KR102332926B1

KR102332926B1 - 코중격 연골세포를 포함하는 연골손상 치료용 약학적 조성물

Info

Publication number: KR102332926B1
Application number: KR1020190099786A
Authority: KR
Inventors: 김성원; 전정호; 박선화; 임정연; 임미현
Original assignee: 가톨릭대학교 산학협력단
Priority date: 2018-08-16
Filing date: 2019-08-14
Publication date: 2021-11-30
Also published as: KR102332926B9; KR20200020625A; US20210196760A1

Abstract

본 발명은 코중격 연골세포(nasal septum chondrocyte, NSC)를 유효성분으로 포함하는 연골손상 치료용 약학적 조성물 및 상기 코중격 연골세포를 스페로이드(spheroid) 형태로 제조하는 방법에 관한 것으로 코중격 연골세포는 연골의 구성성분인 콜라겐 타입2 및 연골세포 분화에 관여하는 속스9(SOX9)를 발현하고 연골손상동물 모델에 스페로이드 형태 코중격 연골세포를 투여한 결과 우수한 연골 치료 효과를 보였는 바, 본 발명의 약학적 조성물과 코중격 연골세포 제조방법은 자가 연골세포 이식술(Autologous chondrocyte implantation) 분야에 유용하게 이용될 수 있다.

Description

코중격 연골세포를 포함하는 연골손상 치료용 약학적 조성물 {Pharmaceutical composition for treating cartilage damage comprising nasal septum cartilage cell}

본 발명은 코중격 연골세포(nasal septum chondrocyte, NSC)를 유효성분으로 포함하는 연골손상 치료용 약학적 조성물 및 상기 코중격 연골세포를 스페로이드(spheroid) 형태로 제조하는 방법에 관한 것이다.

관절연골(Articular cartilage)은 조밀하고, 탄력있는 결합조직(connective tissue)으로 구성되어 있으며, 뼈대(skeleton)에서 몇몇의 연결지점 부분에 위치하고 있다. 연골은 뼈(bone)와 연결되어 있으며 표면은 연결부분으로 다른 연골과 닿아 있다. 연골은 도관조직(avascular tissue)이며 신경이 분포되어있지 않고, 대개 싱글셀(single cell) 종류의 기본적인 연골세포로 구성되어 있고 세포외 기질(extracellular matrix, ECM)으로 합성되어 있다.

관절연골 치료는 여전히 현대 의학에서 풀리지 않은 문제로 남아있으며, 치료방법이 존재하지만 많은 문제가 남아있다. 큰 문제 중 하나는 관절연골이 자가치유능력(self-repair capacity)이 매우 낮다는 것이다. 이러한 문제를 해결하기 위해 재생의료(regenerative medicine)가 개발되기 시작했고 연골조직 엔지니어링(Cartilage tissue engineering)은 생물학적 대체(biological replacement)를 통해 조직을 복구하게 된다.

자가 연골세포 이식술(Autologous chondrocyte implantation, ACI) 테크닉은 관절연골 표면의 넓은 면적이 손상 받으면 사용하게 되는데, 이때 이식하게 되는 자가 연골세포는 건강한 관절 연골을 조금 생검(biopsy) 하여 효소로 분리하여 얻는다. 다만, 일반적으로 알려진 자연적으로 일어나는 자가 연골세포는 한계를 가지고 있다.

연골세포 재분화(chondrocyte redifferentiation)는 인 비트로(in vitro) 익스펜션 컬쳐(expansion culture)하게되면 제한이 있으며, 분화(chondrogenic) 포텐셜은 도너(donor)의 나이에 따라 줄어들게 되고, 많은 양의 세포을 사용하게 되는 자가 연골세포 이식술 특성상 세포의 증식(proliferation)이 중요한데 관절 연골세 포의 경우 증식력이 많이 낮은 편으로 알려져 있다. 사람 코중격 연골세포는 사람 관절 연골세포가 가지고 있는 이러한 문제점을 보완할 수 있다. 사람 코중격 연골세포는 증식률이 사람 관절 연골세포보다 높고, 분화능력(chondrogenic capacity) 또한 인 비트로(in vitro)와 인 비보(in vivo)상에서 둘 다 높고, 도너의 나이 의존적으로 떨어지지 않는 장점이 있다.

