“MÉTODO DE PRODUÇÃO DE COMPOSIÇÃO PARA A REPARAÇÃO DE TECIDOS CARTILAGINOSOS” Campo da Invenção Trata-se a presente invenção de uma composição para a reparação de tecidos cartilaginosos e seu método de preparação e, de forma mais específica, de biomateriais, como, por exemplo, colágeno e fibrina, que são misturados de modo a permitir que o tecido cartilaginoso danificado seja reparado a um estado que permita o transplante sobre o tecido e a regeneração eficiente seja induzida, tornando, assim, possível reduzir o estresse relacionado à cirurgia em pessoas e animais, enquanto induz a reparação e a regeneração da cartilagem de forma eficiente e relativamente rápida e, como consequência, possibilita melhorar substancialmente a qualidade e a confiabilidade do produto, bem como dar uma boa impressão para os pacientes.
Fundamentos da Invenção Descrição da Técnica Relacionada A cartilagem articular encontrada em muitas superfícies articulares é um material extremamente escorregadio e brilhante, que funciona para reduzir o atrito e a resistência ao desgaste das articulações durante as ações das articulações.
A fricção da cartilagem articular é aumentada quando a cartilagem articular está danificada, e as cartilagens articulares tornam-se desgastadas e corroídas, causando dor e distúrbio funcional, sendo que os danos na cartilagem na articulação tornam-se osteoartrite.
As causas da lesão da cartilagem são traumas, como, por exemplo, queda, batida direta ou força de rotação, ou doenças, como, por exemplo, artrite, osteonecrose, artrite inflamatória ou osteocondrite dissecante, e os sintomas são dor, edema e travamento.
Muitos estudos para a regeneração fisiológica da cartilagem articular são realizados há dezenas de anos para tratar danos em cartilagem articular e vários tratamentos têm sido utilizados.
No entanto, de acordo com os relatórios, até agora, um tratamento comum, como, por exemplo, uma terapia física ou um tratamento com medicamentos para o tratamento de danos na cartilagem articular é utilizado porque os tecidos da cartilagem articular não podem ser regenerados.
Tratamentos cirúrgicos e não cirúrgicos são utilizados. Compressas quentes e frias e medicamentos, como, por exemplo, anti-inflamatórios não esteroides (AINEs) e injeção intra-articular de esteroides, são exemplos de tratamento não cirúrgico que apenas suaviza os sintomas e não atenua a doença. Procedimentos reparadores, como, por exemplo, desbridamento, microfratura, artroplastia por perfuração/abrasão, transplante osteocondral autólogo, implante de condrócitos e substituição da cartilagem articular são exemplos de tratamentos cirúrgicos.
Recentemente, foram feitas diversas tentativas de um tratamento cirúrgico, no qual biomateriais são aplicados sobre a região do defeito da cartilagem.
Biomateriais são compatíveis com o corpo humano e não mostram qualquer rejeição. Estes biomateriais podem substituir ou regenerar órgãos e tecidos danificados em tecidos normais e órgãos normais. Portanto, são aumentadas as atenções sobre os biomateriais que podem ser utilizados para substituir ou regenerar órgãos e tecidos danificados.
O corpo humano rejeita material estranho em seu corpo. Portanto, a substituição de uma parte de um órgão humano por outros materiais é muito difícil. Os biomateriais contribuem para o progresso da cirurgia médica porque os biomateriais têm afinidade biológica com o corpo humano.
Existem dois tipos de biomateriais, biomateriais sintéticos e biomateriais naturais, que podem ser utilizados para fabricar dispositivos médicos de implante, para diagnóstico e tratamento.
Metais, materiais inorgânicos, cerâmicas, polímeros sintéticos pertencem à classe de biomateriais sintéticos que não apresentam rejeição, mas não têm vitalidade.
Os biomateriais naturais, como, por exemplo, fibrina, colágeno, ácido hialurônico e quitosana, são desenvolvidos e comercializados.
Os materiais que formam o corpo humano e sustentam a vida são polímeros biológicos e células. Os polissacarídeos e proteínas encontrados no corpo humano são exemplos representativos. Se eles não têm rejeição imunológica, eles podem ser um estado semelhante a um estado natural e espera-se a regeneração de órgãos humanos que têm a função de crescimento.
