BR112020015615B1 - Composição de biotinta para regeneração de cartilagem, método para fabricar arcabouço customizado para regeneração de cartilagem usando a mesma e arcabouço customizado para regeneração de cartilagem fabricado usando o método de fabricação - Google Patents

Composição de biotinta para regeneração de cartilagem, método para fabricar arcabouço customizado para regeneração de cartilagem usando a mesma e arcabouço customizado para regeneração de cartilagem fabricado usando o método de fabricação Download PDF

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Abstract

O presente relatório descritivo se refere a uma composição de biotinta para regeneração de cartilagem, um método para fabricar um arcabouço customizado para regeneração de cartilagem usando a mesma, e um arcabouço customizado para regeneração de cartilagemusando o dito método de fabricação, em que a composição de biotinta compreende: um primeiro líquido que compreende uma fração vascular de estroma derivada de tecido adiposo, pó de cartilagem hialina, e fibrinogênio; e um segundo líquido que compreende trombina.

Description

[Campo Técnico]
[0001] O presente relatório descritivo reivindica prioridade a e o benefício de Pedido de Patente Coreano n° 10-2018-0012221 depositado no Escritório de Propriedade Intelectual Coreano em 31 de janeiro de 2018, cujo conteúdo do mesmo é incorporado ao presente documento a título de referência.
[0002] A presente invenção se refere a uma composição de biotinta para regeneração de cartilagem, um método para fabricar um arcabouço customizado para regeneração de cartilagem usando a mesma e um arcabouço customizado para regeneração de cartilagem fabricado usando o dito método de fabricação.
[Antecedentes da Técnica]
[0003] Artrite degenerativa é uma doença na qual alterações degenerativas locais surgem enquanto a cartilagem articular se desgasta, e é também chamada osteoartrite ou osteoartrose. Artrite degenerativa é um tipo de artrite crônica, e é uma doença na qual uma alteração degenerativa ocorre na cartilagem articular que recebe uma carga de peso, resultando em crescimento excessivo de osso na superfície de articulação e é, em geral, observada em adultos de meia idade. Nessa doença, primeiro, cartilagem perde elasticidade enquanto a função de condrócitos que produz componentes de composição de cartilagem se deterioram devido ao envelhecimento. Ademais, com o passar do tempo, a superfície da cartilagem se torna dura, e diversos tipos de materiais fluem na cavidade de articulação envolvida pela membrana de articulação para ocasionar inflamação. Clinicamente, dor recorrente, rigidez em articulação, um distúrbio de movimento progressivo na articulação e similares aparecem. A causa de artrite degenerativa é intimamente associada a fenômenos de envelhecimento ou peso corporal excessivo, e artrite degenerativa mais frequentemente e de modo mais grave é observada em mulheres conforme as mesmas envelhecem. Como um sintoma inicial, uma ou duas articulações exibem uma dor latejante juntamente com rigidez e, quando prolongado, o endurecimento do osso subcondral, formação excessiva do osso ao redor da articulação, deformação da articulação e similares são ocasionados.
[0004] A causa de alterações degenerativas em cartilagem articular ainda não foi elucidada, mas a redução absoluta no número de condrócitos e o desequilíbrio entre síntese e degradação da matriz de cartilagem que ocorrem em condrócitos conhecidos como sendo uma das causas. Portanto, alterações degenerativas em cartilagem articular reduzem resistência de cartilagem e a habilidade como um amortecimento devido à degradação da matriz de cartilagem.
[0005] Os agentes terapêutico celulares existente têm uma desvantagem, uma vez que, células implantadas são inclinadas em uma direção devido à gravidade, de modo que seja difícil distribuir de modo uniforme o agente terapêutico em um sítio defeituoso, e há dificuldade em enxerto celular, o que reduz regeneração celular no sítio defeituoso de cartilagem. Além disso, no caso de implantação de condrócito autólogo e implantação de célula- tronco, um tecido é aplicado a um paciente através de um processo de cultura após o tecido ser extraído, de modo que duas cirurgias sejam necessárias e uma manipulação ou período de cultura celular de aproximadamente 4 semanas é necessário. Ademais, há problemas devido à gravidade, é difícil para células implantadas serem distribuídas e enxertadas de modo uniforme em um sítio defeituoso, e a diferenciação na fibrocartilagem em vez da cartilagem hialina é induzida, de modo que um fenômeno no qual a cartilagem se rompe facilmente ocorra. Portanto, há uma necessidade de desenvolver um método com capacidade de regenerar de modo eficaz células em um sítio defeituoso de cartilagem.
[Documentos da Técnica Anterior] [Documento de patente]
[0006] Pedido de Patente Coreano Aberto à Inspeção Pública n° 10-2017-0012099
[Revelação] [Problema Técnico]
[0007] A presente invenção foi realizada em um esforço para fornecer uma composição de biotinta para regeneração de cartilagem para fabricar um arcabouço customizado para regeneração de cartilagem de um sítio de cartilagem defeituoso. Além disso, a presente invenção foi realizada em um esforço para fornecer um método para fabricar um arcabouço customizado para regeneração de cartilagem usando a composição de biotinta para regeneração de cartilagem, e um arcabouço customizado para regeneração de cartilagem fabricado usando a mesma.