다만, 이러한 우수한 효과가 있는 코중격 연골세포를 이용한 관절 손상 치료제의 개발은 미흡한 반면 손상된 연골의 완전한 재생에 대한 임상적 수요는 급격히 증가하고 있으며, 이러한 수요는 고령화 사회로 진입한 시기에 더욱 증가하는 추세에 있다.

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본 발명자들은 코중격 연골세포의 경우 콜라겐 타입2(collagen type 2) 및 속스9(SOX9)을 발현하며 연골손상동물 모델에 스페로이드(spheroid) 형태로 배양된 코중격 연골세포를 투여한 결과 관절 연골세포에 비하여 우수한 연골 치료 능력이 있음을 확인하였는바 본 발명을 완성하였다.

이에, 본 발명의 목적은 코중격 연골세포(nasal septum chondrocyte, NSC)를 유효성분으로 포함하는, 연골손상 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 a) 코중격 연골세포(nasal septum chondrocyte, NSC)를 코중격 조직으로부터 분리하는 단계;

b) 상기 a)단계에서 분리된 코중격 연골세포를 스페로이드(spheroid) 형태로 세포를 배양할 수 있는 세포배양용기에서 BSA(Bovine serum albumin)가 함유된 세포배양용 배지를 이용하여 배양하는 단계; 및

c) 상기 세포배양용기에서 배양된 스페로이드 형태의 코중격 연골세포를 회수하는 단계를 포함하는, 연골손상 치료용 코중격 연골세포 제조방법을 제공하는 것이다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 코중격 연골세포(nasal septum chondrocyte, NSC)를 유효성분으로 포함하는, 연골손상 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예로, 상기 코중격 연골세포는 스페로이드(spheroid) 형태일 수 있다.

본 발명의 다른 구현예로, 상기 코중격 연골세포는 콜라겐 타입 2(collagen type 2) 또는 속스9(SOX9)을 발현할 수 있다.

또한, 본 발명은 a) 코중격 연골세포(nasal septum chondrocyte, NSC)를 코중격 조직으로부터 분리하는 단계;

c) 상기 세포배양용기에서 배양된 스페로이드 형태의 코중격 연골세포를 회수하는 단계를 포함하는, 연골손상 치료용 코중격 연골세포 제조방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현예로, 상기 a)단계에서 코중격 연골세포는 40~50nm 필터에서 필터링한 뒤 수득될 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 c)단계 이후 회수된 스페로이드 형태의 코중격 연골세포와 지지체를 섞는 단계를 더 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 코중격 연골세포(nasal septum chondrocyte, NSC)를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 연골손상 치료방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 코중격 연골세포(nasal septum chondrocyte, NSC)를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물의, 연골손상 치료용도를 제공한다.

또한, 본 발명은 코중격 연골세포(nasal septum chondrocyte, NSC)의 연골손상 치료에 이용되는 약제를 생산하기 위한 용도를 제공한다.