Tecidos naturais podem ser utilizados como um biomaterial médico que pode dar funções biológicas a poliméricos sintéticos inorgânicos e materiais. A biocompatibilidade entre os tecidos circundantes e biomateriais inorgânicos transplantados no corpo humano pode ser estabelecida pelos tecidos naturais e, além disso, os tecidos naturais podem dar funções biológicas a biomateriais inorgânicos.
A fibrina biocompatível e biodegradável é utilizada como um adesivo natural e um agente anti-hemorrágico. A fibrina é absorvida em várias semanas durante a cicatrização de feridas. Tem sido relatado que a fibrina não apresenta efeitos secundários, como, por exemplo, inflamação, resposta imune, necrose do parênquima e hipertrofia das fibras.
A fibrina, pelo fato de ter uma forma de suporte natural para célula fibroblasto, tem um papel importante na cicatrização de feridas.
A concepção de produtos de fibrina foi estabelecida em 1970 e o primeiro produto industrial de fibrina foi vendido para a Europa em 1982 e é vendido até os dias de hoje. Estudos recentes provaram que a fibrina pode ser utilizada como um suporte para a engenharia de tecidos, e a otimização é realizada em vários campos da medicina, como, por exemplo, ortopedia, odontologia e neurocirurgia.
O colágeno é um grupo de proteínas e é encontrado na derme, em tendão/ligamento, vasos sanguíneos, ossos e cartilagens. Um terço da proteína total nos mamíferos é colágeno.
Mais de 20 tipos diferentes de colágeno são relatados, entre os quais a quantidade de colágeno do tipo |, que é encontrado na pele, tendão/ligamento e osso, é de aproximadamente 90% de colágeno total.
O colágeno é composto de uma tripla hélice, cujo peso molecular é 300.000 Dalton (100.000 Dalton de cada hélice). O menor aminoácido glicina é encontrado em cada terceira posição (-GXY; X e Y são quaisquer aminoácidos) da molécula do colágeno. Assim, o total de glicina no colágeno é um terço do total dos aminoácidos. O colágeno tem hidroxiprolina e o teor de hidroxiprolina é de 10% do total de aminoácidos. A hidroxiprolina é utilizada para a análise quantitativa de colágeno.
O colágeno é utilizado em vários campos da medicina, como, por exemplo, um estíptico, um curativo para feridas, vascular artificial e agente de melhoria de enrugamento. O primeiro colágeno estíptico Avitene, que tem a forma de pó extraído da pele de bezerro, foi desenvolvido em 1974 e é utilizado até agora.
Existem três formas de utilização de colágeno como uma matéria-prima. São utilizados colágeno puro, colágeno processado, que é processado através de um processo acelular/decelular do tecido, e colágeno alterado.
O colágeno puro tem baixa resistência à tensão, portanto, não é recomendado para ser utilizado para sutura, apesar da sua alta estabilidade e pureza. O colágeno tem baixa resistência à tensão e à ruptura do que outros polímeros, de modo que outros materiais como, por exemplo, glicosaminoglicanos (GAG) ou polímeros sintéticos biocompatíveis (poliácido glicólico - PGA, poliácido láctico- PLA) são adicionados ao colágeno para melhorar as suas resistências.
O colágeno tem muitas vantagens, como, por exemplo, baixa antigenicidade, alta biocompatibilidade e bioabsorbilidade, adesão de células, crescimento celular, indução de diferenciação celular, coagulação sanguínea, efeito estíptico e biocompatibilidade com outros polímeros.
No entanto, propriedades físicas e características para manutenção de volume são inferiores e o colágeno puro é caro.
A fibrina tem propriedades moderadas em termos de volume, elasticidade e adesividade, e também tem efeito estíptico. Portanto, a fibrina é um biomaterial eficaz para reparação e regeneração de tecidos cartilaginosos.
A cartilagem articular é avascular e tecido não nervoso, e tem capacidade de autocicatrização muito limitada, ao contrário do outro tecido mesenquimal. Portanto, um dos objetivos da presente invenção consiste em fornecer nutrientes que sejam utilizados para a regeneração do tecido cartilaginoso, por meio da adição de componentes de meio para o cultivo de condrócitos.
Quando o tecido de cartilagem de uma articulação está danificado, ele não pode ser regenerado normalmente no corpo. O paciente fica submetido à vida diária limitada com dor e quando se torna crônica induz a osteoartrite fatal, que torna a vida normal do paciente impossível. Existem mais de
500.000 casos de artroplastia e de cirurgia de substituição de toda articulação nos Estados Unidos e na Europa, respectivamente.
