KR20210062589A - 가교 결합된 단백질 발포체 및 다가 세포 스캐폴드 사용 방법 - Google Patents

가교 결합된 단백질 발포체 및 다가 세포 스캐폴드 사용 방법 Download PDF

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KR20210062589A
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collagen
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이스하이 아타르
샤이 야코브 세르보 젤리
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바이오-체인지 엘티디.
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Abstract

일 구현예에서, 본 발명은 조성물을 제공하되, 조성물은 다공성 스캐폴드이고, 스캐폴드의 기공은 1 내지 500 마이크론이고, 조성물은 a) 콜라겐 및 젤라틴으로 이루어진 군으로부터 선택된 가교성 단백질; b) 가교성 단백질의 가교 결합을 유도하는 가교제; 및 c) 액체를 포함한다.

Description

가교 결합된 단백질 발포체 및 다가 세포 스캐폴드 사용 방법
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은, 2017년 10월 4일에 출원된 미국 가특허출원 제62/567,919호에 대한 우선권을 주장하고, 이의 전체 내용이 참조로 포함된다.
기술 분야
본 발명은, 가교성 단백질 및 가교성 단백질의 가교 결합을 유도하는 비독성 물질을 포함하는, 개선된 가교 결합된 조성물에 관한 것이다. 상기 조성물은 조직 재생의 생물학적 과정을 촉발하기 위한 것이다.
젤을 인시츄로 형성할 수 있는 생체물질은, 예를 들어 제어된 세포 및/또는 약물 전달을 위한 주입 가능한 매트릭스, 조직 공학에 대한 주입 가능한 스캐폴드, 또는 조직을 접합하거나 생리학적 환경에서 유체 누출을 밀봉하기 위한 접착제와 같이 다양한 응용 분야에서 유용하다.
일 구현예에서, 본 발명은 조성물을 제공하며,
상기 조성물은 다공성 스캐폴드이고,
상기 스캐폴드의 기공은 1 내지 500 μm이고, 상기 조성물은,
a) 콜라겐과 젤라틴으로 이루어진 군으로부터 선택된 가교성 단백질;
b) 상기 가교성 단백질의 가교 결합을 유도하는 가교제; 및
c) 액체를 포함한다.
일 구현예에서, 상기 액체는 생리학적 완충액이다.
일 구현예에서, 상기 조성물은 발포체이다.
일 구현예에서, 상기 가교성 단백질은, 5 내지 200 μm의 평균 입자 크기를 갖는 미분화된 단백질 분말로서 조성물 내에 도입된다.
일 구현예에서, 상기 가교성 단백질은 200 내지 300 블룸의 젤라틴을 포함한다.
일 구현예에서, 상기 가교성 젤라틴은 0.5% w/w 내지 25% w/w 범위의 조성물 내에 존재한다.
일 구현예에서, 상기 가교제는 트랜스글루타미나제이다.
일 구현예에서, 상기 트랜스글루타미나제는 0.0001% w/w 내지 2% w/w 범위의 조성물 내에 존재한다.
일 구현예에서, 본 발명은 조성물을 제공하며, 상기 조성물은,
a) 가교성 젤라틴;
b) 상기 가교성 젤라틴의 가교 결합을 유도하는 트랜스글루타미나제; 및
c) 액체를 포함하고,
상기 조성물은 1 내지 500 μm의 기공 크기를 갖는 다공성 스캐폴드이고,
상기 가교성 젤라틴은, 5 내지 200 μm의 평균 입자 크기를 갖는 미분화된 젤라틴 분말로서 상기 조성물 내에 도입되고,
상기 가교성 젤라틴은 200 내지 300 블룸이고,
상기 가교성 젤라틴은 0.5% w/w 내지 30% w/w 범위의 조성물 내에 존재하고,
상기 트랜스글루타미나제는 0.0001% w/w 내지 2% w/w 범위의 조성물 내에 존재한다.
일 구현예에서, 상기 액체는 생리학적 완충액이다.
일 구현예에서, 상기 조성물은, 환자의 조직 결함 치료를 필요로 하는 부위에서 환자에게 인시츄로 형성된다.
일 구현예에서, 상기 조성물은, 환자의 조직 결함 치료를 필요로 하는 부위에서 환자에게 상기 조성물을 도입하기 전에, 형성된다.
일 구현예에서, 본 발명은, 이를 필요로 하는 환자의 조직 결함 또는 질환을 치료하는 방법을 제공하되, 상기 방법은,
a) 상기 조직 결함 또는 질환을 치료하기에 충분한 양으로 상기 조직 결함의 부위에서 상기 조성물을 상기 환자에게 도입하는 단계를 포함하되,
상기 조성물은 상기 결함의 부위에서 상기 조직에 부착된다.
일 구현예에서, 본 발명은, 이를 필요로 하는 환자의 조직 결함 또는 질환을 치료하는 방법을 제공하되, 상기 방법은,
a) 상기 조직 결함 또는 질환을 치료하기에 충분한 양으로 상기 조직 결함의 부위에서 상기 조성물을 상기 환자 내에 형성하는 단계를 포함하되,
상기 조성물은 상기 결함의 부위에서 상기 조직에 부착된다.
일 구현예에서, 상기 조직 결함은 상처이다.
일 구현예에서, 상기 조직은 손상되고 재생이 필요하다.
일 구현예에서, 상기 조직 결함은 뼈 결함이다.
일 구현예에서, 상기 조성물은 환자의 뼈의 재생을 유도한다.
일 구현예에서, 적어도 하나의 세포 유형은 조성물 내로 침투하고 조성물 내에서 성장한다.
일 구현예에서, 상기 적어도 하나의 세포 유형은, 췌장 줄기 세포, 장내분비 세포, 골세포, 간세포, 기구, 근세포, 조혈, 전이유세포, 상피 세포, 내피 세포, 뉴런, 배아 줄기 세포, 간엽 줄기세포, 자가 골수 유래 간엽 줄기세포, 전구 세포, 조혈 줄기 세포, 간엽 줄기 세포, 신경 줄기 세포, 뼈 시스템 줄기 세포, 연골 세포주 줄기 세포, 상피 줄기 세포 및 간 줄기 세포로 이루어지는 군으로부터의 세포 유형이다.
일 구현예에서, 본 발명은, 섬유아세포를 자극하여 환자에게 새로운 콜라겐을 생성하는 방법을 제공하며, 상기 방법은,
a) 섬유아세포 자극을 유도하기에 충분한 양으로 상기 환자에게 조성물을 형성하는 단계를 포함하되,
b) 상기 조성물은 섬유아세포 자극 및 콜라겐 합성을 촉진하도록 구성되고, 상기 섬유아세포 부착 및 콜라겐 합성은 조직(피부) 재생을 유도하고,
c) 상기 조성물은 다공성 스캐폴드이고,
d) 상기 스캐폴드의 기공은 1 내지 500 μm이고, 상기 조성물은,
i. 콜라겐과 젤라틴으로 이루어진 군으로부터 선택된 가교성 단백질;
ii. 상기 가교성 단백질의 가교 결합을 유도하는 가교제; 및
iii. 액체를 포함한다.
일 구현예에서, 상기 젤라틴은 액체로 희석한 후 3% w/w 내지 30% w/w 범위의 조성물 내에 존재한다.
일 구현예에서, 상기 젤라틴은 액체로 희석한 후 8% w/w 내지 25% w/w 범위의 조성물 내에 존재한다.
일 구현예에서, 상기 젤라틴은 액체로 희석한 후 8% w/w 내지 20% w/w 범위의 조성물 내에 존재한다.
도 1은 본 발명의 일부 구현예에 따라 미분화된 단백질의 입자 크기 분포를 나타내는 그래프이다.
도 2는 본 발명의 조성물을 형성하기 위해 본 발명의 일부 구현예에 따른 장치의 사진이다.
도 3a는 본 발명의 일부 구현예에 따라 처리된 조직의 세포를 보여주는 사진이다.
도 3b는 본 발명의 일부 구현예에 따라 비처리된 조직의 세포를 보여주는 사진이다.
도 4는 본 발명의 일부 구현예에 따른 스캐폴드 조성물에서 씨딩된 세포를 나타내는 사진이다.
도 5는 본 발명의 일부 구현예에 따른 콜라겐 침착 분석의 사진이다.
도 6a 내지 도 6e는 본 발명의 일부 구현예에 따라 본 발명의 조성물 사진이다.
도 7의 a 내지 d는 본 발명의 일부 구현예에 따라 본 발명의 조성물 사진이다.
도 8은 본 발명의 일부 구현예에 따른 조성물의 현미경 사진이다.
도 9는 본 발명의 일부 구현예에 따른 제트 밀링 장치의 사진이다.
도 10은 본 발명의 일부 구현예에 따른 스캐폴드 조성물에서 씨딩된 세포의 생존 능력을 나타낸다.
도 11의 a 및 b는 본 발명의 일부 구현예에 따라 본 발명의 조성물 사진이다.
도 12는 본 발명의 일부 구현예에 따라 본 발명의 조성물 사진이다.
도 13의 a 내지 d는 본 발명의 일부 구현예에 따라 본 발명의 조성물 사진이다.
도 14는 본 발명의 일부 구현예에 따라 본 발명의 조성물 사진이다.
