ES2338464T3 - Material compuesto, especialmente para uso medico, y procedimiento para producir el material. - Google Patents

Abstract

Un material compuesto, que comprende: una primera capa autosoportada, que comprende un primer material que es insoluble, reabsorbible y no gelificable bajo condiciones fisiológicas; y una segunda capa, producida sobre la base de un segundo material que contiene gelatina, reticulado, teniendo la segunda capa una estructura porosa principalmente abierta.

Description

Material compuesto, especialmente para uso médico, y procedimiento para producir el material.

La presente invención se refiere a un material compuesto biocompatible, reabsorbible, que se usa en particular como un material de matriz en el campo de la medicina humana y veterinaria. Los materiales de este tipo pueden usarse libres de células o también poblados de células.

Además, la invención se refiere a un procedimiento para producir un material compuesto de esta clase.

Finalmente, la invención se refiere a implantes, en particular implantes de células y tejidos, que se producen usando el material compuesto, y al uso de estos implantes para el tratamiento del cuerpo humano o animal.

En el caso de daño a muchos tejidos humanos o animales, que puede ser causado tanto por enfermedad como por herida, los implantes capaces de reabsorberse se usan para soportar el proceso de curación. Esto promueve la regeneración del tejido en cuestión en el sentido de que cumple con una función de protección mecánica para el tejido recién formado y/o proporciona una matriz que promueve el desarrollo celular.

Un campo importante de uso para los implantes de este tipo es el tejido de cartílago. Este consiste de condrocitos (células de cartílago) y de la matriz extracelular sintetizada por estas células, que está construida principalmente de colágeno y proteoglicanos. Dado que la sangre no fluye a través del cartílago, que es predominantemente nutrido por difusión y no tiene acceso directo a las poblaciones de células regenerativas cuando ha terminado la función epifisaria, el cartílago sólo tiene capacidad limitada para la regeneración intrínseca. La curación autónoma del daño del cartílago por lo tanto sólo es posible hasta un grado limitado, sobre todo en el caso de los adultos, y se observa rara vez. Los defectos del cartílago pueden ocurrir debido a heridas o a efectos degenerativos, y sin la intervención biológicamente reconstructiva, con frecuencia conducen a un ulterior avance del daño del cartílago, hasta llegar a la osteoartritis destructiva.

En el caso de una forma específica de tratamiento para el daño en cartílago que se describe arriba, los condrocitos son primeramente cultivados in vitro sobre un implante reabsorbible, usando una solución nutriente. La construcción portadora de células producida de este modo es luego insertada en el sitio del cartílago faltante o dañado. Los condrocitos cultivados se toman previamente del propio paciente, de manera que este procedimiento también puede ser llamado trasplante de células autólogas de cartílago. Después del implante, las células producen una nueva matriz extracelular y así conducen a la curación del defecto. El material portador es descompuesto (reabsorbido) en el curso de la regeneración. Aparte del uso de condrocitos autólogos, también puede contemplarse el implante de condrocitos alogénicos o el uso de células madre que han sido previamente diferenciadas condrogénicamente (autóloga o alogénicamente) in vitro, y actualmente es avaluada en investigación preclínica y experimental en animales para su utilización clínica en humanos.

Junto con el trasplante de condrocitos autólogos, los procedimientos de estimulación de la médula ósea, tales como la microfractura o la perforación, proporcionan otra terapia clínicamente establecida que tiene un propósito biológicamente reconstructivo en el caso de daño en el cartílago. En estos procedimientos, la placa de hueso subcondrial se perfora con pequeños trépanos en punta o taladros, después de la desbridación previa, en virtud de lo cual tiene lugar el flujo sanguíneo en la región del defecto, formándose un coágulo de sangre. En el curso posterior de los eventos, a partir del coágulo de sangre se desarrolla un cartílago fibroso (o el así llamado súper coágulo), que en muchos casos conduce al relleno del defecto y al alivio del problema. Los resultados de este procedimiento también pueden ser mejorados con el uso de matrices adecuadas y biocompatibles. El biomaterial usado fija, en la región del defecto, al súper coágulo que se ha desarrollado, lo protege de la ruptura, y actúa como una matriz primaria para las células que migran por la vía sanguínea, para sanar el defecto.

Otro campo de uso para los biomateriales está en el tratamiento de rupturas de la cabeza giratoria del hombro o el tratamiento de la degeneración parcial del manguito de los rotadores. Aunque ya se conocen biomateriales libres de células para estas indicaciones, estos tienen sin embargo la desventaja de que, sin la población previa con células, no pueden contribuir activamente a la regeneración. Para vitalizar el material, debe tomarse tejido para siembra mediante biopsia. Las células pueden entonces ser aisladas in vitro, cultivadas, sembradas en un biomaterial adecuado e implantadas, junto con el biomaterial, en la región del defecto.

Otro uso para un biomaterial poblado con células es la regeneración ósea, por ejemplo en la región del maxilar para aumento del seno, usando células autólogas precultivadas del periostio o células madre mesenquimales, que son sembradas en la matriz.

Además de en las indicaciones mencionadas hasta ahora, los biomateriales también pueden usarse en conexión con o sin población celular previa para el tratamiento y la curación de heridas crónicas, daños en la piel o quemaduras de la piel.

Para que los biomateriales adecuados para las indicaciones y procedimientos arriba descritos puedan usarse en humanos o animales, debe cumplirse sin embargo con una serie de requerimientos. Entre estos es de gran importancia, antes que nada, la biocompatibilidad del material, es decir, no debería haber reacciones de inflamación, reacciones de rechazo u otras reacciones inmunes después del implante. Además, el material no deberá ejercer efecto negativo en el desarrollo o en el metabolismo de las células trasplantadas o migrantes y debería ser completamente reabsorbido en el cuerpo después de un tiempo específico. Además, el material deberá tener una estructura tal que sea poblado y penetrado por las células tan uniformemente como sea posible.

Al mismo tiempo, también deben estipularse altas demandas en las propiedades mecánicas del material usado. El manejo seguro del material durante el implante, sin que este se dañe, sólo puede asegurarse mediante una alta resistencia mecánica. En particular, esta resistencia también debe ser proporcionada para los implantes de tejido que ya hayan sido poblados con las células.

Los desarrollos recientes muestran que estas demandas parecen ser mejor cumplidas por los materiales compuestos de capas múltiples. Por ejemplo, en el documento WO 99/19005 se describe una membrana de capas múltiples que comprende: una capa de matriz de colágeno tipo II con una textura parecida a esponja y al menos una capa de barrera con una textura cerrada, relativamente impermeable.

En el artículo "EGF containing gelatin-based wound dressing" de K. Ulubayram y col. (Biomaterials (2001) 22, 1345-1356) se describe un material compuesto de doble capa, que comprende una capa interior porosa de gelatina reticulada que contiene un factor de crecimiento para favorecer la cicatrización de heridas y una capa exterior de una membrana elastómera de poliuretano que sirve para proteger la herida.

La solicitud de patente internacional WO 2006/045330 A1 (artículo 54(3) del CPE) da a conocer un implante para el tratamiento de defectos del cartílago que comprende una primera capa y una segunda capa, comprendiendo la primera capa una estructura membranosa y la segunda capa una estructura esponjosa. El material de la segunda capa puede comprender, por ejemplo, colágeno, ácido hialurónico, alginato, quitosano o gelatina.

La solicitud de patente internacional WO 2005/111121 A2 (artículo 54(3) CPE) da a conocer un procedimiento para preparar cuerpos moldeados a base de gelatina reticulada que se basa en reticular la gelatina en dos etapas. Respecto a los cuerpos moldeados preparados de este modo, puede tratarse, entre otros, de láminas, esponjas o materiales compuestos de láminas y esponjas. En la Patente EP 1 263 485 B1, se describe un material biocompatible de capas múltiples, que tiene una primera y una segunda capas con matrices de colágeno biocompatible.

