser útiles en situaciones en las que se requiere una actividad anti-cancerígena, anti-plaquetaria o antiinflamatoria. En general, cualquier anticuerpo cuya eficacia se mejora con su administración dirigida puede beneficiarse de ser usado con este sistema de administración en un TS.

Ensayos para valorar las propiedades de curación de heridas de un TS suplementado con factores de crecimiento

Con objeto de determinar si un TS suplementado con un factor de crecimiento concreto promueve la curación de heridas y de seleccionar las concentraciones óptimas del(de los) factor(es) de crecimiento para ello, las composiciones se pueden ensayar siguiendo cualquier procedimiento conocido por los expertos en la materia (véase, por ejemplo, Tsuboi y col., J. Exp. Med. 172:245-251 (1990); Ksander y col., J. Am. Acad. Dermatol. 22: 781-791 (1990); y Greenhalgh y col., Am. J. Path. 136: 1235 (1990)). Se puede usar cualquier procedimiento, incluidos ensayos tanto in vivo como in vitro, mediante el cual se pueda valorar la actividad del(de los) factor(es) de crecimiento seleccionado(s) en la composición del TS. Por ejemplo, se valoró la actividad del HBGF-1\beta usando dos ensayos in vitro independientes. En el primero, se determinó la proliferación de células endoteliales que se habían suspendido en una capa poco profunda de fluido cubriendo una superficie de plástico que se había impregnado con FG suplementada con un factor de crecimiento. En el segundo, se midió la incorporación de timidina-^{3}H en fibroblastos cultivados en presencia de HBGF-1.

En un ensayo in vivo, se ensayó la capacidad de la FG que se había suplementado con HBGF-1\beta para promover la curación in vivo, usando ratones como sistema modelo. En este procedimiento, se realizaron biopsias en sacabocados idénticas en la región dorsal de los ratones, que se separaron entonces en grupos de ensayo, controles tratados y controles no tratados. Las heridas en los ratones del grupo de ensayo se trataron con el TS suplementado con factor de crecimiento. Las heridas en los ratones del grupo control tratado se trataron con TS no suplementado. Las heridas del grupo no tratado no se trataron con TS. Tras un tiempo suficiente como para que se desarrolle una curación detectable de las heridas, generalmente entre una semana y diez días, los ratones se sacrificaron y el tejido de la herida se examinó al microscopio para valorar histológicamente la extensión de la reparación de la herida en cada grupo.

La capacidad del TS suplementado con un factor de crecimiento para inducir proliferación celular y para reclutar células también se puede valorar por procedimientos in vitro conocidos por los expertos en la materia. Por ejemplo, los ensayos in vitro descritos más arriba para medir la actividad biológica de factores de crecimiento y descritos en detalle en los Ejemplos, se pueden usar para ensayar la actividad del factor de crecimiento en la composición del TS. Además, también se pueden valorar los efectos de la adición de compuestos inhibidores y/o potenciadores.

Generalmente, la necesidad de añadir compuestos inhibidores y/o potenciadores se puede determinar empíricamente. Por ejemplo, en los experimentos descritos más abajo, el HBGF-1\beta en la FG suplementada con HBGF-1 fue escindido específicamente de forma estocástica, sugiriendo que un componente de la preparación de FG, más probablemente la trombina, fue el responsable. La heparina, que se sabe se une al HBGF-1 y lo protege de ciertas actividades proteolíticas, se añadió a la FG suplementada con HBGF-1. La adición de concentraciones relativamente bajas de heparina protegió al HBGF-1\beta de la escisión que destruiría su actividad biológica en la FG. Por lo tanto, las composiciones de TS que incluyen HBGF-1 pueden incluir heparina o alguna otra sustancia que inhiba la escisión del HBGF-1 por la trombina u otros componentes proteolíticos de la FG.

De forma similar, la capacidad de un inhibidor para proteger un factor de crecimiento de la degradación por componentes del TS se puede valorar mediante cualquier procedimiento conocido por los expertos en la materia. Por ejemplo, se ensayó la capacidad de la heparina para inhibir la escisión del HBGF-1 por la trombina, que es un componente esencial de la FG. Para ello, se prepararon mezclas de varias concentraciones de heparina y FG suplementada con HBGF-1 y se incubaron durante varios tiempos. La actividad biológica de HBGF-1 en la mezcla se ensayó y se determinó la integridad del HBGF-1 mediante la técnica de hibridación de tipo Western de geles SDS. Concentraciones relativamente bajas, aproximadamente una relación molar 1:1 de heparina:HBGF-1, son suficientes para proteger al HBGF-1 de la degradación en la FG.

También se puede determinar empíricamente si un compuesto concreto se puede usar para potenciar, mediar en o aumentar la actividad biológica de un(os) factor(es) de crecimiento en el TS.

Aplicación tópica o interna del TS suplementado con un factor de crecimiento en una herida interna o externa.

Antes de su uso clínico, el factor de crecimiento y el TS, o el TS suplementado con un factor de crecimiento, se pasteuriza o se trata de otra manera para inactivar cualquier contaminante patogénico en su interior, como los virus. Los procedimientos para inactivar contaminantes son bien conocidos por los expertos en la materia e incluyen, pero no se encuentran limitados a, tratamiento con un disolvente-detergente y tratamiento por calor (véanse, por ejemplo, Tabor y col., Thrombosis Res. 22: 233-238 (1981) y Piszkiewicz y col., Transfusion 28: 198-199 (1988)).

El TS suplementado se aplica directamente sobre la herida, otro tejido u otra localización deseada. Generalmente, para las heridas externas, se puede aplicar directamente de cualquier manera, incluido pulverizando la parte superior de la herida. También se puede aplicar internamente, como durante un procedimiento quirúrgico. Cuando se aplica internamente, como en huesos, el coágulo de disuelve gradualmente a lo largo del tiempo.

Los siguientes ejemplos se incluyen con propósitos ilustrativos solamente y no pretenden limitar el ámbito de la invención. Los ejemplos marcados con un asterisco * tratan, al menos en parte, de TS no suplementados o TS suplementados con un factor de crecimiento, que se encuentran fuera del ámbito de la presente invención. En este sentido, los ejemplos son ejemplos comparativos, útiles para entender la invención.

Ejemplo 1 * Preparación de HBGF-1 para suplementar FG

Se preparó un cultivo de 800 ml de E. coli recombinante que contenía un plásmido portador del ADN que codifica el HBGF-1\beta. Tras la inducción y el cultivo durante 24 horas a 37ºC, las células se centrifugaron y los sobrenadantes se descartaron. El sedimento de células se resuspendió en 25 ml de tampón fosfato 20 mM, que contenía NaCl 0,15 M, pH 7,3. Las células suspendidas se desintegraron con un desintegrador celular y los restos celulares se separaron de la solución resultante por centrifugación a 5000 g durante 20 min.

Se descartó el sedimento y el sobrenadante que contenía el HBGF-1\beta solubilizado y otras proteínas bacterianas se cargó en una columna de 2,6 cm de diámetro y 10 cm de alto de Heparin-Sepharosa® (Pharmacia Fine Chemicals, Upsala, Suecia). La columna se lavó con 5 volúmenes de la columna de NaCl 0,15 M en tampón fosfato 20 mM, pH 7,3, y se eluyó a continuación con un gradiente desde NaCl 0,15 M en tampón fosfato 20 mM hasta NaCl 2,0 M.

Los eluatos se monitorizaron por absorción UV a 280 nm. Se eluyeron tres picos de material con absorción UV y se analizaron por electroforesis en gel de poliacrilamida SDS. El pico número tres corrió como una banda única de aproximadamente 17.400 daltons y contenía HBGF-1\beta sustancialmente puro.

Con objeto de asegurar todavía más que el HBGF-1\beta estaba libre de proteínas bacterianas contaminantes, el pico número tres, que contenía la actividad del factor de crecimiento, se dializó durante toda la noche frente a histidina 20 mM, NaCl 0,15, pH 7,5. Se cargaron dos mg de proteína en una columna de intercambio iónico CM-Sepharosa® de 1 ml (Pharmacia, Upsala, Suecia). La columna se lavó con 10 volúmenes del lecho (0,5 ml/min) de histidina 20 mM, NaCl 0,15 M, pH 7,5 y se eluyó con un gradiente desde NaCl 0,15 M hasta NaCl 1,0 M en histidina 20 mM, pH 7,5. El eluato se monitorizó por absorción UV a 280 nm y el HBGF-1\beta se identificó por electroforesis en gel de poliacrilamida SDS.

Este HBGF-1 purificado se usó para suplementar FG en ejemplos subsiguientes.

Ejemplo 2 * Estabilidad del HBGF-1

Era necesario añadir un ingrediente a la FG que inhibiese o previniese la digestión del HBGF-1\beta por la trombina (Lobb, Biochem. 27: 2572-2578 (1988)), que es un componente de la FG. La heparina, que se adsorbe al HBGF-1, se seleccionó y ensayó para determinar si podía proteger al HBGF-1 de la digestión por la trombina y por cualquier otro componente proteolítico de la FG. Se evaluó la estabilidad del HBGF-1 en presencia de concentraciones crecientes de heparina.

Se incubaron soluciones que contenían HBGF-1\beta (10 \mug/ml), trombina (250 U/ml) y concentraciones crecientes de heparina (0, 0,5, 5, 10, 20 y 50 U/ml) a 37ºC. Se recogieron periódicamente alícuotas de las soluciones incubadas y se congelaron y almacenaron a -70ºC para su posterior ensayo.

Tras completarse la incubación, las muestras se descongelaron y se separaron en geles de poliacrilamida SDS al 15% en condiciones reductoras de acuerdo con el procedimiento de Laemmli (Nature 227 :680 (1970)). A continuación el gel se transfirió sobre una membrana de nitrocelulosa y la banda que corresponde al HBGF-1 se identificó usando un antisuero policlonal de conejo, purificado por afinidad, frente a HBGF-1. Las técnicas de hibridación tipo Western se muestran en la Fig. 1, en la que se puede ver la banda de HBGF-1\beta en un peso molecular de 17.400. Los resultados indicaron que en presencia de concentraciones de heparina tan bajas como 5 U/ml, el HBGF-1\beta estaba protegido de la digestión por la trombina. Además, tal como se describe en el Ejemplo 3, su actividad biológica no se alteró.

Ejemplo 3 * Actividad biológica de HBGF-1\beta tras su incubación en presencia de heparina y trombina

Se midió la actividad biológica del HBGF-1 en la mezcla que contenía 5 U/ml de heparina, y que se ha descrito en el Ejemplo 2, mediante un ensayo de incorporación de timidina-^{3}H con células NIH 3T3.

Las células NIH 3T3 se introdujeron en placas de 96 pocillos y se incubaron a 37ºC en condiciones de deprivación de nutrientes en Dulbecco's Modified Medium (DMEM; GIBCO, Grand Island, New York) con 0,5% de suero bovino fetal (BCS; GIBCO, Grand Island, New York) hasta que las células alcanzaron entre el 30 y el 50% de confluencia. Dos días más tarde, se añadieron distintas diluciones de HBGF-1 de las muestras preparadas en el Ejemplo 2 a cada pocillo sin cambiar el medio. Se añadió diluyente (tampón de incubación) en lugar de factor de crecimiento en los controles negativos y se añadió DMEM con 10% de BCS, que contiene factores de crecimiento necesarios para el crecimiento, en lugar de muestra de HBGF-1 para los controles positivos.

Tras la incubación a 37ºC durante 18 horas, se añadieron 0,25 \muCi de timidina-^{3}H, actividad específica 6,7 \muCi/mol, a cada pocillo y la incubación se continuó a 37ºC, durante 4 horas más. Las placas se lavaron con tampón fosfato salino (PBS) y se fijaron con 0,5 ml de ácido tricloroacético (TCA) al 10% frío, durante 15 min a 4ºC. El TCA se retiró, las placas se lavaron con PBS y el material precipitable con ácido se solubilizó con 0,5 ml/pocillo de hidróxido de sodio 0,1 N, durante 1 hora, a temperatura ambiente. Las muestras se transfirieron a viales de centelleo y se añadieron 10 ml de líquido de centelleo (New England Nuclear, Aquasure®) por vial.

Los resultados, que se muestran en la Figura 2, demostraron que el HBGF-1, que se había incubado en presencia de trombina y heparina, mantuvo su actividad biológica. La incorporación de timidina dependiente de la concentración observada fue independiente del tiempo de incubación y fue la que se espera típicamente por la dependencia de la proliferación de células de la concentración de factor de crecimiento. Los factores de crecimiento presentan generalmente una concentración óptima a la que la proliferación celular es máxima.

La actividad biológica del HBGF-1 en presencia de trombina y heparina también se midió observando la proliferación de células endoteliales. Se impregnaron las superficies de placas petri con la FG suplementada con HBGF-1. Se añadió un capa poco profunda de células endoteliales y se determinó el número de células. Con el tiempo, el número de células se incrementó. Además, parece que las células se estaban organizando en vasos.

Por lo tanto, el HBGF-1 retuvo sus actividades biológicas en la FG que incluía heparina, que protege al HBGF-1 de la actividad de degradación de la trombina y también puede potenciar la actividad biológica del HBGF-1 en la FG suplementada con factor de crecimiento.

Ejemplo 4 * Difusión de HBGF-1 a partir de un coágulo de FG

Se formó un coágulo de FG en un tubo de ensayo de plástico de 5 ml mezclando 0,3 ml de complejo de fibrinógeno que contenía 10 U/ml de heparina y trombina y CaCl_{2} 40 mM. Se dispusieron cuatro tubos de ensayo como se indica a continuación:

(A) trombina 0,5 U/ml y HBGF-1 10 \mug/ml;

(B) trombina 0,5 U/ml y HBGF-1 50 \mug/ml;

(C) trombina 5 U/ml y HBGF-1 10 \mug/ml; y

(D) trombina 5 U/ml y HBGF-1 50 \mug/ml;

Cada coágulo se cubrió con tampón histidina 0,2 M, pH 7,3. Se recogieron de cada tubo muestras de treinta \mul del tampón cubriente cada dos horas y se analizaron según la técnica de hibridación tipo Western.