개시의 명확성을 위해, 그리고 제한적이지 않게, 본 발명의 상세한 설명은 본 발명의 특정 특징부, 구현예 또는 응용을 설명하거나 예시하는 하기 하위섹션으로 나누어진다.
명세서 및 청구범위 전체에 걸쳐, 다음의 용어는 문맥이 달리 명확하게 지시하지 않는 한, 본원에서 명시적으로 연관된 의미를 취한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 문구 "일 구현예에서" 및 "일부 구현예에서"는 반드시 동일한 구현예(들)를 지칭할 필요는 없지만, 지칭할 수 있다. 또한 본원에서 사용된 바와 같이, 문구 "다른 구현예에서" 및 "일부 다른 구현예에서"는 반드시 다른 구현예(들)를 지칭할 필요는 없지만, 지칭할 수 있다. 따라서, 후술하는 바와 같이, 본 발명의 다양한 구현예는 본 발명의 범주 또는 사상을 벗어나지 않고서 쉽게 조합될 수 있다.
또한, 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "또는"은, 포괄적인 "또는" 연산자이며, 문맥이 달리 명확하게 언급하지 않는 한 "및/또는"이라는 용어와 등가이다. 용어 "기초로 하는"은 독점적이지 않으며, 문맥상 달리 명확하게 언급하지 않는 한, 설명되지 않은 추가 요인에 기초로 하는 것을 허용한다. 또한, 명세서 전체에 걸쳐, "일", "하나", 및 "그것" 라는 의미는 복수의 참조를 포함한다. "내"의 의미는 "내" 및 "상"을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, "젤라틴"은 동물 피부, 결합 조직, 어금니, 뿔, 뼈, 생선 비늘로 이루어진 군으로부터 선택된 동물 조직 또는 동물 조직으로부터 얻은 콜라겐의 부분적 가수분해, 그리고 박테리아, 효모, 동물, 곤충, 또는 식물 시스템(비제한적인 예로 담배를 포함함) 또는 임의 유형의 세포 배양을 사용하여 생산된 재조합 젤라틴, 또는 이들의 임의의 조합에 의해 얻는다.
본원에서 사용된 바와 같이, "블룸"은 10 DC에서 17시간 동안 젤화된 6% 고체를 함유한 젤라틴 용액으로 1/2 인치 직경 플런저로 4 mm 누르기 위해 필요한 그램 단위의 중량으로서 정의된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "담체"는 중합체, 단백질, 다당류, 또는 가교 결합 반응 전 또는 그 동안에 가교 효소와 공유 또는 비공유 결합되는 임의의 다른 성분을 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "공중합체"는 가교 결합 반응에 참여할 수 있는 매트릭스의 성분을 지칭하며, 통상적으로 매트릭스의 주 성분을 포함하지 않는다. 공중합체는 전형적으로 효소에 또는 매트릭스 물질, 예컨대 매트릭스의 단백질 염기에 공유 결합되지 않는다. 공중합체의 비제한적인 예는, 덱스트란과 같은 다당류 및/또는 카르복시메틸 셀룰로오스와 같은 셀룰로오스 중합체이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "가교 효소"는 적어도 하나의 효소(예, 1 효소, 2 효소, 3 효소, 4 효소, 5 효소 등, 그러나 이에 제한되지 않음)를 지칭하고, 이는 직접적으로 (예를 들어, 트랜스글루타민화, 그러나 이에 제한되지 않음) 또는 간접적으로 (예를 들어, 퀴논 또는 자유 라디칼 형성, 그러나 이에 제한되지 않음) 중합체 가닥 상에 기재 기를 가교 결합해서, 예컨대 하이드로젤과 같으나 이에 제한되지 않는 매트릭스를 형성할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "확산성" 또는 "이동성"은, 예를 들어 효소(들)의 무작위 분자 운동을 지칭하나 이에 제한되지 않고/않거나 기타 분자, 예를 들어 브라운 운동으로부터 기인할 수 있는 용액 내의 임의의 단백질, 수소, 또는 매트릭스를 지칭하나 이에 제한되지 않는다.
본원에서 정의된 바와 같이 "확산 계수" 또는 "확산도"는 특정 조건 하에서 단일 유형의 분자에 대한 확산 정도를 정량화하는 용어를 지칭한다. 구체적으로, 확산 계수 또는 확산도는, 분자 확산으로 인한 몰 플럭스와 종 농도의 구배(또는 확산을 위한 구동력) 사이의 비례 상수이다. 즉 하이드로젤에 의해 용출된 효소의 속도 및/또는 총량을 측정하는 방법은, 하이드로젤로부터의 효소의 용출량을 측정함으로써 수행한다.
본원에서 정의된 바와 같이, "유체 역학적 부피"는, 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여 통상적으로 측정될 수 있는, 단백질 또는 효소의 분자량을 지칭한다. 성분의 유체역학적 부피는, 액체 형태로 움직이는 경우에 성분의 직경 및/또는 부피를 지칭한다.
본원에서 정의된 바와 같이, "매트릭스"는 가교 결합된 물질의 조성물을 지칭한다. 통상적으로, 매트릭스 형성 물질이 가교 결합되는 경우, 이들 물질을 포함하는 조성물은 액체 상태로부터 젤 상태로 전이됨으로써, "젤", "하이드로젤" 또는 "젤화 조성물"을 형성한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "MW"로 약칭된 "분자량"은 달톤 또는 킬로달톤의 단백질 또는 중합체의 절대 중량을 지칭한다. 예를 들어, PEG화된 단백질(예, 하나 이상의 PEG(폴리에틸렌 글리콜) 분자가 결합된 단백질, 그러나 이에 제한되지 않음)의 MW는 그의 모든 성분의 MW 합이다.
본원에 사용된 바와 같이, "환자"는 본 발명의 방법에 따라 치료를 필요로 하는 임의의 동물 또는 인간을 지칭한다.
본원에서 정의된 바와 같이, "인지 부피" 또는 "유효 부피"는 가교 결합된 매트릭스 내부에서 가교 결합 효소의 유효 유체역학적 부피를 지칭한다. 인지 부피는, 가교 결합 반응 전에 또는 이 동안에 효소가 다른 분자, 담체, 중합체, 단백질, 다당류 및 기타 등에 공유 결합 또는 비공유 결합에 의해 증가될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "중합체"는 반복 가능한 단위를 함유하는 천연, 합성 또는 절반 합성 분자를 지칭한다.
본원에서 정의된 바와 같이, "감소된 이동성"은 용액 또는 하이드로젤 내부에서 단백질 또는 효소의 보다 느린 분자 이동, 또는 보다 작은 확산 계수를 지칭하며, 용출률에 의해 측정될 수 있다.
본원에서 정의된 바와 같이, "크기"는 분자 중량 또는 유체 역학적 부피 또는 인지 부피를 지칭한다.
본원에서 정의된 바와 같이, "밀링"은 다음 방법 중 임의의 것에 의해 물질을 분쇄하는 것을 지칭한다: 제트 밀링, 회전/와류 밀링, 볼 밀링, 고압 균질화 및 미세유체화, 분무 건조, 재결정화, 에멀젼 용매 추출, 및 초임계 솔루션의 빠른 확장(RESS)과 같은 초임계 유체를 사용하는 방법.
"제트 밀링"은 회전 또는 와류 밀링에 의한 미분화 방법을 지칭한다.
가교성 단백질
상기 방법 및/또는 매트릭스에 대한 적어도 일부 구현예에 따라, 적어도 하나의 기재 중합체는, 천연 가교성 중합체, 상기 효소에 의해 가교성인 부분 변성된 중합체 및 상기 비변형 또는 변형된 효소에 의해 가교성인 펩티드 또는 작용기를 포함한 중합체로 이루어진 군으로부터 선택된 기재 중합체를 포함한다. 선택적으로, 적어도 하나의 기재 중합체는, 젤라틴, 콜라겐, 카세인 또는 알부민, 또는 변형된 중합체를 포함하고, 여기서 변형된 효소 분자는, 트랜스글루타미나제 및/또는 산화 효소, 변형된 트랜스글루타미나제 및/또는 변형된 산화 효소를 포함한다. 선택적으로, 적어도 하나의 기재 중합체는, 동물 피부, 결합 조직, 어금니, 뿔, 뼈, 생선 비늘로 이루어진 군으로부터 선택된 동물 조직 또는 동물 조직으로부터 얻은 콜라겐의 부분적 가수분해에 의해 얻은 젤라틴, 그리고 박테리아, 효모, 동물, 곤충, 또는 식물 시스템 또는 임의 유형의 세포 배양을 사용하여 생산된 재조합 젤라틴, 또는 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 젤라틴을 포함한다. 선택적으로 젤라틴은 포유류 또는 어류로부터 유래한다. 선택적으로 젤라틴은 A형(산처리) 또는 B형(알칼리 처리)이다. 선택적으로 젤라틴은 250 내지 300 블룸이다. 일부 구현예에서, 젤라틴은 75 내지 150 kda의 평균 분자량을 갖는다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 적합한 작용기를 갖는 합성 또는 부분 합성 중합체는, 또한 본원에 기술된 임의의 효소에 대한 가교성 기재로서 작용할 수 있다. 본 발명의 다른 구현예에서, 효소의 조합이 사용된다. 본 발명의 다른 구현예에서, 가교제의 조합이 사용되나 반드시 오직 효소일 필요는 없다.