El colágeno es un material natural con resistencia relativamente alta, sobre cuya base pueden producirse implantes con buenas propiedades mecánicas y buena capacidad de manejo. Por otra parte, el uso del colágeno como una matriz para las células tiene sin embargo la desventaja de que, a cuenta de la composición menos que precisamente reproducible y de la pureza del colágeno, pueden ocurrir problemas con respecto de la biocompatibilidad. Además, el tiempo de reabsorción de los materiales que contienen colágeno no es muy controlable, pero el control del tiempo de reabsorción sería deseable para los diversos campos de uso.

El objetivo de la presente invención es poner a disposición un material en el cual se eviten estas desventajas tanto como sea posible, y que tenga propiedades mejoradas en comparación con los materiales conocidos.

Este objetivo se alcanza de conformidad con la invención en el caso del material compuesto del tipo mencionado al inicio, mediante el material compuesto que comprende las dos capas siguientes:

- una primera capa autosoportada, que comprende un primer material que es insoluble, reabsorbible y no gelificable bajo condiciones fisiológicas; y

- una segunda capa, producida sobre la base en un segundo material que contiene gelatina, reticulado, teniendo la segunda capa una estructura porosa principalmente abierta.

En el caso del material compuesto de conformidad con la invención, la primera capa asegura la resistencia mecánica requerida, mientras que la segunda capa forma una matriz para el desarrollo de las células.

El primer material es insoluble y no gelificable bajo condiciones fisiológicas. En el sentido de la presente invención, esto significa que el material no se disuelve físicamente en una solución acuosa bajo las condiciones prevalecientes en el cuerpo (en particular la temperatura, el valor del pH y la resistencia iónica) y tampoco se transforma en un gel o en un estado parecido a gel por la absorción de agua. La formación de gel en este sentido está presente por lo tanto cuando el primer material pierde con ello su resistencia original y su capacidad de retención de la forma hasta un extremo sustancial. Esto no excluye que el material absorba ciertas cantidades de agua y con ello posiblemente también se hinche, en tanto que esto no conduzca a ningún deterioro significativo de la resistencia mecánica.

En virtud de las propiedades señaladas, el primer material también permanece mecánicamente firme y estable para darle forma aún en un estado hidratado, con los cual se da a la primera capa su función de autosoporte. Esto significa que la primera capa no sólo puede ser manejada sin ningún portador adicional, sino que está, por su parte, en una posición para servir como portadora para la segunda capa.

Al mismo tiempo el primer material es reabsorbible, es decir, se descompone por hidrólisis después de un tiempo específico en el cuerpo. Las enzimas también pueden jugar una parte en esta degradación hidrolítica. Antes de que tenga lugar la reabsorción en el cuerpo, por ende en particular durante el cultivo de las células en el material compuesto in vitro y durante el implante del material compuesto, la función de portadora de la primera capa no es fuertemente deteriorada, con lo cual al material compuesto, como un todo, se le da la resistencia mecánica requerida.

En virtud de la realización de la primera capa, de conformidad con la invención, se asegura el manejo libre de daño del material compuesto. Esto también se aplica en particular en el caso en el que la segunda capa ya está poblada con las células antes del implante.

Además, la primera capa también ofrece protección mecánica para las células después de que el material compuesto ha sido implantado. Esto es significativo tanto para el trasplante de células previamente cultivadas in vitro como para una microfracturación enlazada con una matriz. Para ambos procedimientos, el biomaterial se usa ventajosamente de modo que la primera capa se orienta hacia afuera alejada del hueso. Entonces esta protege a las células en desarrollo en la segunda capa del cizallamiento y de las influencias perturbadoras de la regeneración desde el interior de la articulación, como por ejemplo, la carga mecánica excesiva.

Otra ventaja fundada en la alta resistencia de la primera capa es la capacidad de sutura quirúrgica o también la fijación subcondrial estable al ejercicio del material compuesto de conformidad con la invención, por medio de una fijación reabsorbible. La primera capa tiene preferiblemente una resistencia al desgarre tal que el material compuesto no se desgarra cuando es suturado o cuando sufre fijación transósea por medio de miniclavos reabsorbibles.

Preferiblemente, la primera capa tiene una resistencia a la rasgadura de 20 N/mm^{2} o más.

En una forma de realización preferida de la invención, el primer material insoluble, reabsorbible y no gelificable es un material plano con base de colágeno. Entre estos materiales están los materiales planos están formados sustancialmente de colágeno y para los cuales se cuestionan preferiblemente las membranas naturales de origen animal. Pueden obtenerse membranas animales, que consisten casi completamente de colágeno, que están libres de constituyentes extraños que tendrían efectos desventajosos en la biocompatibilidad.

Las membranas animales proporcionan como regla altas resistencias y por lo tanto son especialmente muy adecuadas para la primera capa del material compuesto de conformidad con la invención. En particular, el colágeno muestra las propiedades requeridas hasta el grado en que es, bajo condiciones fisiológicas, insoluble, no gelificable y reabsorbible.

Como un material plano preferido basado en colágeno, se usa una membrana pericardial como primera capa del material compuesto. El pericardio es la capa exterior del saco del corazón, lo cual representa una membrana animal particularmente resistente al desgarre. Por ejemplo, puede usarse la membrana pericardial de ganado vacuno.

La membrana pericardial tiene, al igual que muchas otras membranas animales, un lado rugoso y un lado liso. Preferiblemente, estas membranas se usan en el material compuesto de tal manera que el lado rugoso se orienta hacia la segunda capa. La estabilidad de la unión entre las dos capas aumenta, debido a la rugosidad de la superficie.

En otra forma de realización preferida del material compuesto de conformidad con la invención, el primer material comprende: un material de refuerzo. La resistencia de la primera capa también puede ser incrementada por medio de materiales de refuerzo insolubles, reabsorbibles y no gelificables, hasta el grado en el que tengan las propiedades ventajosas arriba descritas.

Cuando se usan materiales de refuerzo como el primer material, la primera capa comprende: preferiblemente una matriz en la cual se integra el material de refuerzo. La primera capa es entonces, por ejemplo, una película reforzada. Para esto, la matriz debe ser de igual manera reabsorbible y comprender preferiblemente gelatina.

Una matriz que comprende gelatina para la primera capa, por ejemplo, una película de gelatina, se produce preferiblemente con base en un material que contiene gelatina reticulada. La reticulación se requiere como regla para convertir el material a una forma insoluble. Las modalidades preferidas para la reticulación del que contiene gelatina, en particular la propia gelatina, se explican más adelante en conexión con la segunda capa del material compuesto.

El material de refuerzo muestra, aún en proporciones de 5% en peso con referencia a la masa de la primera capa, una marcada mejora en las propiedades mecánicas de la capa.

Por arriba del 60% en peso, no puede lograrse mejora significativa, y/o las propiedades deseadas de reabsorción, o también la flexibilidad necesaria de la primera capa, sólo pueden lograrse con dificultad. El material de refuerzo puede seleccionarse a partir de materiales de refuerzo particulados y moleculares, así como de mezclas de éstos.

Con respecto de los materiales de refuerzo particulados, el uso de fibras de refuerzo debe recomendarse en particular. Para estos, las fibras se seleccionan preferiblemente de entre fibras polisacáridas y fibras de proteína, en particular fibras de colágeno, fibras de seda y algodón, y de fibras de poliactida y mezclas de cualquiera de las anteriores.

Por otra parte, los materiales moleculares de refuerzo son igualmente adecuados para mejorar las propiedades mecánicas y, si se desea, también la estabilidad de reabsorción de la primera capa.

Los materiales moleculares de refuerzo preferidos son en particular los polímeros de poliactida y sus derivados, los derivados de celulosa, y el quitosano y sus derivados. Los materiales moleculares de refuerzo también pueden usarse como mezclas.