Los resultados del experimento demostraron que la difusión de HBGF-1 al exterior del coágulo se realiza en función del tiempo y de su concentración en el coágulo, y que la concentración de trombina en el coágulo no afecta a la tasa a la que se libera el HBGF-1 a partir del coágulo.

Ejemplo 5 * Comportamiento de células endoteliales procedentes de vena umbilical humana en FG suplementada con un factor de crecimiento: efecto de FGF-1 salvaje y mutante

Para estudiar los efectos in vitro de FG suplementada con factor de crecimiento de fibroblastos ácido (FGF-1) en células endoteliales humanas, se añadieron suspensiones de estas células a placas petri de 10 cm de diámetro que contenían capas uniformemente extendidas de 2,5 ml de FG que contenía a su vez aproximadamente 9 mg de fibrinógeno por ml y 0,25 unidades NIH de trombina por ml. La FG se suplementó de las siguientes formas:

(A) Sin factor de crecimiento añadido;

(B) Suplementada con 100 ng/ml de FGF-1 salvaje activo;

(C) Suplementada con 100 ng/ml de FGF-1 mutante inactivo; o

(D) Suplementada con 10 ng/ml de FGF-1 salvaje activo.

Las células sembradas sobre la capa de FG se mantuvieron durante 7 días en DMEM con 10% de suero bovino fetal (FBS).

Las células se alargaron y proliferaron de forma eficaz cuando estaban en contacto con FG suplementada con FGF-1 biológicamente activo (Figuras 3 y 4). Las células que estaban en contacto con FG no suplementada (Figura 5) o con FG suplementada con FGF-1 mutante biológicamente inactivo (Figura 6) se alargaron pero proliferaron relativamente despacio.

Ejemplo 6 * Comportamiento de células endoteliales de vena umbilical humana en FG suplementada con FGF-1

Para estudiar su crecimiento, las células endoteliales umbilicales humanas, 10^{3} o más células por ml, se embebieron en FG, cuya concentración proteica era de 4 mg/ml. La concentración de trombina en la FG se ajustó a 0,6 U NIH/ml. En todos los experimentos se usó medio de cultivo M199 (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) suplementado con 10% de suero bovino fetal, 10 \mug/ml de estreptomicina, 100 U/ml de penicilina, 1 ng/ml de FGF-1 y 10 U/ml de heparina.

Al cabo de 24 horas en FG las células se alargaron, presentado múltiples lamelipodios y formaron una red celular al contactar unas con otras (Fig. 7). Este crecimiento continuó durante al menos 5 días. La Figura 8 muestra esta situación a 48 horas.

Como control, se cultivó una suspensión idéntica de células en una superficie revestida con fibronectina a 10 \mug/cm^{2}. Las células control adquirieron una morfología en empedrado y mantuvieron esta morfología durante al menos 5 días. Las Figuras 9 y 10 muestran esta situación a 24 y 48 horas, respectivamente.

Ejemplo 7 Comportamiento de células PMEXNEO-3T3-2.2 en FG

Las células PMEXNEO-3T3-2.2 son fibroblastos que tienen el genoma modificado con potencial para expresar proteínas generadas por ingeniería genética (Forough y col., J. Biol. Chem. 268: 2960-2968 (1993)). Para determinar el comportamiento de estas células en FG, se cultivaron 10^{5} células por pocillo en tres condiciones: (1) embebidas en FG; (2) sobre la superficie de FG; y (3) en ausencia de FG (controles). Los experimentos se llevaron a cabo por duplicado en placas de 24 pocillos, en medio DMEM (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) suplementado con 10% de FBS. La concentración proteica de la FG era de 4 mg/ml. Como control negativo, se usaron experimentos idénticos en los que el medio se suplementó con 1,5% de FBS.

En presencia de medio suplementado con 10% de FBS, las células de los tres grupos crecieron y llegaron a confluencia. En los experimentos control negativo en los que el medio estaba suplementado con 1,5% de FBS, las células crecieron y sobrevivieron durante al menos cinco días en presencia de FG, pero no sin ella. Sin embargo, su crecimiento fue más rápido en FG suplementada con 10% de FBS que en la suplementada con 1,5% de FBS. En ausencia de FG, en el medio suplementado con 1,5% de FBS, las células murieron al cabo de 48 horas. El criterio para la supervivencia fue la capacidad de las células ensayadas para proliferar tras ser transferidas a medio nuevo suplementado con 10% de FBS.

Ejemplo 8 * Endotelización de injertos vasculares de PTFE expandido por pre-tratamiento con HBGF-1

Dos estudios demostraron que el pre-tratamiento de biomateriales que contactan con la sangre con mitógenos para las células endoteliales (EC) potenció su endotelización. El primer estudio examinó las características de aclaramiento in vivo de una suspensión de FG suplementada con HBGF-1 aplicada en injertos de PTFE expandido implantados en aortas de conejo. En el segundo estudio se implantaron injertos similares en posición aortoiliaca en perros. En estos estudios, se usó HBGF-1, un factor angiogénico. También se pueden usar otros factores de crecimiento como FGF, FGF-4 y/u OP-1 como suplemento(s) para los injertos vasculares.

A. Estudio de aclaramiento

Generalmente, la FG modificada se preparó estéril añadiendo aproximadamente 1 ng/cm^{2} del área de la superficie interna y externa de los injertos de HBGF-1-^{125}I recombinante humano, 20 \mug/cm^{2} de mucosa intestinal porcina de heparina, y 2,86 mg/cm^{2} de fibrinógeno a 2,86 x 10^{-2} U/cm^{2} de trombina humana (1000 U/ml), disponible en el mercado y reconstituida, para inducir polimerización.

El HBGF-1-^{125}I se preparó específicamente como se describe a continuación. El fibrinógeno se reconstituyó añadiendo 500 mg de fibrinógeno a 25 ml de PBS, para dar una concentración de fibrinógeno de 20 mg/ml de PBS. Tres ml de esta solución, que contenían 60 mg de fibrinógeno, se pusieron en 12 tubos de plástico Eppendorf y se mantuvieron a -70ºC. Cada una de estas alícuotas se usó individualmente.

La trombina se reconstituyó diluyendo una preparación de la misma disponible en el mercado (Armour Pharmaceutical Co., Kankakee, IL), a una concentración de 1000 U/ml, aplicando un factor de dilución 1:10, en una solución estéril para dar una concentración de 100 U/ml. Esta solución de trombina se diluyó de nuevo 1:10 para dar una solución a 10 U/ml.

La heparina bovina (Upjohn, Kalamazoo, MI) se reconstituyó diluyendo la preparación a una concentración de 1000 U/ml, aplicando un factor de dilución 1:1000, usando salino normal.

Se mezclaron uno y 48/100 ml (1,48 ml) del fibrinógeno reconstituido, 63 \mul de la heparina reconstituida, más 15,66 \muL de HBGF-1-^{125}I en un tubo de cristal de centelleo. Esta mezcla se aspiró a continuación en una jeringa de plástico de 3 ml. Se pusieron cinco ml de la trombina reconstituida en un tubo de cristal de centelleo.

Se conectó un extremo del injerto de PTFE expandido con una vía de plástico de tres pasos y se aseguró con una sutura de seda de 2-0. El PTFE se rodeó a continuación con un cuadrado de 3 x 3 cm de Parafilm® que se sujetó con una pinza hemostática recta para establecer un cierre hermético. Se realizó una segunda sutura con seda de 2-0 sobre el parafilm adyacente a la vía para formar otro cierre. A continuación, se usó otra pinza hemostática recta para pinzar los 2 mm distales del PTFE/parafilm para sellar este extremo.

Se mezclaron cantidades iguales de solución de fibrinógeno y de trombina, preparadas tal como se ha descrito más arriba, y se dejaron reaccionar durante aproximadamente 30 segundos, que es cuando se produce la polimerización. La fibrina polimerizada por la trombina es entonces opaca. (Este factor tiempo es aproximado y varía de un lote de trombina a otro. La cantidad de tiempo apropiada para la polimerización se puede determinar viendo la opacidad de la mezcla). La mezcla de fibrina/trombina se aspiró en una jeringa de un cc. (Nota: el volumen de este injerto era de 0,42 ml. Para un injerto de mayor volumen se debe usar una jeringa mayor.) La jeringa se unió a la vía y la mezcla se inyectó manualmente a lo largo de un periodo de 5 segundos hasta ver que el líquido "transpira" a través de los intersticios del PTFE y rellena el espacio entre el PTFE y el Parafilm®. La vía de tres pasos al injerto de PTFE se cerró durante 3 minutos y se usó una cuchilla de escalpelo para cortar la ligadura al final del PTFE que estaba unido a la vía. El injerto de PTFE/parafilm se retiró de la vía y se usó una pinza hemostática para retirar el PTFE de la envoltura de parafilm. Para dejar la luz del injerto libre de FG suplementada con factor de crecimiento residual, se pasó un catéter de embolectomía número 2 a través del injerto cinco veces hasta que la luz del injerto estaba completamente despejada. El injerto de PTFE tratado con FG suplementada con factor de crecimiento se dejó secar durante toda la noche durante aproximadamente 12 horas en una campana de flujo laminar. El injerto tratado estaba entonces listo para su implantación.

De forma alternativa, esta FG suplementada con HBGF se perfundió a presión en un injerto de PTFE expandido de 34 mm (24 mm + 5 mm a cada extremo) x 4 mm (diámetro interno), de paredes finas, revistiendo así la superficie luminal del injerto y extendiéndola a través de los nudos hacia las superficies externas del injerto. La luz del injerto se despejó tal como se ha descrito más arriba. Estos injertos se interpusieron, a continuación, en las aortas abdominales infrarrenales de 24 conejos blancos New Zealand de 3-5 kg. En el primer estudio, los animales se sacrificaron y las muestras se explantaron a tiempo 0 (para corregir las pérdidas debidas a la manipulación quirúrgica) y tras 5, 30 y 60 min y 1, 7, 14 y 30 días. Se determinó la radioactividad residual por recuento gamma. El HBGF-1-^{125}I restante, corregido para la decadencia espontánea, se expresa como porcentaje del valor a tiempo cero.

El aclaramiento de HBGF-1-^{125}I siguió cinéticas clásicas con una rápida pérdida inicial con el restablecimiento de la circulación (%/min = -24,1 entre 5 y 60 minutos) seguida de una pérdida lenta tras 1 hora (%/min = -0,03), permaneciendo el 13,4% \pm 6,9% tras 1 semana y el 3,8% \pm 1,1% tras 30 días.

B. Estudio de endotelización in vivo

El segundo estudio evaluó los efectos de la aplicación de la suspensión de FG suplementada con HBGF-1 sobre: la tasa de endotelización de injertos de PTFE muy expandido con una distancia internodal de 60 \mum implantados en localizaciones aortoiliacas en perros; la actividad proliferativa de estas células en función del tiempo; y las contribuciones relativas del HBGF-1 y de la FG a la estimulación de la proliferación observada de las células endoteliales. Tres grupos de injertos de PTFE expandido y sin reforzar, de 50 x 4 mm, se implantaron en localización aorto-iliaca en 12 perros. El grupo 1 (n = 6) contenía 20 \mug/cm^{2} de heparina, 2,86 mg/cm^{2} de fibrinógeno y 2,86 x 10^{-2} de trombina humana más 1 ng/cm^{2} de HBGF-1. El grupo 2 (n = 3) contenía la misma FG sin HBGF-1. El grupo 3 (n = 3) consistía en injertos control idénticos pero no tratados. Se inyectó timidina tritiada (TdR-^{3}H; 0,5 \muCi/kg) a lo largos de 10 horas, antes de la explantación. Los injertos se explantaron en los días 7 y 28 para su estudio por microscopía óptica y electrónica, para realizar la inmunohistoquímica del Factor VIII, y la realización de autoradiografías de frente para determinar la proliferación de células endoteliales en campos de gran aumentos aleatorios. Cada injerto fue analizado por tres observadores que no sabían de qué grupo de tratamiento provenía el injerto. Se analizaron estadísticamente las diferencias en la proliferación de células endoteliales mediante ANOVA de dos factores y test t para muestras independientes.

A los 7 días, el 33% de los injertos, tanto con FG como con FG suplementada con HBGF-1, presentaron focos de células endoteliales no contiguos. La superficie de los injertos control siguió siendo un coágulo de fibrina. A los 28 días, todas las FG suplementadas con HBGF-1 mostraron un crecimiento capilar considerable y superficies de contacto con la sangre endotelizadas y confluentes, que no se vieron en ninguna muestra de los otros dos grupos (Figs. 11 y 12). La Figura 12 demuestra que, a los 28 días, los injertos no tratados tenían pocas células endoteliales visibles en su superficie (Panel G). Los injertos tratados con FG sola tenían aproximadamente un 33% de su superficie recubierta con células endoteliales, lo que indica que el tratamiento con FG sola estimula algo la reendoteliazación (Panel H). Sin embargo, los injertos tratados con FG suplementada con HBGF-1 (Panel I) aparecieron completamente (> 95%) recubiertos con células endoteliales, que presentaban la morfología característica en empedrado de las células endoteliales. Así, la combinación de factores de crecimiento aportada por la FG fue capaz de estimular fundamentalmente el recubrimiento completo del injerto vascular con un revestimiento de células endoteliales no trombogénico. La autoradiografía de frente reveló un aumento estadísticamente significativo (p < 0,05) de la incorporación de TdR-^{3}H en el ADN de células endoteliales de los injertos con FG suplementada con HBGF-1 a los 28 días frente a todos los demás grupos en función del tiempo y del tratamiento del injerto.

Estos datos demuestran que la perfusión a presión de una suspensión de FG suplementada con HBGF-1 en injertos de PTFE expandido con una distancia internodal de 60 \mu promueve la endotelización a través del crecimiento de capilares y el aumento de la proliferación de las células endoteliales.

Estos estudios demuestran un aumento de la reendotelización espontánea de injertos vasculares de pequeño diámetro y también un procedimiento para estimular una confluencia más rápida de células endoteliales trasplantadas.