[Solução Técnica]
[0008] Uma modalidade exemplificativa da presente invenção fornece uma composição de biotinta para regeneração de cartilagem, em que a composição de biotinta compreende: um primeiro líquido que compreende uma fração vascular de estroma derivada de tecido adiposo, pó de cartilagem hialina, e fibrinogênio; e um segundo líquido que compreende trombina.
[0009] Outra modalidade exemplificativa da presente invenção fornece um método para fabricar um arcabouço customizado para regeneração de cartilagem, sendo que o método compreende: a) obter dados em 3D de um sítio de cartilagem defeituoso com o uso de um digitalizador 3D, e fabricar um molde para estruturação com o uso de uma impressora 3D; b) usar um primeiro líquido que compreende uma fração vascular de estroma derivada de tecido adiposo, pó de cartilagem hialina e fibrinogênio e aplicar o primeiro líquido no molde para estruturação para formar uma primeira camada; c) aplicar um segundo líquido que compreende trombina na primeira camada para formar uma segunda camada; e d) formar um arcabouço customizado para regeneração de cartilagem ao permitir que uma primeira camada e uma segunda camada reajam entre si.
[0010] Ainda outra modalidade exemplificativa da presente invenção fornece um arcabouço customizado para regeneração de cartilagem fabricada usando o método de fabricação.
[Efeitos Vantajosos]
[0011] Uma composição de biotinta para regeneração de cartilagem de acordo com a presente invenção tem uma vantagem de que um arcabouço customizado para paciente para regeneração de cartilagem pode ser fabricado.
[0012] Um arcabouço customizado para regeneração de cartilagem fabricada usando a composição de biotinta para regeneração de cartilagem de acordo com a presente invenção pode tratar de modo eficaz a cartilagem aperfeiçoando-se a capacidade de uma fração vascular de estroma implantada derivada de tecido adiposo para diferenciação em cartilagem e, além disso, aumentar regeneração de cartilagem no sítio implantado.
[0013] O arcabouço customizado para regeneração de cartilagem de acordo com a presente invenção tem uma excelente força de ligação a uma área afetada, e tem uma vantagem de que capacidade de diferenciação de cartilagem e um efeito de regeneração de cartilagem são excelentes devido à excelente força de ligação.
[0014] Um método para fabricar um arcabouço customizado para regeneração de cartilagem de acordo com a presente invenção tem uma vantagem de que um arcabouço pode ser implantado através de um único procedimento cirúrgico devido ao fato de que um arcabouço customizado para regeneração de cartilagem pode ser imediatamente fabricado por varredura 3D de um sítio defeituoso de cartilagem de uma área afetada em uma sala de operação. [Descrição dos desenhos]
[0015] A FIG. 1 ilustra um processo de fabricar um pélete para confirmar a capacidade de diferenciação de cartilagem de Exemplo Experimental 1.
[0016] A FIG. 2 mostra um resultado de realizar coloração de safranina O em um pélete de Exemplo Comparativo 1 (0 mg de MCCM) de acordo com o Exemplo Experimental 1.
[0017] A FIG. 3 mostra um resultado de realizar coloração de safranina O em um pélete de Exemplo 1 (10 mg de MCCM) de acordo com o Exemplo Experimental 1.
[0018] A FIG. 4 mostra um resultado de realizar coloração de safranina O em um pélete de Exemplo 2 (50 mg de MCCM) de acordo com o Exemplo Experimental 1.
[0019] A FIG. 5 mostra um resultado de realizar coloração de safranina O em um pélete de Exemplo 3 (100 mg de MCCM) de acordo com o Exemplo Experimental 1.
[0020] A FIG. 6 ilustra um procedimento experimental em animal para confirmar se a cartilagem de Exemplo Experimental 2 é regenerada.
[0021] A FIG. 7 mostra imagens durante um procedimento experimental em animal de Exemplo 4 de acordo com o Exemplo Experimental 2 e uma imagem de imageamento de micro CT para uma região defeituosa 6 semanas após a implantação de um arcabouço.
[0022] A FIG. 8 mostra imagens durante um procedimento experimental em animal de Exemplo Comparativo 2 de acordo com o Exemplo Experimental 2 e uma imagem de imageamento de micro CT para uma região defeituosa 6 semanas após a implantação de um arcabouço.
[0023] A FIG. 9 mostra um resultado de realizar coloração de safranina O em uma região defeituosa 6 semanas após a implantação de Exemplo Comparativo 2 de acordo com o Exemplo Experimental 2.
[0024] A FIG. 10 mostra um resultado de realizar coloração de safranina O em uma região defeituosa 6 semanas após a implantação de Exemplo 4 de acordo com o Exemplo Experimental 2.