일부 구현예에서, 가교성 중합체는 적어도 하나의 RGD(Arg-Gly-Asp) 모티프를 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 RGD 모티프는 본 발명의 조성물에 세포 부착을 촉진한다.
일부 구현예에서, 가교성 중합체는, 세포 유형 또는 움직임 상태와 무관하게 세포용 스캐폴드로서 작용할 수 있는 RGD 모티프의 불균일한 분포를 함유하여, 이를 다가 세포 스캐폴드로 만들 수 있다.
따라서 본 발명은, RGD 모티프의 다가 표시를 통해 개선된 세포 부착 및 움직임 호환성을 갖는 가교성 중합체를 제공한다.
따라서 본 발명은, RGD 모티프의 다가 표시를 통해 개선된 세포 부착 및 움직임 호환성을 갖는 비재조합 가교성 폴리펩티드를 제공한다.
따라서 본 발명은, RGD 모티프의 다가 표시를 통해 개선된 세포 부착 및 움직임 호환성을 갖는 젤라틴을 제공한다.
따라서 본 발명은, RGD 모티프의 다가 표시를 통해 개선된 세포 부착 및 움직임 호환성을 갖는 비재조합 젤라틴을 제공한다.
따라서 본 발명은, RGD 모티프의 다가 표시를 통해 개선된 세포 부착 및 움직임 호환성을 갖는 미분화된 젤라틴을 제공한다.
따라서 본 발명은, RGD 모티프의 다가 표시를 통해 개선된 세포 부착 및 움직임 호환성을 갖는 다공성 스캐폴드, 예컨대 젤라틴 발포체를 제공한다.
따라서 본 발명은, RGD 모티프의 다가 표시를 통해 개선된 세포 부착 및 움직임 호환성을 갖는 다공성 스캐폴드, 예컨대 적어도 3% w/w의 젤라틴을 갖는 젤라틴 발포체를 제공한다.
따라서 본 발명은, RGD 모티프의 다가 표시를 통해 개선된 세포 부착 및 움직임 호환성을 갖는 다공성 스캐폴드, 예컨대 105 내지 25% w/w의 젤라틴을 갖는 젤라틴 발포체를 제공한다.
따라서 본 발명은, 피브린 첨가를 이용한, 임의의 진술된 조성물을 제공한다.
본원에서 정의된 바와 같이, "중합체 가닥" 또는 "중합체 사슬"은 효소 가교 결합을 위한 기재 중합체를 지칭하고, 이는 본 발명의 적어도 일부 구현예에 따르면, (비제한적인 구현예로서만) 하기 카테고리 중 하나에 속한다:
1) 효소에 의해 자연적으로 가교 결합될 수 있고 그 자체가 효소에 의해 자연적으로 가교 결합될 수 있는 기재 작용기를 갖는 임의의 중합체. 예를 들어, 트랜스글루타미나제의 경우, 이는 효소에 의해 자연적으로 가교 결합되는 젤라틴, 콜라겐 및 카세인과 같은 단백질 또는 폴리펩티드를 포함할 것이다.
2) 효소에 의해 가교 결합되나, 그 구조의 결과로서 효소에 의해 자연적으로 가교 결합되지 않는 기재 작용기를 포함하는 중합체. 이러한 경우, 중합체 구조는 효소 가교 결합에 앞서 변형되어야 한다. 예를 들어, 트랜스글루타미나제의 경우, 이것은 효소의 접근을 방해하는 구 형상의 구조를 갖기 때문에 효소에 대한 천연 기재가 아닌 단백질, 예컨대 알부민 또는 락토글로불린을 포함할 것이다. 이들은 환원제, 변성제 또는 열을 사용하여 단백질을 부분적으로 변성시킴으로써 기재로 제조될 수 있다.
3) 효소 가교 결합용 기재가 아니라, 효소의 기재인 펩티드 또는 작용기로 변형되고 따라서 변형된 중합체를 효소에 의해 가교 결합시키는 천연 또는 합성 중합체. 이러한 중합체의 비제한적인 예는, 예를 들어 전술한 바와 같이 젤라틴을 포함할 수 있는 임의 적합한 유형의 단백질을 포함한다. 젤라틴은, 동물 피부, 결합 조직(인대, 연골 등을 포함하나 이에 제한되지 않음), 어금니 또는 뿔 등, 및/또는 뼈, 및/또는 물고기 비늘 및/또는 뼈, 또는 다른 성분을 포함하나 이에 제한되지 않는 동물 조직 및/또는 동물 조직으로부터 얻은 콜라겐의 부분적 가수분해에 의해 얻은 젤라틴; 및/또는 박테리아, 효모, 동물, 곤충, 또는 식물 시스템 또는 임의 유형의 세포 배양을 사용하여 생산된 재조합 젤라틴, 또는 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 젤라틴을 포함하나 이에 제한되지 않고 당 분야에 알려진 단백질을 포함한 임의 유형의 젤라틴을 포함할 수 있다.
본 발명의 일부 구현예에 따라, 동물 유래의 젤라틴은 포유류 유래의 젤라틴을 포함할 수 있으며, 예를 들어, 돼지 피부, 돼지 및 소 뼈, 또는 찢긴 소 가죽, 또는 임의의 다른 돼지 또는 소의 공급원, 또는 이들의 조합을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 젤라틴은, 더 낮은 아나필락시스 속도를 갖기 때문에 돼지 젤라틴을 포함할 수 있다. 동물 유래의 젤라틴은 선택적으로 A형(산 처리) 또는 B형(알칼리 처리됨)일 수 있지만, A형일 수 있다.
일부 구현예에서, 동물 유래의 젤라틴은 제1 추출 중에 얻어진 젤라틴을 포함하고, 이는 일반적으로 낮은 온도(50 내지 60°C, 이 정확한 온도 범위는 반드시 제약이 아님)에서 수행된다. 이 방식으로 제조된 젤라틴은 250 내지 300 블룸 범위일 것이고, 적어도 약 95 내지 100 kDa의 높은 분자량을 갖는다. 일부 구현예에서, 275 내지 300 블룸의 젤라틴이 사용된다. 이러한 젤라틴의 제조사의 비제한적인 예는, PB 젤라틴(Tessenderlo Group, 벨기에)이다.
본 발명의 일부 구현예에 따라, 동물 유래의 젤라틴은 어류에서의 젤라틴을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 임의 유형의 어류가, 예를 들어 잉어, 대구, 또는 강꼬치 또는 참치와 같이 차가운 수종의 어류가 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 생선 젤라틴의 pH(10% w/w 용액에서 측정됨)는 pH 4 내지 pH 6의 범위일 수 있다.
일부 구현예에서, 냉수성 어류 젤라틴은 10°C에서 수용액을 형성한다. 일부 구현예에서, 냉수성 어류 젤라틴은 0 블룸이다. 일부 구현예에서, 적어도 약 95 내지 115 kDa의 평균 분자량을 포함하는 고분자량 냉수성 어류 젤라틴을 사용할 수 있다(상기 냉수성 어류 젤라틴은 250 내지 300 블룸의 동물 젤라틴의 분자량과 견줄 수 있음). 일부 구현예에서, 냉수성 어류 젤라틴은, 감소된 양의 프롤린 및 히드록시프롤린으로 인해, 동물 젤라틴 보다 낮은 온도에서 열가역성 젤화를 겪는다. 이러한 젤라틴의 제조사의 비제한적인 예는 Norland Products(크랜버리, NJ)이다.
본 발명의 일부 구현예에서, 저 내독성 젤라틴이 젤라틴 매트릭스 조성물의 젤라틴 용액 성분을 형성하기 위해 사용된다. 일부 구현예에서, 저 내독성 젤라틴은 GelitaTM(에버바흐, 독일)와 같은 공급자로부터 시판되고 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 저 내독성 젤라틴은 그램 당 1000 내독성 단위(EU) 미만인 젤라틴으로 정의된다. 일부 구현예에서, 500 EU/그램 미만인 내독성의 젤라틴이 사용된다.
일부 구현예에서, 척추 또는 뇌와 접촉하게 될 물질을 생성하는 경우, 100 EU/그램 미만(예, 1 내지 100 EU/그램)인 내독성을 갖는 젤라틴을 사용한다. 일부 구현예에서, 50 EU/g 미만인 젤라틴이 사용된다. 일부 구현예에서, 10 EU/g 미만인 내독성을 갖는 젤라틴이 사용될 수 있다.
본 발명의 일부 구현예에 따라, I형, II형, 또는 임의의 다른 유형의 가수분해되거나 비가수분해된 콜라겐은, 가교 결합되는 단백질 물질로서 젤라틴을 대체한다. 다양한 유형의 콜라겐은, 열적으로 안정한 mTG 가교 결합된 젤을 형성하는 능력을 입증하였다. 이로서, 예를 들어 문헌 "Characterization of a microbial transglutaminase cross-linked type II collagen scaffold"; PMID: 16846344에 보고된 바와 같다.