La segunda capa del material compuesto de conformidad con la invención es aquella capa que entra directamente en contacto con las células en el uso médico y por lo tanto debería estar en una posición para funcionar como un substrato para el poblado con las células y como una matriz para su desarrollo. Por esta razón, se ponen demandas especialmente altas en la biocompatibilidad (es decir, en la compatibilidad celular) del segundo material. Dado que la primera capa ya asegura la resistencia mecánica requerida del material compuesto y satisface una función de soporte para la segunda capa, la selección del material y la estructura para la segunda capa pueden determinarse por completo sobre su biocompatibilidad y su funcionalidad biológica.

Los requerimientos arriba mencionados para la segunda capa se satisfacen hasta un gran extremo con el uso de gelatina, de conformidad con la invención. La gelatina puede obtenerse, en contraste con el colágeno, con una composición definida y reproducible así como con alta pureza. Tiene excelente compatibilidad con el tejido y las células y se reabsorbe hasta no dejar residuos.

Preferiblemente, el segundo material está formado hasta un extremo predominante por gelatina, más preferiblemente, está formado sustancialmente por completo por gelatina.

Para asegurar la biocompatibilidad óptima de la segunda capa del material compuesto de conformidad con la invención en el uso médico, el segundo material preferiblemente comprende: una gelatina con un contenido particularmente bajo de endotoxinas. Las endotoxinas son productos metabólicos o fragmentos de microorganismos, que están presentes en una materia prima animal. El contenido de endotoxinas de la gelatina se especifica en Unidades Internacionales por gramo (U.I./g) y se determina mediante la prueba LAL, cuya realización se describe en la cuarta edición de la European Pharmacopoeia (Ph. Eur. 4).

Para mantener el contenido de endotoxinas tan bajo como sea posible, es ventajoso que los microorganismos sean destruidos tan pronto como sea posible en el curso de la preparación de la gelatina. Además, deben observarse estándares adecuados de higiene en el procedimiento de preparación.

De acuerdo con ello, el contenido de endotoxinas de la gelatina pude reducirse drásticamente durante el procedimiento de preparación mediante medidas específicas. Entre estas medidas, pertenecen principalmente el uso de materias primas frescas (por ejemplo, piel de cerdo) evitando tiempo de almacenaje, la limpieza meticulosa de toda la instalación de producción inmediatamente antes de iniciar la preparación de la gelatina, y opcionalmente el reemplazo de los intercambiadores de iones y de los sistemas de filtro en la instalación de producción.

La gelatina usada en el marco de la presente invención tiene preferiblemente un contenido de endotoxinas de 1,200 U.I./g o menos, aún más preferiblemente, de 200 U.I./ g o menos. Óptimamente, el contenido de endotoxinas es de 50 U.I./g o menos, en cada caso determinado de acuerdo con la prueba LAL. En comparación con esto, muchas gelatinas comercialmente disponibles tienen contenidos de endotoxinas de más de 20,000 U.I./g.

De conformidad con la invención, el segundo que contiene gelatina está reticulado, siendo preferiblemente la gelatina reticulada. Dado que la propia gelatina es soluble en agua, la reticulación es una regla requerida para evitar el aceleramiento indebido de la disolución del segundo material, y con ello también para asegurar una durabilidad suficiente para la segunda capa del material compuesto bajo condiciones fisiológicas.

La gelatina ofrece entonces la ventaja adicional de que la velocidad de reabsorción del material reticulado, o el periodo de tiempo hasta que se completa la reabsorción, pueden ser ajustados a lo largo de un amplio intervalo mediante la elección del grado de reticulación.

El segundo material está preferiblemente reticulado químicamente. En principio, todos los compuestos pueden usarse como reticulantes que efectúan la reticulación química de la gelatina. Los preferidos son los aldehídos, los dialdehídos, los isocianatos, los diisocianatos, las carbodiimidas y los haluros de alquilo. Particularmente preferido es el formaldehído, ya que este tiene también un efecto esterilizante.

Para asegurar la biocompatibilidad del segundo material, preferiblemente este está sustancialmente libre de reticulante en exceso, es decir, del reticulante que no ha reaccionado. Preferiblemente para esto, el contenido de agente de enlace cruzado en exceso es de aproximadamente 0,2% en peso o menos, en particular en el caso de que el formaldehído represente un valor limitante para esta disponibilidad como un material de implante.

En otra forma de realización, el segundo material se reticula enzimáticamente. Para esto, se usa preferiblemente la enzima transglutaminasa como reticulante, efectuando esta el enlace de las cadenas laterales de glutamina y lisina de las proteínas, en particular también de la gelatina.

Los reticulantes especificados son igualmente adecuados para reticular el material que contiene gelatina de la primera capa, en el caso en el que esta comprenda una matriz gelatinosa con un material de refuerzo integrado.

Además de la biocompatibilidad del material usado, la segunda capa del material compuesto también debería crearse de tal manera que tenga una estructura adecuada para la población con células. De conformidad con la invención, esto se asegura por medio de la estructura principalmente de poro abierto, que permite la penetración de las células en la estructura así como la distribución más uniforme posible de las células a través del grosor total de la segunda
capa.

La estructura principalmente de poro abierto se realiza, en una modalidad preferida de la invención, teniendo la segunda capa una estructura fibrosa. La estructura de fibra comprende: preferiblemente un tejido, un género de punto, o una napa. Las estructuras de fibra pueden ser producidas a partir del segundo material que contiene gelatina, por ejemplo por extrusión o por electro-hilado de una solución de gelatina.

En otra forma de realización preferida del material compuesto de conformidad con la invención, la segunda capa tiene una estructura de esponja. Las estructuras de esponja pueden producirse espumando una solución del segundo material que contiene gelatina, lo que irá con mayor detalle en conexión con el procedimiento de producción de conformidad con la invención.

Las estructuras de esponja con poros principalmente abiertos son especialmente adecuadas para ser pobladas con células. En virtud de los espacios huecos conectados entre sí, puede lograrse una distribución muy uniforme de las células a través de todo el volumen. Entonces se forma una estructura de tejido tridimensional durante el desarrollo de las células y la síntesis de la matriz extracelular. Esto es acompañado por la descomposición hidrolítica sucesiva del material que contiene gelatina reticulado, de modo que el volumen de la estructura de esponja, después de la degradación completa del material (o después de su reabsorción por el cuerpo), es absorbido hasta un alto grado por el tejido recién formado.

El diámetro de poro promedio preferido de la estructura de esponja se ajusta principalmente al tamaño de las células con las cuales se va a poblar in vitro o in vivo el material compuesto. Si los diámetros de los poros son demasiado pequeños, las células no pueden penetrar en la estructura, mientras que si los poros son demasiado grandes, el resultado es un soporte demasiado pequeño cuando las células se introducen o se desarrollan en el interior. Preferiblemente, el diámetro promedio de poro está por debajo de 500 \mum, en particular en la escala de 100 a 300 \mum.

El tamaño de poro de las estructuras de esponja depende en gran medida de su densidad. La densidad de la segunda capa del material compuesto, en particular en el caso de una estructura de esponja, está preferiblemente en el intervalo de desde 10 a 100 g/l, más preferiblemente de 10 a 50 g/l, lo más preferible de 15 a 30 g/l. La densidad de las estructuras de esponja puede, por esto, ser influenciada por las condiciones de producción, en particular por la intensidad del espumado.

Preferiblemente, la segunda capa del material compuesto de conformidad con la invención es elásticamente deformable en un estado hidratado, en particular en el caso de una estructura de esponja. Un estado hidratado existe cuando el material compuesto en un ambiente acuoso ha absorbido tanta agua que se alcanza sustancialmente un estado de equilibrio. Las condiciones de este tipo están presentes tanto en el caso del cultivo de células en un medio nutriente in vitro como en el cuerpo.