Ejemplo 9 * Preparación de un extracto derivado de plaquetas para su uso con FG

Se prepararon plaquetas en plasma reducido y se sedimentaron. El plasma sobrenadante se eliminó. Las plaquetas sedimentadas se lavaron, se resuspendieron en tampón, que contenía histidina 50 mM y cloruro sódico 0,15 M a pH 6,3, y se trataron con trombina bovina. Tras el tratamiento, el sobrenadante se recogió por centrifugación y se congelaron alícuotas del mismo a -80ºC. El extracto se descongeló y se mezcló con FG y otros TS.

El extracto de plaquetas obtenido de esta forma era biológicamente activo ya que incrementó la incorporación de timidina marcada con radioactividad en el ADN de fibroblastos NIH3T3 en proliferación, comparado con los controles.

Para evaluar el efecto del extracto de plaquetas sobre la curación de heridas, se llevaron a cabo experimentos con extracto de plaquetas en ratones diabéticos, idénticos a los que se realizaron más abajo, en el Ejemplo 10, con HBGF-1beta. De los resultados de estos experimentos está claro que, dada la baja concentración de factores de crecimiento en el extracto de plaquetas, es necesario usar una dosis mayor de 100 \mug de proteínas en el extracto de plaquetas por herida para promover la curación de heridas.

Ejemplo 10 Efecto de la FG sobre la curación de heridas de la piel in vivo Materiales y procedimientos A. FG no suplementada Animales

Se adquirieron ratones hembra C57BL/K_{S}J-db/db en los Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME) y tenían de 8 a 12 semanas de edad al comienzo del experimento. Tras la cirugía, se alojaron en jaulas separadas en un dispositivo de acogida y cuidado de animales.

Estos ratones se usan como modelo de curación de heridas defectuosa en humanos diabéticos porque las anomalías metabólicas que se observan en estos ratones son similares a las que se encuentran en diabéticos humanos. Además, los defectos de curación caracterizados por infiltración celular, formación de tejido de granulación y tiempo requerido para el cierre de la herida claramente retardados, sugieren que la curación en este modelo de ratones puede estar relacionada con los defectos de curación que se observan en la diabetes en humanos.

Cola de fibrina

El complejo de fibrinógeno tópico (TFC) concentrado usado en este estudio se generó a partir de un conjunto de plasma humano fresco congelado. El producto TFC (American Red Cross- Baxter Hyland Division, Los Angeles, CA) se suministró en forma de liofilizado. Tras su reconstitución con 3,3 ml de agua estéril, las características proteicas de la solución de TFC usada en este estudio eran: proteína total, 120 mg/ml; fibrinógeno, 13,5 mg/ml; Factor XIII, 17 U/ml; y plasminógeno, 2,2 \mug/ml.

La trombina bovina tópica (vial de 5000 unidades, Armour Pharmaceutical Co., Kankakee, IL) se reconstituyó con 5 ml de agua estéril y se realizaron diluciones seriadas con una solución de cloruro cálcico 80 mM (American Reagent Laboratories, Shirley, NY), hasta una concentración de 15 U/ml.

Se mezclaron volúmenes iguales de TFC y trombina reconstituida para producir FG. Con objeto de rellenar una herida redonda, de 6 mm de diámetro, de espesor completo, se mezclaron 0,015 ml de TFC con 0,015 ml de trombina. La FG producida tenía una concentración proteica de aproximadamente 60 mg/ml.

También se usó una FG diluida con una concentración proteica de aproximadamente 1 mg/ml.

Cirugía

Los ratones se anestesiaron con una mezcla que consistía en 7 ml de clorhidrato de ketamina (100 mg/ml; Ketaset, Aveco Co., Inc., Fort Dodge, IL), 3 ml de xilazina (20 mg/ml; Rompun, Mobey Corp., Shawnee, KA), y 20 ml de salino fisiológico, a una dosis de 0,1 ml por 100 g de peso corporal, administrada por vía intramuscular. El pelo dorsal se rasuró y la piel se lavó con una solución de povidona yodada y se limpió con una solución de alcohol al 70%. Se hicieron dos heridas quirúrgicas redondas (6 mm de diámetro), de espesor completo, en la parte inferior del lomo del ratón, una a cada lado, equidistantes de la línea media. Los bordes mediales de las dos heridas estaban separados por un margen de piel no lesionada de al menos 1,5 cm.

Inmediatamente después de realizar la herida, se puso FG o un vendaje sobre la herida indicada. El vendaje era un vendaje de poliuretano adhesivo, semipermeable y transparente (Opsite®, Smith and Nephew, Massillon, OH). Se aplicó el compuesto para la tinción de Benzoina (Paddock Laboratories, Minneapolis, MN) en la periferia de la herida antes de aplicar el vendaje. Se dejó un margen de al menos 0,5 cm de piel alrededor del borde de la herida, sobre el que no se aplicó la tinción con benzoina, para evitar los posibles efectos inflamatorios de la benzoina sobre la herida abierta. No se aplicaron más tratamientos a la herida mientras duró el experimento.

Grupos de tratamiento

Los ratones se dividieron en 4 grupos de tratamiento, con cada ratón sirviendo como su propio control:

Grupo I: La herida de un lado del animal se trató con FG (60 mg/ml) mientras que la herida contralateral no recibió tratamiento. Ambas heridas se cubrieron con Opsite®.

Grupo II: Se aplicó por vía tópica FG diluida (0,1 mg/ml) a la herida de un lado mientras que la herida contralateral no recibió tratamiento. Ambas heridas se cubrieron con Opsite®.

Grupo III: Se aplicó por vía tópica FG (60 mg/ml) sobre las dos heridas. La herida de un lado se dejó sin cubrir mientras que la herida contralateral se cubrió con Opsite®.

Grupo IV: No se aplicó tratamiento tópico sobre las heridas. La herida de una lado del animal se dejó sin cubrir mientras que la herida del lado contralateral se cubrió con Opsite®.

Análisis de las heridas

Los animales se sacrificaron en el día 9 del experimento. Las heridas se escindieron hasta la capa muscular, incluido un margen de 0,5 mm de piel no dañada, y se sumergieron en una solución tamponada de formalina al 10%. Las muestras se enviaron a un laboratorio de histología para su procesamiento. Las muestras se incluyeron en parafina, y la porción media de la herida se cortó en secciones de 5 \mum. Los portaobjetos se tiñeron con hematoxilina y eosina o con tricrómico de Masson para su estudio histológico.

Se dio a cada porta una puntuación histológica variando entre 1 y 15, con 1 para no curación y 15 para cicatriz con fibras de colágeno organizadas (Tabla 1). La escala de puntuación se basó en las escalas usadas por investigadores anteriores. Los criterios usados anteriormente se modificaron y se definieron a posteriori para reflejar de forma más precisa la extensión de: la reepitelización, el grado de invasión celular, la formación de tejido de granulación, el depósito de colágeno, la vascularización y la contracción de la herida. Al menos tres analistas asignaron, por separado, la puntuación histológica. El código que describía el tratamiento de las heridas se destruyó después de que todos los observadores completaran la puntuación.

2

Análisis estadístico

Se hizo la media de los valores de las puntuaciones histológicas de los analistas y se expresaron como la media \pm el error estándar de la media.

Se usó el test t para muestras apareadas para comparar medias apareadas en los distintos grupos de tratamiento. Los análisis se realizaron usando el paquete software estadístico RS/t Release 3.0 (BBN Software Products Corporation).

Las diferencias de las medias de las muestras se ensayaron para el análisis de la varianza usando el Sistema Statistical Analysis Software (SAS).

Resultados Efecto de la FG sobre el cierre de heridas (Grupo I)

En el Grupo I ambas heridas en cada ratón se recubrieron con Opsite®. En estas condiciones, la aplicación tópica de FG con una concentración proteica de 60 mg/ml en un solo lado del animal dio como resultado puntuaciones histológicas medias significativamente menores (3,06) para el lado con FG comparado con las heridas no tratadas (5,26) (P<0,005) (Tabla 2).

4

Efecto de la FG diluida sobre el cierre de heridas (Grupo II)

En este grupo, en que ambas heridas emparejadas se cubrieron con Opsite®, la aplicación tópica de FG diluida (concentración proteica de 1 mg/ml) dio como resultado una puntuación histológica media (4,0) que no fue estadísticamente diferente de la de las heridas no tratadas (4,36) (P=0,17) (Tabla 3).

5

Efecto de Opsite® sobre heridas tratadas con FG (Grupo III)

En este grupo de heridas emparejadas, tratadas ambas con FG con una concentración proteica de 60 mg/ml, la aplicación de Opsite® en un lado dio como resultado una puntuación histológica media (4,2) que no era estadísticamente diferente de la de heridas que se dejaron sin cubrir (4,93) (P=0,11) (Tabla 4).

6

Efecto de Opsite® sobre el cierre de heridas no tratadas emparejadas (Grupo IV)

En este grupo de heridas emparejadas que no recibieron tratamiento tópico con FG, la aplicación de Opsite® en un lado dio como resultado una puntuación histológica media significativamente menor (4,92) en comparación con la de heridas que se dejaron sin cubrir (6,31) (P<0,0005) (Tabla 5).

El ANOVA de los efectos del tratamiento sobre las diferencias en la media de las muestras fue significativo a <0,0001.

7

Discusión

Los resultados de este estudio indicaron que en ratones (1) cuando se aplicó sobre heridas abiertas, la FG a una concentración formulada para la hemostasis (60 mg/ml) dio como resultado puntuaciones histológicas menores en el día 9, lo que indicó tasas más lentas de curación de heridas en comparación con las de heridas no tratadas; (2) la dilución de la concentración proteica de la FG a 1 mg/ml dio como resultado una puntuación histológica mayor en el día 9, lo que indicó una tasa más rápida de curación de la herida; y (3) la aplicación de un vendaje semipermeable (Opsite®) en sí retrasó significativamente el cierre de la herida por sí sola en este modelo animal.

La concentración proteica total de la FG constituye una variable importante cuando se comparan los resultados de estudios usando FG. Se ha informado de los efectos beneficiosos de la fibrina promoviendo la curación de heridas y la reparación tisular, pero en los presentes estudios se han usado concentraciones de fibrinógeno más bajas que las que se suelen encontrar en las preparaciones comerciales.

La FG a una concentración de 60 mg/ml retrasó el cierre de la herida (Grupo I). La concentración de proteína total de la FG que se encuentra disponible en el mercado en Europa, tras la mezcla de los componentes de fibrinógeno y trombina, es de 37,5 a 57,5 mg/ml. Estos datos indican que la FG tal como se encuentra formulada en la actualidad para indicaciones hemostáticas y adhesivas retrasa la curación cuando se aplica sobre heridas abiertas. Este efecto puede ser debido (1) a la obstrucción mecánica de la migración o proliferación de elementos celulares que participan activamente en el proceso de curación de las heridas, (2) a la inhibición mecánica de la contracción de la herida o (3) a un efecto inhibitorio químico, por uno o más componentes de la FG, de la curación de las heridas. La obstrucción mecánica y la inhibición del cierre de la herida pueden ser la explicación más posible, ya que en el día 9 persiste un coágulo sólido con base de fibrinógeno sobre la superficie de la herida.

Con objeto de ayudar a determinar si esta era la causa, la concentración de proteína total de la FG se diluyó hasta 1 mg/ml. La aplicación tópica de esta FG diluida dio como resultado una puntuación histológica que no era significativamente diferente de la de heridas no tratadas (Grupo II), sugiriendo que concentraciones de proteína total más bajas no inhibían significativamente el proceso de curación de heridas.

También merece la pena fijarse en que la puntuación histológica media de las heridas recubiertas tratadas con las mismas concentraciones de FG (60 mg/ml) pero que pertenecían a distintos grupos de tratamiento (Grupos I y III) tenían valores significativamente diferentes (3,06 para el Grupo I frente a 4,2 para el Grupo III). Estos datos demuestran que la variación de un animal a otro hace difícil el sacar conclusiones definitivas a partir de distintos animales sometidos a las mismas variables de tratamiento, porque algunos animales pueden curar más rápido o más despacio que otros a pesar de recibir el mismo tratamiento. Esto se refleja en el intervalo de los errores estándar para las puntuaciones medias. Por esta razón, cada animal sirvió como su propio control, por ejemplo, las heridas en el mismo animal se compararon entre ellas. Teniendo las heridas control en el mismo animal que las heridas del ensayo, se minimizaron los efectos de la variabilidad interanimal. Estos datos muestran también que un vendaje adhesivo como Opsite® retrasó significativamente el cierre de la herida. Debería señalarse, sin embargo, que en heridas de la piel de espesor parcial, en cerdos, la concentración proteica de la FG no parecía estar relacionada con la tasa de curación de la herida.

B. FG suplementada con factores de crecimiento sobre la curación de heridas in vivo *

Se evaluó el efecto de FG suplementada con el factor de crecimiento HBGF-1B sobre la tasa de reparación de heridas en ratones diabéticos. Los procedimientos usados en este experimento fueron similares a los que se acaban de describir más arriba. Se rellenaron dos biopsias de 6 mm de piel en la totalidad de su espesor, de la parte dorsal de cada uno de los 6 ratones del ensayo con FG a la que se habían añadido 5 \mug de HBGF-1\beta. Se dejaron sin tratar idénticas biopsias en seis ratones y, en seis ratones control, se rellenaron con FG sin suplementar. Tras 9 días, todos los ratones se sacrificaron y se realizaron preparaciones histológicas de cortes de 5 micras de grosor de cada una de las heridas y la piel circundante y se tiñeron con hematoxilina y eosina.

La extensión de la reparación de la herida en cada muestra, que no estaba identificada por el grupo de tratamiento del que provenía, fue evaluada "ciegamente" por cada uno de los tres experimentados analistas, que valoraron el depósito de colágeno, la reepitelización, el grosor del tejido de granulación y la densidad de células inflamatorias, fibroblastos y capilares. Cada muestra se puntuó de 1 a 15, yendo de ausencia de reparación a reparación completa. Las muestras de las heridas tratadas con FG sin suplementar recibieron de forma consistente las puntuaciones más bajas y aquellas procedentes de las heridas no tratadas o heridas tratadas con FG suplementada con el factor de crecimiento recibieron las puntuaciones más altas.