본 발명의 일부 구현예에 따라, 재조합 인간 젤라틴이 사용된다. 일부 구현예에서, 재조합 인간 젤라틴은 FibrogenTM(샌프란시스코, CA)과 같은 공급업체로부터 시판 중이다. 일부 구현예에서, 재조합 인간 젤라틴은 Collplant사(레호봇, 이스라엘)와 같은 공급업체로부터 시판 중이다. 　 일부 구현예에서, 재조합 젤라틴은 적어도 약 90%(예, 90.01 내지 100%) 순수할 수 있다. 일부 구현예에서, 재조합 젤라틴은 적어도 약 95%(예, 95.01 내지 100%) 순수할 수 있다. 일부 구현예에서, 재조합 젤라틴은 10℃에서 젤화되지 않을 수 있으며, 따라서 0 블룸으로 간주된다. 본 발명의 일부 구현예를 위해, 예를 들어 적어도 약 95 내지 100 kDa의 분자량을 포함하나 이에 제한되지 않는 고분자량 재조합 젤라틴을 사용할 수 있다.
일부 구현예에서, 가교성 단백질은 젤라틴을 포함할 수 있지만, 추가적으로 또는 대안적으로 다른 유형의 단백질을 포함할 수 있다. 본 발명의 일부 구현예에 따라, 단백질은 또한 트랜스글루타미나제를 위한 기재이다. 일부 구현예에서, 트랜스글루타미나제를 위한 기재는 콜라겐 또는 다른 합성된 중합체 서열을 포함할 수 있고, 이는 트랜스글루타민에 의해 가교될 물질의 능력을 증가시키는 트랜스글루타미나제 특이적 기재로 변형된 바이오 접착제 또는 중합체를 독립적으로 형성하는 특성을 갖는다. 조성물은 또한 피브린을 포함할 수 있다.
예시적인 구현예에서, 가교 결합을 위한 적당한 트랜스글루타미나제 표적을 갖는 합성된 폴리펩티드 및 중합체 서열은, 약 20 내지 약 40℃의 전이점을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 물리적 특성은 조직을 결합하는 능력 및 섬유를 형성하는 능력을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 이러한 펩티드의 비제한적인 예는 미국 특허 제5,428,014호 및 제5,939,385호에 설명되고, 이는 본원에 완전히 진술되는 것처럼 참조로 본원에 포함되며 바이오 적합성, 바이오 접착성, 트랜스글루타미나제 가교성 폴리펩티드를 설명하고, 트랜스글루타미나제는 단백질에 결합된 글루타밀 잔기의 γ -카르복사미드 기와 Lys 잔기의 ε -아미노기 사이에 아실-전달 반응을 촉매하여 8-(y-글루타밀) 리신 이소펩티드 결합의 형성을 초래한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 화합물은, 따뜻하거나 차가운 액체(예, 4°C 내지 37°C의 액체, 그러나 이에 제한되지 않음)로 신속하게 수화시켜 다공성 스캐폴드, 젤 또는 발포체를 형성하도록 구성된 실질적으로 건식 젤라틴으로서, 다공성 스캐폴드, 젤 또는 발포체는 생체외 또는 생체내 임의의 공동, 신체 공동으로, 상처 상에서, 기관 상에서 또는 이의 조합으로 형상화되고 성형되도록 추가로 구성된다. 일부 구현예에서, 가교 결합되지 않은 젤라틴 및 가교제가 수화/재구성된 이후, 가교 결합되지 않은 젤라틴은 가교제와 반응/혼합되고, 여기서 가교 결합되지 않은 젤라틴과 가교제의 혼합은 안정적이고, 용해되지 않고, 열 가역성이 아닌 젤, 발포체 또는 다공성 스캐폴드의 형성 결과를 갖는다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용해도 상수에 대한 입자 크기의 효과는 다음과 같이 정량화될 수 있다:
Figure pct00001
여기서 * KA는 상기 몰 표면적 A를 갖는 상기 용질 입자에 대한 용해도 상수이고, *KA→0은 표면적이 영으로 되는 경우(즉, 입자가 큰 경우)의 물질에 대한 용해도 상수이고, γ는 용매 내의 용질 입자의 표면 장력이고, Am은 용질의 몰 표면적(m2/mol)이고, R은 범용 기체 상수이고, T는 절대 온도이다.
약물 및 단백질의 마이크론 크기인 입자의 제조를 위한 통상적인 기술은, 이전에 형성된 더 큰 입자의 기계적 분쇄(예, 으깸, 연마, 및 밀링)이다. 본 발명의 방법의 일부 구현예에서, 밀링은 모르타르에 의해 달성되고, 다른 바람직한 구현예에서는 제트 밀링에서 달성된다. 도 1은 제트 밀링에 의한 미분화 후의 입자 크기 분포를 나타낸다.
일부 구현예에서, 본 발명의 방법은, 신속하에 용해하는, 가교 결합되지 않은 단백질의 건조 단백질(예, 젤라틴, 그러나 이에 제한되지 않음)을 제조하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 젤라틴은 제트 밀링에 의해 제조되어 2 내지 250 μm의 입자 크기를 달성한다. 일부 구현예에서, 입자 크기는 5 내지 130 ㎛이다. 일부 구현예에서, 입자 크기는 10 내지 80 ㎛이다. 일부 구현예에서, 입자 크기는 10 내지 70 ㎛이다. 일부 구현예에서, 입자 크기는 10 내지 60 ㎛이다. 일부 구현예에서, 입자 크기는 10 내지 50 ㎛이다. 일부 구현예에서, 입자 크기는 10 내지 40 ㎛이다. 일부 구현예에서, 입자 크기는 10 내지 30 ㎛이다. 일부 구현예에서, 입자 크기는 10 내지 20 ㎛이다. 일부 구현예에서, 입자 크기는 2 내지 10 ㎛이다. 일부 구현예에서, 입자 크기는 10 내지 100 ㎛이다. 일부 구현예에서, 입자 크기는 20 내지 100 ㎛이다. 일부 구현예에서, 입자 크기는 30 내지 100 ㎛이다. 일부 구현예에서, 입자 크기는 40 내지 100 ㎛이다. 일부 구현예에서, 입자 크기는 50 내지 100 ㎛이다. 일부 구현예에서, 입자 크기는 60 내지 100 ㎛이다. 일부 구현예에서, 입자 크기는 70 내지 100 ㎛이다. 일부 구현예에서, 입자 크기는 80 내지 100 ㎛이다. 일부 구현예에서, 입자 크기는 90 내지 100 ㎛이다. 일부 구현예에서, 입자 크기는 5 내지 50 ㎛이다. 일부 구현예에서, 입자 크기는 10 내지 20 ㎛이다. 일부 구현예에서, 입자 크기는 10 내지 15 ㎛이다. 일부 구현예에서, 입자 크기는 15 내지 20 ㎛이다. 일부 구현예에서, 입자 크기는 12 내지 18 ㎛이다.
일부 구현예에서, 본 발명의 방법은 제트 밀링을 포함하고, 제트 밀링은 액체에서 신속한 용해(예, 0.01초 내지 60초에서 용해되나 이에 제한되지 않음)를 위해 각각의 젤라틴 입자(결정)를 제조하는 결과를 갖는다(즉, 최종 제트 밀링된 입자는 놀랍게도 제트 밀링되지 않은 출발 재료에 비해 증가된 흡습 특성을 나타냄). 일부 구현예에서, 제트 밀링된 입자는 가교제와 혼합되어 열적 안정성 및 조직 유착성 하이드로젤 또는 발포체를 형성할 수 있다. 일부 구현예에서, 다공성 스캐폴드, 젤/발포체는 인간 또는 동물의 조직층 사이 및/또는 체강 내부에 배치될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명은 다양한 의료 용도에 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명은, 개선된 노출 및 인테그린 부착 부위의 접근성(예컨대 RGD 모티프)을 제공하는 세포 스캐폴드로서 이용될 수 있다.
일부 구현예에서, 젤라틴은 밀링에 의해 작은 입자 크기로 제조되어, 증가된 가교 결합 프로파일을 초래하며, 상기 제조된 젤라틴은 2 내지 200 μm인 마이크론 크기 프로파일을 갖는 것을 특징으로 한다. 일부 구현예에서, 젤라틴은 밀링에 의해 작은 입자 크기로 제조되어, 증가된 가교 결합 프로파일을 초래하며, 상기 제조된 젤라틴은 2 내지 100 μm인 마이크론 크기 프로파일을 갖는 것을 특징으로 한다. 일부 구현예에서, 젤라틴은 밀링에 의해 작은 입자 크기로 제조되어, 증가된 가교 결합 프로파일을 초래하며, 상기 제조된 젤라틴은 2 내지 50 μm인 마이크론 크기 프로파일을 갖는 것을 특징으로 한다. 일부 구현예에서, 젤라틴은 밀링에 의해 작은 입자 크기로 제조되어, 증가된 가교 결합 프로파일을 초래하며, 상기 제조된 젤라틴은 50 내지 150 μm인 마이크론 크기 프로파일을 갖는 것을 특징으로 한다. 일부 구현예에서, 젤라틴은 밀링에 의해 작은 입자 크기로 제조되어, 증가된 가교 결합 프로파일을 초래하며, 상기 제조된 젤라틴은 100 내지 150 μm인 마이크론 크기 프로파일을 갖는 것을 특징으로 한다. 일부 구현예에서, 젤라틴은 제트 밀링에 의해 제조되어, 증가된 가교 결합 프로파일을 초래하며, 상기 제조된 젤라틴은 마이크론 크기 프로파일을 갖는 것을 특징으로 한다. 일부 구현예에서, 사전 가교된 젤라틴은 (1) 동결 건조된 다음 (2) 제트 밀링되어 건조 분말화된 젤라틴(즉 고 블룸 젤라틴)을 제조할 수 있고, 상기 건조 분말화된 젤라틴은, 120초 이하(즉, 0.01초 내지 120초)의 시간으로 예를 들어, 5℃ 내지 37℃의 온도, 그러나 이에 제한되지 않는 온도에서 용액을 생성하기 위해 용액에 용해될 수 있다.
