ES2933951T3

ES2933951T3 - Composición de tinta biológica para la regeneración de cartílagos, método de fabricación de armazón personalizado para regeneración de cartílagos usando la misma y armazón personalizado para regeneración de cartílagos fabricado con el método de fabricación

Info

Publication number: ES2933951T3
Application number: ES18903638T
Authority: ES
Inventors: Seok Hwan You
Original assignee: Rokit Healthcare Inc
Current assignee: Rokit Healthcare Inc
Priority date: 2018-01-31
Filing date: 2018-08-23
Publication date: 2023-02-15
Anticipated expiration: 2038-08-23
Also published as: JP2021512681A; KR20200000421A; CN111670055B; WO2019151597A1; MX2020008033A; JOP20200189A1; RU2020124011A; KR102491318B1; JP7105899B2; BR112020015615A2; ECSP20045844A; SG11202007115QA; BR112020015615B1; CL2020002004A1; CO2020009497A2; EP3747477B1; KR102068176B1; CN111670055A; US20210038762A1; EP3747477A4

Abstract

La presente especificación se refiere a una composición de biotinta para la regeneración de cartílago, un método para fabricar un andamio personalizado para la regeneración de cartílago usando el mismo, y un andamio personalizado para la regeneración de cartílago fabricado usando dicho método de fabricación, comprendiendo la composición de biotinta: un primer líquido que comprende un tejido adiposo -fracción vascular estromal derivada, polvo de cartílago hialino y fibrinógeno; y un segundo líquido que comprende trombina. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Composición de tinta biológica para la regeneración de cartílagos, método de fabricación de armazón personalizado para regeneración de cartílagos usando la misma y armazón personalizado para regeneración de cartílagos fabricado con el método de fabricación

Campo técnico

La presente memoria descriptiva reivindica la prioridad y el beneficio de la solicitud de patente coreana N.° 10-2018-0012221 presentada en la Oficina de Propiedad Intelectual de Corea el 31 de enero de 2018.

La presente invención se refiere a una composición de tinta biológica para la regeneración de cartílago, a un método para fabricar un armazón personalizado para la regeneración de cartílago usando el mismo y a un armazón personalizado para la regeneración de cartílago fabricado usando dicho método de fabricación.

Técnica anterior

La artritis degenerativa es una enfermedad en la que aparecen cambios degenerativos locales mientras el cartílago articular se desgasta y también se llama osteoartritis u osteoartrosis. La artritis degenerativa es un tipo de artritis crónica y es una enfermedad en la cual se produce un cambio degenerativo en el cartílago articular que recibe una carga de peso, dando como resultado un crecimiento excesivo de hueso en la superficie de la articulación y a menudo se observa en adultos de mediana edad. En esta enfermedad, en primer lugar, el cartílago pierde elasticidad mientras que la función de los condrocitos que producen componentes de la composición del cartílago se deteriora debido al envejecimiento. Por otra parte, a medida que pasar el tiempo, la superficie del cartílago se vuelve áspera y varios tipos de materiales fluyen hacia la cavidad articular rodeada por la membrana articular para causar inflamación. Clínicamente, aparecen dolor recurrente, rigidez de las articulaciones, un trastorno progresivo del movimiento progresivo en la articulación y similares. La causa de la artritis degenerativa está estrechamente asociada con los fenómenos de envejecimiento o el peso corporal excesivo, y la artritis degenerativa aparece con mayor frecuencia y más gravedad en las mujeres a medida que envejecen. Como síntoma inicial, una o dos articulaciones exhiben un dolor punzante junto con rigidez y, cuando se prolonga, se produce el endurecimiento del hueso subcondral, formación excesiva del hueso alrededor de la articulación, deformación de la articulación y similares.

La causa de los cambios degenerativos en el cartílago articular aún no se ha dilucidado, pero se sabe que la disminución absoluta en el número de condrocitos y el desequilibrio entre la síntesis y la degradación de la matriz del cartílago que se produce en los condrocitos es una de las causas. Por tanto, los cambios degenerativos en el cartílago articular reducen la resistencia y la capacidad del cartílago como amortiguador debido a la degradación de la matriz del cartílago.

Los agentes terapéuticos celulares existentes tienen la desventaja de que las células implantadas están sesgadas en una dirección debido a la gravedad, de modo que es difícil distribuir uniformemente el agente terapéutico en un sitio defectuoso, y existe dificultad en el injerto celular, que reduce la regeneración celular en el sitio del defecto del cartílago. Además, en el caso de la implantación de condrocitos autólogos y la implantación de células madre, se aplica un tejido a un paciente mediante un proceso de cultivo después de extraer el tejido, por lo que se requieren dos cirugías y se requiere un período de cultivo celular o manipulación de aproximadamente 4 semanas. Además, con esto existen problemas debido a la gravedad, es difícil que las células implantadas se distribuyan uniformemente y se injerten en un sitio defectuoso, y se induce la diferenciación en el fibrocartílago en lugar del cartílago hialino, para que se produzca fácilmente un fenómeno en el cual el cartílago se descompone. Por tanto, existe la necesidad de desarrollar un método capaz de regenerar con eficacia las células en un sitio con defectos de cartílago.