Ejemplo 11 * FG como vehículo para la administración de sustancias osteoinductoras in vivo Materiales y procedimientos Sellante de fibrina

Se produjo TFC humano concentrado (Baxter Hyland Division, San Pedro, CA) y trombina humana (Baxter Hyland Division, Glendale, CA) para la American Red Cross a partir de una mezcla de plasma humano fresco congelado cribado. Se llevó a cabo la inactivación de virus en ambos componentes, usando el procedimiento que emplea detergentes y disolventes (New York Blood Center), durante su producción y se suministraron en forma de liofilizados. Tras la reconstitución con 3,3 ml de agua estéril, las características proteicas de la solución de TCF eran: proteínas totales = 120 mg/ml; fibrinógeno = 90 mg/ml; fibronectina = 13,5 mg/ml; Factor XIII = 17 UI/ml; y plasminógeno = 2,2 ug/ml.

La trombina humana (vial de 1000 U) se reconstituyó con 3,3 ml de agua estéril, y se realizaron diluciones seriadas en una solución de cloruro cálcico 40 mM (American Regent Laboratories, Shirley, NY) hasta una concentración de 15 U/ml. La trombina humana se usó para preparar discos que se implantaron en defectos de la bóveda cra-
neal.

La trombina bovina tópica (vial de 5000 U, Armour Pharmaceutical Co., Kankakee, IL) se reconstituyó con 5 ml de agua estéril y se realizaron diluciones seriadas en una solución de cloruro cálcico 40 mM hasta una concentración de 15 U/ml. La trombina bovina se usó para preparar implantes para el bioensayo intramuscular.

En la práctica de esta forma de realización de esta invención el fibrinógeno debería estar presente a una concentración entre 1 y 120 mg/ml de FG, más preferentemente entre 3 y 60 mg/ml de FG, más preferentemente aún entre 10 y 30 mg/ml de FG. La DBM debería estar presente en una concentración aproximada entre aproximadamente 1 y 1000 mg/ml de FG, más preferentemente entre 50 y 500 mg/ml de FG, más preferentemente aún entre 300 y 500 mg/ml de FG. El tamaño de las partículas del hueso desmineralizado en polvo debería estar entre 0,01 y 1000 micras, preferentemente entre 20 y 500 micras y más preferentemente aún entre 70 y 250 micras. El(los) factor(es) de crecimiento osteoinductor(es) o las BMP debería(n) estar presente(s) en una concentración(ones) entre aproximadamente 1 y 100 \mug/ml, en la que la(s) concentración(ones) es(son) eficaz(ces) para cumplir con el propósito deseado. Los factores de crecimiento que se pueden usar como sustancias osteoinductoras en esta forma de realización incluyen, pero no se encuentran limitados a: osteogenina (BMP-3); BMP-2; OP-1; HBGF-1; HBGF-2; BMP 2A, 2B y 7; FGF-1; FGF-4; y TGF-\beta. Además, se pueden usar fármacos, como antibióticos, para suplementar el TS para su uso en la reparación de huesos.

Preparación de los implantes

La DBM de rata se preparó tal como se indica a continuación. Se retiraron las epífisis de huesos largos de ratas, dejando solamente las diáfisis. Las diáfisis se partieron, si fue necesario, y la médula ósea se limpió bien con agua desionizada (Milli-Q Water Purification System®, Millipore Corporation, Bedford, MA). A continuación, las diáfisis se lavaron a temperatura ambiente. Se añadieron, a 4ºC, 1000 ml de agua desionizada a 100 g de hueso. La mezcla se agitó durante 30 minutos y el agua se decantó. Esta etapa se repitió durante dos horas.

Se añadió, a 4ºC, un litro de etanol absoluto frío (Quantum Chemical Corporation, U.S.I. Division, Tuscola, IL) por cada 100 g de hueso. Tras agitar durante 15 minutos, el etanol se decantó. Esto se repitió cuatro veces durante el total de una hora de duración.

Bajo una campana extractora, se añadieron al hueso 500 ml de éter dietílico (Mallinckrodt Speciality Chemicals, Paris, KY) para cubrirlo. Se agitó suavemente durante 15 minutos y a continuación el éter se decantó. Se añadieron 500 ml más de éter al hueso y la mezcla se agitó durante 15 minutos. El éter se decantó de nuevo. El hueso se dejó bajo la campana extractora para que se evaporase el éter. El hueso desengrasado se puede almacenar indefinidamente en un ultracongelador (-135ºC).

A continuación, el hueso se molió para hacer hueso en polvo. Los polvos se tamizaron y se recogieron partículas de 74 a 420 micras de tamaño.

Se pusieron alícuotas de hueso en polvo de diez gramos en botes de centrífuga de 250 ml. Se añadieron ocho ml de HCl 0,5 N a cada bote lentamente con objeto de evitar hacer espuma. A continuación, los contenidos de cada bote se agitaron suavemente. Tras 15 minutos, se añadieron 100 ml más de HCl 0,5 N a cada bote a lo largo de 10 minutos. A continuación, los botes se agitaron suavemente durante 35 minutos más. El tiempo total que estuvieron los polvos en el HCl no excedió una hora.

A continuación, cada mezcla se centrifugó a 3000 rpm a 4ºC durante 15 minutos. Se comprobó entonces el pH del sobrenadante. Si el pH era mayor de 2, el sobrenadante se vertió en un fregadero para productos químicos sin agitar el(los) sedimento(s). Si el pH del sobrenadante era menor de 2, el sobrenadante se tiró en un recipiente para residuos peligrosos. Si el(los) sedimento(s) estaba(n) suelto(s), el tiempo de centrifugación se incrementó hasta 30 minutos. Estas etapas se repitieron hasta que el pH del sobrenadante era igual que el de HCl 0,5 N.

A continuación, los sedimentos se lavaron con 180 ml de agua desionizada, agitándolos para dar una suspensión uniforme. A continuación, la suspensión se centrifugó durante 15 minutos más. El sobrenadante se decantó entonces al igual que anteriormente. El lavado se repitió hasta que el pH de los sobrenadantes igualó el pH del agua desionizada.

Los sedimentos se congelaron entonces a -180ºC en un congelador. Se liofilizaron, a continuación, siguiendo procedimientos estándar.

Se generaron implantes en forma de disco de 1 mm de grosor y 8 mm de diámetro usando un molde de aluminio de 4 piezas (Figura 13). Se añadieron veinticinco mg de DBM de rata en polvo a la cámara del molde. Se pipetearon entonces treinta \mul de TFC sobre la DBM y se mezclaron hasta que la DBM hubo absorbido toda la solución. Las concentraciones de TFC que se usaron fueron 10, 20, 40, 80 ó 120 mg/ml. Se añadieron a continuación treinta \mul de solución de trombina (15 U/ml en una solución de cloruro cálcico 40 mM) al complejo de DBM-TFC, se mezcló todo y se comprimió en forma de disco usando un cabezal en forma de pistón. Se determinó que 25 mg de DBM en polvo tenían un volumen de 20 \mul. Tras añadir la DBM a la FG, las concentraciones finales de proteína eran las siguientes:

8

Los implantes en forma de disco compuestos de DBM sola o FG sola (concentraciones de proteína totales 4, 8, 15 y 45 mg/ml) se prepararon asimismo usando el mismo molde.

Se vertieron cincuenta mg de DBM en un molde de aluminio, en el que se añadieron a continuación 60 \mul de TFC a la DBM y se mezclaron hasta que se absorbió completamente. Se añadieron, a continuación, sesenta \mul de trombina al complejo DBM-TFC, se mezclaron y todo ello se comprimió en forma de disco con un diámetro de 1 cm y un grosor de 2 mm, usando un cabezal con forma de pistón. A continuación el disco se cortó a mano para darle la forma deseada (triángulo, cuadrado o disco perforado).

Para el experimento de bioensayo intramuscular, los implantes se colocaron en una bolsa de nylon estéril con un tamaño de malla de 70 micras y que medía 1 cm x 1 cm.

Animales

Se adquirieron ratas macho Long-Evans en los Charles River Laboratories (Wilmington, MA). Para el bioensayo intramuscular, se usaron ratas de 28 a 35 días de edad. Para los experimentos con craneotomías se usaron ratas de tres meses de edad.

Cirugía

Los animales se anestesiaron con una mezcla que consistía en 10 ml de clorhidrato de ketamina (Vetalar, 100 mg/ml, Parke-Davis, Morris Plains, NJ), 5 ml de xylazina (Rompun, 20 mg/ml, Mobay Corporation, Shawnee, KN), y 1 ml de salino fisiológico (NaCl al 0,9%), a una dosis de 0,1 ml por 100 g de peso corporal, administrada por vía intramuscular. El campo quirúrgico del animal se preparó con una solución de alcohol al 70%, seguida de una solución de povidona yodada. A continuación, se realizó el procedimiento quirúrgico usando una técnica asépti-
ca.

Bioensayo intramuscular. Se realizó una incisión ventral media y se creó un espacio entre los músculos pectorales mediante disección con un instrumento romo. Se insertó en el espacio intramuscular una envuelta de nylon que contenía el material experimental indicado y se aseguró mediante una sutura con Dexon de 3-0 (Figura 14). A continuación, se repitió el mismo procedimiento en el lado contralateral. La piel se cerró a continuación con grapas. Los implantes se retiraron tras cuatro semanas, se realizaron radiografías y preparaciones histológicas.

Los implantes en forma de disco se colocaron de forma aleatoria y consistieron en: DBM sola (n = 12); FG sola a distintas concentraciones (4 mg/ml, n = 14; 8 mg/ml, n = 3; 15 mg/ml, n = 3; y 45 mg/ml, n = 12), y complejo de DBM-FG (4 mg/ml, n = 12; 8 mg/ml, n = 12; 15 mg/ml, n = 12; y 45 mg/ml, n = 12). Había cuatro de cada uno de los implantes en forma de cuadrado, triángulo y disco perforado.

Procedimiento para la craneotomía. Se realizó una incisión lineal a partir del hueso nasal hasta la cresta sagital media. Los tejidos blandos se apartaron suavemente y se diseccionó el periostio del lugar de la craneotomía (huesos occipital, frontal, parietal). Se realizó una craneotomía de 8 mm con un trépano con una pieza de mano giratoria de baja velocidad con una abundante irrigación salina a demanda. El disco de bóveda craneal se disecó completamente, evitando las perforaciones durales y la invasión del seno sagital superior. El defecto en la bóveda craneal de 8 mm se dejó sin tratar como control o bien se rellenó con un disco de 1 x 8 mm de DBM o DBM-FG (Figura 15). A continuación, la piel se cerró con grapas para piel.

Tras la cirugía, cada rata se identificó mediante perforaciones en las orejas y se devolvieron a sus jaulas en las que estuvieron de forma ambulatoria durante 2-3 horas.

El primer grupo de implantes de bóveda craneal consistió en DBM sola (25 mg, n = 3) o DBM en una matriz de FG (15 mg/ml, n = 2; 30 mg/ml, n = 3; y 45 mg/ml, n = 3), y se recuperaron al cabo de 28 días. El segundo grupo de implantes de bóveda craneal consistió en 25 mg de DBM en una matriz de FG de 30 mg/ml y se recuperaron a distintos tiempos en el postoperatorio (28 días, n = 10; 3 meses, n = 9; y 4 meses, n = 5).

Recuperación de los implantes

En los tiempos indicados, las ratas se sacrificaron en una cámara de dióxido de carbono. Se realizó una incisión en la piel alrededor del lecho receptor experimental (es decir, el pectoral mayor o la bóveda craneal) y los tejidos blandos se apartaron de los lechos receptores. En localizaciones ortotópicas, se recuperaron las craneotomías con 3-4 mm de hueso contiguo del complejo fronto-occípito-parietal. En localizaciones heterotópicas, se usó una disección con instrumentos afilados y romos para recuperar las envueltas de nylon implantadas.

Radiografía

Se realizaron radiografías de los implantes usando la película de rayos X de alto contraste de Kodak X-OMATL® (Eastman Kodak Company, Rochester, NY) en un sistema de rayos X Minishot Benchtop Cabinet (TFI Corporation, West Haven, CT) a 30 kvp, 3 Ma y 10 segundos. Se analizaron las densidades de niveles de gris de las radiografías de las localizaciones intramuscular y de craneotomía usando un Cambridge 920 Image Analysis System® (Cambridge Instruments Limited, Cambridge, England).

Estudio histológico

Todas las muestras recuperadas (tejidos blandos y duros) se pusieron inmediatamente en viales adecuadamente etiquetados que contenían una solución conservante y se enviaron a un laboratorio histológico para su procesamiento. Las muestras histológicas eran cortes de 4,5 micras de grosor a través del diámetro coronal. Para cada localización receptora, se preparó una sección con una tinción con hematoxilina y eosina (para fotomicrografía y el examen de los detalles celulares y estromales) y la otra sección se preparó con una tinción de von Kossa.

Resultados Radiografías de los implantes intramusculares

Todos los discos de DBM presentaron imágenes radioopacas. Cuarenta y cinco de los 48 discos de DBM-FG implantados (93,75%) eran radioopacos. Todos los discos de DBM-FG, sin tener en cuenta la concentración proteica (4-45 mg/ml) indujeron radioopacidad (Figura 16). Las determinaciones de radioopacidad de algunos discos de DBM (Figura 16) fueron mayores que las de discos de DBM-FG pero las determinaciones de éstos estaban bien dentro del intervalo de determinaciones para los discos de DBM-FG. Treinta de los 32 discos que no estaban suplementados con DBM (93,75%) no desarrollaron radioopacidad.

Los discos de DBM-FG en forma de cuadrados, triángulos o discos perforados también eran notablemente radioopacos comparado con los discos de FG que no estaban suplementados con DBM. Las formas originales de los implantes, en general, se mantuvieron.