일 구현예에서, 밀 장치 및 방법은 미국 특허 제5,855,326호에 개시되고, 이는 본원에 그 전문이 참고로 포함된다. 또 다른 구현예에서, 밀 장치는 미국 특허 제6,789,756호에 개시되고, 이는 본원에 그 전문이 참고로 포함된다. 이러한 밀링 장치의 일례는, 이스라엘 요크님의 SuperFine사에 의해 제조된 SuperFine Vortex MillTM이다(도 9에 개략적으로 나타냄). Beliaysky의 미국 특허 제5,855,326호는 전체 내용이 참조로 포함되고, 미립자 고체 물질의 미세 분쇄를 위한 회전 밀링 챔버를 개시하고 있으며, 상기 챔버는, 작동 유체를 챔버 내로 주입하고 그 안에 와류를 생성하기 위한 하나 이상의 접선 방향 노즐을 구비하고 두 개의 말단 표면과 측벽을 갖는 실질적으로 원통형 형상을 갖는 하우징에 형성되고, 상기 챔버는, 미립자 고체 물질이 분쇄되도록 그 안에 도입하기 위한 수단, 하나 또는 둘 모두 상기 말단 표면에 제공된 축방향으로 배치된 배출 경로, 및 와류가 형성되는 경우 챔버의 내벽에 가깝게 이동하는 층과 상호 작용함으로써 분쇄의 제어를 가능하게 하도록 조정된 하나 이상의 기계 요소 형태인 제어 수단을 포함한다. 회전 챔버의 작동은 모래를 사용하여 특허에서 예시된다. Beliaysky의 미국 특허 제6,789,756호는, 전체 내용이 또한 참조로 포함되고, 실질적으로 미립자 고체 물질의 밀링을 위해 개선된 와류 밀을 개시하며, 이는 하나 이상의 작동 챔버를 포함한다. 밀은, 또한 하나 이상의 작동 유체 유입구 및 하나 이상의 배출 포트를 포함한다. 하나 이상의 배출 포트와 함께 하나 이상의 작동 유체 유입구는, 하나 이상의 작동 챔버 내의 와류 흐름을 용이하게 한다. 하나 이상의 배출 포트로부터 배출된 고체 물질의 밀링을 제공하기 위한 하나 이상의 공급 유입구가 또한 존재한다. 또한, 하나 이상의 작동 챔버 내의 작동 유체의 흐름에 제어된 교란을 유도하기 위한 장치가 있으며, 이에 의해 와류 흐름 내의 고체 물질의 밀링을 개선한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 방법은 젤라틴 입자의 표면 흡습성을 증가시키기 위해 플라즈마 빔 에너지를 사용하는 단계를 포함할 수 있고, 플라즈마 빔 에너지로 처리된 최종 미분화된 젤라틴은 플라즈마 빔 처리되지 않은 젤라틴과 실질적으로 동일한 특징/특성을 갖는다. 일부 구현예에서, 젤라틴과 혼합하기 위한 추가 물질/화합물, 예를 들어 이에 제한되지 않지만, 미생물 트랜스글루타미나제, 골 보강 물질, 단백질 및 최종 산물에 혼합될 공중합체, 또는 이들의 임의의 조합은 플라즈마 빔 에너지로 처리될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명의 조성물은 흡습성 미립자 젤라틴 분말을 특징으로 할 수 있고, 이는, 0.01 내지 120초의 시간 동안 액체와 혼합되는 경우에 유동성 젤 또는 발포체로 용해되도록 구성된다. 일부 구현예에서, 액체는 제품 제형(즉, 키트)의 일부로서 제공될 수 있고, 혼합 전에 보호소의 의료 실무진(예, 간호사, 의사, 보조 의사 등)에 의해 시린지에 로딩될 수 있다. 일부 구현예에서, 건식 젤라틴 단독, 또는 가교제와 함께 혼합된 건식 젤라틴, 또는 수술용 메쉬와 함께 젤라틴 및 가교제 모두는, 습윤 조직과 접촉하는 경우에 신체에 바로 적용될 수 있거나 유체(즉, 식염수)를 적용함에 의해 또는 체액(즉, 신체에 내인성인 액체)에 의해 활성화될 수 있다. 일부 구현예에서, 밀링된 젤라틴 분말은 4 내지 40℃의 온도에서 수화될 수 있다. 일부 구현예에서, 밀링된 젤라틴 분말은 4 내지 20℃의 온도에서 수화될 수 있다. 일부 구현예에서, 밀링된 젤라틴 분말은 4 내지 15℃의 온도에서 수화될 수 있다. 일부 구현예에서, 밀링된 젤라틴 분말은 10 내지 25℃의 온도에서 수화될 수 있다. 일부 구현예에서, 밀링된 젤라틴 분말은 25 내지 37℃의 온도에서 수화될 수 있다. 일부 구현예에서, 밀링된 젤라틴 분말은 15 내지 25℃의 온도에서 수화될 수 있다. 일부 구현예에서, 밀링된 젤라틴 분말은 20 내지 25℃의 온도에서 수화될 수 있다. 일부 구현예에서, 밀링된 젤라틴 분말은 10 내지 20℃의 온도에서 수화될 수 있다. 일부 구현예에서, 밀링된 젤라틴 분말은 12 내지 18℃의 온도에서 수화될 수 있다. 일부 구현예에서, 밀링된 젤라틴 분말은 14 내지 19℃의 온도에서 수화될 수 있다(이는 수술실의 온도 범위임). 일부 구현예에서, 밀링된 젤라틴 분말은 약 16℃의 온도에서 수화될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명의 용해된 젤라틴은 37°C 보다 낮은 온도에서조차 유동성 형태를 유지하도록 구성된다(즉, 용해된 젤라틴은 즉시 그의 액체-젤 전이점을 넘어 비가역성 고체가 되지 않을 것임).
일부 구현예에서, 본 발명의 용해된 젤라틴은 긴 바늘, 카테터 또는 내시경을 통해 전달될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명의 용해된 젤라틴은 발포화되는 경우, 동일한 조성물의 융합성 젤라틴 하이드로젤보다 적은 점도를 갖는다.
일부 구현예에서, 본 발명의 방법은, 방사선 에너지를 사용하여 젤라틴을 제조/멸균하는 단계를 포함하며, 방사선을 쪼인 최종 젤라틴은 방사선을 쪼이지 않은 시작 젤라틴과 비교하여 실질적으로 유사한 기능적 특성(예, 가교성)을 갖는다.
일부 구현예에서, 본 발명의 방법은, 방사선 에너지를 사용하여 젤라틴을 제조/멸균하는 단계를 포함하며, 방사선을 쪼인 최종 젤라틴은 방사선을 쪼이지 않은 시작 젤라틴과 비교하여 적어도 약 25%의 기능적 특성(예, 가교성)을 갖는다. 일부 구현예에서, 본 발명의 방법은, 방사선 에너지를 사용하여 젤라틴을 제조/멸균하는 단계를 포함하며, 방사선을 쪼인 최종 젤라틴은 방사선을 쪼이지 않은 시작 젤라틴과 비교하여 25 내지 100%의 기능적 특성(예, 가교성) 갖는다.
일부 구현예에서, 본 발명의 방법은 젤라틴 분말을 추가의 활성 성분, 예컨대 이에 제한되지 않지만 안정화제(예, EDC (1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드, NHS (N-하이드록시숙신이미드), 카르바마이드, 글루타르알데히드, 호스래디쉬 페록시다제 및/또는 트랜스글루타미나제, 그러나 이에 제한되지 않음)와 혼합하는 단계를 포함하고, 상기 혼합된 젤라틴 및 안정화제는 안정적인 다공성 스캐폴드, 젤 또는 발포체를 형성하고, 다공성 스캐폴드, 젤 또는 발포체의 형상은 (즉, 젤라틴 분자 사이의 공유 결합 가교로 인해) 비가역적이다. 일부 구현예에서, 젤라틴 다공성 스캐폴드, 젤 또는 발포체의 가교 결합(즉, 안정화)은 인간 또는 동물의 신체 외부나 내부에 발생할 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명의 방법은 단백질 및/또는 폴리펩티드와 같은 중합체를 건조시키는 단계를 포함하고, 저온 또는 실온 액체인 환경(예, 5°C 내지 37°C의 액체, 그러나 이에 제한되지 않음)을 포함하는 전형적인 비 분쇄된 젤라틴과 비교하여 액체 내에서 실질적으로 더 빠른(예, 0.01초 내지 60초 재생, 그러나 이에 제한되지 않음) 재생 프로파일을 갖는 건조 중합체를 초래하기 위해, 단백질 및/또는 폴리펩티드는 콜라겐 및/또는 젤라틴 및/또는 임의의 젤라틴 변형물이다. 일부 비제한적인 예시적인 구현예에서, 젤라틴 분말은 (1) 실질적으로 긴 유효 기간(예, 1개월 내지 36개월)을 갖고 (2) 실질적으로 더 빠른 재생/용해도를 갖는 것을 특징으로 할 수 있다. 일부 구현예에서, 건조 중합체는 멸균되고, 멸균된 건식 중합체는, 실질적으로 유사한 비멸균 건식 중합체와 비교하여 실질적으로 유사한 생물학적 기능 및 용해/재생 특징을 나타낸다. 일부 구현예에서, 건조 중합체는 멸균되고, 멸균된 건식 중합체는, 실질적으로 유사한 비멸균 건식 중합체와 비교하여 적어도 25%의 생물학적 기능 및 용해/재생 특징을 나타낸다. 일부 구현예에서, 건조 중합체는 멸균되고, 멸균된 건식 중합체는, 실질적으로 유사한 비멸균 건식 중합체와 비교하여 50% 내지 100%의 생물학적 기능 및 용해/재생 특징을 나타낸다.