Deste modo, é necessário que haja um procedimento simples para o tratamento da região de defeito na cartilagem por meio do uso ou do transplante de biomateriais, como, por exemplo, colágeno e fibrina. Estes métodos de tratamento da região de defeito na cartilagem são muito eficazes na fase inicial da lesão da cartilagem. E quando tal tratamento é realizado na fase inicial da lesão da cartilagem, o número de pacientes que necessitam de cirurgia de substituição de joelho pode ser diminuído. Por meio deste tratamento preventivo, o número de osteoartrite também será diminuído.
No passado, não foi feita uma descrição de uma composição para a reparação de tecidos cartilaginosos por meio do uso de biomateriais, como, por exemplo, colágeno e cola de fibrina, nem de métodos para aplicá-los para tratamento.
Sumário da Invenção A presente invenção foi desenvolvida para resolver os problemas da técnica anterior.
O primeiro objetivo da presente invenção consiste em fornecer uma composição para a reparação cartilaginosa composta de solução de aprotinina e fibrinogênio, trombina e uma solução estabilizante, e uma solução de colágeno.
O segundo objetivo da presente invenção consiste na regeneração eficaz do tecido cartilaginoso danificado por uma forma transplantável composta de biomateriais, como, por exemplo, colágeno e fibrinogênio. Este tratamento reduz o estresse relacionado à cirurgia e induz a regeneração e a recuperação da região de defeito da cartilagem.
O terceiro objetivo da presente invenção consiste no fato deste método simplificar o tratamento da região de defeito da cartilagem.
O quarto objetivo da presente invenção consiste na redução do número de pacientes que necessitam de cirurgia de articulações, por meio do tratamento precoce da região de defeito da cartilagem.
O quinto objetivo da presente invenção consiste na redução do número de pacientes que necessitam de cirurgia de articulações, por meio do tratamento preventivo.
O sexto objetivo da presente invenção consiste em oferecer uma composição para a reparação de tecidos cartilaginosos e método de produção da dita composição, de tal modo que a melhoria da qualidade e a confiabilidade do produto proporcionam uma boa imagem aos pacientes.
Para a realização dos objetivos, a presente invenção oferece um método de produção de uma composição para a reparação de tecidos cartilaginosos, que compreende as seguintes etapas: (a) dissolver o fibrinogênio seco por congelamento em uma solução de aprotinina; (b) dissolver a trombina seca por congelamento em uma solução estabilizante; (c) misturar uma solução de colágeno enriquecido com trombina e a solução estabilizante e; instalar a solução de fibrinogênio (a) em um lado de um kit duplo e a solução (c) contendo a solução de colágeno no outro lado e, em seguida, misturar a solução (a) e a solução (c) e injetar em um tecido cartilaginoso danificado.
A presente invenção também oferece a composição para a reparação de tecidos cartilaginosos preparada pelo método acima.
Conforme descrição acima, a presente invenção oferece uma composição para a reparação cartilaginosa composta de fibrinogênio e solução de aprotinina, trombina e uma solução estabilizante, e uma solução de colágeno.
A presente invenção oferece regeneração eficaz de tecidos cartilaginosos danificados por meio de uma forma transplantável composta de biomateriais, como, por exemplo, colágeno e fibrinogênio, e este método reduz o estresse relacionado à cirurgia, induz a regeneração de forma rápida e eficaz e a recuperação da região de defeito da cartilagem.
A presente invenção oferece um método simples para o tratamento da região de defeito da cartilagem.
A presente invenção oferece uma redução no número de pacientes que necessitam de cirurgia de articulações, ao oferecer tratamento precoce da região de defeito da cartilagem.
Além disso, a presente invenção oferece uma redução no número de pacientes que necessitam de cirurgia de articulações, ao oferecer um tratamento preventivo.
A presente invenção oferece melhoria da qualidade e a confiabilidade do produto, que proporcionam uma boa imagem aos pacientes.
Breve Descrição dos Desenhos A Figura 1 mostra um método de produção de uma composição para a reparação de tecidos cartilaginosos, de acordo com a presente invenção.
A Figura 2 mostra uma fotografia da aplicação do Kit duplo contendo a composição para a reparação de tecidos cartilaginosos, de acordo com a presente invenção.
A Figura 3 mostra uma fotografia da aplicação da composição para a reparação de tecidos cartilaginosos, de acordo com a presente invenção, em uma região de defeito da cartilagem de um animal (porco).