Histología de los implantes intramusculares

El bioensayo intramuscular fue positivo para los implantes de DBM y de DBM-FG, tal como evidenció la formación de osículos con una cavidad central rellena de médula y resorción de las partículas de DBM previamente implantadas.

Radiografía de los implantes de bóveda craneal

Los rayos X mostraron que los implantes de DBM en una matriz de FG eran en general más radioopacos que los implantes de DBM sola o los controles no tratados. No había una diferencia notable discernible entre distintas concentraciones de FG usadas para administrar la DBM. Las radiografías de defectos de la bóveda craneal de 8 mm de diámetro no tratados mostraron una cantidad insignificante de radioopacidad.

El segundo grupo de implantes de bóveda craneal usando DBM en una matriz de FG a 30 mg/ml mostró un incremento notable de la radioopacidad en las heridas de craneotomía de la bóveda craneal a los 3 ó 4 meses en comparación con la bóveda craneal a los 28 días (Figura 17).

Histología de los implantes de bóveda craneal

La heridas de craneotomía de 8 mm no tratadas mostraron solamente el desarrollo de tejido conectivo fibroso a través de la herida de craneotomía (Figura 18). La histología de los implantes de DBM mostró la presencia de partículas de DBM dispersas por todo el campo. Algunas de las partículas de DBM migraron sobre y por debajo de los bordes del hueso del huésped (Figura 19). La mayoría de las partículas de DBM estaban, sin embargo, dentro de los confines de la herida de la craneotomía y estaban rodeadas de tejido conectivo laxo que estaba bien vascularizado. Se observó resorción activa de DBM por los osteoclastos. También se observó que muchas de las partículas de DBM estaban pobladas por células vivas. Eran bastante evidentes osteoides y hueso nuevos depositados por los osteoblastos.

La histología de los implantes de DBM en una matriz de FG mostró partículas de DBM localizadas en el interior de la herida de craneotomía, rodeadas de tejido conectivo mucho más denso y más celular (Figuras 20 y 21). La matriz osteoide y la formación de trabéculas óseas eran bastante evidentes. Se observó que se había formado más médula ósea en las heridas de craneotomía en las que se habían implantado discos de DBM-FG que en las que se habían implantado discos de DBM sola. También había una mayor vascularización con discos de DBM-FG que con implantes de DBM sola o que en los controles no tratados. La regeneración ósea era evidente en todas las concentraciones de FG usadas para administrar la DBM.

Discusión

La biocompatibilidad y la biodegradabilidad natural de la FG son características que la hacen un vehículo ideal para la administración de DBM y BMP. La FG facilitó el darle la forma deseada a la DBM para rellenar defectos óseos, mantuvo la DBM en el interior del defecto y puede haber tenido un efecto sinérgico con la DBM. Además, no se produjo prolapso de tejidos blandos y se mantuvo el contorno óseo. La FG suplementada con DBM tenía una microarquitectura, un perfil de degradación y una cinética de liberación adecuados para dar soporte al reclutamiento de osteoblastos y a la regeneración ósea.

En conjunto, los datos indicaron que la DBM administrada en FG, a cualquiera de las concentraciones proteicas de FG ensayadas, indujo tanta formación de hueso como la DBM sola. Además, cuando la DBM se configuró con la FG en una forma preoperatoria concreta, el hueso inducido mantuvo en gran medida la forma original en el postoperatorio.

Ya que la forma de la matriz de DBM-FG determinó la morfología del hueso nuevo formado, cuando sea posible, la matriz de DBM-FG debería realizarse confiriéndole una forma predeterminada. Sin embargo, la matriz de DBM-FG en forma de líquido se puede administrar o inyectar en un defecto con una forma irregular, en el que polimerizará y estimulará la formación de hueso en el área rellena con DBM-FG.

Ejemplo 12 Liberación de antibióticos (AB) a partir de FG e incremento de la longevidad de FG suplementada con AB Procedimientos A. Preparación de AB-FG 1. TET en forma de base libre

Se inyectaron tres ml y medio de agua para inyección en un vial con concentrado de fibrinógeno tópico (TFC) humano liofilizado, suministrado por la American Red Cross. La concentración proteica de la solución resultante era aproximadamente de 120 mg/ml.

El concentrado de trombina liofilizado, suministrado por la American Red Cross/Baxter-Hyland, Inc., Glendale, CA, se reconstituyó con 3,5 ml de una solución de cloruro cálcico 40 mM preparada en agua para inyección. La solución resultante contenía aproximadamente 250 U/ml.

La TET-FG se formuló mezclando el peso deseado de TET con 1 ml de solución de TFC reconstituido y con 1 ml de solución de trombina reconstituida en presencia de cloruro cálcico con calidad para inyección (adquirido en la American Reagent, Shirley, NY). La TET estaba en forma de base libre y se compró a Sigma Chemical Company (St. Louis, MO). La TET-FG se formó mezclando TFC y trombina con la ayuda de un dispensador Duoflo® (Hamaedics, CA) sobre una membrana Millipore en una placa de cultivo Millipore de 12 mm de diámetro (Millipore Corporation, Bedford, MA). Se dejó que la mezcla se asentase durante una hora a 22ºC. De esta última, se recortaron discos de seis mm de diámetro que contenían la TET-FG y la membrana Millipore, realizando una biopsia en sacabocados de 6 mm. Los discos que contenían TET-FG se usaron para los estudios de liberación de TET.

La liberación de TET a partir de TET-FG a tampón fosfato salino (PBS) o saliva se midió usando placas de cultivo celular de 24 pocillos (Corning Glass Works, Corning, NY) en dos grupos distintos de condiciones. En una condición, el modo estático, se cambiaron a diario 2 ml de PBS o 0,75 ml de saliva en las placas de cultivo celular de 24 pocillos. En la otra condición, el modo de intercambio continuo, la liberación de TET a partir de la TET-FG se midió con PBS que había cambiado a una tasa de aproximadamente 3 ml al día. Las muestras se almacenaron a -20ºC hasta que se analizaron. La saliva se había recogido de 10 personas diferentes, se había juntado, y se había aclarado por centrifugación a 5000g. A continuación, se filtró a través de una membrana con un tamaño de poro de 0,45 \mum y se almacenó a 4ºC para su uso diario.

Con objeto de medir la concentración y la actividad biológica de la TET liberada a partir de los discos de TET-FG, la TET eluida se descongeló y se analizó por espectrofotometría a 320 nm y/o biológicamente por la inhibición del crecimiento de E. coli en placas de agar. Para calibrar estos ensayos, se usaron curvas patrón que cubrían concentraciones de TET de 0 a 50 y de 0 a 500 \mug/ml, respectivamente.

2. FG suplementada con ciprofloxacino HCl (CIP), amoxicilina (AMO) y metronidazol (MET).

Las FG que contenían CIP HCl, AMO o MET se prepararon al igual que anteriormente para la TET. Para monitorizar la liberación de estos AB a partir de la AB-FG correspondiente al entorno inmediato, los discos de AB-FG se dispusieron en pocillos individuales en una placa de cultivo de 24 pocillos y se recubrieron con 2 ml de PBS que se recogieron, se cambiaron a diario y se almacenaron a -20ºC al igual que anteriormente, hasta que se analizaron. Las concentraciones de CIP, AMO y MET en los eluatos se midieron por espectrofotometría a 275, 274 y 320 nm, respectivamente, y se compararon con curvas patrón que contenían de 0 a 50 ug/ml del AB correspondiente.

B. Integridad estructural de AB-FG

El mantenimiento de la integridad estructural de los discos de FG y de TET-FG se estimó por observación e inspección física "removiendo" los discos con una fina espátula. La membrana porosa que se había cortado al hacer los discos permaneció unida a la TET-FG y se usó para ayudar a posicionar los discos durante la evaluación de su integridad estructural. Se tomaron también fotos de vistas desde arriba y laterales de los discos y se usaron en la evaluación.

La integridad estructural de FG y TET-FG se midió en condiciones tanto estériles como no estériles. Para los experimentos no estériles, el PBS y la saliva se almacenaron congelados hasta que se analizaron. Para los experimentos en estéril, se usó el mismo procedimiento salvo que el procedimiento al completo se realizó en condiciones estériles. La esterilidad del sistema se ensayó incubando 0,2 ml de muestra y 2 ml de caldo de cultivo a 37ºC y la turbidez del caldo de cultivo se monitorizó durante 48 horas. La falta de turbidez indicó la esterilidad del sistema. La estabilidad de CIP-, AMO- y MET-FG se estudió al igual que anteriormente pero solamente en condiciones no estériles.

C. Actividad antimicrobiana in vitro de AB liberado a partir de AB-FG

La actividad antimicrobiana del AB liberado a partir de AB-FG se estimó midiendo los diámetros de las áreas de inhibición generadas por el eluato, procedente de los discos de 6 mm de diámetro, del PBS o la saliva que rodeaban la AB-FG recogidos a diario. Los eluatos procedentes de FG no suplementada sirvieron como controles. Su usaron como patrones soluciones de AB de concentración conocida. Se usó E. coli cultivado en placas de agar para medir la actividad AB de TET, CIP y MET liberados. Para hacer las placas, se mezclaron 100 \mul de la suspensión de células bacterianas, que contenían aproximadamente 10^{6} células/ml, con 3 ml de agar a 50ºC para la capa superior y se vertió inmediatamente sobre la capa inferior, dura, de agar de la placa para crear una capa uniforme de células. Las placas se incubaron a 37ºC durante 18 horas.

Resultados A. TET 1. Datos sobre la liberación de TET

La liberación de TET a partir de discos de TET-FG al PBS circundante en los experimentos "estáticos" se midió por espectrofotometría determinando la concentración de TET alcanzada en los 2 ml de PBS que se cambiaron a diario. Las concentraciones de TET que se obtuvieron a partir de diferentes cantidades de TET que se habían incorporado a la TET-FG se muestran en la Figura 22. A concentraciones de TET en la TET-FG menores de 50 mg/ml, la liberación de TET se completó en cinco días o menos. Sin embargo, la liberación de TET a partir de discos de TET-FG que contenían concentraciones de TET de 100 y 200 mg/ml se produjo aproximadamente durante dos semanas y más de tres semanas, respectivamente. La integridad estructural de los discos de TET-FG se preservó durante tres a cinco semanas. Estos resultados demostraron que la liberación de TET era independiente de la degradación de la FG y que la tasa de liberación de TET dependió de la cantidad de TET que quedaba en los discos de TET-
FG.

Los datos de espectrofotometría que se recogieron en el experimento de intercambio continuo se muestran en la Figura 23. Estos datos indican que una liberación de TET continua a partir de un disco de TET-FG que contenía en origen una concentración de TET de 100 mg/ml de FG se produjo a lo largo de un periodo de dos semanas. El disco de FG mantuvo su integridad estructural durante este periodo de dos semanas, infra. Los datos de la liberación de TET obtenidos en el experimento de modo continuo también indicaron que la tasa de posibilidad de liberación de TET dependió de la concentración de TET restante en el disco de TET-FG.

Sin pretender a quedar ligado a teoría alguna, se cree las concentraciones de TET iniciales elevadas observadas en estos experimentos eran probablemente consecuencia de la difusión de TET desde o cerca de la superficie del disco. Esto es, cuando el TET "atrapado" en estas localizaciones se agotó, la tasa de solubilización y/o difusión disminuyó de una manera que estaba probablemente determinada por el gradiente de concentración de TET y por la forma o configuración de la FG.

La temperatura y la concentración proteica de la FG también desempeñaron un papel en la determinación de la tasa de difusión de TET a partir de los discos de TET-FG (véanse los Ejemplo 13 y 14), pero estos dos parámetros se mantuvieron constantes en estos experimentos.

La liberación de TET a la saliva a partir de TET-FG que contenía 50 y 100 mg/ml de TET se midió en experimentos estáticos determinando la concentración de TET en 0,75 ml de saliva que se reponían a diario. Estos resultados (Fig. 24) son similares a los que se obtuvieron en PBS salvo que la concentración de TET fue mayor, reflejando más probablemente el volumen menor de saliva que se usó para recoger la TET liberada. Además, la presencia de TET en la matriz de FG prolongó de nuevo de forma inesperada la integridad estructural de las matrices de TET-FG durante al menos 15 días comparado con la de los discos de FG control que habían empezado a descomponerse a los 9 días y estaban casi completamente destruidos a los 15 días (Figura 25).

2. Datos antimicrobianos de TET

Los efectos antimicrobianos sobre el crecimiento de E. coli de varias concentraciones de TET en PBS se muestran en la Figura 26. La concentración de TET detectable más baja por este procedimiento fue aproximadamente 5 \mug/ml. Estos resultados indican claramente que la TET liberada tiene actividad antimicrobiana. Estos datos de TET corroboran los que se obtuvieron por espectrofotometría e indican que la cantidad de TET incorporada a la FG determina la concentración de TET en la solución que rodea la TET-FG. Estos datos también demuestran que la cantidad de TET en la FG se puede adaptar para mantener la concentración de TET deseada en el medio que rodea a la TET-FG en la concentración de TET mínima deseada o por encima de ella.

3. Longevidad de la matriz TET-FG

La longevidad de discos control de FG y de AB-FG se evaluó por valoración visual de los discos. La membrana porosa, cortada durante la elaboración de los discos, permaneció unida a la FG y ayudó a posicionar los discos durante la evaluación de su integridad. En la Figura 25 se muestran vistas desde arriba de discos que no contenían TET (controles), y que contenían 50 o 100 mg de TET por ml de FG, en los días 0, 9 y 15. Esta figura muestra los resultados típicos, a saber, los discos control de FG se degradaron en dos semanas mientras que los discos de TET-FG permanecieron intactos, o casi intactos, durante 15 días. En experimentos adicionales, los discos de TET-FG permanecieron intactos o casi intactos durante al menos cinco semanas (datos no mostrados). No se observó ningún cambio significativo en la longevidad de la FG entre los experimentos de liberación de TET estériles y no estériles.