가교제
예시적인 구현예에서, 중합체 가닥 상에 기재 기를 가교 결합하는 직접 가교결합 효소의 비제한적인 예는, 트랜스글루타미나제 및 산화 효소를 포함한다. 트랜스글루타미나제의 예는, 미생물 트랜스글루타미나제(mTG), 조직 트랜글루타미나제(tTG), 각질 세포 트랜스글루타미나제, 표피 트랜스글루타미나제 전립선 트랜스글루타미나제, 뉴런 트랜스글루타미나제, 인간 트랜글루타미나제, 및 Factor XIII을 포함한다. 일부 구현예에서, 이들 효소는 천연 또는 재조합 공급원으로부터 유래할 수 있다. 일부 구현예에서, 중합체 가닥에서 글루타민 및 리신 아미노산은 트랜스글루타미나제 가교 결합을 위한 기재이다.
예시적인 구현예에서, 산화 효소의 비제한적인 예는 티로시나아제, 라카아제, 페록시다아제, 또는 이들의 임의의 조합이다. 일부 구현예에서, 산화 효소 가교 결합 중합체는 퀴논 형성(티로시나제) 또는 자유 라디칼 형성(라카아제, 페록시다아제)에 의한 가교 결합 중합체이다. 그 다음, 퀴논 및 자유 라디칼은 서로 또는 다른 아미노산 또는 페놀산과 상호 작용하여 중합체를 가교 결합시킨다. 일부 구현예에서, 산화 효소를 위한 가교성 기재는 티로신 또는 다른 방향족 아미노산을 함유하는 임의의 단백질일 수 있다. 일부 구현예에서, 기재는, 예컨대 페룰산을 포함하지만 이에 제한되지 않는 페놀산을 함유하는 탄수화물일 수 있다. 일부 구현예에서, 탄수화물은 아라비옥실란 또는 펙틴일 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 방법의 일부 구현예에 따라, 트랜스글루타미나제 용액은 1 단계 또는 다중 단계의 정제를 거쳐, 1) 트랜스글루타미나제 혼합물로부터 발효 잔기를 제거하고; 2) 트랜스글루타미나제 용액에서 활성 트랜글루타미나제의 양을 농축시키고; 3) 담체 단백질 및/또는 탄수화물로부터 트랜스글루타미나제 용액을 정제하며; 4) 트랜스글루타미나제 용액의 내독성 수준을 낮추고; 5) 트랜스글루타미나제 용액으로부터 모든 미생물을 제거하여 효과적으로 용액을 멸균하는 것; 닫힌 리스트에 제한되지 않도록 모든 또는 임의의 조합 중 하나 이상을 수행한다.
본 발명의 일부 구현예에 따라, 트랜스글루타미나제는 재조합 트랜스글루타미나제일 수 있다. 이러한 비결합 예는, 대장균 박테리아에서 발현되는 효소이다.
일부 구현예에서, 가교 결합 물질의 용액은, 가교성 단백질 또는 폴리펩티드와 혼합하기 전에 여과된다. 일부 구현예에서, 여과 공정은 보통 정화라고 알려진 거친 여과를 먼저 사용하여, 보다 미세한 여과 단계를 빠르게 차단할 발효 잔기의 큰 블록을 제거한다. 이러한 거친 여과의 비제한적인 예는, 약 0.45 μm 기공 크기 여과 및 약 0.65 μm 기공 크기 여과이다. 일부 구현예에서, 가교 결합 물질의 용액은 0.22 μm의 기공 크기의 필터를 통과하여, 예를 들어 그램 당 10 집락 형성 단위(CFU) 미만의 바이오버든을 감소시키고 의료 용도로 적당히 만들 수 있다. 일부 구현예에서, 바이오버든은 약 10 내지 2 미만의 멸균 보장 수준(SAL)을 달성하도록 감소된다. 일부 구현예에서, 바이오버든은 약 10 내지 3 미만의 멸균 보증 수준(SAL)을 달성하기 위해 감소되고, 여기서 SAL은 멸균 공정을 거친 후에 단일 단위가 비멸균 상태인 확률을 설명하기 위해 미생물학에서 사용되는 용어이다.
본 발명의 방법의 다른 구현예에 따라, 접선 방향 유동 및/또는 중공형 섬유 초여과 기술을 사용하여, 담체 탄수화물과 단백질의 제거에 의해 가교 결합 물질의 용액을 정제하고, 용액을 농축시킨다. 본 발명과 함께 사용하기 위한 기공 크기는, 가교 결합 조성물의 성분의 크기보다 작은 기공 크기를 갖는 것이다. 일부 구현예에서, 가교 결합 물질은 mTG이고 기공 크기는 10 내지 50 kDa 범위이다. 일 구현예에서, 가교 결합 물질은 mTG이고 기공 크기는 10 내지 30 kDa 범위이다. 일부 구현예에서, 이들의 비 결합 상업적 예는 Uniflux(GE), AKTA Pilot(GE) 또는 AKTA 플럭스 6(GE)이다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 크기 배제 크로마토그래피 단계는 주변 물질로부터 가교 결합 물질을 선택적으로 분리하는 데 사용된다(예, 페닐 Sepharose FF 컬럼(2.6*10cm, Pharmacia Biotech) 또는 예컨대 Sephacryl 컬럼(GE), 그러나 이에 제한되지 않음). 일부 구현예에서, 하나 이상의 소수성 및/또는 친수성 상호 작용 크로마토그래피 단계가, 주변 물질로부터 가교 결합을 선택적으로 분리하는 데 사용된다. 일부 구현예에서, 가교 결합 물질은 단백질이고, 하나 이상의 이온 교환 크로마토그래피 단계는 가교 결합 단백질을 결합하여 주변 물질로부터 정제하는 데 사용된다.
일부 구현예에서, 가교 결합 단백질은 mTG이고 하나 이상의 양이온 교환 크로마토그래피 단계는 mTG를 정제하는 데 사용된다. 일부 구현예에서, 양이온 교환 수지는 세파로즈 수지이다.
일부 구현예에서, 정제는 가교 결합 물질의 내독성 수준을 그램 당 5 내독성 단위(EU) 미만으로 감소시킨다. 일부 구현예에서, 정제는 가교 결합 물질의 내독성 수준을 그램 당 0.001 내지 5인 내독성 단위(EU) 미만으로 감소시킨다.
일부 구현예에서, 가교제는 mTG이고, 정제는 mTG 조성물을 초래하고, 여기서 특정 활성은 밀리그램 당 20 효소 단위보다 크고 밀리그램 당 25 단위를 초과한다. 일부 구현예에서, 가교제는 mTG이고, 정제는 mTG 조성물을 초래하고, 여기서 특정 활성은 밀리그램 당 10 효소 단위 내지 밀리그램 당 35 단위이다. 일부 구현예에서, 가교 결합 물질은 mTG이고, 정제는 95% 내지 99.9%의 전기영동 순도를 초래한다.
일부 구현예에서, 비제한적인 예로서 mTG 정제 공정은, 식품 등급 mTG 생성물을 정제하여 24 효소 단위/밀리그램 초과의 특정 활성, 95% 초과의 전기영동 순도, 5 내독성 단위/그램 미만, 및 10 CFU/g 미만을 갖는 mTG 조성물을 생산하도록 본원에서 설명된다. 비제한적인 예로서, mTG 정제 공정은, 식품 등급 mTG 생성물을 정제하여 밀리그램 당 25 내지 35 효소 단위의 특정 활성, 95 내지 99.9%의 전기영동 순도, 그램 당 0.001 내지 5 내독성 단위, 0.001<10 CFU/g, 또는 이들의 임의의 조합을 갖는 mTG 조성물을 생성하도록 본원에서 설명된다. 일부 구현예에서, 상기 명세서의 정제된 효소는 추가 탄수화물 또는 안정화제와 함께 또는 없이 동결 건조되고, 후속하여 감마 또는 전자 빔 방사선에 의해 말단 멸균을 거친다. 일부 구현예에서, 상기 말단 멸균 후 특정 활성은 밀리그램 당 5 내지 30 효소 단위이다. 일부 구현예에서, 상기 말단 멸균 후 특정 활성은 밀리그램 당 20 내지 30 효소 단위이다. 일부 구현예에서, 상기 말단 멸균 후 특정 활성은 밀리그램 당 20 내지 25 효소 단위이다.