La medida de la capacidad de deformación elástica puede definirse por ejemplo mediante el comportamiento de descompresión. Preferiblemente la segunda capa se forma de modo que, después de que ha pasado por una descompresión en el volumen por la acción de una presión de 22 N/mm^{2}, en un estado hidratado, se descomprime hasta el 90% o más dentro de 10 minutos, no pudiendo lograrse esto como regla con el material basado en colágeno. Para medir la relación de descompresión en un estado hidratado, el material que se va a probar se pone en un regulador de PBS (pH 7.2) a 37ºC.

Las estructuras elásticamente deformables de este tipo conducen a la flexibilidad de la segunda capa del material compuesto, lo cual es extremadamente ventajoso para el uso del material como un implante. Por lo tanto el material compuesto puede ser bien adaptado a la forma del defecto del tejido que se va a tratar, que es frecuentemente irregular o al menos curvado, como por ejemplo en el caso de daño en el cartílago de la articulación.

Otra ventaja del material compuesto de conformidad con la invención es que la segunda capa, en el estado hidratado, no muestra disminución de volumen significativa. En particular en el tratamiento de defectos del cartílago, donde las piezas con ajuste preciso del material compuesto se insertan en el cartílago circundante, el encogimiento de este tipo, tal como el que se observa en el caso de los materiales porosos basados en colágeno, conduce a problemas significativos. Preferiblemente, la segunda capa, después de tres días en condición hidratada, tiene una reducción de volumen de menos de 5% en comparación con el volumen medido después de 5 minutos. Es más ventajoso si el volumen de la segunda capa se incrementa ligeramente en el estado hidratado.

Como ya se ha dicho, el material compuesto de conformidad con la invención ofrece la ventaja particular de que la velocidad de reabsorción de la segunda capa puede adaptarse a los requerimientos individuales. Esto puede efectuarse en particular mediante la selección de la densidad de la segunda capa y el grado de reticulación del segundo material que contiene gelatina, conduciendo ambos de la mayor densidad y de un mayor grado de reticulación a una tendencia hacia la prolongación de la vida útil. En el caso ideal, la descomposición del material se efectúa de acuerdo con el grado hasta el cual la matriz extracelular es sintetizada a partir de las células. Este puede ser muy diferente de acuerdo con el tipo de célula, teniendo en particular las células de cartílago un desarrollo comparativamente lento y que por lo tanto involucra una tendencia hacia tiempos de descomposición más largos para la segunda capa.

Como medida de la velocidad de reabsorción o de degradación de la segunda capa cuando está poblada con células, también puede recurrirse a su estabilidad sin la población de células bajo condiciones fisiológicas estándar (regulador PBS, pH de 7.2, 37ºC). Las condiciones fisiológicas a las cuales se expone el material compuesto, se distinguen principalmente por la temperatura, el valor del pH y la resistencia iónica, y pueden simularse por medio de la incubación del material compuesto bajo las condiciones estándar mencionadas, para probar y comparar diferentes materiales respecto de su comportamiento de descomposición dependiente del tiempo.

De conformidad con la invención, los materiales compuestos pueden obtenerse cambiando las condiciones de producción, para las cuales, bajo condiciones fisiológicas estándar, la segunda capa permanece estable por ejemplo durante más de una semana, durante más de dos semanas y durante más de cuatro semanas.

El concepto de estabilidad debe entenderse como que la segunda capa retiene sustancialmente su forma original (geometría macroscópica) durante el periodo de tiempo respectivo y sólo entonces se degrada hasta un grado visible desde el exterior.

En el caso en el que la segunda capa tenga una estructura de esponja, esta degradación tiene lugar relativamente de manera rápida después del periodo de tiempo respectivo, desintegrándose la estructura de esponja en el transcurso de unos cuantos días.

Alternativamente, el comportamiento de descomposición de la segunda capa también puede definirse por la pérdida de peso bajo las condiciones arriba descritas. De acuerdo con ello, pueden obtenerse materiales compuestos de conformidad con la invención en los cuales la segunda capa todavía comprenda 70% o más por peso después de una semana, después de dos semanas o después de cuatro semanas.

Otra ventaja de la estructura de la segunda capa es que esta puede ser convertida a un estado parecido a hidrogel durante la fase de reabsorción. La conversión de este tipo en una estructura parecida a hidrogel bajo condiciones fisiológicas estándar, es particularmente ventajosa para estabilizar los fenotipos de las células condrogénicas. Estas propiedades soportan la reconstrucción del tejido con un valor altamente cualitativo en comparación con otros biomateriales. Por otra parte, los biomateriales que son principalmente parecidos al gel permiten una población celular claramente peor y difícilmente cualquier desarrollo celular (por ejemplo, después de la micro-fractura) en sus estructuras relativamente cerradas.

La convertibilidad de la estructura de la segunda capa a una estructura de hidrogel es por lo tanto dependiente del grado de reticulación. Esto no contradice la estabilidad arriba mencionada, ya que esto se relaciona con la geometría macroscópica de la segunda capa, que inicialmente permanece existente aún en presencia de la estructura de hidrogel.

El tiempo de degradación para la primera capa del material compuesto de conformidad con la invención puede desviarse del de la segunda capa, y puede elegirse para que sea más largo o más corto, dependiendo de las circunstancias. Sin embargo, en todos los casos la primera capa basada en el primer material de conformidad con la invención proporciona un tiempo de vida suficiente para asegurar que la primera capa tiene su propiedad de autosoporte, incluso después del cultivo de las células en la segunda capa y que da al material compuesto la resistencia mecánica requerida para el implante.

Si por ejemplo, se usa una gelatina reforzada como la primera capa, su tiempo de degradación puede ajustarse en un intervalo específico por medio del grado de reticulado de la gelatina, como en el caso del material que contiene gelatina de la segunda capa. Cuando se usa una membrana de origen animal, su tiempo de descomposición está grandemente predeterminado y en la mayoría de los casos es mayor que el de la segunda capa.

La primera y la segunda capas del material compuesto de conformidad con la invención están preferiblemente unidas entre sí directamente. Esto puede lograrse por ejemplo preparando a la segunda capa directamente sobre una superficie de la primera capa, en particular sobre el lado rugoso de una membrana animal.

En otra forma de realización del material compuesto de conformidad con la invención, las dos capas son unidas entre sí mediante un adhesivo, adhesivo que preferiblemente comprende: gelatina.

El material compuesto de conformidad con la invención tiene preferiblemente un grosor de 2 a 5 mm, siendo preferido un grosor de hasta 3 mm. El grosor de la primera capa es entonces preferiblemente de aproximadamente 1 mm o menos.

El grosor mencionado del material compuesto se refiere por lo tanto al grosor total de la primera y de la segunda capas. El material compuesto de conformidad con la invención pude, sin embargo, comprender también aún más capas.

En una forma de realización en particular, se proporciona una tercera capa que está unida a la segunda capa, produciéndose esta tercera capa con base en un material que contiene gelatina. Una tercera capa de este tipo sirve, por ejemplo en el caso de trasplante de células precultivadas in vitro, para proteger a las células localizadas en la segunda capa contra la carga mecánica o contra el desarrollo de células extrañas, o para mejorar la unión del material compuesto con el tejido circundante durante el implante.

Para fijar un implante en su posición prescrita en el cuerpo, en particular con un hueso en el caso de trasplante de células de cartílago, puede usarse una solución de gelatina, por ejemplo como tercera capa, aplicándose la solución de gelatina como adhesivo a la segunda capa. El material que contiene gelatina de la tercera capa es preferiblemente reticulado, en particular la propia gelatina. Los reticulantes preferidos para esto son las composiciones y las enzimas descritas en conexión con el segundo material de la segunda capa.

La tercera capa tiene ventajosamente una estructura que evita o impide la penetración de células extrañas, por ejemplo células óseas en el caso del trasplante de cartílago. La tercera capa tiene preferiblemente por lo tanto una estructura sustancialmente cerrada. Con esto se entiende una estructura sin poros o pasajes, en particular una película, por ejemplo, una película de gelatina.