B. Datos de CIP, AMO y MET 1. Datos de la liberación de CIP, AMO y MET

El antibiótico liberado a partir de CIP-, AMO- y MET-FG se muestra en la Figura 27. El CIP se liberó a una tasa aparentemente constante durante aproximadamente 4 semanas y entonces la tasa disminuyó gradualmente durante aproximadamente una semana más. La liberación de AMO y MET se completó a los 3 días.

2. Actividad antibacteriana de CIP y MET

La actividad antibacteriana de CIP y MET liberados (datos no mostrados) es comparable a los perfiles determinados por espectrofotometría para discos de AB-FG idénticos.

3. Longevidad de una matriz de FG suplementada

Los resultados de CIP-FG fueron similares a los de TET-FG. Los resultados de AMO- y MET-FG fueron similares a los que se obtuvieron para el control de FG. No se observó un cambio significativo en la longevidad de la FG entre experimentos estériles y no estériles.

Discusión

Los resultados demostraron que las formas de CIP y TET poco solubles en agua proporcionan una combinación de factores que incrementan de forma significativa la carga máxima de AB, el periodo de liberación y la longevidad de la matriz de FG en el interior de la cual están mezclados. De forma alternativa, los discos de FG se pueden estabilizar sumergiéndolos en soluciones de AB como TET o CIP.

Los resultados también demuestran claramente que el AB administrado por AB-FG preservó su actividad antimicrobiana tal como se demostró por la inhibición del crecimiento de E. coli. Los resultados demostraron que el suplemento con TET y CIP de FG y otros TS puede superar la degradación de FG como factor limitativo de la administración de fármacos a partir de ella. Esto es, estos AB estabilizaron la FG de forma que sus periodos de liberación y las concentraciones de AB liberadas se pueden controlar usando concentraciones de AB en la FG. Usando estos procedimientos, se puede cargar TET y CIP en FG y su liberación se puede controlar durante un periodo de días o semanas a concentraciones antimicrobianas eficaces.

La estabilización de la FG inducida por TET y CIP se puede explotar para controlar el tiempo total de liberación no solamente de estos AB, sino también de otros fármacos o "suplementos" añadidos a la FG cuya tasa de liberación y/o duración total de la liberación dependa de la integridad de la matriz de FG.

Estos resultados tienen aplicaciones clínicas en dolencias periodontales y otras dolencias en las que la FG puede servir como sistema de liberación localizada de fármacos. La estabilización de FG inducida por TET o CIP se puede explotar para controlar el tiempo total de liberación de TET, CIP y otros fármacos o suplementos que se han añadido a las matrices de TET-FG o CIP-FG.

Ejemplo 13 Efecto de la temperatura sobre la tasa de liberación de TET a partir de FG suplementada con TET

La FG se suplementó con 50 mg/ml de TET en forma de base libre y se le dio forma de discos de 6 x 2,5 mm para este estudio. La concentración proteica de la FG se ajustó a 60 mg/ml. Los discos se dispusieron en 2 ml de PBS, pH 7,3 y se dejaron a 4, 23 y 37ºC. Para lavar los discos, el PBS se cambió cada 10 minutos, 6 veces, por 2 ml de PBS nuevo. Después de esto, el PBS se cambió cada hora durante 4 horas. Las concentraciones de TET en las muestras recogidas se determinaron por espectrofotometría frente a una curva patrón al igual que anteriormente.

Resultados y conclusiones

Los resultados demostraron que la tasa de liberación de TET era proporcional a la temperatura (Figura 28).

Ejemplo 14 Efecto de la concentración proteica de la FG sobre la tasa de liberación de TET a partir de FG suplementada con TET

Se preparó FG suplementada con una solución a 1 mg/ml de TET HCl y se le dio forma de discos de 6 x 2,5 mm para este estudio. La concentración proteica de la FG se ajustó a 60, 30 y 15 mg/ml. Cada disco se puso en 3 ml de agua destilada. El agua se sustituyó por el mismo volumen de agua cada 10 minutos, durante una total de una hora. La concentración de TET en las muestras recogidas se determinó por espectrofotometría frente a una curva patrón al igual que anteriormente.

Los datos (Figura 29) muestran que la tasa de liberación de TET era mayor a partir de la FG con la menor concentración proteica total y viceversa. Esto es, la tasa de liberación de TET era inversamente proporcional a la concentración proteica de la FG.

Ejemplo 15 Actividad antimicrobiana in vivo de AB liberado a partir de FG suplementada con AB

Para ensayar la actividad antimicrobiana de TET y CIP liberados a partir de TET- y CIP-FG, se evaluó la capacidad de estas FG suplementadas con AB para proteger a los ratones de una peritonitis inducida. De forma experimental, en el día 1, se inyectaron por vía intraperitoneal a cada uno de los 5 animales de cada grupo 0,5 ml de PBS (Grupo I), FG (Grupo II), TET-FG (Grupo III) o CIP-FG (grupo IV). La FG y AB-FG se administraron usando dispensadores Hamaedics que contenían 0,25 ml de TFC a 120 mg/ml y 0,25 ml de trombina humana a 250 U/ml. En el caso de TET- y CIP-FG, la solución de trombina contenía 50 mg del AB respectivo. En el día 2, se inyectaron a todos los animales por vía intraperitoneal 2 x 10^{8} (Experimento 1) o 4 x 10^{8} (Experimento 2) unidades formadoras de colonias (cfu) de S. aureus 202A. Resultados: (Experimento 1, Experimento 2. Animales que sobreviven 48 horas tras la infección): Grupo I, 0 y 1 supervivientes; Grupo II, 3 y 1; Grupo III, 3 y 5; y Grupo IV, 5 y 4 supervivientes. La mayoría de los supervivientes vivieron durante toda la duración del experimento (2 semanas) pero algunos perecieron o se sacrificaron intencionadamente porque estaban enfermos.

Estos datos demuestran que TET-FG y CIP-FG protegieron a los ratones de la muerte por S. aureus 202A durante al menos 48 horas tras la administración de la FG suplementada con AB.

Ejemplo 16 Administración dirigida a largo plazo de fármacos citotóxicos/antiproliferativos a partir de FG

El fibrinógeno se solubilizó con agua estéril o, para un grupo, con agua saturada con 5-FU a una concentración de 17 mg/ml. Las soluciones de trombina se hicieron con agua estéril y se diluyeron a continuación en CaCl_{2} 40 mM hasta una concentración de 15 U/ml, o bien la trombina se disolvió en CaCl_{2} 40 mM saturado con 5-FU a una concentración de 17 mg/ml.

Los coágulos de FG control no contenían 5-FU y se generaron mezclando 200 \mul de solución de TFC (a 60 mg/ml) con 200 \mul de solución de trombina (a 15 U/ml) y dejándolos durante 20 minutos para que polimerizasen. Estos coágulos se hicieron en tubos de ensayo de 12 x 75 mm y se colocaron a continuación en 10 ml de Histidina 0,05 M, NaCl 0,15 M, pH 7,3 (Tampón).

Los coágulos de FG que contenían niveles de 5-FU líquido se generaron mezclando 200 \mul de TFC (60 mg/ml + 17 mg/ml de 5-FU) con 200 \mul de solución de trombina (15 U/ml + 17 mg/ml de 5-FU) y dejándolos 20 minutos para que los coágulos polimerizasen completamente. La adición de niveles saturados de 5-FU tanto en la solución de TFC como en la de trombina alteró de alguna manera la formación del coágulo dando lugar a un coágulo translúcido en comparación con los coágulos de FG control que eran bastante opacos. Los coágulos formados eran físicamente los mismos que los que se hicieron con FG sola salvo el color. Los coágulos se formaron en tubos de ensayo de 12 x 75 mm y se pusieron a continuación en 10 ml de tampón.

Se hizo un segundo grupo de coágulos de FG que contenían una cantidad de 5-FU anhidro sólido igual a la cantidad incluida en coágulos formados con soluciones saturadas de 5-FU. Estos coágulos se formaron mediante la adición de 7 mg de 5-FU anhidro sólido a 200 \mul de TFC (60 mg/ml) y 200 \mul de trombina (15 U/ml). Se dispusieron siete mg de 5-FU en un tubo de ensayo de 12 por 75 mm. Se añadieron a continuación doscientos \mul de TFC seguidos de 200 \mul de trombina. Los 3 componentes se mezclaron después pipeteando arriba y abajo hasta que se observó una mezcla homogénea y no se pudo seguir mezclando debido a la reacción de coagulación. A continuación, los coágulos se pusieron en 10 ml de tampón histidina.

El último grupo contenía 50 mg de 5-FU anhidro sólido por coágulo. Debido al incremento de masa del 5-FU (50 mg en lugar de 7 mg) el procedimiento usado anteriormente no funcionó. En lugar de dar lugar a un coágulo homogéneo, se formó un coágulo con la mayoría del 5-FU habiéndose asentado en el fondo del tubo de ensayo. Para evitar este problema, el fondo del tubo de ensayo se revistió primero con 100 \mul de TFC (60 mg/ml) y 100 \mul de trombina (15 U/ml). Esto dio lugar a un coágulo que recubrió el fondo cóncavo del tubo de ensayo. Después, se añadieron 50 mg de 5-FU anhidro sólido a la superficie del coágulo de 200 \mul. Después de esto, se añadieron 100 \mul de TFC junto con 100 \mul de trombina. Las dos soluciones se mezclaron usando un pipeteador automático hasta que la proteína empezó a gelificar. Cuando esto se produjo, se terminó de pipetear y se dejó que el coágulo polimerizase durante 20 minutos. El producto final era un coágulo que contenía un núcleo denso de aproximadamente 50 mg de 5-FU. Como los demás coágulos, éstos se pusieron en 10 ml de tampón. La concentración proteica total final de la FG en todos los grupos era de 30 mg/ml.

Cada grupo contenía 10 replicados. Cada duplicado se incubó a 37ºC en 10 ml de tampón. El tampón se cambió por 10 ml de solución nueva a las 5, 10, 22, 33, 52, 75 y 114 horas. A continuación, se examinaron alícuotas del tampón eluido en un espectrofotómetro con la longitud de onda ajustada en 260 nm. Experimentos previos habían demostrado que el 5-FU absorbía fuertemente a esta longitud de onda, mientras que los eluatos de los coágulos de FG control no lo hicieron.

Los resultados se muestran en la Figura 30. Los coágulos control que no contenían 5-FU no dieron lecturas significativas. Los coágulos hechos con 7 mg de 5-FU tanto en forma de soluciones saturadas de 5-FU como en una cantidad equivalente de 5-FU anhidro sólido completaron su administración de 5-FU entre 5 y 10 horas, mientras que los coágulos que contenían 50 mg de 5-FU anhidro sólido continuaron administrando 5-FU durante al menos 75 horas. Los niveles máximos aparecieron, en todos los casos, en el punto de tiempo de 5 horas.

Sin pretender quedar ligado a teoría alguna, se cree que la duración de la administración de 5-FU pareció estar en función de la masa de 5-FU cargada en el gel. Como resultado, la cantidad de 5-FU administrable a partir de los coágulos que contenían 5-FU en solución estaba limitada por la solubilidad del fármaco. De este modo, la inclusión de cantidades de la forma anhidra sólida iguales a la cantidad presente en los coágulos formados a partir de líquido saturado con 5-FU dio como resultado cinéticas de administración prácticamente idénticas, mientras que la inclusión de cantidades mayores de 5-FU en la forma sólida que las que eran posibles usando la forma líquida, dieron como resultado el triplicado de la duración total de administración, y generalmente un aumento de 10 veces la duración de la administración de una concentración dada del fármaco. Se esperaría que la inclusión de cantidades aún mayores de 5-FU anhidro sólido también dieran como resultados tiempos de administración incluso mayores. En otros experimentos, hemos observado que la cantidad de 5-FU incluido en los fármacos se puede incrementar al menos 5 veces y probablemente más y que la mezcla de 5-FU-FG también se puede formular en una forma inyectable (datos no mostrados). Se esperaría además que el uso de un análogo u otra forma de 5-FU menos soluble en el medio acuoso circundante que la forma anhidra y/o con una tasa de disolución más lenta, dieran como resultado un incremento mayor de los tiempos de administración.

El resultado de este procedimiento es una administración mantenible del fármaco antiproliferativo/citotóxico 5-FU a partir de coágulos de fibrina durante al menos 10 veces más de lo posible usando el fármaco en forma acuosa. Esta tecnología (es decir, el uso de una forma sólida del fármaco, preferentemente uno con una baja solubilidad y/o tasa de disolución) debería ser aplicable generalmente sin tener en cuenta la matriz en la que están suspendidas las partículas del fármaco, o el fármaco en sí.

Ejemplo 17 * Quimiotaxis de fibroblastos en respuesta a FG suplementada con factor de crecimiento de fibroblastos y fibronectina Materiales y procedimientos Materiales

Se compró Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) a Sigma Chemical Co., St. Louis, MO. La solución antibiótica-antimicótica se compró a GIBCO (Grand Island, N.Y.). Los factores de crecimiento de fibroblastos-1 (FGF-1) y -4 (FGF-4) recombinantes fueron un amable obsequio de Reginald Kidd, Plasma Derivatives Laboratory, American Red Cross, Rockville, MD, y del Genetics Institute (Cambridge, MA), respectivamente. El factor de crecimiento de fibroblastos-2 (FGF-2, también conocido como FGF básico o FGFb) recombinante se compró a Upstate Biotechnology, Inc. (Lake Placid, NY). Todo el material de plástico necesario para el crecimiento estéril de cultivos así como los ensayos de quimiotaxis se compraron a Fisher Scientific (Newark, DE). Las membranas Millicell-PCF (12,0 \mum) se compraron a Millipore, Inc. (Bedford, MA). La heparina se compró a UpJohn Company (Kalamazoo, MI).