본 발명은 코중격 연골세포(nasal septum chondrocyte, NSC)를 유효성분으로 포함하는 연골손상 치료용 약학적 조성물 및 상기 코중격 연골세포를 스페로이드(spheroid) 형태로 제조하는 방법에 관한 것으로 코중격 연골세포는 연골의 구성성분인 콜라겐 타입2 및 연골세포 분화에 관여하는 속스9(SOX9)를 발현하고 연골손상동물 모델에 스페로이드 형태 코중격 연골세포를 투여한 결과 손상부위에 생착되어, 스페로이드 형태 관절 연골세포를 투여한 결과와 비교하여 더 우수한 연골 치료 효과를 보였는바, 본 발명의 약학적 조성물과 스페로이드 형태의 코중격 연골세포 제조방법은 자가 연골세포 이식술(Autologous chondrocyte implantation) 분야에 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은 웨스턴 블롯을 이용하여 8종류의 사람 코중격 연골세포(human nasal septum chondrocytes, hNSCs)와 사람 코 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포(human turbinate derived mesenchymal stem cells, hTMSCs)를 비교하여 콜라겐 타입2 및 속스9(SOX9) 발현을 비교한 결과이다.
도 2는 2D 세포 배양과 3D 세포배양시 형태적 차이를 비교하기 위해 헤마톡실린과 에오진(Hematoxylin & Eosin), 알시안 블루(Alcian blue) 및 마손 트리크롬(Masson trichrome)을 이용하여 배양된 세포를 염색한 결과이다.
도 3은 스페로이드 배양으로 사람 코중격 연골세포(hNSCs)와 관절 연골세포(AC)를 배양한 결과 생존률을 라이브&데드 염색(Live & Dead staining)을 통해 확인한 결과이다.
도 4는 연골손상동물 모델에서의 연골재생능을 확인하기 위한 개략적인 실험과정을 나타낸 것이다.
도 5는 연골손상동물 모델을 만드는 방법 및 연골 이식방법에 대하여 나타낸 것이다.
도 6은 정상연골과 연골손상동물 모델의 결손부위 연골을 헤마톡실린과 에오진(Hematoxylin & Eosin), 알시안 블루(Alcian blue) 사프라닌 오(Safranin O) 및 트리크롬(Trichrome)으로 염색한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 연골손상동물 모델에서 사람 코중격 연골세포(hNSCs)와 관절 연골세포(AC)를 스페로이드 펠릿화 또는 펠릿화 하지 않은 세포 상태에서 이식한 경우 연골 재생능의 차이를 나타낸 결과이다.
도 8은 연골손상동물 모델에서 사람 코중격 연골세포를 스페로이드 형태로 펠릿화하여 이식한 이후 염색을 통해 연골이 생착되었음을 확인한 결과이다.
도 9는 연골손상동물 모델에서 주사형 코중격 연골세포 치료제를 투여한 후 세포 생착을 검증한 결과이다.
도 10은 연골손상동물 모델에서 사람 코중격 연골세포 스페로이드, 및 사람 관절 연골세포 스페로이드를 콜라겐과 혼합하여 각각 이식한 후, 무릎 연골의 조직학적 분석을 한 결과이다.
도 11은 연골손상동물 모델에서 사람 코중격 연골세포, 및 사람 코중격 연골세포 스페로이드를 각각 이식한 후, 무릎 연골의 형태학적 차이를 확인한 결과이다.

본 발명자들은 코중격 연골세포의 경우 콜라겐 타입2(collagen type 2) 및 속스9(SOX9)을 발현하며 연골손상동물 모델에 스페로이드 형태의 코중격 연골세포를 투여한 결과 관절 연골세포에 비하여 우수한 연골 치료 능력이 있음을 확인하였는바 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 일 실시예에서는 사람 코중격 연골세포를 코중격 조직으로부터 분리하는 방법 및 배양방법에 대하여 확인하였다(실시예 1 참조).

본 발명의 다른 실시예에서는 사람 코중격 연골세포에서 연골의 구성성분인 콜라겐 타입2 및 연골세포 분화에 관여하는 속스9(SOX9)를 발현함을 웨스턴 블롯으로 확인하였다(실시예 2 참조).

본 발명의 또 다른 실시예에서는 사람 코중격 연골세포를 스페로이드 형태로 제조하는 방법에 대해 확인하였다(실시예 3 참조).

본 발명의 또 다른 실시예에서는 3D 배양인 스페로이드 배양의 경우 세포가 구(sphere)형태를 이루고 있음을 확인하였다(실시예 4 참조)

본 발명의 또 다른 실시예에서는 스페로이드 형태의 코중격 연골세포의 생존력(Viability)이 스페로이드 형태의 관절 연골세포보다 뛰어남을 확인하였다(실시예 5 참조).

본 발명의 또 다른 실시예에서는 연골손상동물 모델을 확립하였으며 코중격 연골세포를 이용하여 만든 스페로이드 펠릿을 연골손상동물 모델의 관절손상 부위에 투여한 결과 펠릿의 생착을 확인하였다(실시예 6 및 7 참조).

본 발명의 또 다른 실시예에서는 연골손상동물 모델에서 스페로이드 형태의 코중격 연골세포를 관절손상 부위에 투여한 결과 세포가 잘 생착하는 것을 확인하였다(실시예 8 참조).

본 발명의 또 다른 실시예에서는 연골손상동물 모델에서 스페로이드 형태의 사람 코중격 연골세포를 투여한 경우, 스페로이드 형태의 사람 관절 연골세포를 투여한 경우와 비교하여, 더 매끄러운 연골 재생 효과가 나타남을 확인하였다(실시예 9 참조).