Alternativamente, la tercera capa también puede tener una estructura porosa, cuyo diámetro promedio de poro es menor al diámetro promedio de poro de la estructura de la segunda capa. Por lo tanto, la cuestión está en una estructura de esponja como la descrita en conexión con la segunda capa, preferiblemente teniendo la estructura de esponja de la tercera capa un diámetro promedio de poro de 300 \mum o menos, en particular 100 \mum o menos. La tercera capa tam-
bién tiene preferiblemente una mayor densidad que la segunda capa, preferiblemente una densidad de 50 g/l o más.

En virtud de una tercera capa con una estructura cerrada o porosa, también puede ser mejorada la unión entre el material compuesto y el tejido vecino, especialmente el hueso. El grado de reticulación del material de la tercera capa se selecciona por lo tanto para que sea relativamente bajo, de modo que el material se gelifique parcialmente y de esta manera funcione como adhesivo.

Para el uso del material compuesto en el transplante de células precultivadas, tales como por ejemplo células de cartílago o células madre mesenquimales, la tercera capa puede ser optimizada con respecto de la buena compatibilidad con el hueso. Preferiblemente, la tercera capa comprende: entonces uno o más fosfatos de calcio, apatitas, o mezclas de los mismos.

La tercera capa del material compuesto se aplica preferiblemente a la segunda capa después de que las células han sido introducidas en, y cultivadas en, la segunda capa. Alternativamente, las células pueden ser introducidas en la segunda capa desde el lado después de que la tercera capa ha sido aplicada, siendo esto fácilmente posible en la producción de implantes más pequeños.

La presente invención también tiene el objetivo de proporcionar un procedimiento para producir el material compuesto arriba descrito.

Este objetivo se cumple de conformidad con la invención en el caso del procedimiento mencionado al principio, por medio del procedimiento que comprende:

- proporcionar una primera capa de autosoporte que comprende un primer material que es insoluble, reabsorbible y no gelificable bajo condiciones fisiológicas;

- la producción de una segunda capa con base en un segundo material que contiene gelatina, reticulado, de modo que la segunda capa tenga una estructura porosa principalmente abierta; y

- unir la primera y la segunda capas, formando el material compuesto.

La unión de las dos capas puede efectuarse, de conformidad con la invención, como el paso final del procedimiento o en el curso de la preparación de la segunda capa.

En el primer caso, la unión es preferiblemente por medio de un adhesivo. Para esto, el adhesivo preferiblemente comprende: gelatina, que puede aplicarse por ejemplo en la forma de una solución a una o a ambas capas, después de lo cual las capas se juntan y se secan.

En el caso en el que la primera capa comprende: una matriz gelatinosa, es además preferible que la segunda capa preparada sea presionada parcialmente en la primera capa. Esto puede efectuarse por ejemplo haciendo que la matriz gelatinosa, por ejemplo, una película de gelatina, esté en una condición plásticamente deformable durante la presión de la segunda capa, por ejemplo, en condición de humedad después de la preparación de la matriz.

Una forma de realización preferida del procedimiento de acuerdo con la invención se refiere a materiales compuestos en los que la segunda capa tiene una estructura de esponja. La unión de las dos capas se efectúa en el curso de la producción de la segunda capa, comprendiendo el procedimiento los siguientes pasos:

a) proporcionar la primera capa;

b) preparación de una solución acuosa del segundo material que contiene gelatina;

c) reticulado parcial del segundo material disuelto;

d) espumado de la solución;

e) aplicación de la solución espumada a la primera capa; y

f) dejar secar la solución espumada, de modo que se forme la segunda capa con una estructura porosa principalmente abierta.

Para este procedimiento, puede usarse básicamente gelatina de origen y calidad diversos como material de partida; con respecto del uso médico del material compuesto, se prefiere sin embargo la gelatina que es baja en endotoxinas, como se describió arriba. La solución en el paso b) tiene preferiblemente una concentración de gelatina de 5 a 25% en peso, en particular de 10 a 20% en peso.

Aparte de la gelatina, el segundo material en el procedimiento de conformidad con la invención pude contener aún más constituyentes, por ejemplo, otros biopolímeros.

En la reacción de reticulación del paso c), uno, varios o todos los constituyentes del segundo material disuelto pueden, en este caso, reticularse parcialmente. Preferiblemente, a este respecto la gelatina en particular se reticula. La reticulación puede efectuarse químicamente o enzimáticamente, habiéndose ya descrito los reticulantes preferidos en conexión con el material compuesto de conformidad con la invención.

Otra forma de realización preferida de este procedimiento comprende: un paso adicional g) en el cual el segundo material comprendido en la segunda capa se reticula adicionalmente.

La ventaja de la reticulación de dos etapas de este tipo es que puede lograrse un grado más alto de reticulación del segundo material, y con ello, como resultado, los tiempos de reabsorción más largos, ventajosos, para la segunda capa. Esto no puede realizarse hasta el mismo grado con un procedimiento de un paso único mediante el incremento de la concentración del reticulante, porque, si la reticulación del material disuelto es demasiado fuerte, este ya no puede ser espumado y formado.

Por otra parte, la reticulación del material, en particular la gelatina, no es adecuado exclusivamente después de la preparación del material compuesto, porque con ello el material se reticula con mayor fuerza en la superficie delimitante accesible desde el exterior que en las regiones interiores, reflejándose esto en el comportamiento de descomposición no homogénea.

La segunda reticulación (paso g)) puede realizarse mediante la acción de una solución acuosa de un reticulante, para lo cual pueden usarse los reticulantes químicos o enzimáticos arriba descrito. Sin embargo, es preferible la acción de un reticulante gaseoso, en particular formaldehído, que al mismo tiempo tiene un efecto esterilizante. La acción del formaldehído puede efectuarse para esto en el material compuesto, facilitado por una atmósfera de vapor.

El reticulante cruzado del paso c) se añade preferiblemente a la solución en una cantidad de 600 a 5,000 ppm, preferiblemente de 1,000 a 2,000 ppm, con referencia a la gelatina.

Variando la concentración del reticulante en la solución, pero también mediante grados diferentemente altos de reticulación en el segundo paso de reticulado, la vida útil de la segunda capa del material compuesto puede establecerse con facilidad. Sorprendentemente, pueden obtenerse estructuras de esponja que, bajo condiciones fisiológicas, permaneces estables por ejemplo durante más de una semana, durante más de dos semanas, o durante más de cuatro semanas, como ya se ha explicado al detalle en conexión con el material compuesto de conformidad con la invención.

El espumado (paso d)) se efectúa preferiblemente introduciendo un gas, en particular aire, en la solución. La densidad y el diámetro promedio de poro de la estructura de esponja que se va a producir pueden de esta forma ajustarse a lo largo de una escala amplia, preferiblemente por medio de la intensidad del espumado. Además de ajustar el diámetro promedio de poro a las células con las que se va a poblar la segunda capa, la flexibilidad y la capacidad de deformación elástica de la segunda capa también pueden ser influenciadas por estos parámetros (y con ello, la flexibilidad y la capacidad de deformación elástica del material compuesto como un todo). La alta flexibilidad es deseable por ejemplo para que sea posible ajustar, de manera óptima, un implante a la forma del defecto del tejido que se va a tratar.

Las propiedades del material compuesto producido de acuerdo con este procedimiento pueden ser mejoradas aún más con respecto de la estabilidad de la segunda capa, si el material compuesto se expone a un tratamiento térmico posterior bajo presión reducida, después de la segunda reticulación. Este postratamiento térmico se realiza preferiblemente a temperaturas de desde 80 hasta 160ºC, ya que, por debajo de 80ºC, los efectos observados se desarrollan solamente hasta un grado relativamente débil mientras que, por arriba de 160ºC, puede ocurrir una coloración indeseada de la gelatina. Mayormente, los valores en la escala de 90 a 120ºC son los preferidos.