일부 구현예에서, mTG 정제 공정은 비제한적인 예로서, 문헌 "Purification and Characterization of Novel Transglutaminase from Bacillus subtilis Spores" PMID: 11193401에서 설명된다.
일부 구현예에서, 정제 후, mTG는 건조되거나 동결 건조될 수 있고, 그 다음 본원에서 설명하는 것과 유사한 방법에서 5 내지 50 μm 흡습성 입자로의 밀링(임의의 유형)에 의해 미립자화될 수 있다. 일부 구현예에서, 정제 이후에 mTG를, 안정화 하이드로콜로이드로서의 셀룰로오스 에테르(HPMC)와 또는 트레할로오스와 혼합할 수 있다.
일부 구현예에서, 트랜스글루타미나제는 말토덱스트린과 혼합될 수 있다. 일부 구현예에서, 말토덱스트린은 안정화제이다.
일부 구현예에서, 풍부하고/풍부하거나 정제된 효소는, mTG와 안정화 부형제를 포함하는 미세 입자를 첨가하여 안정화될 수 있고, 첨가제 재료, 예를 들어 방사선 중에 안정화하는 데 도움을 줄 수 있는 안정화제(예, 셀룰로오스, 당류, 말토덱스트린, 카로티노이드, 아스코르베이트, L - 티로신, 그러나 이에 제한되지 않음)를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 안정화 부형제는 폴리올, 만니톨, 수크로오스, 글리세롤, 락토오스, 글리신, 또는 트레할로오스이다.
일부 구현예에서, 변형된 트랜스글루타미나제는 변형된 미생물 트랜스글루타미나제를 포함한다. 일부 구현예에서, 중합체는, 변형된 미생물 트랜스글루타미나제에 의한 가교 결합을 허용하도록 변형된다. 일부 구현예에서, 변형된 산화 효소는 티로시나제, 라카아제, 페록시다제, 또는 이들의 임의의 조합 중 하나 이상을 포함한다. 일부 구현예에서, 매트릭스는, 개질된 산화 효소에 의해 적어도 하나의 기재 중합체로서 가교되기 위한 페놀산을 포함하는 탄수화물을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 탄수화물은 아라빈옥실란 또는 펙틴 중 하나 이상을 포함한다. 일부 구현예에서, 효소 분자는 PEG화를 통해 변형되며, 여기서 PEG화는 매트릭스를 수용하는 숙주 동물의 면역 체계로부터 효소 분자를 마스킹함으로써 면역원성 마스킹을 제공한다. 일부 구현예에서, 숙주 동물은 인간이다.
본 발명의 일부 구현예에 따른 조성물
일부 구현예에서, 본 발명은 조성물을 제공하며,
상기 조성물은 다공성 스캐폴드이고,
상기 스캐폴드의 기공은 1 내지 500 μm이고, 상기 조성물은,
a) 콜라겐과 젤라틴으로 이루어진 군으로부터 선택된 가교성 단백질;
b) 상기 가교성 단백질의 가교 결합을 유도하는 가교제; 및
c) 액체를 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "스캐폴드"는 바람직한 세포 상호 작용을 유발하여 의료 목적으로 새로운 기능성 조직의 형성에 기여하도록 엔지니어링된 물질을 지칭한다. 세포는 3차원 조직 형성을 지지할 수 있는 이들 구조체 내로 '씨딩'될 수 있다. 스캐폴드는 천연 조직의 천연 세포외 매트릭스를 모방할 수 있고, 생체내 환경을 요약하고 세포가 자신의 마이크로 환경에 영향을 미칠 수 있게 한다. 스캐폴드는 다음 목적 중 적어도 한 가지 기능을 할 수 있다.
1) 셀 부착 및 이동을 허용한다.
2) 세포 및 생화학적 인자를 전달하고 보유한다.
3) 필수 세포 영양소 및 발현된 생성물의 확산을 가능하게 한다.
4) 소정의 기계적 및 생물학적 영향을 발휘하여 세포 상의 거동을 변형시킨다.
일부 구현예에서, 상기 액체는 생리학적 완충액이다.
일부 구현예에서, 상기 조성물은 발포체이다.
일부 구현예에서, 상기 가교성 단백질은, 5 내지 200 μm의 평균 입자 크기를 갖는 미분화된 단백질 분말로서 조성물 내에 도입된다.
일부 구현예에서, 상기 가교성 단백질은 200 내지 300 블룸의 젤라틴을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 가교성 젤라틴은 0.5% w/w 내지 25% w/w 범위의 조성물 내에 존재한다.
일부 구현예에서, 상기 가교제는 트랜스글루타미나제이다.
일부 구현예에서, 상기 트랜스글루타미나제는 0.0001% w/w 내지 2% w/w 범위의 조성물 내에 존재한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 조성물을 제공하며, 상기 조성물은,
a) 가교성 젤라틴;
b) 상기 가교성 젤라틴의 가교 결합을 유도하는 트랜스글루타미나제; 및
c) 액체를 포함하고,
상기 조성물은 1 내지 500 μm의 기공 크기를 갖는 다공성 스캐폴드이고,
상기 가교성 젤라틴은 1 내지 200 μm의 입자 크기를 갖는, 미분화된 젤라틴 분말로서 상기 조성물 내에 도입되고,
상기 가교성 젤라틴은 200 내지 300 블룸이고,
상기 가교성 젤라틴은 0.5% w/w 내지 25% w/w 범위의 조성물 내에 존재하고,
상기 트랜스글루타미나제는 0.0001% w/w 내지 2% w/w 범위의 조성물 내에 존재한다.
일부 구현예에서, 상기 액체는 생리학적 완충액이다.
일부 구현예에서, 상기 조성물은 환자의 조직 결함 치료를 필요로 하는 부위에서 환자에게 인시츄로 형성된다.
일부 구현예에서, 상기 조성물은, 환자의 조직 결함 치료를 필요로 하는 부위에서 환자에게 상기 조성물을 도입하기 전에, 형성된다.
일부 구현예에서, 건조된 가교제는 트랜스글루타미나제 효소이다. 일부 구현예에서, 건조된 단백질 조성물은 젤라틴이다. 일부 구현예에서, 건조 미립자 단백질은 안정화제를 필요로 하지 않는다. 일부 구현예에서, 상기 분말 조성물은 5분 미만 이내에 유동성 용액 내로 용해된다. 일부 구현예에서, 상기 분말 조성물은 5분 미만 이내에 유동성 용액 내로 용해된다. 일부 구현예에서, 상기 분말 조성물은 37°C 보다 낮은 온도에서 5분 미만 이내에 유동성 용액 내로 용해된다. 상기 분말 조성물은 27°C 보다 낮은 온도에서 1분 미만 이내에 유동성 용액 내로 용해된다. 상기 분말 조성물은 20°C 보다 낮은 온도에서 1분 미만 이내에 유동성 용액 내로 용해되고, 이 온도는 수술실의 표준 온도이다. 일부 구현예에서, 상기 젤라틴 조성물은 단일 구획부 내의 가교제 분말과 함께 저장된다. 일부 구현예에서, 상기 젤라틴 분말과 가교제는, 1 그램 젤라틴에 대한 최대 10 ml의 비율로, 액체와 혼합된다. 일부 구현예에서, 상기 젤라틴 분말과 가교제는, 1 그램 젤라틴에 대한 최대 8 ml의 비율로, 액체와 혼합된다. 일부 구현예에서, 상기 젤라틴 분말과 가교제는, 1 그램 젤라틴에 대한 최대 6 ml의 비율로, 액체와 혼합된다. 일부 구현예에서, 상기 젤라틴 분말과 가교제는, 1 그램 젤라틴에 대한 최대 4 ml의 비율로, 액체와 혼합된다. 일부 구현예에서, 상기 젤라틴 분말과 가교제는, 1 그램 젤라틴에 대한 최대 2 ml의 비율로, 액체와 혼합된다. 일부 구현예에서, 분말의 혼합물은, 흡수성 또는 비흡수성 패드 내로 가압되어 기계적 지지부를 제공한다. 일부 구현예에서, 패드는 부직포인 산화 셀룰로오스이다. 일부 구현예에서, 생분해성에 상관 없이 수술용 메쉬로 가압된다. 일부 구현예에서, 젤라틴 조성물의 농도는 0.5% 내지 25% w/w의 범위이다. 일부 구현예에서, 젤라틴 조성물의 농도는 8% 내지 20% w/w의 범위이다. 일부 구현예에서, 건식 젤라틴 분말은 약 15% 미만의 수분을 함유한다. 일부 구현예에서, 건식 젤라틴 분말은 약 8% 미만의 수분을 함유한다. 일부 구현예에서, 조성물은 약 6 내지 약 7인 범위의 pH를 갖는다. 일부 구현예에서, 건식 가교제 분말은 약 15% 미만의 수분을 함유한다. 일부 구현예에서, 건식 가교제 분말은 약 8% 미만의 수분을 함유한다. 일부 구현예에서, 트랜스글루타미나제는 칼슘과 무관하다.