[0025] A FIG. 11 mostra um resultado de realizar um tratamento de imuno-histoquímica (IHC) com colágeno tipo 1 em uma região defeituosa 6 semanas após a implantação de Exemplo Comparativo 2 de acordo com o Exemplo Experimental 2.
[0026] A FIG. 12 mostra um resultado de realizar um tratamento de imuno-histoquímica (IHC) com colágeno tipo 1 em uma região defeituosa 6 semanas após a implantação de Exemplo 4 de acordo com o Exemplo Experimental 2.
[0027] A FIG. 13 mostra um resultado de realizar um tratamento de imuno-histoquímica (IHC) com colágeno tipo 2 em uma região defeituosa 6 semanas após a implantação de Exemplo Comparativo 2 de acordo com o Exemplo Experimental 2.
[0028] A FIG. 14 mostra um resultado de realizar um tratamento de imuno-histoquímica (IHC) com colágeno tipo 2 em uma região defeituosa 6 semanas após a implantação de Exemplo 4 de acordo com o Exemplo Experimental 2. [Modos da invenção]
[0029] Quando um membro está disposto “em” outro membro no presente relatório descritivo, isso inclui não apenas um caso no qual o um membro é colocado em contato com outro membro, mas também um caso em que ainda outro membro está presente entre os dois membros.
[0030] Quando uma parte “inclui” um elemento constituinte no presente relatório descritivo, a menos que especificamente descrito de outro modo, isso não significa que outro elemento constituinte é excluído, mas significa que outro elemento constituinte pode ser ainda incluído.
[0031] Doravante, a presente invenção será descrita em detalhes.
[0032] Uma modalidade exemplificativa da presente invenção fornece uma composição de biotinta para regeneração de cartilagem, em que a composição de biotinta compreende: um primeiro líquido que compreende uma fração vascular de estroma derivada de tecido adiposo, pó de cartilagem hialina, e fibrinogênio; e um segundo líquido que compreende trombina.
[0033] A composição de biotinta para regeneração de cartilagem de acordo com a presente invenção é um tipo de dois líquidos, e o primeiro líquido e o segundo líquido podem ser aplicados de modo sequencial e, então, reagidos para formar um arcabouço para regeneração de cartilagem. Especificamente, a trombina no segundo líquido pode ser reagida com o fibrinogênio no primeiro líquido para formar uma rede de fibrina, que pode servir para fixar de modo suficiente a fração vascular de estroma derivada de tecido adiposo e o pó de cartilagem hialina.
[0034] A fração vascular de estroma derivada de tecido adiposo inclui células-tronco derivadas de adiposo. De preferência, a fração vascular de estroma derivada de tecido adiposo pode não incluir substancialmente células (por exemplo, adipócitos, eritrócitos, outras células de estroma e similares) além de células-tronco derivadas de tecido adiposo e materiais de matriz extracelular e, mais preferencialmente, pode não incluir outras células e materiais de matriz extracelular de modo algum.
[0035] A fração vascular de estroma derivada de tecido adiposo pode ser extraída de um tecido adiposo de um animal alogênico ou um animal heterólogo. De preferência, a fração vascular de estroma derivada de tecido adiposo pode ser extraída de um tecido adiposo autólogo. Mais especificamente, a fração vascular de estroma derivada de tecido adiposo pode ser extraída com o uso de adipócitos de um paciente ou animal a ser tratado.
[0036] De acordo com uma modalidade exemplificativa da presente invenção, um teor da fração vascular de estroma derivada de tecido adiposo pode ser 105 a 107 de células/ml da primeira solução. Quando o teor da fração vascular de estroma derivada de tecido adiposo está dentro da faixa acima, a capacidade de diferenciação de cartilagem e capacidade de regeneração de cartilagem de um arcabouço a ser fabricado podem ser significativamente aprimoradas.
[0037] A fração vascular de estroma derivada de tecido adiposo pode ser usada com pó de cartilagem hialina para diferenciação em células de cartilagem e, quando o arcabouço customizado para regeneração de cartilagem é implantado em uma área afetada por essa razão, a diferenciação em condrócitos pode ser ativamente induzida.
[0038] O pó de cartilagem hialina pode ser um elemento que constitui um suporte de arcabouço fabricado usando a composição de biotinta para regeneração de cartilagem. Especificamente, uma matriz de fibrina através da reação de fibrinogênio e trombina pode permitir que partículas do pó de cartilagem hialina sejam ligadas umas às outras.
[0039] O pó de cartilagem hialina pode ser derivado de cartilagem hialina alogênica ou heteróloga. De preferência, o pó de cartilagem hialina pode ser derivado de cartilagem hialina alogênica. Especificamente, quando um sujeito que é submetido a tratamento de cartilagem é um ser humano, pó de cartilagem hialina extraído da cartilagem hialina de ser humano pode ser usado. Além disso, quando um sujeito que é submetido a tratamento de cartilagem é um animal, pó de cartilagem hialina extraído de cartilagem hialina de um animal da mesma espécie pode ser usado.