Por presión reducida, debe entenderse aquí presiones menores a la presión atmosférica, siendo preferibles los valores de presión más bajos posibles, en el caso ideal, al vacío.

El postratamiento térmico actúa ventajosamente en dos aspectos. Por una parte, las condiciones arriba mencionadas de temperatura y presión efectúan una reticulación dehidrotérmica adicional de la gelatina, en la que diferentes cadenas de aminoácidos reaccionan entre sí con la eliminación del agua. Esto se favorece eliminándose agua disociada del equilibrio mediante la baja presión. En virtud del postratamiento térmico, puede lograrse por lo tanto un grado mayor de reticulación para la misma cantidad de reticulantes, o puede reducirse la cantidad de agentes de enlace cruzado para un grado comparable de reticulación.

La ventaja adicional del postratamiento térmico reside en la marcada reducción del contenido residual del reticulante no consumido que permanece en la segunda capa.

Para asegurar buena biocompatibilidad del material compuesto, el exceso de reticulante que no ha reaccionado preferiblemente se elimina de la segunda capa en el procedimiento de conformidad con la invención. Esto puede efectuarse por ejemplo desgasificando el material compuesto durante varios días a presión normal y/o lavando el medio con un fluido, requiriendo este último, de modo similar, un periodo de tiempo de un día a una semana dependiendo de la concentración del reticulante, del tamaño del material compuesto y etcétera.

Dado que mediante el postratamiento térmico arriba descrito, por una parte puede reducirse la cantidad de reticulante que se use, y además el reticulante en exceso puede ser eliminado del material compuesto en virtud de la elevación de temperatura y de la presión reducida, puede lograrse una marcada reducción del reticulante por medio de este paso adicional del procedimiento, incluso dentro de 4 a 10 horas.

En una forma de realización particular del procedimiento de conformidad con la invención, este comprende: la aplicación adicional de una tercera capa a la segunda capa del material compuesto. Esto puede tener lugar de ambas maneras, antes o después de la introducción de las células en la segunda capa. Las ventajas y modalidades de una tercera capa ya se han descrito en conexión con el material compuesto de conformidad con la invención.

La invención también se refiere a la utilización del material compuesto descrito para su uso en los campos de medicina humana y veterinaria, en particular para producir implantes.

El material compuesto de acuerdo con la invención es sobresalientemente adecuado para ser poblado con células humanas o animales, o para el desarrollo de estas células. Para el trasplante de células que han sido aisladas y/o precultivadas in vitro, el material compuesto es poblado por ejemplo con condrocitos, células madre mesentéricas, células del periostio o fibroblastos, que son sembrados sobre la segunda capa en un medio nutriente adecuado y preferiblemente integrado en la estructura principalmente de poro abierto de esta capa. Debido a la alta estabilidad del material, las células pueden desarrollarse y proliferar in vitro durante varias semanas.

La invención se refiere además a implantes, en particular a implantes de tejido, que comprenden al material compuesto y células humanas o animales.

En una forma de realización del implante de conformidad con la invención, este comprende: sólo células en desarrollo, que son integradas en la segunda capa. En este caso, no se realiza el cargado de células in vitro sino que el material compuesto es implantado directamente, por ejemplo después de la microfractura previa. Las células del coágulo sanguíneo pueblan entonces el biomaterial in vivo.

En otra forma de realización del implante de conformidad con la invención, las células se cultivan en la segunda capa, es decir, el poblado y el cultivo se realizan in vitro antes del implante, como se describió arriba.

Las células que se desarrollan in vivo y/o las sembradas in vitro están preferiblemente distribuidas de manera uniforma en la segunda capa del material compuesto. De esta manera, se hace posible la formación de una estructura de tejido tridimensional.

Los implantes de acuerdo con la invención se usan para el tratamiento de defectos del tejido, como ya se ha mencionado varias veces. Los usos preferidos se relacionan con el tratamiento de daño y/o lesiones del cartílago humano o animal, en particular en el contexto del trasplante autólogo de células de cartílago o de microfractura enlazada con matriz, el tratamiento de defectos en el manguito de los rotadores del hombro, defectos óseos (por ejemplo aumento del seno maxilar), así como en el tratamiento de daño, lesiones y/o quemaduras de la piel humana o animal.

También aquí, el material compuesto de acuerdo con la invención facilita una rehabilitación protegida y dirigida de los defectos, en el sentido de regeneración hística guiada, a cuenta de su estructura.

Finalmente, la invención se refiere, como ya se mencionó, a un procedimiento para la regeneración del cartílago basado en células, con células cultivadas in vitro. El procedimiento comprende: tomar condrocitos o células madre de origen autólogo o alogénico, sembrar las células potencialmente condrogénicas en la segunda capa de un material compuesto de conformidad con la invención, e insertar el material compuesto con las células en la locación del defecto en el cartílago en un paciente.

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La forma del material compuesto para esto, es preferiblemente ajustada a la forma del defecto del cartílago. Además, es preferible que la primera capa del material compuesto se oriente hacia afuera cuando es insertado en el cartílago.

En una modalidad preferida del procedimiento, las células sembradas se cultivan in vitro antes del implante del material compuesto, preferiblemente durante un periodo de tiempo de 4 a 14 días.

Estas y otras ventajas de la invención se explicarán con mayor detalle sobre la base de los ejemplos que la acompañan, con referencia a las Figuras. En particular:

La figura 1 muestra una imagen, tomada usando un microscopio óptico, de una sección transversal a través de un material compuesto de acuerdo con la invención;

la figura 2 muestra una imagen, tomada usando un microscopio óptico, de la segunda capa de un material compuesto de conformidad con la invención después de un periodo de dos semanas de población con condrocitos; y

la figura 3 muestra una ilustración fotográfica de un material compuesto de conformidad con la invención después de un periodo de cuatro semanas de población con condrocitos.

Ejemplo 1 Producción y propiedades de un material compuesto de conformidad con la invención

Este ejemplo se refiere a la producción de un material compuesto de conformidad con la invención, en el cual se usa una membrana de pericardio de ganado vacuno como primera capa.

Para garantizar la mayor biocompatibilidad posible, la membrana de pericardio que se usó debió dejarse libre de grasas, enzimas y otras proteínas hasta el mayor grado posible. Una estructura de fibra suelta para el colágeno se obtuvo mediante la liofilización de la membrana. Las membranas de pericardio de este tipo, que constan sustancialmente de colágeno tipo I, también se usan para reemplazar estructuras de tejido conjuntivo en neurocirugía.

Tres piezas de la membrana de pericardio, cada una de aproximadamente 10 x 10 cm de tamaño se fijaron, con el lado rugoso hacia arriba, sobre bloques subyacentes de aproximadamente 3 cm de altura. Estos tres bloques se distribuyeron después en el piso de un molde de caja con una longitud y un ancho de 40 x 20 cm^{2} y una altura de 6 cm.

Para producir la segunda capa del material compuesto, en primer lugar se preparó una solución al 12% en peso de gelatina de piel de cerdo con una resistencia Bloom de 300 g, disolviéndose la gelatina en agua a 60ºC. La solución se desgasificó por medio de ultrasonido y se añadió una cantidad apropiada de una solución acuosa de formaldehído (1.0% en peso, temperatura ambiente), de modo que estuvieran presentes 2,000 ppm de formaldehído con relación a la gelatina.

La mezcla homogeneizada se llevó hasta los 45ºC y después de un tiempo de reacción de 5 minutos, se espumó mecánicamente con aire durante un periodo de aproximadamente 30 minutos, obteniéndose una espuma de gelatina con una densidad húmeda de 130 g/l.

El molde de caja con las membranas pericardiales tensadas se rellenó con esta solución de gelatina espumada, que tenía una temperatura de 27ºC, y la espuma de gelatina se secó durante aproximadamente 6 a 8 días a una temperatura de 26ºC y una humedad relativa del 10%.