Documentos de la técnica anterior

Documento de patente

Solicitud de Patente KR abierta a inspección pública N.° 10-2017-0012099

En el documento EP2998392 se desvela la preparación de armazones de hidrogel de fibrina/cartílago que comprenden células estromales derivadas de cuerpo adiposo mezclando partículas de cartílago hialino criomolido (1,5 % p/v) con fibrinógeno (100 mg/ml), mezclando la suspensión con las células estromales, añadiendo a moldes de forma apropiada, seguido de la adición de trombina.

Divulgación

Problema técnico

La presente invención se ha realizado en un esfuerzo por proporcionar una composición de tinta biológica para la regeneración de cartílago para fabricar un armazón personalizado para la regeneración de cartílago de un sitio de deficiencia de cartílago. Adicionalmente, la presente invención se ha realizado en un esfuerzo por proporcionar un método para fabricar un armazón personalizado para la regeneración de cartílago usando la composición de tinta biológica para la regeneración de cartílago, y un armazón personalizado para la regeneración de cartílago fabricado usando el mismo.

Solución técnica

La presente invención proporciona una composición de tinta biológica para la regeneración de cartílago, comprendiendo la composición de tinta biológica: un primer líquido que comprende una fracción vascular estromal derivada de tejido adiposo, polvo de cartílago hialino, y fibrinógeno, en donde el primer líquido comprende fibrinógeno en una cantidad de 65 mg a 115 mg por ml del primer líquido; y un segundo líquido que comprende trombina disuelta en una solución de cloruro de calcio, en donde el segundo líquido comprende trombina en una cantidad de 400 UI a 600 UI y de 5 mg a 6,5 mg de cloruro de calcio por ml del segundo líquido.

La presente invención proporciona un método para fabricar un armazón personalizado para la regeneración de cartílago, comprendiendo el método: a) obtener datos 3D de un sitio de deficiencia de cartílago usando un escáner 3D y fabricar un molde para armazones usando una impresora 3D; b) usar un primer líquido que comprende una fracción vascular estromal derivada de tejido adiposo, polvo de cartílago hialino y fibrinógeno, en donde el primer líquido comprende fibrinógeno en una cantidad de 65 mg a 115 mg por ml del primer líquido, y aplicar el primer líquido en el molde para armazones para formar una primera capa; c) aplicar sobre la primera capa un segundo líquido que comprende trombina disuelta en una solución de cloruro de sodio para formar una segunda capa, en donde el segundo líquido comprende trombina en una cantidad de 400 UI a 600 UI y de 5 mg a 6,5 mg de cloruro de calcio por ml del segundo líquido y d) formar un armazón personalizado para la regeneración de cartílago permitiendo que la primera capa y la segunda capa reaccionen entre sí.

La presente invención proporciona un armazón personalizado para la regeneración de cartílago fabricado usando el método de fabricación.

Efectos ventajosos

Una composición de tinta biológica para la regeneración de cartílago de acuerdo con la presente invención tiene la ventaja de que se puede fabricar un armazón personalizado para la regeneración de cartílago.

Un armazón personalizado para la regeneración de cartílago fabricado usando la composición de tinta biológica para la regeneración de cartílago según la presente invención puede tratar eficazmente el cartílago potenciando la capacidad de una fracción vascular estromal derivada de tejido adiposo implantada para diferenciarse en el cartílago y, además, aumentar la regeneración del cartílago en el sitio implantado.

El armazón personalizado para la regeneración de cartílago según la presente invención tiene una excelente fuerza de unión a un área afectada y tiene una ventaja en que la capacidad de diferenciación de cartílago y un efecto de regeneración de cartílago son excelentes debido a la excelente fuerza de unión.

Un método para fabricar un armazón personalizado para la regeneración de cartílago según la presente invención tiene la ventaja de que un armazón puede implantarse mediante un único procedimiento quirúrgico porque un armazón personalizado para la regeneración de cartílago puede fabricarse inmediatamente escaneando en 3D un sitio de deficiencia de cartílago de un área afectada en un quirófano.

Descripción de dibujos

La figura 1 ilustra un proceso de fabricación de un sedimento para confirmar la capacidad de diferenciación de cartílago del ejemplo experimental 1.

La figura 2 muestra el resultado de realizar tinción con safranina O en un sedimento del ejemplo comparativo 1 (MCCM 0 mg) de acuerdo con el ejemplo experimental 1.

La figura 3 muestra el resultado de realizar la tinción con safranina O en un sedimento del ejemplo 1 (MCCM 10 mg) de acuerdo con el ejemplo experimental 1.

La figura 4 muestra el resultado de realizar la tinción con safranina O en un sedimento del ejemplo 2 (MCCM 50 mg) de acuerdo con el ejemplo experimental 1.