[0040] O pó de cartilagem hialina pode induzir diferenciação da fração vascular de estroma derivada de tecido adiposo em condrócitos liberando-se fatores de crescimento relacionados a regeneração de cartilagem. Além disso, as proteínas incluídas no pó de cartilagem hialina podem servir para auxiliar em regeneração ativa de cartilagem em uma área afetada.
[0041] De acordo com uma modalidade exemplificativa da presente invenção, o pó de cartilagem hialina pode ser derivado de cartilagem costal. Especificamente, quando o arcabouço customizado para regeneração de cartilagem é aplicado a um ser humano, o pó de cartilagem hialina pode ser derivado de cartilagem costal de ser humano. Além disso, quando o arcabouço customizado para regeneração de cartilagem é aplicado a um animal, o pó de cartilagem hialina pode ser derivado da cartilagem costal da mesma espécie que o sujeito animal. Por exemplo, o pó de cartilagem hialina pode ser usado pulverizando-se cartilagem costal alogênica comercialmente disponível.
[0042] De acordo com uma modalidade exemplificativa da presente invenção, o pó de cartilagem hialina pode ter um diâmetro de partícula de 30 μm a 300 μm. Quando o diâmetro médio de partícula do pó de cartilagem hialina está dentro da faixa acima, há uma vantagem de que os condrócitos são efetivamente diferenciados e regenerados.
[0043] De acordo com uma modalidade exemplificativa da presente invenção, a concentração do pó de cartilagem hialina pode ser 0,005 %(p/v) a 0,1 %(p/v). Ou seja, o pó de cartilagem hialina pode ser incluído em uma quantidade de 0, 005 g a 0,1 g por ml do primeiro líquido. Uma concentração do pó de cartilagem hialina pode ser, de preferência, 0,005 %(p/v) a 0,07 %(p/v), mais preferencialmente, 0,005 %(p/v) a 0,03 %(p/v) e, com máxima preferência, 0,007 %(p/v) a 0,03 %(p/v). Quando a concentração do pó de cartilagem hialina está dentro da faixa acima, a capacidade de sobrevivência de condrócitos, diferenciação em condrócitos e morfologia podem ser realizados com máxima excelência após implantação de um arcabouço customizado para regeneração de cartilagem.
[0044] De acordo com uma modalidade exemplificativa da presente invenção, o número de células da fração vascular de estroma derivada de tecido adiposo pode ser 105 a 107 em relação a 5 mg a 100 mg do pó de cartilagem hialina. De preferência, o número de células da fração vascular de estroma derivada de tecido adiposo pode ser 105 a 107 em relação a 5 mg a 70 mg do pó de cartilagem hialina. Mais preferencialmente, o número de células da fração vascular de estroma derivada de tecido adiposo pode ser 105 a 107 em relação a 5 mg a 30 mg do pó de cartilagem hialina.
[0045] De acordo com uma modalidade exemplificativa da presente invenção, o primeiro líquido pode incluir ainda aprotinina. A aprotinina é um inibidor de enzimas proteolíticas secretadas do pâncreas, e é um polipeptídeo que consiste em um total de 58 aminoácidos. A aprotinina é, geralmente, extraída dos pulmões de gado, e é conhecida por realizar uma ação hemostática inibindo-se a degradação de fibrina no sangue.
[0046] De acordo com uma modalidade exemplificativa da presente invenção, o fibrinogênio pode ser incluído em uma quantidade de 65 mg a 115 mg por ml do primeiro líquido.
[0047] De acordo com uma modalidade exemplificativa da presente invenção, a aprotinina pode ser incluída em uma quantidade de 900 unidades de ativador de cininogênio (KIU) a 1.1000 KIU, especificamente 1.000 KIU, por ml do primeiro líquido.
[0048] Especificamente, de acordo com uma modalidade exemplificativa da presente invenção, o primeiro líquido pode incluir 105 a 107 de células de fração vascular de estroma derivada de tecido adiposo, 5 mg a 100 mg de pó de cartilagem hialina, 65 mg a 115 mg de fibrinogênio, e 900 KIU a 1.100 KIU de aprotinina por ml do primeiro líquido.
[0049] De acordo com uma modalidade exemplificativa da presente invenção, o segundo líquido pode ser trombina dissolvida em uma solução de cloreto de cálcio. Especificamente, o segundo líquido pode incluir 400 IU a 600 IU de trombina e 5 mg a 6,5 mg de cloreto de cálcio por ml do segundo líquido.
[0050] Um solvente do primeiro líquido e do segundo líquido pode ser água, especificamente soro fisiológico. Além disso, o fibrinogênio no primeiro líquido e a trombina no segundo líquido podem ser obtidos por um kit de cola de fibrina comercialmente disponível.
[0051] Visto que a reação do primeiro líquido e do segundo líquido é completada dentro de 10 minutos, de preferência, dentro de 5 minutos, a composição de biotinta para regeneração de cartilagem tem uma vantagem de que um arcabouço customizado para paciente para regeneração de cartilagem pode ser imediatamente fabricado com o uso de uma impressora 3D em um sítio de tratamento.