A Figura 4 mostra fotografias que mostram observações visuais de resultados experimentais de uma aplicação da composição para a reparação de tecidos cartilaginosos, de acordo com a presente invenção, em uma região de defeito da cartilagem de um animal (coelho).
A Figura 5 mostra fotografias que mostram observações histopatológicas de resultados experimentais de uma aplicação da composição para a reparação de tecidos cartilaginosos, de acordo com a presente invenção, em uma região de defeito da cartilagem de um animal (coelho).
Descrição Detalhada da Invenção
A seguir, modalidades da presente invenção serão descritas de forma detalhada, em relação às Figuras em anexo.
Uma composição para a reparação de tecidos cartilaginosos e um método de fazer a composição, de acordo com a presente invenção, e as aplicações das mesmas, são mostrados nas Figuras 1-5.
Quando uma explicação detalhada relativa à técnica conhecida e a configuração técnica confundir desnecessariamente a essência da presente invenção, tal explicação detalhada será omitida.
As definições da presente invenção deverão ser interpretadas a partir do conteúdo da presente invenção, porque os termos podem ser interpretados pela intenção do produtor ou personalizados.
Em primeiro lugar, a presente invenção oferece um material sólido, por meio do uso de biomateriais, como, por exemplo, colágeno e fibrinogênio, e também fornece a produção e a utilização de uma solução estabilizante que oferece nutrição a um ambiente, para a regeneração da cartilagem, e, então, é fornecida uma composição para a reparação de tecidos cartilaginosos, que é feita através de diversas etapas sequenciais.
Para mais detalhes, a preparação de uma composição para a reparação de tecidos cartilaginosos é composta das seguintes etapas: (a) dissolver o fibrinogênio seco por congelamento em uma solução de aprotinina; (b) dissolver a trombina seca por congelamento em uma solução estabilizante; (c) misturar uma solução de colágeno enriquecido com trombina e a solução estabilizante e; instalar a solução de fibrinogênio (a) em um lado de um Kit duplo e a solução (c) contendo a solução de colágeno no outro lado e, em seguida, misturar a solução (a) e a solução (c) e injetar em um tecido cartilaginoso danificado.
A concentração de fibrinogênio varia de 33 a 55 mg/ml, a concentração de aprotinina é de 1.500 KIU/ml, a concentração de trombina é de 29,41 Ul/ml, a concentração estabilizante é de 0,685 mg/ml e a concentração de colágeno é de 13,23 mg/ml.
0,26 mg/ml de cloreto de cálcio são contidos na solução estabilizante. A solução estabilizante reforçada com cloreto de cálcio é preparada por meio da adição de cloreto de cálcio ao meio de cultura DMEM, para a cultura de células de cartilagem, e o meio de cultura DMEM contém sais, aminoácidos e vitaminas.
A concentração final de cloreto de cálcio na solução estabilizante varia de 0,1 a 0,5 mg/ml.
A concentração final de cloreto de cálcio na composição para a reparação de tecidos cartilaginosos varia de 2,78 a 3,12 mg/ml.
O colágeno, cuja concentração é inferior a 5 mg/ml, é esterilizado pelo uso de filtro de 0,22 um e, em seguida, o colágeno é concentrado sob manipulação asséptica.
A concentração de colágeno varia de 5 a 100 mg/ml.
A produção da solução estabilizante na presente invenção será explicada de forma detalhada, conforme segue abaixo: - O cloreto de cálcio é adicionado ao meio de cultura DMEVM utilizado na cultura de condrócitos para fazer a solução estabilizante. O meio de cultura DMEM contém sais, aminoácidos e vitaminas. A concentração de cloreto de cálcio varia de 0,2-6 mg/ml.
- A concentração final de cloreto de cálcio no colágeno e na solução estabilizante varia de 0,1 a 0,5 mg/ml.
- A concentração de cloreto de cálcio na solução estabilizante é determinada pelo tempo de gelificação e da faixa de tensão máxima. O tempo de gelificação é de 3 minutos e a tensão máxima é superior a 10N.
- A faixa mínima da solução estabilizante é a faixa mínima utilizada para a condição de cultura, e 0,5 mg/ml de cloreto de cálcio é a faixa máxima provada para a estabilização. A concentração final de cloreto de cálcio utilizado na cola de fibrina comercial varia de 2,78 a 3,12 mg/ml que afeta as células.