La figura 5 muestra el resultado de realizar la tinción con safranina O en un sedimento del ejemplo 3 (MCCM 100 mg) de acuerdo con el ejemplo experimental 1.

La figura 6 ilustra un procedimiento experimental en animales para confirmar si el cartílago del ejemplo experimental 2 se regenera.

La figura 7 muestra imágenes durante un procedimiento experimental en animales del ejemplo 4 de acuerdo con el ejemplo experimental 2 y una prueba de imagen de micro CT para una región defectuosa 6 semanas después de la implantación de un armazón.

La figura 8 muestra imágenes durante un procedimiento experimental en animales del ejemplo comparativo 2 según el ejemplo experimental 2 y una prueba de imagen micro TC para una región defectuosa 6 semanas después de la implantación de un armazón.

La figura 9 muestra el resultado de realizar tinción con safranina O en una región defectuosa 6 semanas después de la implantación del ejemplo comparativo 2 de acuerdo con el ejemplo experimental 2.

La figura 10 muestra el resultado de realizar tinción con safranina O en una región defectuosa 6 semanas después de la implantación del ejemplo 4 de acuerdo con el ejemplo experimental 2.

La figura 11 muestra el resultado de realizar un tratamiento de inmunohistoquímica (IHC) con colágeno e tipo 1 en una región defectuosa 6 semanas después de la implantación del ejemplo comparativo 2 de acuerdo con el ejemplo experimental 2.

La figura 12 muestra el resultado de realizar un tratamiento de inmunohistoquímica (IHC) con colágeno tipo 1 en una región defectuosa 6 semanas después de la implantación del ejemplo 4 de acuerdo con el ejemplo experimental 2. La figura 13 muestra el resultado de realizar un tratamiento de inmunohistoquímica (IHC) con colágeno e tipo 2 en una región defectuosa 6 semanas después de la implantación del ejemplo comparativo 2 de acuerdo con el ejemplo experimental 2.

La figura 14 muestra el resultado de realizar un tratamiento de inmunohistoquímica (IHC) con colágeno tipo 2 en una región defectuosa 6 semanas después de la implantación del ejemplo 4 de acuerdo con el ejemplo experimental 2.

Modos de la invención

Cuando un elemento está dispuesto "sobre" otro elemento en la presente memoria descriptiva, esto incluye no solo un caso en el que un elemento se pone en contacto con otro elemento, sino también un caso en el que todavía hay otro elemento presente entre los dos elementos.

Cuando una parte "incluye" un elemento constituyente en la presente memoria descriptiva, a menos que se describa específicamente lo contrario, esto no significa que se excluya otro elemento constituyente, sino que significa que otro elemento constituyente puede incluirse también.

En lo sucesivo en el presente documento, la presente invención se describirá en detalle.

La composición de tinta biológica para la regeneración de cartílago según la presente invención es del tipo de dos líquidos, y el primer líquido y el segundo líquido se aplican secuencialmente y luego reaccionan para formar un armazón para la regeneración de cartílago. En concreto, la trombina en el segundo líquido puede reaccionar con el fibrinógeno en el primer líquido para formar una red de fibrina, que puede servir para fijar suficientemente la fracción vascular estromal derivada del tejido adiposo y el polvo de cartílago hialino.

La fracción vascular estromal derivada de tejido adiposo incluye células madre derivadas de tejido adiposo. Preferentemente, la fracción vascular estromal derivada de tejido adiposo puede no incluir sustancialmente células (por ejemplo, adipocitos, eritrocitos, otras células estromales y similares) que no sean células madre derivadas de tejido adiposo y materiales de matriz extracelular, y, más preferentemente, puede no incluir otras células y materiales de matriz extracelular en absoluto.

La fracción vascular estromal derivada de tejido adiposo puede extraerse de un tejido adiposo de un animal alogénico o un animal heterólogo. Preferentemente, la fracción vascular estromal derivada de tejido adiposo puede extraerse de un tejido adiposo autólogo. De manera más específica, la fracción vascular estromal derivada de tejido adiposo puede extraerse usando adipocitos de un paciente o animal a tratar.

Según una realización de ejemplo de la presente invención, un contenido de la fracción vascular estromal derivada de tejido adiposo puede ser de 105 a 107 células / ml de la primera solución. Cuando el contenido de la fracción vascular estromal derivada de tejido adiposo está dentro del intervalo anterior, la capacidad de diferenciación de cartílago y la capacidad de regeneración de cartílago de un armazón que se va a fabricar pueden mejorarse significativamente.

La fracción vascular estromal derivada del tejido adiposo puede usarse con polvo de cartílago hialino para diferenciarse en células de cartílago, y cuando el armazón personalizado para la regeneración de cartílago se implanta en un área afectada por este motivo, la diferenciación en condrocitos puede ser inducida activamente.

El polvo de cartílago hialino puede ser un elemento que constituye un soporte de armazón fabricado usando la composición de tinta biológica para la regeneración de cartílago. En concreto, una matriz de fibrina a través de la reacción de fibrinógeno y trombina puede permitir que las partículas del polvo de cartílago hialino se unan entre sí.