본 발명의 또 다른 실시예에서는 연골손상동물 모델에서 스페로이드 형태의 사람 코중격 연골세포를 투여한 경우, 사람 코중격 연골세포를 투여한 경우와 비교하여, 더 매끄러운 연골 재생 효과가 나타남을 확인하였다(실시예 10 참조).

상기와 같은 실시예 결과를 통해 본 발명에 따른 스페로이드 형태의 코중격 연골세포는 연골 손상을 치유시킬 수 있음을 확인하였는바 상기 스페로이드 형태의 코중격 연골세포는 연골손상 치료를 위한 용도로 사용될 수 있다.

이에, 본 발명은 코중격 연골세포(nasal septum chondrocyte, NSC)를 유효성분으로 포함하는, 연골손상 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명에서 사용되는 용어, "치료"란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 연골 손상 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에서 사용되는 용어, "연골세포"란 연골기질의 연골소 내에 존재하며 연골기질을 합성 및 분비하는 세포. 조면소포체, 골지장치 등이 잘 발달하고 있다. 외형은 연골소강의 외형과 일치하고 연골막 밑 및 관절연골 표층에서는 장타원형 혹은 편평, 심층부에서는 반원형 또는 다각형으로 존재한다. 연골세포의 세포막에는 다당체나 단백질의 복합체가 결합하고 있다. 이 복합체는 기질의 다당체나 섬유와 입체적으로 결합하고 있기 때문에 연골세포는 기질속에서 부유하고 있다. 본 발명에서 연골세포는 이미 연골세포로 분화 방향이 결정된 세포인 연골전구세포까지도 포함하는 개념이다.

본 발명에서 사용하는 용어 "코중격 연골세포"는 비강을 좌우로 나누는 칸막이 벽인 코 중격의 앞부분을 이루고 있는 연골세포이다. 본 발명의 코중격 연골세포는 최다빈도 수술중 하나인 코중격 교정술 과정에서 폐기되는 코중격 연골조직이나 국소마취 하의 단순생검 코중격 연골조직에서 분리할 수 있고, 체중 부하가 없는 공여부로서 국소마취로 합병증이 없는 장점이 있다. 또한, 코중격 조직에서 분리되는 연골세포수에 대한 보고는 없으나 관절 연골세포에 비해 많은 숫자가 확보 가능하며 초자연골인 코중격 연골에서 분리되는 연골세포는 관절 연골세포에 비해 세포 증식능이 높으며 체외 배양시 연골 특이적 세포외 기질을 생성하는 능력이 뛰어나다.

본 발명에서 사용하는 용어 "손상"이란 그 원인이 무엇이든 조직의 정상적 구조가 형태학적으로 파괴되는 모든 현상을 의미한다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 코중격 연골세포를 유효성분으로 포함하며, 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 상기 약학적으로 허용 가능한 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 사이클로덱스트린, 덱스트로즈 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, 리포좀 등을 포함하지만 이에 한정되지 않으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액 등 다른 통상의 첨가제를 더 포함할 수 있다. 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제, 윤활제 등을 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립, 또는 정제로 제제화할 수 있다. 적합한 약학적으로 허용되는 담체 및 제제화에 관해서는 레밍턴의 문헌에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 제형에 특별한 제한은 없으나 주사제, 흡입제, 피부 외용제, 또는 경구 섭취제 등으로 제제화할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 피부, 비강, 기도에 적용)할 수 있으며, 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 시간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.

본 발명에 따른 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여할 수 있다. 본 발명에 있어서, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명에 따른 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

구체적으로, 본 발명에 따른 조성물의 유효량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있다. 그러나 투여 경로, 비만의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명에서 상기 코중격 연골세포는 스페로이드(spheroid) 형태일 수 있다.

본 발명에서 사용하는 용어 "스페로이드"는 대체적으로 단면이 원형 또는 타원형으로 보일 수 있을 정도로 세포가 응집되어 있는 입체 구조를 의미하는데, 이러한 형태는 세포 또는 세포응집체의 특성을 고려해 판단되어야 하며, 완전한 스페로이드형이나 구형을 의미하는 것이 아님은 자명하다.

본 발명에서 상기 코중격 연골세포는 콜라겐 타입 2(collagen type 2) 또는 속스9(SOX9)을 발현할 수 있다.