Después del secado, la espuma de gelatina formó un material firme con una estructura de esponja principalmente de poro abierto (llamada esponja de gelatina en el texto que sigue). Al secar la espuma de gelatina en contacto directo con la membrana de pericardio, resultó una unión estable entre los dos materiales sobre la mayor parte de sus áreas, siendo esto además promovido por la rugosidad de la superficie usada en la membrana de pericardio.

Se cortaron piezas de la membrana de pericardio de aproximadamente 1.5 x 1.5 cm^{2} de tamaño, junto con la esponja de gelatina adherida a los mismos, separándose la esponja de gelatina por encima de la membrana hasta el punto en que las piezas tuvieron un grosor de aproximadamente 3 mm.

La esponja de gelatina que formaba la segunda capa del material compuesto tenía, en el ejemplo anterior, después del secado, una densidad de 22 g/l y un diámetro promedio de poro de aproximadamente 250 \mum. Al cambiar las circunstancias de producción, estos parámetros pueden ser controlados sobre un intervalo amplio para que ajusten con el diámetro promedio de poro al tamaño de las células con las cuales va a poblarse el material compuesto.

Por lo tanto, cambiando la intensidad del espumado, por ejemplo, los materiales compuestos también pueden ser producidos de conformidad con el procedimiento arriba descrito en el cual la esponja de gelatina tiene una densidad húmeda de 175 g/l, una densidad seca de 27 g/l y un diámetro promedio de poro de aproximadamente 200 \mum, o una den-
sidad húmeda de 300 g/l, una densidad seca de 50 g/l y un diámetro promedio de poro de aproximadamente 125 \mum.

Para asegurar una vida útil suficientemente larga para la segunda capa del material compuesto, la gelatina se sometió a un segundo paso de reticulación. Para esto, piezas del material portador, cada una de un tamaño de 1,5 x 1,5 cm^{2}, se expusieron en un desecador, durante 17 horas, a la presión de vapor de equilibrio de una solución acuosa de formaldehído de 17% en peso a temperatura ambiente, habiéndose evacuado previamente el desecador dos o tres veces, y recargado con aire.

En la Figura 1, se ilustra una imagen tomada con un microscopio óptico de una sección transversal a través del material compuesto de conformidad con la invención, producido de esta forma. En este, la primera capa se forma con la membrana de pericardio 11 y la segunda capa 12 se forma con la esponja de gelatina con el diámetro promedio de poro de aproximadamente 250 \mum. La estructura predominantemente de poro abierto de la segunda capa debe verse con claridad.

Para demostrar el efecto del segundo paso de enlace cruzado, el comportamiento de descomposición del material compuesto que se había reticulado dos veces, se comparó con el del material compuesto que se había reticulado una vez. Para esto, las piezas de prueba del material compuesto arriba descrito, cada una de un tamaño aproximado de 1.5 x 1.5 cm^{2}, así como las muestras de referencia que no se habían expuesto a ningún reticulado adicional en la fase de gas, se colocaron en 75 ml de regulador PBS (pH 7.2) y se almacenaron a 37ºC. Esto mostró que, en el caso de las muestras del material compuesto con gelatina que se había reticulado una vez solamente, la segunda capa estaba completamente descompuesta después de sólo tres días. En contraste, para las muestras que habían sido expuestas a la reticulación subsecuente en la fase de gas, arriba descrito, la segunda capa todavía era existente hasta el punto de más de 80% en peso, incluso después de 14 días. Para todas las muestras, aún no había degradación visible en la membrana de pericardio de la primera capa, después de 14 días.

En conexión con esto, naturalmente debe tenerse en cuenta que en el caso de la población del material compuesto con células o cuando este está en el cuerpo, los tiempos reales para la descomposición pueden diferir de los tiempos encontrados en este experimento. Sin embargo, este resultado muestra que la vida útil de la segunda capa bajo condiciones fisiológicas puede prolongarse notablemente mediante la reticulación de dos etapas de la gelatina, lo que es de significativa importancia para el uso médico del material compuesto, en particular en el campo de trasplante de cartílago.

Además, es posible influir en la duración de una manera dirigida mediante la variación de las condiciones de producción. En particular, una proporción mayor de reticulante en la solución de gelatina, una mayor densidad de la esponja de gelatina y/o un tiempo más largo de exposición al reticulante en la fase de gas, conducen a la prolongación de los tiempos de descomposición.

Además, la duración también puede prolongarse más mediante un postratamiento térmico. Este puede tener lugar, en el ejemplo presente, desgasificando las piezas de la muestra al vacío después del segundo paso de reticulado y manteniéndolas a un vacío de aproximadamente 14 mbar por medio de un evaporador giratorio durante seis segundos a 105ºC.

Si se realiza un postratamiento térmico de este tipo, el tiempo de reacción de 17 horas para el formaldehído en el segundo paso de reticulación puede ser acortado hasta, por ejemplo, dos a cinco horas, para lograr un material compuesto con una duración para la segunda capa del orden de una a cuatro semanas. En virtud de este procedimiento, la segunda capa también tiene un contenido residual de formaldehído en exceso de hasta un 40% menor. Con ello se acorta el tiempo durante el cual requiere ser lavado el material compuesto de conformidad con la invención, antes de ser implantado o poblado con las células.

Ejemplo 2 Producción de otro material compuesto de conformidad con la invención

Este ejemplo se refiere a la producción de un material compuesto de conformidad con la invención, en el cual se usa como primera capa una lámina de gelatina reforzada con fibras de algodón.

Para producir la primera capa, se disolvieron 20 g de gelatina de piel de cerdo (resistencia Bloom de 300 g) a 60ºC en una mezcla de 71 g de agua y 9 g de glicerina, y la solución se desgasificó por medio de ultrasonido. En esta la glicerina sirvió como un plastificante, para asegurar una cierta flexibilidad y capacidad de estiramiento de la lámina de gelatina producida.

1 g de fibras cortas de algodón (línter) se formaron en una mezcla aguada en 25 g de agua, como material de refuerzo, y esta suspensión se añadió con agitación continua a la solución de gelatina y glicerina. Después de la adición de 2 g de una solución acuosa de formaldehído (2.0% en peso, temperatura ambiente) a la solución, esta fue homogeneizada, y se pasó por rodillo a 60ºC hasta un grosor de 1 mm sobre una capa subyacente de polietileno.

Después de secar a 25ºC y a una humedad relativa de 30% a lo largo de aproximadamente tres días, la película producida fue desprendida de la subcapa de PE.

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La lámina de gelatina reforzada con fibra tenía un grosor de aproximadamente 200 a 250 \mum y una resistencia al rasgado de aproximadamente 22 n/mm^{2} para una elongación final de aproximadamente 45%. En contraste, una lámina de gelatina no reforzada producida de manera correspondiente tuvo una resistencia al rasgado de aproximadamente 15 N/mm^{2}.

La producción de la segunda capa se efectuó como se describió en el Ejemplo 1, rellenando el molde de caja (sin la membrana de pericardio) con la solución de gelatina espumada. Se cortó una capa de aproximadamente 2 a 3 mm de grosor de la esponja de gelatina secada.

La lámina de gelatina reforzada con fibra (primera capa) y la esponja de gelatina (segunda capa) se adhirieron entre sí a través de toda el área de superficie por medio de una solución de gelatina de hueso (resistencia Bloom de 160 g) y el material compuesto producido se expuso después a una segunda reticulación, en la fase de gas, con formaldehído, como se describe en el Ejemplo 1.

En lugar de usar una solución de gelatina como adhesivo, la unión entre las dos capas puede ser producida alternativamente mediante la esponja, que ya ha sido secada, presionándola parcialmente en la lámina con el adhesivo aplicado mientras esta todavía no esté seca. De esta manera, puede lograrse una unión estable a través de toda el área de la superficie.