El polvo de cartílago hialino puede derivarse de cartílago hialino alogénico o heterólogo. Preferentemente, el polvo de cartílago hialino puede derivarse del cartílago hialino alogénico. En concreto, cuando un sujeto que va a someterse a un tratamiento de cartílago es un ser humano, se puede usar polvo de cartílago hialino extraído de cartílago hialino humano. Además, cuando un sujeto que se va a someter a tratamiento de cartílago es un animal, se puede utilizar polvo de cartílago hialino extraído del cartílago hialino de un animal de la misma especie.

El polvo de cartílago hialino puede inducir la diferenciación de la fracción vascular estromal derivada de tejido adiposo en condrocitos a través de la liberación de factores de crecimiento relacionados con la regeneración del cartílago. Adicionalmente, las proteínas incluidas en el polvo de cartílago hialino pueden servir para ayudar en la regeneración activa del cartílago en un área afectada.

Según una realización de ejemplo de la presente invención, el polvo de cartílago hialino puede proceder del cartílago costal. En concreto, cuando el armazón personalizado para la regeneración de cartílago se aplica a un ser humano, el polvo de cartílago hialino puede proceder del cartílago costal humano. Además, cuando el armazón personalizado para la regeneración de cartílago se aplica a un animal, el polvo de cartílago hialino puede proceder del cartílago costal de la misma especie que la del animal sujeto. Por ejemplo, el polvo de cartílago hialino puede usarse pulverizando cartílago costal alogénico comercialmente disponible.

Según una realización de ejemplo de la presente invención, el polvo de cartílago hialino puede tener un diámetro de partícula de 30 pm a 300 pm. Cuando el diámetro de partícula promedio del polvo de cartílago hialino está dentro del intervalo anterior, existe la ventaja de que los condrocitos se diferencian y regeneran efectivamente.

Según una realización de ejemplo de la presente invención, la concentración del polvo de cartílago hialino puede ser del 0,005 % (p / v) al 0,1 % (p / v). Esto es, el polvo de cartílago hialino puede incluirse en una cantidad de 0,005 g a 0,1 g por ml del primer líquido. Una concentración del polvo de cartílago hialino puede ser, preferentemente, de 0,005 % (p / v) a 0,07 % (p / v), más preferentemente de 0,005 % (p / v) a 0,03 % (p / v), y, lo más preferentemente, de 0,007 % (p / v) a 0,03 % (p / v). Cuando la concentración del polvo de cartílago hialino está dentro del intervalo anterior, la capacidad de supervivencia de los condrocitos, la diferenciación en condrocitos y la morfología pueden realizarse de manera excelente después de la implantación de un armazón personalizado para la regeneración de cartílago.

Según una realización de ejemplo de la presente invención, el número de células de la fracción vascular estromal derivada de tejido adiposo puede ser de 105 a 107 con respecto a de 5 mg a 100 mg del polvo de cartílago hialino. Preferentemente, el número de células de la fracción vascular estromal derivada de tejido adiposo puede ser de 105 a 107 con respecto a de 5 mg a 70 mg del polvo de cartílago hialino. Más preferentemente, el número de células de la fracción vascular estromal derivada de tejido adiposo puede ser de 105 a 107 con respecto a de 5 mg a 30 mg del polvo de cartílago hialino.

Según una realización de ejemplo de la presente invención, el primer líquido puede incluir además aprotinina. La aprotinina es un inhibidor de las enzimas proteolíticas secretadas por el páncreas y es un polipéptido que consiste en un total de 58 aminoácidos. La aprotinina generalmente se extrae de los pulmones de ganado vacuno y se sabe que realiza una acción hemostática al inhibir la degradación de la fibrina en la sangre.

Según la presente invención, el fibrinógeno se incluye en una cantidad de 65 mg a 115 mg por ml del primer líquido.

Según una realización de ejemplo de la presente invención, la aprotinina puede incluirse en una cantidad de 900 unidades inactivadoras de cininógeno (KlU) a 1.1000 KIU, específicamente 1.000 KIU, por ml del primer líquido.

En concreto, según una realización de ejemplo de la presente invención, el primer líquido puede incluir de 105 a 107 células de fracción vascular estromal derivadas de tejido adiposo, de 5 mg a 100 mg de polvo de cartílago hialino, de 65 mg a 115 mg de fibrinógeno, y de 900 KlU a 1.100 KlU de aprotinina por ml del primer líquido.

Según la presente invención, el segundo líquido comprende trombina disuelta en una solución de cloruro de calcio. El segundo líquido incluye de 400 Ul a 600 Ul de trombina y de 5 mg a 6,5 mg de cloruro de calcio por ml del segundo líquido.

Un disolvente del primer líquido y el segundo líquido puede ser agua, solución salina fisiológica específica. Además, el fibrinógeno en el primer líquido y la trombina en el segundo líquido pueden obtenerse mediante un kit de pegamento de fibrina disponible comercialmente.