본 발명에서 사용하는 용어 "콜라겐 타입 2(collagen type 2)"와 관련하여 콜라겐이란 동물의 뼈와 피부에 주로 존재하고 연골, 장기 막, 머리카락 등에도 분포되어 있는 경단백질로 교원질 이라고도 하며 섬유상 고체로 존재한다. 전자현미경으로 보면 복잡한 가로무늬 구조로 되어 있으며 물, 묽은산, 묽은 알칼리에 녹지 않지만 끓이면 젤라틴이 되어 용해된다. 이러한 콜라겐은 6타입이 존재하며 본 발명의 콜라겐 타입 2는 연골의 주성분이다.

본 발명에서 사용하는 용어 "속스9(SOX9)" HMG-box 클래스 DNA 결합 단백질의 다른 구성원과 함께 CCTTGAG 서열을 인식하며 연골세포 분화에 관여하는 것으로 알려져 있다.

본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 a) 코중격 연골세포(nasal septum chondrocyte, NSC)를 코중격 조직으로부터 분리하는 단계;

본 발명의 상기 b)단계에서 세포배양용기는 스페로이드 형태로 세포를 배양할 수 있는 용기이면 특별히 제한되지는 않으며 하기 실시예에서는 Microfit사의 StemFIT 3D를 사용하였으나 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 상기 a)단계에서 코중격 연골세포는 30~50nm 필터에서 필터링한 뒤 수득 될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니며 바람직하게는 40nm 필터이다.

본 발명의 상기 b)단계에서 BSA는 1~5% 농도일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니며 바람직하게는 BSA는 3% 농도이다

본 발명의 상기 b)단계에서 세포배양용 배지는 배지와 BSA가 2 : 0.5 내지 1.5의 비율로 혼합될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니며 바람직하게는 배지와 BSA는 2 : 1 비율이다.

본 발명의 상기 c)단계 이후 회수된 스페로이드 형태의 코중격 연골세포와 지지체를 섞는 단계를 더 포함 할 수 있다.

본 발명에서 사용하는 용어 “지지체”란 세포외 기질(Extracellular matrix ; ECM)의 성질을 그대로 채외에서 모방한 것으로, 생체 조직은 다종의 세포와 세포외 물질과의 상호작용에 의해 그 형태와 기능이 유지되고 특히, 세포외 물질 중에서도 유기 고분자를 주성분으로 하고 있는 세포외 기질은 조직의 구조적 지지체 겸 세포 접착 유도물질로서의 역할을 한다. 즉, 세포는 ECM에 접착되어야만 조직에 융합되어 기본적인 기능을 수행할 수 있으며 세포외 여러가지 생물학적인 조절이 가능해진다. 본 발명에 있어서 지지체는 바람직하게는 다공성 스폰지, 나노섬유, 하이드로겔, 콜라겐 등이 있으나 이에 제한되는 것은 아니며 임상에 적용될 수 있는 ECM이면 모두 가능하다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

실시예1. 코중격 연골세포의 분리 및 배양

본 연구에 이용한 코중격 연골조직은 비중격 교정술을 진행하는 과정에서 얻어진 조직으로 수술 전 환자의 동의하에 이용하였다. 코중격 연골조직을 채취한 직 후 겐타마이신(gentamicin)이 포함된 생리식염수로 3-5회 세척하여 연골세포를 분리하였다.

사람 코중격 연골세포의 분리를 위해 수술과정에서 생검한 조직을 4℃ 냉장고에서 보관하였고, 이 조직을 이용하여 연골세포를 분리하기 전 PBS(phosphate buffered saline)에서 2회 세척하였다. 세척한 뒤 코중격 연골을 논코팅디쉬(non-coating dish) 위에서 1mm³로 잘게 자른 뒤 잘게 자른 조직을 타입 2 콜라게네이즈(type 2 collagenase)처리하여 논코팅디쉬에서 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 하룻밤 반응 시켰다. (Type 2 collagenase, 0.01g in 10mL low glucose DMEM media, 10% FBS, 1% Antibiotic-Antimycotic) 분리된 연골세포를 40nm필터를 이용하여 필터링한 뒤 수확(harvest)하였다.

수확된 연골세포를 스핀다운(spin down)하여 배지(media)를 제거해준 뒤 PBS 로 세척 하였다. 연골세포를 배양 디쉬에 시딩(seeding)한 뒤 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 배양하였다.