[0052] A presente invenção usa uma cola de fibrina que inclui fibrinogênio e fibrina como um adesivo, que pode manter viscosidade maior que aquela de um adesivo de ácido hialurônico ou adesivo de colágeno, de modo que o arcabouço customizado para regeneração de cartilagem tenha excelente força de ligação a uma área afetada e, ademais, pode manter alta resistência.
[0053] Outra modalidade exemplificativa da presente invenção fornece um método para fabricar um arcabouço customizado para regeneração de cartilagem, sendo que o método compreende: a) obter dados em 3D de um sítio de cartilagem defeituoso com o uso de um digitalizador 3D, e fabricar um molde para estruturação com o uso de uma impressora 3D; b) usar um primeiro líquido que compreende uma fração vascular de estroma derivada de tecido adiposo, pó de cartilagem hialina e fibrinogênio e aplicar o primeiro líquido no molde para estruturação para formar uma primeira camada; c) aplicar um segundo líquido que compreende trombina na primeira camada para formar uma segunda camada; e d) formar um arcabouço customizado para regeneração de cartilagem ao permitir que uma primeira camada e uma segunda camada reajam entre si.
[0054] Na etapa a), equipamento de digitalizador 3D e equipamento de impressão 3D conhecidos na técnica podem ser usados. Além disso, o molde para estruturação pode servir para fixar uma forma tridimensional quando o primeiro líquido e o segundo líquido são aplicados. O molde para estruturação pode ser removido após o arcabouço para regeneração de cartilagem ser formado. O molde para estruturação pode ser formado com o uso de um polímero biocompatível geralmente usado na técnica.
[0055] De acordo com uma modalidade exemplificativa da presente invenção, etapas b) e c) podem ser realizadas usando impressão de jato de tinta ou impressão 3D. Especificamente, nas etapas b) e c), um dispositivo de impressão que tem dois ou mais bocais conhecidos na técnica pode ser usado, e um formato tridimensional pode ser criado descarregando-se o primeiro líquido e o segundo líquido dos respectivos bocais.
[0056] De acordo com uma modalidade exemplificativa da presente invenção, etapas b) e c) podem ser repetidas alternadamente. Especificamente, quando é necessário formar um arcabouço de volume grande para regeneração de cartilagem, etapas b) e c) são alternadamente realizadas para laminar camadas como na “primeira camada/segunda camada/primeira camada/segunda camada e, então, as camadas podem ser coaguladas para formar um arcabouço para regeneração de cartilagem.
[0057] De acordo com uma modalidade exemplificativa da presente invenção, a etapa d) pode ser completada dentro de 10 minutos, de preferência, dentro de 5 minutos. Especificamente, na etapa d), uma reação pode ser realizada por 3 minutos a 7 minutos e a primeira camada e a segunda camada podem ser reagidas para formar um arcabouço para regeneração de cartilagem.
[0058] No caso de implantação de condrócito autólogo existente e implantação de célula-tronco, há um problema de que, após a incisão primária ser realizada em uma área afetada para extrair um tecido de uma área de cartilagem defeituosa do paciente, a incisão secundária para implantação para a área afetada através de um processo de cultura do tecido é necessário, de modo que dois procedimentos cirúrgicos sejam necessários. Em contrapartida, o método para fabricar um arcabouço customizado para regeneração de cartilagem tem uma vantagem de que, após uma região de cartilagem defeituosa ser confirmada através da incisão primária, um arcabouço que corresponde à região de cartilagem defeituosa é fabricado dentro de um curto período de tempo e pode ser implantado na região de cartilagem defeituosa. Ou seja, o método para fabricar um arcabouço customizado para regeneração de cartilagem tem uma vantagem de que um arcabouço customizado pode ser implantado em uma área afetada por apenas uma incisão.
[0059] Outra modalidade exemplificativa da presente invenção fornece um arcabouço customizado para regeneração de cartilagem fabricado usando o método de fabricação.
[0060] O arcabouço customizado para regeneração de cartilagem pode ser fabricado em um formato que corresponde a uma região de cartilagem defeituosa dentro de um curto período de tempo e implantado, como descrito acima. O arcabouço customizado para regeneração de cartilagem não necessita de um processo de cultura para células, uma fração vascular de estroma derivada de tecido adiposo no arcabouço após implantação diferencia em condrócitos, e pó de cartilagem hialina pode ativar a regeneração da cartilagem e aperfeiçoar a viabilidade de regenerada condrócitos.
[0061] Quando o arcabouço customizado para regeneração de cartilagem é implantado em uma área afetada, cartilagem hialina natural pode ser induzida para ser regenerada por fatores de crescimento de cartilagem hialina e proteínas secretadas do pó de cartilagem hialina. Quando o arcabouço customizado para regeneração de cartilagem é aplicado a uma área afetada dessa maneira, a área afetada pode ser efetivamente restaurada para o mesmo estado ou estado similar que aquele da cartilagem original.