Dado que la reacción del primer líquido y el segundo líquido se completa en 10 minutos, preferentemente en 5 minutos, la composición de tinta biológica para la regeneración de cartílago tiene la ventaja de que un armazón personalizado para el paciente para la regeneración de cartílago se puede fabricar inmediatamente usando una impresora 3D en un sitio de tratamiento.

La presente invención usa un pegamento de fibrina que incluye fibrinógeno y fibrina como adhesivo, que puede asegurar una viscosidad más alta que la de un adhesivo de ácido hialurónico o adhesivo de colágeno, para que el armazón personalizado para la regeneración de cartílago tenga una excelente fuerza de unión a un área afectada y, además, pueda mantener una alta resistencia.

La presente invención proporciona un método para fabricar un armazón personalizado para la regeneración de cartílago, comprendiendo el método: a) obtener datos 3D de un sitio de deficiencia de cartílago usando un escáner 3D y fabricar un molde para armazones usando una impresora 3D; b) usar un primer líquido que comprende una fracción vascular estromal derivada de tejido adiposo, polvo de cartílago hialino y fibrinógeno, en donde el primer líquido comprende fibrinógeno en una cantidad de 65 mg a 115 mg por ml del primer líquido, y aplicar el primer líquido en el molde para armazones para formar una primera capa; c) aplicar sobre la primera capa un segundo líquido que comprende trombina disuelta en una solución de cloruro de calcio para formar una segunda capa, en donde el segundo líquido comprende trombina en una cantidad de 400 UI a 600 UI y de 5 mg a 6,5 mg de cloruro de calcio por ml del segundo líquido; y d) formar un armazón personalizado para la regeneración de cartílago permitiendo que la primera capa y la segunda capa reaccionen entre sí.

En la etapa a), se pueden usar equipos de escáner 3D y equipos de impresión 3D conocidos en la técnica. Además, el molde para el armazón puede servir para fijar una forma tridimensional cuando se aplican el primer líquido y el segundo líquido. El molde para armazón puede retirarse después de formar el armazón para la regeneración de cartílago. El molde para el armazón puede formarse usando un polímero biocompatible generalmente usado en la técnica.

De acuerdo con una realización de ejemplo de la presente invención, las etapas b) y c) pueden realizarse usando impresión por inyección de tinta o impresión 3D. En concreto, en las etapas b) y c), se puede usar un dispositivo de impresión que tiene dos o más boquillas conocidas en la técnica, y se puede crear una forma tridimensional descargando el primer líquido y el segundo líquido desde las boquillas respectivas.

De acuerdo con una realización de ejemplo de la presente invención, las etapas b) y c) pueden repetirse alternativamente. En concreto, cuando es necesario formar un armazón de gran volumen para la regeneración de cartílago, las etapas b) y c) se realizan alternativamente para laminar capas como en "primera capa / segunda capa / primera capa / segunda capa, y luego las capas pueden coagularse para formar un armazón para la regeneración de cartílago.

De acuerdo con una realización de ejemplo de la presente invención, la etapa d) puede completarse en 10 minutos, preferentemente en 5 minutos. En concreto, en la etapa d), se puede realizar una reacción durante 3 minutos a 7 minutos y la primera capa y la segunda capa se pueden hacer reaccionar para formar un armazón para la regeneración de cartílago.

En el caso de la implantación de condrocitos autólogos existentes y la implantación de células madre, existe un problema en el sentido de que después de realizar la incisión primaria en un área afectada para extraer un tejido del área del deficiencia de cartílago de un paciente, se requiere la incisión secundaria para la implantación en el área afectada a través de un proceso de cultivo del tejido, de modo que se requieren dos procedimientos quirúrgicos. En cambio, el método para fabricar un armazón personalizado para la regeneración de cartílago tiene la ventaja de que después de que se confirma una región de deficiencia de cartílago a través de la incisión primaria, se fabrica un armazón correspondiente a la región de deficiencia de cartílago en un corto período de tiempo y puede implantarse en la región de deficiencia de cartílago. Esto es, el método para fabricar un armazón personalizado para la regeneración de cartílago tiene la ventaja de que un armazón personalizado puede implantarse en un área afectada mediante una sola incisión.

El armazón personalizado para la regeneración de cartílago puede fabricarse en una forma correspondiente a una región de deficiencia de cartílago en un corto período de tiempo e implantarse, como se ha descrito anteriormente. El armazón personalizado para la regeneración de cartílago no requiere un proceso de cultivo para las células, una fracción vascular estromal derivada de tejido adiposo en el armazón después de la implantación se diferencia en condrocitos y el polvo de cartílago hialino puede activar la regeneración del cartílago y mejorar la viabilidad de los condrocitos regenerados.