En una variante de este ejemplo, las fibras de algodón se reemplazaron con fibras de colágeno. La producción de las películas se efectuó como se describió arriba, excepto solamente en que a la solución de gelatina y glicerina se añadió una suspensión de 5 g de fibras de colágeno en 60 g de agua o 10 g de fibras de colágeno en 90 g de agua.

Las láminas secadas tenían una resistencia al desgarre de aproximadamente 25 N/mm^{2} para una elongación final de aproximadamente 40% (5 g de fibras) y una resistencia al desgarre de aproximadamente 30 N/mm^{2} para una elongación final de aproximadamente 27% (10 g de fibras), mientras que la resistencia al desgarre de una película correspondiente no reforzada fue de aproximadamente 17 N/mm^{2}.

Las resistencias al desgarre de las láminas reforzadas con fibras de colágeno subieron todavía más hasta aproximadamente 28 N/mm^{2} (5 g de fibras) y hasta aproximadamente 3 N/mm^{2} (10 g de fibras), en virtud de la segundo reticulación en la fase de gas.

Ejemplo 3 Población con condrocitos de un material compuesto de conformidad con la invención

Este ejemplo describe la población de un material compuesto producido de acuerdo con el Ejemplo 1, y reticulación en dos etapas, con condrocitos (células de cartílago) de cerdos. Esto puede verse como un ensayo para el trasplante de células de condrocito en el cual las células humanas, tal como por ejemplo condrocitos articulares, se cultivan in vitro sobre el material portador.

Como medio de cultivo se usó DMEM/FCS al 10%/glutamina/Pen/Strep, que es un medio de cultivo estándar para el cultivo de células de mamífero. El material compuesto se lavó con el medio de cultivo antes de ser poblado. Luego se sembró un millón de condrocitos, suspendidos en 150 \mum de medio de cultivo, sobre la segunda capa del material compuesto, por cm^{2}. Luego se incubó el material portador en el medio de cultivo durante cuatro semanas a 37ºC.

La Figura 2 muestra una imagen, tomada usando un microscopio óptico, de la segunda capa del material compuesto después de la incubación durante dos semanas. Los núcleos celulares 13 de los condrocitos están distribuidos de manera muy uniforme sobre todo el volumen. La estructura de esponja de la segunda capa se descompuso en el curso de las dos semanas hasta un gran extremo y fue reemplazada por la matriz extracelular 14 sintetizada por los condrocitos. El resto de la estructura de esponja 15 aún puede verse, por ejemplo, en el borde derecho de la ilustración.

En este punto, debería mencionarse de nuevo que la descomposición del material de la segunda capa tiene lugar más rápidamente bajo estas condiciones que, en el caso del experimento descrito en el Ejemplo 1, en regulador PBS, lo cual se atribuye, inter alia, a la descomposición enzimática de la gelatina.

La Figura 3 muestra una ilustración fotográfica del material compuesto de conformidad con la invención después de un tiempo de población de cuatro semanas. El material compuesto es sujetado con un fórceps 16, estando la segunda capa orientada hacia arriba. Debido a la membrana de pericardio 11 extremadamente firme, el material compuesto tiene, como antes, un alto grado de estabilidad como para formarse, y por lo tanto puede manejarse fácilmente. Además, después de cuatro semanas también hay una unión estable entre la membrana de pericardio 11 y la esponja de gelatina 12 o la matriz extracelular formada en la esponja.

Los resultados de este experimento muestran que los correspondientes implantes de tejido, que pueden ser producidos haciendo uso de células condrogénicas humanas, son altamente adecuados para usarse en el campo de la regeneración de cartílago basada en células.

Claims (26)

1. Un material compuesto, que comprende: una primera capa autosoportada, que comprende un primer material que es insoluble, reabsorbible y no gelificable bajo condiciones fisiológicas; y una segunda capa, producida sobre la base de un segundo material que contiene gelatina, reticulado, teniendo la segunda capa una estructura porosa principalmente abierta.

2. El material compuesto de conformidad con la reivindicación 1, en el que el primer material insoluble, reabsorbible y no gelificable es un material plano con base de colágeno.

3. El material compuesto de conformidad con la reivindicación 2, en el que el material plano con base de colágeno es una membrana natural de origen animal.

4. El material compuesto de conformidad con la reivindicación 3, en el que la membrana animal es una membrana de pericardio.

5. El material compuesto de conformidad con alguna de las reivindicaciones 2 a 4, en el que la membrana animal tiene un lado rugoso que está orientado hacia la segunda capa.

6. El material compuesto de conformidad con la reivindicación 1, en el que el primer material comprende un material de refuerzo.

7. El material compuesto de conformidad con la reivindicación 6, en el que el material de refuerzo se ha seleccionado de entre materiales de refuerzo en partículas y/o moleculares.

8. El material compuesto de conformidad con la reivindicación 6 ó 7, en el que la primera capa comprende una matriz en la cual está integrado el material de refuerzo del primer material.

9. El material compuesto de conformidad con la reivindicación 8, en el que la matriz está producido sobre la base de un material que contiene gelatina reticulado.

10. El material compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que la segunda capa presenta una estructura fibrosa.

11. El material compuesto de conformidad con la reivindicación 10, en el que la estructura fibrosa es un tejido, un género de punto o una napa.

12. El material compuesto de conformidad con alguna de las reivindicaciones 1 a 9, en el que la segunda capa presenta una estructura de esponja.

13. El material compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que además comprende una tercera capa unida a la segunda capa.

14. El material compuesto de conformidad con la reivindicación 13, en el que la tercera capa está producida sobre la base de un material que contiene gelatina.

15. El material compuesto de conformidad con la reivindicación 13 ó 14, en el que la tercera capa tiene una estructura sustancialmente cerrada.

16. El material compuesto de conformidad con la reivindicación 13 ó 14, en el que la tercera capa tiene una estructura porosa, cuyo diámetro promedio de poro es menor que el diámetro promedio de poro de la estructura de la segunda capa.

17. Un procedimiento para producir un material compuesto de conformidad con alguna de las reivindicaciones 1 a 16, que comprende:

- proporcionar una primera capa autosoportada que comprende un primer material que es insoluble, reabsorbible y no gelificable bajo condiciones fisiológicas;

- producir una segunda capa basada en un segundo material que contiene gelatina reticulado, de modo que la segunda capa tenga una estructura porosa principalmente abierta; y

- unir la primera y la segunda capas, formando el material compuesto.

18. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 17, que comprende los pasos de:

a)

proporcionar la primera capa;

b)

preparar una solución acuosa del segundo material que contiene gelatinosa;

c)

reticular parcialmente el segundo material disuelto;

d)

espumar la solución;

e)

aplicar la solución espumada a la primera capa; y

f)

dejar secar la solución espumada, de modo que se forme la segunda capa con una estructura porosa principalmente abierta.

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19. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 18, que comprende además el paso de:

g)

reticular el material contenido en la segunda capa.

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20. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 18 ó 19, en el que la reticulación en el paso g) se realiza mediante la acción de un agente reticulante en fase gaseosa.

21. El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 18 a 20, en el que el material compuesto se somete a un postratamiento térmico a presión reducida.

22. El procedimiento de conformidad con alguna de las reivindicaciones 17 a 21, que además comprende la aplicación de una tercera capa a la segunda capa del material compuesto.

23. El uso de un material compuesto de conformidad con alguna de las reivindicaciones 1 a 16, para el cultivo de células in vitro.

24. El uso de un material compuesto de conformidad con alguna de las reivindicaciones 1 a 16, para la fabricación de implantes.

25. Un implante que comprende un material compuesto de conformidad con alguna de las reivindicaciones 1 a 16 y células que están integradas en la segunda capa.

26. Un implante que comprende un material compuesto de conformidad con alguna de las reivindicaciones 1 a 16 y células que están cultivadas en la segunda capa.