실시예2. 코중격 연골세포에서 콜라겐 타입2 및 속스9(SOX9) 발현 확인

코중격 연골세포에서 콜라겐 타입2(collagen type 2)와 속스9(SOX9) 발현을 파악하기 위해 사람 코중격 연골세포(hNSCs)와 사람 코 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포(hTMSc)를 배양하여 하기의 방법으로 웨스턴 블롯을 수행하였다.

우선, 연골세포를 RIPA 버퍼를 이용하여 수확하였다. 20분 정도 아이스(ice)에서 반응 시키고, 4℃ 원심분리기에서 20분 동안 펠릿다운(pellet down) 시켜준 뒤, 상층액만 사용하였다. BCA 정량법을 이용하여 단백질을 정량해주고 SDS 버퍼와 함께 100℃ 온도에서 5분간 변성(denaturation) 시켰다. 정량된 단백질 샘플을 6% 폴리아크릴아마이드 겔(polyacrylamide gel)에서 80V로 전기영동(electrophoresis) 해주고, PVDF 멤브레인(membrane)에 옮겨준다. 이후 PVDF 멤브레인을 5% 스킴밀크(Skim milk)를 이용하여 블로킹해준 뒤 확인하고자 하는 항체를 붙여주고 확인하였다.

그 결과, 도 1과 같이 사람 코 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포에서는 콜라겐 타입2(collagen type 2)와 속스9(SOX9) 단백질의 발현이 없었으나 사람 코중격 연골세포의 경우 콜라겐 타입2(collagen type 2)와 속스9(SOX9) 단백질 발현이 높음을 확인하였다(도 1).

실시예3. 스페로이드 형태의 코중격 연골세포 제조

본 발명에서 스페로이드 형태의 세포 배양을 위한 세포배양용기는 StemFIT 3D(Microfit)을 사용하였으며 모든 배지의 추가와 교체는 StemFIT 3D(Microfit)의 안쪽 코너에서 진행하였다. 우선, StemFIT 3D(Microfit)를 배양을 진행할 디쉬에 올려놓고 70% 에탄올(EtOH)를 채운 다음 피펫팅(Pipetting)으로 거품(bubble)을 제거하였다. 거품이 모두 제거된 다음, 피펫(pipette)으로 StemFIT 3D(Microfit)의 모서리 부분에서 70% 에탄올을 석션(suction) 하였다. 이 때, 웰(well) 안에 있는 70% 에탄올이 모두 빠지지 않도록 조심하여, 거품이 다시 생기지 않도록 하였다. 웰에 거품이 생기지 않으면서 웰에서 세포배양이 가능하도록 하기위해 각각의 웰 안에 70% 에탄올이 차 있는 상태에서, 세포배양배지나 1XPBS(Welgene)를 채워넣었다. 현미경으로 관찰 후, 석션 하고 준비된 싱글셀(single cell)을 StemFIT 3D(Microfit)에 시딩 하였으며, 싱글셀이 풀어져있는 배지에 2:1의 비율이 되도록 필터(filter)된 3% BSA(Bovine serum albumin)를 같이 첨가해서 시딩 하고 나서 세포가 StemFIT 3D(Microfit)의 웰 안에 모두 가라앉을 때까지 대기하였다. 이때, 현미경에 올려놓고 살짝 흔들면 배지가 흔들리면서 부유한 세포들이 관찰되는데, 세포가 모두 가라앉지 않은 상태에서 세척을 하게 되면 그만큼 세포를 잃게 되어 배아줄기세포(embryonic stem cell)이 아닌 세포들의 경우, 스페로이드의 사이즈가 작아지는 문제가 있으므로 부유한 세포들이 모두 가라앉을 때까지 대기하였다. 5분 후, 웰과 웰 사이에 세포가 많다면, StemFIT 3D 안쪽 모서리 부분에서 피펫으로 천천히 배지를 석션하고 StemFIT 3D 안쪽에 표면장력이 생기도록 세포배양배지를 채웠다. 기존 세포배양이 하듯이 인큐베이션(Incubation)하고, 첫번째 배지 교환은 4~24시간 안에 진행하였다. 세포들이 뭉쳐지는 것이 보여지면 BSA를 제외하고 세포배양배지로만 채워주고 2~3일 뒤 현미경으로 컴팩트한 스페로이드를 관찰한 뒤 3D 스페로이드를 수확 하였으며 이식을 위해 지지체와 믹스 하였다.