[0062] Doravante, a presente invenção será descrita em detalhes em referência aos Exemplos para descrever especificamente a presente invenção. No entanto, os Exemplos de acordo com a presente invenção podem ser modificados em diversas formas diferentes, e não deve ser interpretado que o escopo da presente invenção é limitado aos Exemplos a serem descritos abaixo. Os Exemplos do presente relatório descritivo são fornecidos para explicar mais completamente a presente invenção para aqueles com habilidade comum na técnica.
Isolamento de células de fração vascular de estroma derivadas de tecido adiposo (SVF)
[0063] As células de fração vascular de estroma derivadas de tecido adiposo (SVF) foram obtidas através das seguintes etapas. 1. Aproximadamente 60 cc de tecido adiposo foram extraídos realizando-se lipossucção conduzida por um médico em uma sala de operação estéril, e 0, 075 % de fago de lipídio de colagenase foi adicionado na mesma quantidade ao tecido, e a mistura resultante foi reagida agitando-se incubação a 230 rpm em uma temperatura de 37 °C por 30 minutos. 2. Após a reação, como descrito acima, 420 g do produto de reação foram centrifugados a 25 °C por 10 minutos e, como resultado da centrifugação, o produto de reação foi dividido em três camadas de uma camada de pélete de SVF, uma camada de colagenase e uma camada de óleo. 3. Após a solução superior, exceto pela camada de pélete de SVF, ser removida e a camada de pélete de SVF ser novamente suspensa em solução salina tampona com fosfato (PBS), materiais fibrosos e as impurezas remanescentes da camada de SVF novamente suspensa foram removidas com o uso de um filtro de náilon de 100 μm (filtro celular). 4. Após uma solução que inclui a SVF filtrada ser novamente suspensa e centrifugada três vezes, todos os materiais remanescentes foram removidos, exceto pelo pélete na camada de fundo e, então, como resultado de calcular células nucleadas com o uso de um contador de células, poderia ser confirmado que 105 a 107 de células de SVF foram obtidas.
Preparação de pó de cartilagem hialina
[0064] O pó de cartilagem hialina foi preparado como um pó que tem um tamanho de partícula de 30 μm a 300 μm com o uso de cartilagem costal comercialmente disponível. Doravante, o pó de cartilagem hialina será denominado uma matriz de cartilagem costal micronizada.
Exemplo Experimental 1 - Fabricação de pélete para confirmação de diferenciação condrogênica (experimento in vitro) [Exemplos 1 a 3]
[0065] A FIG. 1 ilustra um processo de fabricar um pélete para confirmar capacidade de diferenciação de cartilagem. Especificamente, um experimento para confirmar capacidade de diferenciação de cartilagem foi realizado como a seguir. 1. A SVF obtida (105 a 107 células) foi misturada com soro fisiológico em que 10 mg (Exemplo 1), 50 mg (Exemplo 2), e 100 mg (Exemplo 3) do pó de cartilagem hialina (MCCM) preparado foram dispersos. 2. Após esse líquido misturado ter sido centrifugado a 1.000 rpm a 4 °C por 5 minutos, uma mistura de MCCM/SVF foi obtida removendo-se o sobrenadante de soro fisiológico. 3. A mistura de MCCM/SVF foi misturada com 1 ml de um líquido de aprotinina no qual fibrinogênio foi misturado com o uso de uma seringa de mistura. 4. 1 ml da solução de MCCM/SVF/fibrinogênio e 1 ml de uma solução de cloreto de cálcio na qual trombina foi dissolvida foram, cada uma, conectadas a uma peça Y, e 20 μl de cada solução foram dispensados em um tubo cônico de 15 ml e endurecidos a temperatura ambiente por 5 minutos para formar um pélete. 5. Meios livres de fator de crescimento foram trocados e administrados três vezes na semana para que o pélete fosse suficientemente imerso, o pélete foi incubado sob as condições de 37 °C e 5 % de CO2 por 5 semanas e, então, diferenciação condrogênica foi confirmada realizando-se coloração de safranina O.
Exemplo Comparativo 1]
[0066] Um pélete foi formado e incubado da mesma maneira como descrito acima misturando-se apenas SVF com um líquido de aprotinina no qual fibrinogênio foi misturado sem MCCM (0 mg de MCCM, Exemplo Comparativo 1) e, então, diferenciação condrogênica foi confirmada realizando-se coloração de safranina O.