Cultivo celular

Se compraron fibroblastos NIH/3T3 en pase 126 a la American Type Culture Collection, Rockville, MD. Se usaron cultivos de pases 129-133 en los ensayos de quimiotaxis. Los cultivos se crecieron en DMEM suplementado con 10% de suero de ternera y aproximadamente 1% de solución antibiótica antimicótica. Se compraron fibroblastos dérmicos humanos (HDF) a Cloneics, Inc. (San Diego, CA) en pase 2. Se usaron cultivos de pases 3-5 para los ensayos de quimiotaxis. Los cultivos se crecieron en DMEM suplementado con 20% de FBS (Hyclone Laboratories, Inc., Logan, UT) y aproximadamente 1% de solución antibiótica antimicótica (Gibco, Grand Island, N.Y.).

Ensayos de quimiotaxis celular

El procedimiento usado para determinar la quimiotaxis celular fue una combinación de dos metodologías conocidas. Se usó una modificación de la cámara de Boyden como se indica a continuación: se colocaron membranas de 12.0 mm de diámetro Millicell-PCF (Millipore, Inc., Bedford, MA) (12,0 \mum) en pocillos individuales de placas de 24 pocillos para crear los compartimentos superior e inferior de quimiotaxis. Los resultados de la quimiotaxis se lograron realizando un análisis por el procedimiento del "tablero de ajedrez" para cada combinación de células y factores de crecimiento. Se usaron concentraciones que variaban entre 0,1, 1, 10 y 100 ng/ml con/sin heparina añadida (10 U/ml) para FGF-1, FGF-2 (sin heparina) y FGF-4 con todos los tipos celulares mencionados en la sección de materiales. En resumen, los cultivos se tripsinizaron y se pusieron en DMEM + 0,1% de albúmina sérica bovina (BSA) (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) durante aproximadamente una hora a 37ºC en una cámara húmeda con 5% de CO_{2}. Se añadieron de dos a 2,5 x 10^{5} células en 50 \mul por membrana al compartimiento superior del sistema de placas de 24 pocillos. Los tratamientos se añadieron tal como se ha mencionado más arriba. El ensayo se mantuvo a 37ºC en una cámara húmeda con 5% de CO_{2} durante 4 horas. Todas las combinaciones ensayadas se realizaron por triplicado. Al final de las 4 horas, las placas se sacaron del incubador y los filtros se tiñeron siguiendo el protocolo para la tinción incluido con las membranas Millicell-PCF. En resumen, se retiró el fluido que rodeaba el interior y el exterior de las membranas Millicell-PCF. Se añadió glutaraldehído al tres por ciento (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) al exterior y al interior de las membranas durante aproximadamente 20 minutos. Tras retirar el glutaraldehído al 3,0%, se añadió Triton X-100 al 0,5% (E.M. Science, Cherry Hill, N.J.) durante 5-7 minutos. Tras retirar el Triton X-100 al 0,5 %, se añadió Fisher's Hematoxylin Solution Gill's Formulation (Fisher Scientific, Newark, DE) nº 1 durante aproximadamente 10 minutos. Esta solución se lavó con agua destilada a chorro durante aproximadamente 5 minutos. Con un bastoncillo de algodón se limpió el compartimiento superior de la membrana para retirar las células que no habían migrado. Los filtros se montaron con la cara inferior hacia arriba sobre portaobjetos en una solución Crystal Mount® (Biomeda, Inc., Foster City, CA) y se contaron 10 campos por portaobjetos al azar tanto visualmente a 400 x como a 200 x usando un sistema de análisis de imágenes para automatizar el recuento de células en la cara inferior de los filtros.

Análisis por el procedimiento del tablero de ajedrez

Tal como está establecido, se llevó a cabo el análisis por el procedimiento del tablero de ajedrez para determinar la migración aleatoria y la quimiotaxis positiva y negativa. Se añadieron factores de crecimiento a los compartimentos superiores y/o inferiores para observar si las células migraban hacia el FG solo (quimiotaxis), si la migración era aleatoria sin tener en cuenta si el factor de crecimiento se había añadido al pocillo superior o inferior (quimioquinesis) o si la migración celular se producía en contra del gradiente quimiotáctico (quimiotaxis negativa).

Ensayo de migración celular a FGF liberado a partir de FG

Las cámaras de quimiotaxis y las células se usaron tal como se ha descrito arriba. Se añadieron cincuenta \mul de complejo de fibrinógeno tópico (TFC, American Red Cross, Rockville, MD) a 8 mg/ml en el fondo de placas de 24 pocillos. Se añadieron al TFC cuarenta \mul del factor de crecimiento a ensayar +/- heparina a una concentración final de 10 U/ml (FGF-1, FGF-4 con heparina, FGF-2 solo) y se mezclaron minuciosamente. Se añadieron diez \mul de trombina bovina (Armour Pharmaceutical Company, Kankakee, IL) y se mezclaron minuciosamente. Se dejó que los componentes gelificaran a temperatura ambiente durante aproximadamente 30 minutos. El volumen total en los compartimentos inferior y superior se llevó hasta 0,5 ml cada uno con DMEM + 0,1% BSA. La concentración de los FGF añadidos al TFC se ajustó para dar lugar a la concentración total deseada determinada por:

Concentración de FGF total = [mg de FGF añadidos al TFC]

[Volumen de líquido en el compartimento superior + Volumen de FG y líquido en el compartimento inferior]

El ensayo se llevó a cabo a 37ºC en una cámara húmeda con un 5% de CO_{2} durante aproximadamente 24 horas. Al cabo de las 24 horas, los filtros se retiraron, se fijaron y se tiñeron y se contó el número de células en la cara inferior del filtro tal como se ha descrito arriba.

Resultados Capacidad de migración de fibroblastos

La capacidad de fibroblastos NIH 3T3 para migrar hacia varios agentes quimiotácticos bien conocidos se determinó para asegurar que las células usadas en este ensayo guardaban esta capacidad. La fibronectina fue el agente quimiotáctico más eficaz ensayado tanto para NIH 3T3 como para HDF con respuestas máximas a 20 \mug/ml (Figuras 31, Tabla 7). A partir de entonces, se usó fibronectina a 20 \mug/ml como control positivo para la migración.

Quimiotaxis de fibroblastos NIH 3T3 hacia FGF-1

La estimulación máxima de la migración de fibroblastos NIH 3T3 por FGF-1 se observó a 10 ng/ml en presencia de 10 U/ml de heparina (Figura 32). El análisis por el procedimiento del tablero de ajedrez reveló que FGF-1 era quimiotáctico para células NIH 3T3 (Tabla 8).

Quimiotaxis de fibroblastos NIH 3T3 hacia FGF-2

La estimulación máxima de la migración de fibroblastos NIH 3T3 por FGF-2 se observó a 1 ng/ml de FGF-2 (Figura 33). El análisis por el procedimiento del tablero de ajedrez mostró que FGF-2 era quimiotáctico para células NIH 3T3 (datos no mostrados).

Quimiotaxis de fibroblastos NIH 3T3 hacia FGF-4

La estimulación máxima de la migración de fibroblastos NIH 3T3 por FGF-4 se observó a 10 ng/ml (Figura 34). El análisis por el procedimiento del tablero de ajedrez reveló que FGF-4 era quimiotáctico para células NIH 3T3.

Quimiotaxis de HDF hacia FGF-1

La estimulación máxima de la migración de HDF por FGF-1 se observó entre 1 y 10 ng/ml (Figura 35). El análisis por el procedimiento del tablero de ajedrez mostró que FGF-1 era quimiotáctico para HDF (Tabla 9).

Quimiotaxis de HDF hacia FGF-2

La estimulación máxima de la migración de HDF por FGF-2 se observó a 10 ng/ml (Figura 36). El análisis por el procedimiento del tablero de ajedrez reveló que FGF-2 era quimiotáctico para HDF (datos no mostrados).

Quimiotaxis de HDF hacia FGF-4

La estimulación máxima de la migración de HDF por FGF-4 se observó a 10 ng/ml (Figura 37). El análisis por el procedimiento del tablero de ajedrez mostró que FGF-4 era quimiotáctico para HDF (datos no mostrados).

Migración de fibroblastos dérmicos humanos hacia FGF-1, -2 y -4 incorporados en FG

La respuesta migratoria máxima a FGF liberado a partir de FG se obtuvo con FGF-4 incorporado y a una concentración total en FG de 1 ng/ml (Figura 38). Se obtuvieron también resultados similares cuando se incorporaron FGF-1 y FGF-2 en la FG (datos no mostrados) salvo que la concentración de FGF-2 que provocó el pico de respuesta quimiotáctica fue 0,01 mg/ml.

9

10

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

11

Discusión

Los FGF produjeron una profunda respuesta quimiotáctica en HDF. Se obtuvo, para cada ensayo quimiotáctico realizado con HDF, una distinción muy buena entre el control negativo y la concentración de FGF que producía una respuesta migratoria máxima: 18, 12 y 10 veces en respuesta a FGF-1, -2 y -4, respectivamente.

La estimulación de la quimiotaxis por factores de crecimiento no fue tan alta en células NIH 3T3 como lo fue en HDF, debido posiblemente al elevado número de pases del surtido disponible de cultivos de células NIH 3T3 en comparación con los HDF.

Se observó que FGF-1, FGF-2 y FGF-4 eran potentes estimuladores de la quimiotaxis de fibroblastos. La migración dirigida de fibroblastos por uno o una combinación de los factores de crecimiento anteriores podría dar como resultado la presencia de fibroblastos en el lugar del daño, llevando así a fibroplasia y depósito de colágeno y matriz extracelular. De este modo, aparte de sus propiedades angiogénicas bien conocidas, los FGF pueden desempeñar un papel en la curación de heridas, actuando tanto solos como en combinación con PDGF, IGF-1, TGF-\beta y/u otros factores.

Estudios previos acerca del uso de FGF para acelerar la curación de heridas no han alcanzado resultados significativos (Carter y col., 1988). Esto puede ser debido a la necesidad de una exposición prologada de las células a los factores in vivo para una respuesta máxima (Presta y col., Cell Regul. 2: 719-726 (1991) y Rusnati y col., J. Cell. Physiol. 154: 152-161 (1993)). Desgraciadamente, es difícil administrar factores de crecimiento en heridas durante periodos de tiempo tan largos en condiciones que no interfiriesen con el proceso de curación.

La invención de los solicitantes de incorporar FGF en FG permite la exposición prolongada de células a los FGF y se puede aplicar a una herida. El revestimiento de fibrina resultante mimetiza la respuesta natural al daño tisular, mientras se libera el factor de crecimiento directamente en el sitio de la herida. En un estudio previo de los solicitantes, se usó FG que contenía FGF-1 para revestir injertos vasculares artificiales (Ejemplo 8 de este documento). Cuando estos injertos se situaban en el interior de los vasos de conejos, el FGF-1 se liberaba durante un periodo de hasta 28 días. En más estudios que implicaban injertos caninos, el efecto de la incorporación de FGF-1 en las paredes del injerto era la endotelización total de los injertos en el mismo periodo (Greisler y col., Surgery 112: 244-255 (1992)). De este modo, esta forma de aplicación puede producir un profundo efecto biológico in vivo. En este estudio, los Solicitantes han demostrado que los fibroblastos pueden verse atraídos hacia los FGF liberados a partir de FG. Esta propiedad será útil en el tratamiento de heridas con TS suplementados con GF.

Ejemplo 18 * Angiogénesis dirigida usando un sellante TS para administrar sustancias angiogénicas

Esta forma de realización permite la generación dirigida de nuevos vasos sanguíneos de forma controlada en el cuerpo. En esta forma de realización, el TS contiene y administra sustancias angiogénicas, como factor de crecimiento de fibroblastos-1 (FGF-1), en una cantidad de forma que su concentración liberada a partir del TS suplementado sea eficaz para inducir angiogénesis.

Esta forma de realización se usa de forma controlada para revascularizar áreas del cuerpo que han sido privadas de un aporte adecuado de sangre como el tejido cardiaco, cerebral y muscular y la retina. Esta forma de realización se usa para restaurar o mejorar la circulación a órganos implantados o a extremidades reimplantadas. Esta forma de realización se puede usar para generar una red vascular o "lecho vascular" para: la generación de órganos artificiales u organoides, la liberación y/o localización de y/o la nutrición de células usadas en terapia génica, o como diana de terapia génica, para la nutrición y/o localización de células para el aumento de un tejido. Esta forma de realización también excluye la necesidad de implantar un dispositivo o sustancia que pueda inducir una reacción de cuerpo extraño u otra reacción inflamatoria excesiva que podría comprometer la formación de vasos sanguíneos o la función del(de los) órgano(s) subyacente(s).

La invención consiste en una formulación de fibrinógeno (adecuado para la formación de fibrina), con o sin fibronectina y/o colágeno, en la que se pone una concentración adecuada de una sustancia angiogénica, como FGF-1. El fibrinógeno también puede contener estabilizantes para proteger frente a la actividad proteolítica de la trombina. En el caso de FGF-1, se puede usar sulfato de heparina (1-1000 U/ml) como estabilizante en el intervalo de concentración entre 1 ng/ml y 1 mg/ml. De forma alternativa, la sustancia angiogénica está contenida, a una concentración adecuada, en los componentes de trombina, calcio o agua. Esta formación se mezcla a continuación con trombina y se aplica rápidamente en el cuerpo en una línea que conecte las localizaciones deseadas o en un solo lugar. La mezcla de fibrinógeno-trombina polimeriza entonces para formar FG. El FGF-1, u otra sustancia angiogénica, permanece atrapado en la matriz de FG, tanto en forma libre como unido al estabilizante u otro componente de la mezcla. En una forma de realización, la concentración de FGF-1 en el TS debería estar entre 0,1 ng/ml y 1 mg/ml, más preferentemente entre 1 ng/ml y 100 \mug/ml, más preferentemente aún, entre 100 ng/ml y 10 \mug/ml. El FGF-1, u otra sustancia angiogénica, inducirá la formación de vasos sanguíneos en el cuerpo de la FG depositada. La FG se biodegradará de forma natural dejando el(los) vaso(s) sanguíneo(s) intacto(s).