O colágeno concentrado é preparado conforme segue abaixo:
- É preferível utilizar colágeno altamente enriquecido.
- O colágeno (sob 5mg/ml) é esterilizado por meio do uso de um filtro de 0,22 um e depois concentrado sob manipulação asséptica.
- O peso molecular do colágeno é de aproximadamente
300.000 Daltonn e o comprimento da molécula de colágeno é de aproximadamente 300 nm para que a filtração seja difícil quando a concentração de colágeno for superior a 5 mg/ml.
- O colágeno é concentrado na faixa de 5 a 100 mg/ml.
- A concentração de colágeno começa a 5 mg/l e é possível continuar até 100 mg/ml (concentração solúvel e mensurável).
A diálise e a diafiitação são utilizadas para a concentração de colágeno, ou é utilizado o método de centrífuga sob um determinado pH e temperatura. O colágeno concentrado é colocado em uma seringa para utilização posterior.
A mistura de colágeno, fibrinogênio e a solução estabilizante é ilustrada na Figura 2.
- Dissolver o fibrinogênio seco por congelamento contido em um produto de cola de fibrina em 2 cc de solução de aprotinina e, em seguida, a solução é colocada em uma seringa.
- Dissolver a trombina seca por congelamento em 2 cc da solução estabilizante e, em seguida, a solução é colocada em uma seringa de 0,4 cc.
- A solução de colágeno concentrado (3%, 3 cc) é misturada com a solução de trombina e, em seguida, a solução é colocada em uma seringa de 2 cc.
- A solução de fibrinogênio/aprotinina e a solução de colágeno/trombina são instaladas em um Kkit duplo e, em seguida, são aplicadas na região do defeito da cartilagem.
- Há vários produtos de fibrinogênio (cola de fibrina) vendidos em vários países, e os produtos utilizados na Coréia estão listados na Tabela 1.
Tabela 1
Nome do produto Tissucol/ GreenPlast Beriplast Tisseel ZLB Behring Fabricante Green Cross Baxter AG GmbH República da Coréia Alemanha Áustria Fibrinogênio de plasma mg/ml 71,5-126,5 65-115 70-110 humano Trombina de Fator de plasma IU/mI 400-600 400-600 500 coagulação humano Fator XIII de plasma Um! 44-88 40-80 10-50 humano Estimulante de Cloreto de mg/ml 5,56-6,24 5,9 5,88 coagulação cálcio Inibidor de Aprotinina KIU/mI 1000 1000 3000 trombose Hemassel (Canadá), Quixil (Israel), Bolheal (Japão), Biocol (França) e Vanguard (EUA) também estão disponíveis em outros países.
A presente invenção pode ser alterada de várias formas paraa aplicação dos componentes acima da presente invenção.
No entanto, a presente invenção não se limita à explicação descrita acima e componentes que são equivalentes e substitutivos das reivindicações estão incluídos na presente invenção.
Modalidades de uma composição para a reparação de tecidos cartilaginosos e um método de produção da mesma são explicados abaixo. Em primeiro lugar, a presente invenção oferece biomateriais, como, por exemplo, colágeno e fibrina, que são misturados de modo a permitir que o tecido cartilaginoso danificado seja reparado a um estado que permita o transplante no tecido, e a regeneração eficiente seja induzida, tornando, assim, possível reduzir o estresse relacionado à cirurgia em pessoas e animais, enquanto que induz O reparo e a regeneração da cartilagem de forma relativamente rápida e eficiente.
Daqui em diante, modalidades da presente invenção serão descritas de forma detalhada.
Modalidade 1 Método para aplicar colágeno e cola de fibrina em uma região de defeito da cartilagem de um animal (objetivo: confirmar a possibilidade de uma aplicação de colágeno e cola de fibrina em uma região de defeito da cartilagem de um porco).
- Depois de uma perna de porco ser fixada a um suporte, a cartilagem é danificada com uma broca (2 x 1,5 cm?).
- Thera Fill (colágeno enriquecido) e Greenplast (cola de fibrina) são preenchidos na região de defeito da cartilagem. O método de enchimento compreende as seguintes etapas: 1) Abrir o Greenplast e, em seguida, adicionar fibrinogênio a uma solução de aprotinina por meio de injeção.
2) Adicionar uma trombina seca por congelamento a uma solução de cálcio.