[0067] As FIGS. 2 a 5, cada uma, mostram um resultado de realizar coloração de safranina O em um pélete de acordo com o Exemplo Comparativo 1 (0 mg de MCCM), Exemplo 1 (10 mg de MCCM), Exemplo 2 (50 mg de MCCM) e Exemplo 3 (100 mg de MCCM). Nas FIGS. 2 a 5, poderia ser confirmado que a porção de cartilagem e MCCM foram manchadas de vermelho de acordo com coloração de safranina O e núcleos de condrócitos foram observados ao redor dos MCCMs nos Exemplos 1 a 3, e poderia ser confirmado que um número de condrócitos vivos estava presente. No entanto, poderia não ser confirmado que, no caso de Exemplo Comparativo 1, no qual MCCM foi não usado, condrócitos foram diferenciados. Através dos resultados, pode ser inferido que proteínas de MCCM, fatores de crescimento e similares foram liberados e induziram diferenciação de SVF em condrócitos. Além disso, em relação ao teor de MCCM, poderia ser confirmado que o Exemplo 1 (10 mg de MCCM) teve a viabilidade de condrócito mais ativa e diferenciação em condrócitos em comparação com os Exemplos 2 e 3. Ou seja, quando o teor de MCCM é muito alto, é determinado que a diferenciação em condrócitos seja atrasada devido ao fato de que o espaço no qual SVF pode se diferenciar em condrócitos é reduzido.
Exemplo Experimental 2 - Experimento em animais para confirmação de regeneração de cartilagem (experimento in vivo) [Exemplo 4]
[0068] A FIG. 6 ilustra um procedimento experimental em animal para confirmar se a cartilagem é regenerada. Especificamente, um experimento em animais para confirmar se a cartilagem foi regenerada foi realizado como a seguir. 1. A SVF obtida (105 a 107 células) foi misturada com soro fisiológico no qual 10 mg do pó de cartilagem hialina (MCCM) preparado foi disperso. 2. Após esse líquido misturado ter sido centrifugado a 1.000 rpm a 4 °C por 5 minutos, uma mistura de MCCM/SVF foi obtida removendo-se o sobrenadante de soro fisiológico. 3. A mistura de MCCM/SVF foi misturada com o uso de 1 ml de uma solução de aprotinina na qual fibrinogênio foi misturado e uma seringa de mistura. 4. 1 ml da solução de MCCM/SVF/fibrinogênio e 1 ml de uma solução de cloreto de cálcio na qual trombina foi dissolvida foram, cada uma, preparadas. 5. Um côndilo femoral de joelho de um beagle experimental foi exposto, e uma região defeituosa que tem um diâmetro de cerca de 6 mm e uma profundidade de cerca de 2 mm foi formada nessa parte. 6. A fim de fabricar um molde para estruturação, dados em 3D do sítio de cartilagem defeituoso do beagle experimental foram obtidos com o uso de um digitalizador 3D, e uma parede externa de policaprolactona de grade média (PCL) foi impressa com o uso de uma impressora 3D Bio 3D (INVIVO, ROKIT) com base nesses dados. Além disso, após a solução de MCCM/SVF/fibrinogênio e a solução de cloreto de cálcio na qual trombina foi dissolvida serem, cada uma, aplicadas de modo sequencial no molde para estruturação com o uso de uma impressora 3D Bio 3D (INVIVO, ROKIT), um arcabouço customizado para regeneração de cartilagem foi fabricado por endurecimento das soluções. 7. 100 μl de uma cola de fibrina (Beriplast) foram injetados na região defeituosa do beagle experimental, e o arcabouço customizado fabricado para regeneração de cartilagem foi implantado e, então, o sítio cirúrgico foi suturado. 8. Após 6 semanas, foi confirmado se condrócitos foram formados no arcabouço customizado implantado para regeneração de cartilagem.
[Exemplo Comparativo 2]
[0069] Um experimento em animais foi realizado da mesma maneira como descrito acima misturando-se apenas SVF com um líquido de aprotinina no qual fibrinogênio foi misturado sem MCCM.
[0070] As FIGS. 7 e 8, cada uma, mostram imagens durante um procedimento experimental em animal de Exemplo 4 e Exemplo Comparativo 2 de acordo com Exemplo Experimental 2 e uma imagem de imageamento de micro CT para uma região defeituosa 6 semanas após a implantação de um arcabouço. Nas FIGS. 7 e 8, pode ser confirmado que os resultados de imageamento de micro CT de acordo com Exemplo 4 exibem uma densidade óssea muito alta em comparação com os resultados de imageamento de micro CT de acordo com o Exemplo Comparativo 2. Devido a isso, pode ser confirmado que, no caso do Exemplo 4, com o uso de MCCM, há uma alta capacidade de produzir a cartilagem.
[0071] As FIGS. 9 e 10, cada uma, mostram um resultado de realizar coloração de safranina O em uma região defeituosa 6 semanas após a implantação do Exemplo Comparativo 2 e do Exemplo 4 de acordo com o Exemplo Experimental 2. Como resultado de coloração de safranina O, poderia ser confirmado que apenas no caso do Exemplo 4, a cartilagem na região defeituosa foi regenerada. Isso pode ser confirmado em uma porção na qual um volume expresso em vermelho é gerado na porção marcada com uma seta na FIG 10. Além disso, a porção expressa em vermelho na FIG. 9 é uma região na qual apenas cartilagem normal permanece quando a região defeituosa é fabricada.