Ejemplo 19 * Inducción de cartílago dirigida

Esta forma de realización permite la generación controlada de cartílago nuevo así como la regeneración guiada de cartílago dañado en el cuerpo. En esta forma de realización, el TS contiene y administra un factor(es) promo-
tor(es) de cartílago, como factores inductores de cartílago-A y/o -B (CIF-A y CIF-B, respectivamente, que también son conocidos como TGF-B_{1} y TGF-B_{2}, respectivamente) y/u otro(s) factor(es) como factor inductor de osteoide (OIF),en una cantidad de forma que la concentración del(de los) factor(es) inductor(es) que se libera a partir del TS suplementado es eficaz para inducir la formación de cartílago. En una forma de realización, la concentración de los factores inductores debería estar entre 0,1 mg/ml y 1 mg/ml, más preferentemente entre 1 ng/ml y 500 ng/ml, más preferentemente aún entre 100 y 250 ng/ml. Esta forma de realización, también puede contener fármacos, como antibióticos, y otros factores de crecimiento, como EGF, PDGF y FGFb en el TS. La sustancia inductora de cartílago se encuentra en una concentración adecuada en el(los) componente(s) fibrinógeno o trombina o calcio o agua que se usan para preparar el TS.

El TS suplementado puede estar preformado con la forma final del cartílago deseada antes de implantarlo o bien se puede implantar en el cuerpo del receptor en forma de líquido a medida que el TS se mezcla y polimeriza. La forma resultante se puede entonces esculpir tal como se desea para dar lugar a la forma necesaria de cartílago. La mezcla de TS inductor de cartílago (CI-TS) también se puede usar para revestir previamente un implante convencional, siendo el resultado un implante convencional con un revestimiento de cartílago vivo.

Usando cualquiera de las técnicas descritas más arriba, el CI-TS se implanta a continuación en el cuerpo del receptor. Esta implantación puede ser heterotópica u ortotópica. Tras un intervalo adecuado, el CI-TS es reemplazado por cartílago vivo con la forma del implante de CI-TS original.

Estos implantes se pueden usar para reemplazar cartílago dañado o perdido, o para mejorar la integración y/o función tisular de un implante artificial. Ejemplos de estos usos incluyen la sustitución o reconstitución de tejido nasal o de la oreja, la generación de una superficie articular funcional en un implante de hueso crecido in vivo, o la generación de una superficie similar en un implante artificial. La reparación de cartílago dañado por una enfermedad, como la artritis reumatoide, también se puede llevar a cabo usando el CI-TS para producir una superficie articular nueva y lisa en la articulación. Los implantes deseados en aplicaciones para rellenar espacios en cirugía plástica/de reconstrucción también se pueden formar a partir de CI-TS o se pueden revestir con CI-TS para aumentar la integración del tejido y reducir las reacciones de cuerpo extraño.

Puesto que la tecnología actual no permite la regeneración guiada de cartílago, esta invención es un avance porque permite la generación de tejido cartilaginoso necesario para mimetizar completamente la estructura natural del cuerpo. Esto tiene como resultado una mejora en la reparación articular, las articulaciones artificiales y otros implantes, tanto para aplicaciones ortopédicas como para otras aplicaciones.

Por ejemplo, esta forma de realización se puede usar: para producir implantes ortopédicos mejorados o implantes plásticos/para reconstrucción mejorados; para la reparación de articulaciones con cartílago dañado o disfuncional por una causa traumática, congénita o patológica; para producir revestimientos de implantes de marcapasos y cables para aumentar su integración tisular y para disminuir las reacciones de cuerpo extraño. También se podrían aplicar revestimientos similares a cualquier dispositivo implantable con propósitos similares.

Ejemplo 20 * Vendaje de heridas con TS incorporado

Esta forma de realización es un vendaje de heridas con TS incorporado, o venda, que contiene los componentes de trombina y fibrinógeno de la FG. El calcio se encuentra en el componente de trombina o bien en el de fibrinógeno. El componente de trombina o fibrinógeno o ambos pueden ser, pero no han de ser, suplementados con un fac-
tor(es) de crecimiento, como FGF o FGFb, un fármaco(s) como un analgésico, un antibiótico u otros fármacos, que pueden inhibir una infección, promover la curación de heridas y/o inhibir la formación de cicatrices. El(los) suplemen-
to(s) está(n) a una concentración en el TS de forma que sea(n) eficaz(ces) para su propósito deseado, por ejemplo, un antibiótico inhibirá el crecimiento de microbios, un analgésico aliviará el dolor.

La trombina y el fibrinógeno están separados el uno del otro por una membrana impermeable y ambos se encuentran recubiertos con otra de dichas membranas. La trombina y el fibrinógeno se encuentran contenidos en un gel de evaporación rápida (por ejemplo, metilcelulosa/alcohol/agua). La venda puede estar revestida en la superficie que está en contacto con el gel con objeto de asegurar que el cojinete de gel permanece en su sitio durante su uso (véase la Figura 39).

Al usarlo, se retira la membrana que separa los dos componentes, permitiendo que se mezclen ambos componentes. A continuación, se retira la membrana externa y la venda se aplica en el sitio de la herida. La acción de la trombina y otros componentes de la preparación de fibrinógeno originan la transformación del fibrinógeno en fibrina, simplemente tal como lo hacen en cualquier aplicación de FG. Esto da como resultado la inhibición natural de la pérdida de sangre y fluidos de la herida y el establecimiento de una barrera natural a la infección.

En una forma de realización similar, el componente de trombina y la película de plástico que separa el gel de trombina y el gel de fibrinógeno se puede omitir. El calcio que estaba anteriormente en el gel de trombina se puede incluir o no en el gel de fibrinógeno, según se desee. Al usarlo, la película externa de plástico impermeable se retira y la venda se aplica, tal como se ha descrito anteriormente, directamente sobre el sitio de la herida. La trombina y el calcio presentes de forma natural en el sitio de la herida inducen entonces la transformación del fibrinógeno en fibrina e inhiben la pérdida de sangre y fluido de la herida al igual que anteriormente. Esta forma de realización tiene la ventaja de ser más simple, más barata y más fácil de producir. Sin embargo, pueden existir circunstancias en las que las heridas del paciente no tengan trombina suficiente. En esos casos, se debería usar la forma de realización anterior de la invención.

Esta forma de realización es un avance sobre la tecnología actual puesto que permita la aplicación rápida de TS a una herida sin el tiempo de retraso asociado a la solubilización y la mezcla de los componentes. Su uso tampoco requiere conocimientos técnicos o experiencia. Estas características la hacen ideal para su uso en aplicaciones en el campo, como en kits para traumatismos para soldados, para trabajadores en equipos el rescate, para equipos de ambulancias/paramédicos, para bomberos, en kits de primeros auxilios para la población general y personal de las salas de urgencias en hospitales. Una versión pequeña también puede ser útil para la población general.

Ejemplo 21 * TS suplementado como revestimiento superficial para biomateriales

Esta forma de realización usa TS suplementado como revestimiento para las superficies de dispositivos ortopédicos y otros biomateriales que se van a implantar en el cuerpo de un animal. Ejemplos de estos dispositivos son catéteres urinarios, catéteres intravasculares, suturas, prótesis vasculares, lentes intraoculares, lentes de contacto, válvulas cardiacas, dispositivos de sustitución de hombro/codo/cadera/rodilla, corazones artificiales completos, etc. Desgraciadamente, estos biomateriales pueden convertirse en lugares para la adhesión bacteriana y la colonización, lo que puede llevar, eventualmente, a una infección clínica que pondrá en peligro la vida del animal. Para minimizar este problema, el biomaterial se reviste con un TS suplementado.

En esta forma de realización, el TS se puede suplementar con: un factor(es) de crecimiento, un fármaco(s), como un antibiótico; BMP; y/o células cultivadas, etc. Ejemplos de antibióticos que se pueden incorporar en el TS incluyen, pero no se encuentran limitados a: penicilinas; cefalosporinas; tetraciclinas; cloranfenicoles; metronidazoles y aminoglucósidos. Ejemplos de factores de crecimiento que se pueden incorporar en el TS incluyen, pero no se encuentran limitados a, FGF, PDGF, TGF-\beta. Ejemplos de BMP que se pueden incorporar en el TS incluyen, pero no se encuentran limitados a, BMP-1 hasta -8. También se puede añadir DBM al TS. Ejemplos de células cultivadas que se pueden incorporar en el TS incluyen, pero no se encuentran limitados a, células endoteliales, osteoblastos, fibroblastos, etc.

El(los) suplemento(s) puede(n) estar contenido(s) en el(los) componente(s) trombina, fibrinógeno, calcio o bien agua. La concentración del suplemento en el TS es adecuada de forma que sea eficaz para su propósito deseado, por ejemplo, un antibiótico inhibirá el crecimiento de microbios en el biomaterial, un factor de crecimiento inducirá el crecimiento del(de los) tipo(s) celular(es) deseado(s) en el TS y/o en la superficie del biomaterial.

Esta invención constituye una mejora para los productos biomateriales existentes, que incluyen dispositivos de titanio y aleaciones de titanio (como placas para fijación, dispositivos para la sustitución de hombro/codo/cadera/rodilla, implantes dentales oseointegrados, etc.), productos de silicona sólida (como implantes nasales Silastic), productos de silicona líquida y/o en gel (como implantes de mama e implantes testiculares), y polímeros sintéticos o naturales usados como materiales convencionales para curar heridas, que pueden tener distintas formas como monofilamentos, ensamblajes fibrosos (como algodón, papel, material textil sin tejer), películas, esponjas, bolsas, etc.

La FG se produce a partir de 3 componentes: fibrinógeno (como, por ejemplo, TFC) y trombina, pudiendo ambos estar en forma liofilizada; así como calcio. El fibrinógeno liofilizado se reconstituye en agua estéril, mientras que el componente trombina se reconstituye en una solución de cloruro cálcico. Se puede añadir un suplemento a cualquiera de los tres componentes, antes de mezclarlos. Se mezclan volúmenes apropiados del fibrinógeno y de la trombina que contiene calcio para dar lugar a la FG. La FG se aplica entonces sobre la superficie del biomaterial como un revestimiento del mismo, por ejemplo, pulverizando, pintando, etc. De forma alternativa, el implante se sumerge en la FG mientras que aún es líquida. También se puede añadir un suplemento a la FG, antes o después de revestir la superficie del biomaterial. Por ejemplo, un implante revestido con FG se pone en remojo en una solución antibiótica durante un periodo de tiempo específico, de forma que el antibiótico difunda en el TS. Otro ejemplo es el revestimiento de un dispositivo con TS después de lo cual se siembran células cultivadas sobre el revestimiento de fibrina. El revestimiento de la superficie de biomateriales, que se implantarán en un animal, con TS suplementado servirá para varios propósitos que incluyen: la inhibición de la adhesión bacteriana al biomaterial; la inhibición del crecimiento de bacterias adheridas al biomaterial; la estimulación inmune local y/o normalización; la promoción de la curación de heridas; y la promoción del injerto del biomaterial en el tejido circundante.

Claims (16)

1. Una composición de sellante de tejido suplementado que promueve la administración localizada de al menos un fármaco, que comprende:

(i) un sellante de tejido que comprende cola de fibrina, y

(ii) al menos un fármaco en forma de sólido,

en la que dicho fármaco es un analgésico, un fármaco antiproliferativo/citotóxico, un agente antiinflamatorio, un anticoagulante, un compuesto osteoinductor, un oligonucleótido, un antibiótico, un antiviral, un antifúngico, un agente antiparasitario, un anestésico, un fármaco cardiovascular, un reactivo de terapia génica, vitaminas u otros suplementos nutricionales; en el que dicha composición de sellante de tejido no contiene un factor de crecimiento.

2. La composición de sellante de tejido suplementado de la Reivindicación 1, en la que dicho fármaco es capaz de ser liberado a largo plazo.

3. La composición de sellante de tejido suplementado de la Reivindicación 1, en la que dicho fármaco está unido a un vehículo insoluble para prolongar su administración a partir del sellante de tejido.

4. La composición de sellante de tejido suplementado de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que el sellante de tejido es cola de fibrina y la presencia del fármaco estabiliza el sellante.

5. La composición de sellante de tejido suplementado de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que la composición comprende una pluralidad de dichos fármacos.

6. La composición de sellante de tejido suplementado de la Reivindicación 1, en la que la cola de fibrina comprende complejo de fibrinógeno tópico, trombina humana y cloruro cálcico.

7. La composición de sellante de tejido suplementado de la Reivindicación 1, que comprende al menos un antibiótico que es capaz de estabilizar un coágulo compuesto de cola de fibrina.

8. La composición de sellante de tejido suplementado de la Reivindicación 7, en la que el antibiótico estabilizante es tetraciclina o ciprofloxacino.

9. Un biomaterial tratado con una composición de sellante de tejido suplementado según cualquiera de las reivindicaciones precedentes.

10. El biomaterial de la Reivindicación 9, en el que el biomaterial es una prótesis vascular o un dispositivo médico implantable.

11. Uso de una composición de sellante de tejido suplementado según una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, para la preparación de un agente para el tratamiento y/o la prevención de infecciones, el tratamiento de neoplasias, la aceleración de la curación de heridas, o el tratamiento y/o la prevención de enfermedades cardiovasculares.

12. El uso de la Reivindicación 11, en el que la composición de sellante de tejido suplementado comprende un fármaco citotóxico y el agente es para el tratamiento de neoplasias.

13. El uso de una composición de sellante de tejido suplementado según una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en el que fármaco es un compuesto osteoinductor, para la fabricación de una matriz para proporcionar una estructura de andamiaje temporal en el lugar de un defecto óseo con objeto de determinar la forma y la localización de la formación de hueso nuevo, permitiendo así la osteogénesis en el lugar del defecto.

14. El uso de la Reivindicación 13, en el que el biomaterial es para prevenir el colapso del lugar del defecto óseo por los tejidos blandos.

15. Un procedimiento ex vivo para la preparación de un biomaterial tratado, comprendiendo el procedimiento la aplicación de una composición de sellante de tejido suplementado según una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, a un biomaterial.

16. El procedimiento de la Reivindicación 15, que comprende la siembra de células cultivadas sobre el sellante de tejido.