Cuando el armazón personalizado para la regeneración de cartílago se implanta en un área afectada, puede inducirse la regeneración del cartílago hialino natural a través de factores de crecimiento del cartílago hialino y proteínas secretadas por el polvo de cartílago hialino. Cuando el armazón personalizado para la regeneración de cartílago se aplica a un área afectada de esta manera, el área afectada puede restaurarse efectivamente al mismo estado o similar al del cartílago original.

En lo sucesivo en el presente documento, la presente invención se describirá en detalle con referencia a ejemplos para describir específicamente la presente invención. Sin embargo, los ejemplos de acuerdo con la presente invención pueden modificarse en varias formas diferentes, y no debe interpretarse que el alcance de la presente invención está limitado a los ejemplos que se describen a continuación. Los ejemplos de la presente memoria descriptiva se proporcionan para explicar más completamente la presente invención a los expertos en la materia.

Aislamiento de células de la fracción vascular estromal derivada de tejido adiposo (SVF)

Se obtuvieron células de fracción vascular estromal derivada de tejido adiposo (SVF) a través de las siguientes etapas.

1. Se extrajeron aproximadamente 60 cc de tejido adiposo realizando una liposucción dirigida por un médico en un quirófano estéril, y se añadió fago lipídico de colagenasa al 0,075 % en la misma cantidad al tejido y la mezcla resultante se dejó reaccionar agitando la incubación a 230 rpm a una temperatura de 37 °C durante 30 minutos. 2. Después de la reacción como se ha descrito anteriormente, se centrifugaron 420 g del producto de reacción a 25 °C durante 10 minutos y, como resultado de la centrifugación, el producto de reacción se dividió en tres capas de una capa de sedimentos de SVF, una capa de colagenasa y una capa de aceite.

3. Después de que la solución superior, excepto la capa de sedimentos de SVF, se retiró y la capa de pastillas de SVF se resuspendió en solución salina tamponada con fosfato (PBS), los materiales fibrosos y las impurezas restantes de la capa de SVF resuspendida se eliminaron usando un filtro de nylon de 100 pm (retenedor celular).

4. Después de resuspender y centrifugar tres veces una solución que incluye la SVF filtrada, se eliminaron todos los materiales restantes, excepto el sedimento en la capa inferior y, luego, como resultado del cálculo de las células nucleadas usando un contador de células, se pudo confirmar que se habían obtenido de 105 a 107 células SVF.

Preparación de polvo de cartílago hialino

El polvo de cartílago hialino se preparó como un polvo que tiene un tamaño de partícula de 30 pm a 300 pm usando cartílago costal disponible comercialmente. En lo sucesivo en el presente documento, el polvo de cartílago hialino se denominará matriz de cartílago costal micronizada.

Ejemplo experimental 1: Fabricación de sedimentos para confirmar la diferenciación condrogénica (experimento in vitro)

Ejemplos 1 a 3

La figura 1 ilustra un proceso de fabricación de un sedimento para confirmar la capacidad de diferenciación de cartílago. En concreto, se realizó un experimento para confirmar la capacidad de diferenciación del cartílago de la siguiente manera.

1. La SVF obtenida (105 a 107 células) se mezcló con solución salina fisiológica en la que se dispersaron 10 mg (Ejemplo 1), 50 mg (Ejemplo 2) y 100 mg (Ejemplo 3) del polvo de cartílago hialino preparado (MCCM).

2. Después de que este líquido mezclado se centrifugara a 1.000 rpm a 4 °C durante 5 minutos, se obtuvo una mezcla de MCCM / SVF eliminando el sobrenadante salino fisiológico.

3. La mezcla de MCCM / SVF se mezcló con 1 ml de un líquido de aprotinina en el que se mezcló fibrinógeno usando una jeringuilla de mezcla.

4. 1 ml de la solución de MCCM / SVF / fibrinógeno y 1 ml de una solución de cloruro de calcio en la que se dispersó la trombina se conectaron a una pieza en Y se dispensaron 20 pl de cada solución en un tubo cónico de 15 ml y se endurecieron a temperatura ambiente durante 5 minutos para formar un sedimento.

5. Los medios libres de factor de crecimiento se intercambiaron y administraron tres veces a la semana, de modo que el sedimento estaba lo suficientemente sumergido, el sedimento se incubó en condiciones de 37 °C y 5 % de CO²durante 5 semanas, y luego se confirmó la diferenciación condrogénica realizando tinción con safranina O.

Ejemplo comparativo 1

Se formó un sedimento y se incubó de la misma manera que se ha descrito anteriormente mezclando solo SVF con un líquido de aprotinina en el que se mezcló fibrinógeno sin MCCM (0 mg de MCCM, Ejemplo comparativo 1), y luego se confirmó la diferenciación condrogénica realizando tinción con safranina O.