실시예 4. 스페로이드 형태의 코중격 연골세포의 형태 확인

기존의 2D 세포 배양과 스페로이드 형태의 3D 세포배양시 형태 차이를 비교하기 위해 헤마톡실린과 에오진(Hematoxylin & Eosin), 알시안 블루(Alcian blue) 및 트리크롬(trichrome)을 이용하여 배양된 세포를 염색하였다.

그 결과, 도 2와 같이 2D 배양의 경우 세포들이 전반적으로 퍼져있어 높은 밀도를 보이지 않는 반면에 3D 배양의 경우 높은 밀도로 구(sphere)형태를 이루고 있음을 확인하였다(도 2).

실시예 5. 스페로이드 형태의 코중격 연골세포의 생존력(Viability) 확인

스페로이드 형태의 코중격 연골세포의 생존력(Viability) 분석을 위해 14일 까지 스페로이드 배양을 하고 살아있는 세포는 녹색, 죽은 세포는 빨간색으로 나타나는 라이브 & 데드 염색(Live & Dead staining)을 진행하였다.

그 결과 사람 코중격 연골세포(hNSCs, human nasal septum chondrocyte)와 사람 관절 연골세포(hACs, human articular chondrocyte)는 모두 높은 세포 생존력을 보였으며, 14일까지 90% 이상의 세포 생존력를 보여주었다. 다만 스페로이드 구조면에서 사람 코중격 연골세포와와 사람 관절 연골세포는 조금 다른 양상을 보였는데 7일 이후 사람 코중격 연골세포 스페로이드는 매우 많은 세포들이 모여 있음을 확인할 수 있으나 사람 관절 연골세포는 사람 코중격 연골세포와 비교시 스페로이드 구조에 세포가 다소 적게 모여 있음을 확인하였다(도 3).

실시예 6. 연골손상동물 모델 확립

랫트(Rat)는 SD rat, 12주령, male을 사용하였고, 동물실 규정상 동물실 내부 순화기간을 거쳐야 하기 때문에 10주령을 주문한 뒤 2주 뒤에 실험을 진행하였다.

연골손상동물 모델을 확립하기 위해 도 5와 같이 랫트의 무릎(knee)를 절개하여 대퇴골(femer)를 노출시킨 다음 드릴(2mm)을 이용하여 랫트의 무릎에 결손부위를 만들었다. 그 다음 날 연골 손상을 확인하기 위해 도 6와 같이 헤마톡실린과 에오진(Hematoxylin & Eosin), 알시안 블루(Alcian blue), 사프라닌 오(Safranin O) 및 트리크롬(trichrome)을 이용하여 결손부위를 염색하였다.

그 결과, 도 6의 B, D, F 및 H와 같이 모든 염색 시약에서 결손부위 염색이 확인되지 않아 연골손상동물 모델이 올바르게 확립되었음을 알 수 있었다.

실시예 7. 스페로이드 형태의 코중격 연골세포 이식 효과 확인

스페로이드 형태의 코중격 연골세포 이식 효과 확인하기 위하여 도 4에 나타낸 단계로 실험을 진행하였다. 우선 사람 코중격 연골세포와 사람 관절 연골세포를 이용하여 만든 스페로이드 펠릿(pellet)을 연골 손상 모델 랫트에 이식하였으며 2주 뒤 수확하여 연골 절편(section)을 염색(staining)하고 연골 손상 모델 랫트의 변화를 관찰하였다. 알시안 블루(Alcian blue)와 사프라닌-오(Safranin-O) 염색을 통해 글리코사미노글리칸(glycosaminoglycan, GAG)와 프로테오글리칸(proteoglycan)의 레벨을 확인하고 연골을 확인 하였으며, 트리크롬(Trichrom) 염색을 통해 콜라겐(Collagen)을 확인 하였다.

그 결과, 도 7 및 도 8에 나타난 바와 같이 사람 코중격 연골세포 펠릿 그룹에서 펠릿이 생착하였고, 연골 특이적 염색이 되어 손상된 연골의 치료효과를 확인하였다.