[0072] As FIGS. 11 e 12, cada uma, mostram um resultado de realizar um tratamento de imuno-histoquímica (IHC) com colágeno tipo 1 a fim de confirmar qual tipo de cartilagem é regenerada em uma região defeituosa 6 semanas após a implantação do Exemplo Comparativo 2 e do Exemplo 4 de acordo com o Exemplo Experimental 2. O colágeno tipo 1 se liga a um anticorpo para confirmar fibrocartilagem, e serve para detectar apenas fibrocartilagem e expressar a fibrocartilagem em marrom. De acordo com a FIG. 12, pode ser confirmado que a porção regenerada na região defeituosa é expressa em azul, e pode ser observado que a cartilagem regenerada não é fibrocartilagem, mas cartilagem hialina, e é regenerada em condrócitos adequados para a região defeituosa. Em contrapartida, no caso da FIG. 11, uma diferenciação de região em cartilagem hialina não poderia ser confirmada.
[0073] As FIGS. 13 e 14, cada uma, mostram um resultado de realizar um tratamento de imuno-histoquímica (IHC) com colágeno tipo 2 a fim de confirmar qual tipo de cartilagem é regenerada em uma região defeituosa 6 semanas após a implantação do Exemplo Comparativo 2 e do Exemplo 4 de acordo com o Exemplo Experimental 2. O colágeno tipo 2 se liga a um anticorpo para confirmar cartilagem hialina, e serve para detectar apenas cartilagem hialina e expressar a cartilagem hialina em marrom. De acordo com a FIG. 14, pode ser confirmado que a porção regenerada na região defeituosa é expressa em marrom, e pode ser observado que a cartilagem regenerada não é fibrocartilagem, mas cartilagem hialina, e é regenerada em condrócitos adequados para a região defeituosa. Em contrapartida, no caso da FIG. 13, uma diferenciação de região em cartilagem hialina não poderia ser confirmada.
[0074] Através dos resultados dos Exemplos e dos Exemplos Comparativos, pode ser confirmado que, quando um arcabouço customizado para regeneração de cartilagem simultaneamente com o uso de uma fração vascular de estroma derivada de tecido adiposo e pó de cartilagem hialina é implantado como nos Exemplos, a diferenciação em condrócitos é efetivamente realizada e, além disso, a difusão e regeneração de condrócitos são aprimoradas.

Claims (13)

1. Composição de biotinta para regeneração de cartilagem, sendo a composição de biotinta caracterizada por compreender: um primeiro líquido que compreende uma fração vascular de estroma derivada de tecido adiposo, pó de cartilagem hialina, e fibrinogênio; e um segundo líquido que compreende trombina, em que o primeiro líquido compreende o fibrinogênio em uma quantidade de 65 mg a 115 mg por ml do primeiro líquido, e em que o segundo líquido compreende a trombina em uma quantidade de 400 IU a 600 IU por ml do segundo líquido.
2. Composição de biotinta, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que um teor da fração vascular de estroma derivada de tecido adiposo é 105 a 107 de células por ml do primeiro líquido.
3. Composição de biotinta, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que uma concentração do pó de cartilagem hialina é 0,005 % (p/v) a 0,1 % (p/v).
4. Composição de biotinta, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o primeiro líquido compreende ainda aprotinina.
5. Composição de biotinta, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o segundo líquido é trombina dissolvida em uma solução de cloreto de cálcio.
6. Composição de biotinta, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a fração vascular de estroma derivada de tecido adiposo é extraída a partir de um tecido adiposo autólogo.
7. Composição de biotinta, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o pó de cartilagem hialina é derivado de cartilagem hialina alogênica.
8. Composição de biotinta, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o pó de cartilagem hialina tem um diâmetro de partícula de 30 μm a 300 μm.
9. Composição de biotinta, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o pó de cartilagem hialina é derivado de cartilagem costal.
10. Método para fabricar um arcabouço customizado para regeneração de cartilagem, sendo o método caracterizado por compreender: a) obter dados em 3D de um sítio de cartilagem defeituoso com o uso de um digitalizador 3D, e fabricar um molde para estruturação com o uso de um impressora 3D; b) usar um primeiro líquido que compreende uma fração vascular de estroma derivada de tecido adiposo, pó de cartilagem hialina, e fibrinogênio e aplicar o primeiro líquido no molde para estruturação para formar uma primeira camada; c) aplicar um segundo líquido que compreende trombina na primeira camada para formar uma segunda camada; e d) formar um arcabouço customizado para regeneração de cartilagem ao permitir que a primeira camada e a segunda camada reajam entre si. em que o primeiro líquido compreende o fibrinogênio em uma quantidade de 65 mg a 115 mg por ml do primeiro líquido, e em que o segundo líquido compreende a trombina em uma quantidade de 400 IU a 600 IU por ml do segundo líquido.
11. Método, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que as etapas b) e c) são repetidas alternadamente.
12. Método, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a etapa d) é completada dentro de 10 minutos.
13. Método, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que as etapas b) e c) são realizadas usando impressão de jato de tinta ou impressão 3D.
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