Las figuras 2 a 5 muestran cada una un resultado de la tinción con safranina O en un sedimento de acuerdo con el Ejemplo Comparativo 1 (0 mg de MCCM), el Ejemplo 1 (10 mg de MCCM), el Ejemplo 2 (50 mg de MCCM) y el Ejemplo 3 (100 mg de MCCM). En las figuras 2 y 5, se pudo confirmar que la porción de cartílago y MCCM se tiñeron de rojo de acuerdo con la tinción con safranina O y se observaron núcleos de condrocitos alrededor de los MCCM en los Ejemplos 1 a 3, y se pudo confirmar que había varios condrocitos vivos. Sin embargo, no se pudo confirmar que en el caso del Ejemplo comparativo 1 en el que no se utilizó MCCM, se hubieran diferenciado condrocitos. Con estos resultados, se pudo deducir que las proteínas MCCM, los factores de crecimiento y similares se habían liberado y habían inducido la diferenciación de la SVF en condrocitos. Adicionalmente, con respecto al contenido de MCCM, se pudo confirmar que el Ejemplo 1 (10 mg de MCCM) tenía la viabilidad y diferenciación de condrocitos más activa en condrocitos en comparación con los Ejemplos 2 y 3. Esto es, cuando el contenido de MCCM es demasiado alto, se determina que la diferenciación en condrocitos se retrasa porque se reduce el espacio donde la SVF puede diferenciarse en condrocitos.

Ejemplo experimental 2: experimento con animales para confirmar la regeneración de cartílago (experimento in vivo)

Ejemplo 4

La figura 6 ilustra un procedimiento experimental en animales para confirmar si el cartílago se regenera. En concreto, se realizó un experimento con animales para confirmar si el cartílago se había regenerado de la siguiente manera.

1. La SVF obtenida (105 a 107 células) se mezcló con solución salina fisiológica en la que se dispersaron 10 mg del polvo de cartílago hialino preparado (MCCM).

3. La mezcla de MCCM / SVF se mezcló usando 1 ml de un solución de aprotinina en el que se mezcló fibrinógeno usando una jeringuilla de mezcla.

4. Se prepararon 1 ml de la solución de MCCM / SVF / fibrinógeno y 1 ml de una solución de cloruro de calcio en la que se dispersó trombina.

5. Se expuso un cóndilo femoral de rodilla de un beagle experimental, y en esta parte se formó una región defectuosa que tenía un diámetro de aproximadamente 6 mm y una profundidad de aproximadamente 2 mm.

6. Para fabricar un molde para armazón, los datos 3D del sitio del deficiencia de cartílago del beagle experimental se obtuvieron usando un escáner 3D, y se imprimió una pared externa de policaprolactona de calidad médica (PCL) usando una impresora 3D Bio 3D (INVIVO, ROKIT) basada en estos datos. Adicionalmente, después de que la solución MCCM / SVF / fibrinógeno y la solución de cloruro de calcio en la que se dispersó la trombina se aplicaron cada una secuencialmente al molde para armazón usando una impresora 3D Bio 3D (INVIVO, ROKIT), se fabricó un armazón personalizado para la regeneración de cartílago endureciendo las soluciones.

7. Se inyectaron 100 pl de un pegamento de fibrina (Beriplast) en la región defectuosa del beagle experimental y se implantó el armazón personalizado fabricado para la regeneración de cartílago, y luego se suturó el sitio quirúrgico.

8. Después de 6 semanas, se confirmó si se habían formado condrocitos en el armazón personalizado implantado para la regeneración de cartílago.

Ejemplo comparativo 2

Se realizó un experimento con animales de la misma manera que se ha descrito anteriormente mezclando solo SVF con un líquido de aprotinina en el que se mezcló fibrinógeno sin MCCM.

Las figuras 7 y 8 muestra imágenes durante un procedimiento experimental en animales del ejemplo 4 y el ejemplo comparativo 2 según el ejemplo experimental 2 y una prueba de imagen micro TC para una región defectuosa 6 semanas después de la implantación de un armazón. En las figuras 7 y 8, se puede confirmar que los resultados de las imágenes de micro CT según el ejemplo 4 exhiben una densidad ósea muy alta en comparación con los resultados de las imágenes de micro CT según el ejemplo comparativo 2. A través de esto, se puede confirmar que en el caso del Ejemplo 4 usando MCCM, existe una gran capacidad para producir el cartílago.

Las figuras 9 y 10 muestra un resultado de realizar tinción con safranina O en una región defectuosa 6 semanas después de la implantación del ejemplo comparativo 2 y el ejemplo 4 de acuerdo con el ejemplo experimental 2. Como resultado de la tinción con safranina O, se pudo confirmar que solo en el caso del Ejemplo 4, se regeneró el cartílago en la región defectuosa. Esto puede confirmarse en una porción donde se genera un volumen expresado en rojo en la porción marcada con una flecha en la figura 10. Adicionalmente, la porción expresada en rojo en la figura 9 es una región donde solo queda cartílago normal cuando se fabrica la región defectuosa.