실시예 8. 연골손상동물 모델에서 주사형 코중격 연골세포 치료제의 세포 생착 검증

상기 실시예 6에서 기술한 바와 같이 연골손상동물 모델을 제작한 후, 스페로이드 형태의 사람 코중격 연골세포와 콜라겐(collagen)을 혼합하여, 연골손상 모델 랫트 1마리 당 연골세포 4X10⁴개와 콜라겐 20μl이 되도록 투여하였다. 그리고 4주 또는 8주가 경과한 후, 각 개체를 희생하여 무릎의 연골조직을 채취하고, 이를 사람 세포핵 특이적 항체(human nuclei antibody)를 이용하여 투여한 코중격 연골세포가 잘 생착하였는지 여부를 확인하였다.

그 결과, 도 9에 나타난 바와 같이 4주 및 8주에서 세포를 관찰할 수 있었다.

실시예 9. 스페로이드 형태의 사람 코중격 연골세포 및 사람 관절 연골세포의 연골 재생 효과 비교 확인

상기 실시예 6에서 기술한 바와 같이 연골손상동물 모델을 제작한 후, 스페로이드 형태의 사람 코중격 연골세포, 또는 스페로이드 형태의 사람 관절 연골세포를 콜라겐과 혼합하여, 이를 각각 연골손상 모델 랫트 1마리 당 연골세포 4X10⁴개와 콜라겐 20μl이 되도록 투여하였다. 무릎 연골의 조직학적 분석을 위하여, 4주 뒤 각 개체를 희생하여 무릎 연골 조직을 채취하고, 헤마톡실린과 에오진, 알시안 블루, 사프라닌 오 및 마손 트리크롬을 이용하여 세포를 염색하였다.

그 결과, 도 10에 나타난 바와 같이 스페로이드 형태의 사람 코중격 연골세포를 이식한 개체의 손상 부위에서, 스페로이드 형태의 사람 관절 연골세포를 이식한 개체의 손상부위 보다, 더 매끈한 형태의 연골 재생 효과가 나타났음을 확인할 수 있었다.

실시예 10. 사람 코중격 연골세포와 스페로이드 형태의 사람 코중격 연골세포 이식 후 연골 재생 효과 비교 확인

상기 실시예 6에서 기술한 바와 같이 연골손상동물 모델을 제작한 후, 사람 코중격 연골세포, 또는 스페로이드 형태의 사람 코중격 연골세포를 콜라겐과 혼합하여, 이를 각각 연골손상 모델 랫트 1마리 당 연골세포 4X10⁴개와 콜라겐 20μl이 되도록 투여하였다. 8주 뒤, 각 개체를 희생하여 무릎 연골 조직의 형태학적 분석을 수행하였다.

그 결과, 도 11에 나타난 바와 같이 사람 코중격 연골세포보다 스페로이드 형태의 사람 코중격 연골세포를 이식한 개체에서 더 매끄러운 형태의 연골 재생 효과를 확인할 수 있었다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가지는 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims

스페로이드(spheroid) 형태의 코중격 연골세포(nasal septum chondrocyte, NSC); 및 콜라겐(collagen)을 유효성분으로 포함하는, 연골손상 치료용 약학적 조성물.
삭제
제1항에 있어서,
상기 코중격 연골세포는 콜라겐 타입 2(collagen type 2) 또는 속스9(SOX9)을 발현하는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
a) 코중격 연골세포(nasal septum chondrocyte, NSC)를 코중격 조직으로부터 분리하는 단계;
b) 상기 a)단계에서 분리된 코중격 연골세포를 스페로이드(spheroid) 형태로 세포를 배양할 수 있는 세포배양용기에서 BSA(Bovine serum albumin)가 함유된 세포배양용 배지를 이용하여 배양하는 단계;
c) 상기 세포배양용기에서 배양된 스페로이드 형태의 코중격 연골세포를 회수하는 단계; 및
d) 상기 회수된 스페로이드 형태의 코중격 연골세포와 콜라겐(collagen)을 섞는 단계를 포함하는, 연골손상 치료용 조성물의 제조방법.
제4항에 있어서,
상기 a)단계에서 코중격 연골세포는 40~50nm 필터에서 필터링한 뒤 수득되는 것을 특징으로 하는, 연골손상 치료용 조성물의 제조방법.
삭제