3) 0,1 ml da solução de trombina/cálcio é misturado com 1 cc de Thera Encha, por meio do uso de um adaptador. 4) A solução 1) e a solução 3) são instaladas em um kit duploe,em seguida, são aplicadas na região de defeito da cartilagem.
Após a aplicação, observar a região de defeito da cartilagem durante 15 minutos.
(Resultado: após a aplicação de Thera Fill/cola de fibrina na região de defeito da cartilagem, os materiais sólidos são formados dentro de 10 minutos e os materiais sólidos têm boas características para os médicos. Consulte a Figura 3).
Modalidade 2 Um experimento de aplicação de cola de fibrina e colágeno em uma região de defeito da cartilagem de um coelho (objetivo: confirmar a regeneração da cartilagem do coelho por meio do uso de colágeno e cola de fibrina).
Depois de ser induzido um defeito da cartilagem de 4 mm na região do sulco patelar de um coelho NZW, colágeno e cola de fibrina são aplicados na região do defeito, e, depois, 4 semanas após a aplicação, são realizadas observações microscópicas e a olho nu (Figuras 4 e 5). Colágeno (Thera Fill da Sewoncellontech) e fibrina (Tisseel da Baxter) são utilizados para a experiência.
Hematoxilina-eosina, —safranina-O, azul de alcian, tricrômico de Masson e colágeno tipo I/Il são utilizados para coloração nas observações microscópicas.
(Resultado: foi confirmado, pela observação a olho nu, que os tecidos da região do defeito são restaurados e, pela observação histopatológica, foi confirmado que os tecidos da região do defeito são regenerados como tecidos de cartilagem) As propriedades físicas da solução estabilizante, dependendo da concentração de cloreto de cálcio, são medidas e resumidas da seguinte forma: A. Medição do tempo de gelificação e propriedades físicas, de acordo com a concentração de cloreto de cálcio na solução estabilizante.
1). Concentração de cloreto de cálcio
EFE Concentração da solução 44 3,38 1,69 0,845 | 0,169 estabilizante 2) Método de Aplicação - Preparar uma solução de colágeno (3%, 3 cc) e uma cola de fibrina (da Greenplast).
- Fibrinogênio em Greenplast é misturado com aprotinina (1 cc).
- A trombina é misturada com a solução estabilizante (1cc).
- A solução de colágeno (3 cc) é misturada com trombina (3cc)ea solução estabilizante (0,4 cc).
- Colocar a solução de fibrinogênio (1 cc) e a solução de colágeno (1cc) em um kit duplo e, em seguida, colocar a mistura em um molde cilíndrico (DO 12 x 15 mm) para fazer uma matéria sólida 3) Concentração de cloreto de cálcio/tempo de gelificação egelificação. Tempo de (mg/mL) a
EN A a as a a a a
*: inclui fase líquida **: em progresso de gelificação ***: gelificação concluída Medição das propriedades físicas, dependendo da concentração de cloreto de cálcio. - Reômetro, CR-500DX, é utilizado para medir as propriedades físicas do material sólido. - ltens de medição: tensão máxima, força do gel e resistência à tração. - Distância da entrada: 50% da altura da amostra, 7,5 mm. - Velocidade: 50 mm/min, tensão máxima: 10 kg - Adaptador: No. 1, 9 20 mm. Tensão máxima cálcio (mg/ml) (Concentração ow o w | |
LC A Método de mistura de colágeno e cola de fibrina com a solução estabilizante na região de defeito da cartilagem, medição das propriedades físicas e confirmação da degradabilidade (objetivo: nutrição é bloqueada quando as cartilagens são danificadas. O meio de cultura DMEM que é utilizado para cultura de células de cartilagem é adicionado para ajudar a restauração da cartilagem, e o produto contendo colágeno mantém a forma durante um longo período de tempo). 1) Fazer uma solução estabilizante, isto é, um meio de cultura DMEM reforçado com cloreto de cálcio, que é utilizada para a cultura de células da cartilagem.
O meio de cultura DMEM contém sais, aminoácidos e vitaminas.