Las figuras 11 y 12 muestran cada una un resultado de realizar un tratamiento de inmunohistoquímica (IHC) con colágeno de tipo 1 para confirmar qué tipo de cartílago se regenera en una región defectuosa 6 semanas después de la implantación del Ejemplo Comparativo 2 y el Ejemplo 4 de acuerdo con el Ejemplo Experimental 2. El colágeno de tipo 1 se une a un anticuerpo para confirmar el fibrocartílago y sirve para detectar solo el fibrocartílago y expresar el fibrocartílago en marrón. De acuerdo con la figura 12, se puede confirmar que la porción regenerada en la región defectuosa se expresa en azul, y se puede ver que el cartílago regenerado no es fibrocartílago, sino cartílago hialino, y se regenera en condrocitos adecuados para la región defectuosa. En cambio, en el caso de la figura 11, no se pudo confirmar una región que se diferencia en cartílago hialino.

Las figuras 13 y 14 muestran cada una un resultado de realizar un tratamiento de inmunohistoquímica (IHC) con colágeno de tipo 2 para confirmar qué tipo de cartílago se regenera en una región defectuosa 6 semanas después de la implantación del Ejemplo Comparativo 2 y el Ejemplo 4 de acuerdo con el Ejemplo Experimental 2. El colágeno de tipo 2 se une a un anticuerpo para confirmar el cartílago hialino y sirve para detectar solo el cartílago hialino y expresar el cartílago hialino en marrón. De acuerdo con la figura 14, se puede confirmar que la porción regenerada en la región defectuosa se expresa en marrón, y se puede ver que el cartílago regenerado no es fibrocartílago, sino cartílago hialino, y se regenera en condrocitos adecuados para la región defectuosa. En cambio, en el caso de la figura 13, no se pudo confirmar una región que se diferencia en cartílago hialino.

A través de los resultados de los ejemplos y los ejemplos comparativos, se puede confirmar que cuando se implanta un armazón personalizado para la regeneración de cartílago simultáneamente usando una fracción vascular estromal derivada de tejido adiposo y polvo de cartílago hialino como en los Ejemplos, la diferenciación en condrocitos se realiza de manera efectiva y, además, se mejora la difusión y regeneración de los condrocitos.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una composición de tinta biológica para la regeneración de cartílagos, comprendiendo la composición de tinta biológica:

un primer líquido que comprende una fracción vascular estromal derivada de tejido adiposo, polvo de cartílago hialino y fibrinógeno, en donde el primer líquido comprende fibrinógeno en una cantidad de 65 mg a 115 mg por ml del primer líquido; y

un segundo líquido que comprende trombina disuelta en una solución de cloruro de calcio, en donde el segundo líquido comprende trombina en una cantidad de 400 UI a 600 UI y de 5 mg a 6,5 mg de cloruro de calcio por ml del segundo líquido.

2. La composición de tinta biológica de la reivindicación 1, en donde un contenido de la fracción vascular estromal derivada de tejido adiposo es de 105 a 107 células por ml del primer líquido.

3. La composición de tinta biológica de la reivindicación 1, en donde una concentración del polvo de cartílago hialino es del 0,005 % (p/v) al 0,1 % (p/v).

4. La composición de tinta biológica de la reivindicación 1, en donde el primer líquido comprende además aprotinina.

5. La composición de tinta biológica de la reivindicación 1, en donde la fracción vascular estromal derivada de tejido adiposo se extrae de un tejido adiposo autólogo.

6. La composición de tinta biológica de la reivindicación 1, en donde el polvo de cartílago hialino deriva de cartílago hialino alogénico.

7. La composición de tinta biológica de la reivindicación 1, en donde el polvo de cartílago hialino tiene un diámetro de partícula de 30 pm a 300 pm.

8. La composición de tinta biológica de la reivindicación 1, en donde el polvo de cartílago hialino deriva del cartílago costal.

9. Un método para fabricar un armazón personalizado para la regeneración de cartílago, comprendiendo el método: a) obtener datos 3D de un sitio de deficiencia de cartílago usando un escáner 3D y fabricar un molde para armazones usando una impresora 3D;

b) usar un primer líquido que comprende una fracción vascular estromal derivada de tejido adiposo, polvo de cartílago hialino y fibrinógeno, en donde el primer líquido comprende fibrinógeno en una cantidad de 65 mg a 115 mg por ml del primer líquido, y aplicar el primer líquido en el molde para armazones para formar una primera capa;

c) aplicar sobre la primera capa un segundo líquido que comprende trombina disuelta en una solución de cloruro de sodio para formar una segunda capa, en donde el segundo líquido comprende trombina en una cantidad de 400 UI a 600 UI y de 5 mg a 6,5 mg de cloruro de calcio por ml del segundo líquido y

formar un armazón personalizado para la regeneración de cartílagos permitiendo que la primera capa y la segunda capa reaccionen entre sí.

10. El método de la reivindicación 9, en donde las etapas b) y c) se repiten alternativamente.

11. El método de la reivindicación 9, en donde la etapa d) se completa en 10 minutos.

12. El método de la reivindicación 9, en donde las etapas b) y c) se realizan usando impresión de inyección de tinta o impresión 3D.

13. Un armazón personalizado para la regeneración de cartílago fabricado usando el método de la reivindicación 9.