A solução estabilizante é uma solução de cloreto de cálcio reforçada e a concentração varia de 0,2 a 6 mg/ml. 2) A concentração de cloreto de cálcio varia de 0,1 a 0,5 mga/mlna utilização final. 3) Esta experiência é realizada conforme a descrição abaixo. - Preparar a solução de colágeno (3%, 3 cc) e cola de fibrina (Greenplast) - Fibrinogênio em Greenplast é misturado com um aprotinina (1 cc). - A trombina é misturada com a solução estabilizante (1 co). - A solução de colágeno (3 cc) é misturada com trombina/solução estabilizante (0,4 cc). - A cola de fibrina não contendo colágeno é utilizada para um grupo de comparação. - Colocar a solução de fibrinogênio (1 cc) e a solução de colágeno (1 cc) em um kit duplo e, em seguida, colocar a mistura em um molde cilíndrico (O 12 x 15 mm) para fazer uma matéria sólida.
A concentração final de cloreto de cálcio é de 0,26 mg/ml. 4) Medição de propriedades físicas. - Reômetro, CR-500DX, é utilizado para medir as propriedades físicas do material sólido. - Itens de medição: tensão máxima, força do gel e resistência à tração. - Distância da entrada: 50% da altura da amostra, 75 mm. - Velocidade: 50 mm/min, tensão máxima: 10 kg - Adaptador: No. 1, 9 20 mm. - Os resultados são conforme descrito a seguir.
Um material sólido contendo colágeno apresenta uma cor opaca semelhante à cor da cartilagem, e um produto de cola de fibrina é um material translúcido sólido.
Colágeno/solução estabilizante Produto de cola de fibrina o esse ee
E r à AT Fotos de gelificação & E s À (Gelificação em 3 PE. o í SS At à” 3 minutos) LD 4 À : 4 - ORA! Ea à NStos: 5) Confirmação da degradabilidade: - O material sólido é colocado no meio de cultura (DMEM) e é observado durante um mês a 37 graus Celsius. - O meio de cultura é alterado todos os dias ou a cada dois dias. - O produto de cola de fibrina não contendo colagem é decomposto em 2 a 3 semanas, mas o material sólido contendo colágeno mantém a sua forma ao longo de um mês.
A seguir, uma experiência sobre a viabilidade celular de células de cartilagem na composição da mistura de colágeno e fibrinogênio (consulte Figura 8).
A) Preparação de uma composição de colágeno e fibrinogênio contendo células de cartilagem 1) Fibrinogênio em cola de fibrina (Tisseel) é dissolvido em uma solução de aprotinina (2cc).
2) Uma trombina seca por congelamento é dissolvida na solução estabilizante.
3) A solução de colágeno (preenchimento com Thera, 3 cc) é misturada com a trombina/solução estabilizante (0,4 cc) pó meio uso de um adaptador.
4) Colocar 1,5 cc da mistura de colágeno/trombina/ solução estabilizante em uma seringa e, em seguida, a solução é misturada com as células da cartilagem (0,5 cc (6,0 X 106 células/0,5 cc)). A concentração final de cloreto de cálcio é de 0,24 mg/ml.
5) A mistura de 1) e 4) é, respectivamente, instalada em um kit duplo e, em seguida, colocada em uma placa de Petri de 100 mm.
B) Uma experiência de confirmação da viabilidade das células da cartilagem na composição.
1) O produto em gel separado é transferido para uma placa de Petri de 35 mm, e 3 ml do meio de cultura DMEM é adicionado à placa de Petri, e em seguida é feita a incubação com CO, a 37 graus Celsius.
2) O meio de cultura é trocado duas vezes por dia e incubado 3 dias. A composição do meio de cultura é composta de DMEM/F12, 1% de gentamicina, 5 mg/ml de ITS+Premix, 50 ug/ml de ácido ascórbico, 1 mM de piruvato de sódio e 100 ng/ml de BMP-2.
3) O método com calceína-AM é utilizado para uma análise.
Análise com calceína-AM - Método: é preparada uma solução de trabalho de viabilidade das células vivas/mortas contendo 10 ml! de PBS, 5 uL de calceína-AM (4mM) e 20 uL de EthD-1 (2mM).
O meio de cultura é removido da composição da incubação, e, em seguida, são adicionados 3 ml de solução de trabalho de viabilidade das células vivas/mortas. É incubado durante uma hora à temperatura ambiente, e, em seguida, é movido para uma lâmina de vidro. Observa-se em microscópio de fluorescência.
As células vivas são coradas em verde e as células mortas são coradas em vermelho.
- Resultado: fotos de microscopia de fluorescência de viabilidade das células da cartilagem por análise com calceína-AM. (Esquerda: inicial (40X), Direita: 3 dias de incubação (40X)). Após 72 horas na composição, a observação confirma que 90% das células estão vivas.