일부 구현예에서, 트랜스글루타미나제는 미생물 트랜스글루타미나제 또는 재조합 트랜스글루타미나제이다. 일부 구현예에서, 트랜스글루타미나제의 단백질 농도는, 상기 조성물의 약 0.0001% 내지 약 2% w/w의 양으로 존재한다. 일부 구현예에서, 트랜스글루타미나제는, 상기 조성물의 약 0.01% 내지 약 1.35% w/w의 양으로 존재한다. 일부 구현예에서, 트랜스글루타미나제의 농도는, 총 조성물의 약 1 내지 약 180 효소 단위(U/mL)의 범위에 있다.
일부 구현예에서, 효소 조성물 대 젤라틴 조성물의 비율은, 효소와 젤라틴이 용액 내에 있는 경우에 약 1:1 내지 1:5 v/v이다. 일부 구현예에서, 정제된 효소 조성물 대 젤라틴 조성물의 비율은, 효소와 젤라틴이 고체 건조 상태로 있는 경우에 약 1:100 내지 1:500 v/v이다.
일부 구현예에서, 젤라틴은 동물 유래, 재조합 유래 또는 이들의 조합으로부터 제조된다. 일부 구현예에서, 동물 유래는 어류 및 포유류로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 젤라틴은 A형(산처리) 또는 B형(알칼리 처리)이다. 일부 구현예에서, 젤라틴은 적어도 약 250 블룸, 또는 그 등가물의 고 분자량 젤라틴을 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 계면활성제를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 계면활성제는, 폴리소르베이트 20 (Tween.TM. 20), 폴리옥시에틸렌글리콜 도데실 에테르 (Brij.TM. 35), 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 블록 공중합체 (Pluronic.TM. F-68), 소듐 라우릴 설페이트 (SLS) 또는 소듐 도데실 설페이트 (SDS), 소듐 라우레스 설페이트 또는 소듐 라우릴 에테르 설페이트 (SLES), 폴옥사머 또는 폴옥사민, 알킬 폴리글루코사이드, 지방 알코올, 지방산염, 코카마이드 모노에탄올아민, 코카마이드 디에탄올아민, 또는 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 조성물은 가소제를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 가소제는 소르비톨, 시트르산 알킬 에스테르, 글리세롤, 글리세롤 에스테르, 프탈산 알킬 에스테르, 세바논산 알킬 에스테르, 수크로오스 에스테르, 소르비탄 에스테르, 아세틸화 모노글리세리드, 글리세롤, 지방산 에스테르, 글리콜, 프로필렌 글리콜, 라우릴산, 수크로오스, 글리세릴 트리아세테이트, 폴옥사머, 디에틸 프틀레이트, 식용 지방 또는 오일의 모노- 및 디-글리세라이드, 디부틸 프탈레이트, 디부틸 세바카이트, 폴리소르베이트, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 200 내지 20,000, 카르보왁스 폴리에틸렌 글리콜, 폴리비닐 알코올 (PVA), 아라비아 검, 구아 검, 크산탄 검, Plasdone.RTM. (폴리비닐피롤리돈), 만니톨, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어지는 그룹으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 본 발명의 조성물은, 밀링된 동결 건조 젤라틴 조성물과 건조된 트랜스글루타미나제 조성물을 포함하는 가교성 조성물이고, 여기서 상기 건조된 트랜스글루타미나제 조성물은 밀링된 동결 건조 젤라틴 조성물 전체에 완전히 분산된다.
일부 구현예에서, 본 발명의 조성물은, 젤라틴과 가교제를 포함하는 가교성 조성물이고, 여기서 상기 가교제는 일단 상기 젤라틴과 반응해서 생분해성 안정화 다공성 스캐폴드를 형성한다. 일부 구현예에서, 다공성 스캐폴드는 조직 상에서 적어도 2주 동안 유연성있게 유지된다. 일부 구현예에서, 트랜스글루타미나제는 변형된 효소 분자이고, 변형된 효소 분자는, 매트릭스가 중합체의 가교 결합을 통해 형성됨에 따라 가교 결합된 매트릭스 내의 효소 분자의 인지 부피를 변경시키는 변형을 갖는다. 일부 구현예에서, 젤라틴은 1200 I.U./g 이하의 내독성 함량을 갖는다. 일부 구현예에서, 젤라틴 제트 밀링은 10 기압 압력 강하 미만을 사용한다. 일부 구현예에서, 젤라틴 제트 밀링은 5 기압 압력 강하 미만을 사용한다. 일부 구현예에서, 젤라틴 제트 밀링은 5 m3/분 미만을 요구한 공기 흐름을 사용한다. 일부 구현예에서, 젤라틴 제트 밀링은 2 m3/분 미만을 요구한 공기 흐름을 사용한다. 일부 구현예에서, 상기 조성물은 바륨, 요오드, 기타 방사선 불투과 물질, 또는 이들의 조합을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 방법은, 방사선 에너지를 사용하여 젤라틴 및 가교제 조성물을 제조/멸균하는 단계를 포함하며, 방사선을 쪼인 최종 조성물은 방사선을 쪼이지 않은 시작 조성물과 비교하여 적어도 약 25%의 기능적 특성(예, 가교성, 효소 특정 활성)을 갖는다. 일부 구현예에서, 본 발명의 방법은, 방사선 에너지를 사용하여 젤라틴-가교제 조성물을 제조/멸균하는 단계를 포함하며, 방사선을 쪼인 최종 젤라틴은 방사선을 쪼이지 않은 시작 조성물과 비교하여 25% 내지 100%의 기능적 특성(예, 가교성)을 갖는다.
일부 구현예에서, 본 발명의 방법은, 에틸렌 산화물을 사용하여 젤라틴과 가교제 조성물을 제조/멸균하는 단계를 포함하며, 최종 처리된 조성물은 비처리된 비멸균 시작 젤라틴과 비교하여 적어도 25%의 기능적 특성(예, 가교성)을 갖는다. 일부 구현예에서, 본 발명의 방법은 에틸렌 옥사이드를 사용하여 제조/멸균 조성물을 포함하며, 최종 처리된 조성물은 비처리된 비멸균 시작 조성물과 비교하여 25 내지 100%의 기능적 특성(예, 가교성)을 갖는다.
일부 구현예에서, 본 발명의 조성물은, 세포용 스캐폴드, 조직 리모델링제, 벌크제, 진피 필러, 뼈 접착제, 조직 필러, 폐 부피 감소 조성물, 수술용 실란트, 바이오 접착제, 누공 복구 조성물, 지혈제, 수술용 메쉬, 바이오 활성제의 지속적인 방출을 위한 조성물로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 목적으로 사용된다.
일부 구현예에서, 적어도 하나의 세포 유형은 조성물 내로 침투하고 조성물 내에서 성장한다.
일부 구현예에서, 상기 적어도 하나의 세포 유형은, 췌장 줄기 세포, 장내분비 세포, 골세포, 간세포, 기구, 근세포, 조혈, 전이유세포, 상피 세포, 내피 세포, 뉴런, 배아 줄기 세포, 간엽 줄기세포, 자가 골수 유래 간엽 줄기세포, 전구 세포, 조혈 줄기 세포, 간엽 줄기 세포, 신경 줄기 세포, 뼈 시스템 줄기 세포, 연골 세포주 줄기 세포, 상피 줄기 세포 및 간 줄기 세포로 이루어지는 군으로부터의 세포 유형이다.
일부 구현예에서, 조성물은 환자의 면역 체계로부터 침투된 상기 적어도 하나의 세포 유형을 격리시킨다.
일부 구현예에서, 상기 조성물은 발포체이다. 임의의 특정 이론에 제약되고자 하는 의도 없이, 다공성 스캐폴드는, 일단 (예를 들어, mTG에 의해) 가교 결합되면, 생체내에 안정적으로 유지될 수 있고, 조직 내부 성장과 재생을 유도할 수 있다. 대안적으로, 다공성 스캐폴드는, 세포용 3차원 지지 스캐폴드로서 기능할 수 있다. 가교 결합된 다공성 스캐폴드는 세포 부착과 움직임 호환성을 개선하였다.
일부 구현예에서, 가교성 단백질은 가교제와 혼합된다. 일부 구현예에서, 가교성 단백질 및 가교제는 건조 분말이고, 상기 건조 분말은 혼합되고, 그 다음 생리학적 액체, 완충액 또는 세포 지지 배지에 의해 용해된다. 일부 구현예에서, 가교성 단백질과 가교제 둘 모두가 생리학적 완충액에 용해될 때에만, 가교제는 가교성 단백질을 가교 결합시킨다.
일부 구현예에서, 본 발명의 의료용 물질은 전형적으로, 전술한 성분 이외에 세포, 염(완충액 성분)의 배양에 필요한 배지 성분을 포함한다. 또한, 이는, 이식되는 경우에 이식 단위 내에 긴급 재생제(성장 인자) 조직을 추가로 함유할 수 있다. 사용 가능한 성장 인자, 예를 들어 섬유아세포 성장 인자(FGF: 산성 섬유아세포 성장 인자(aFGF), 염기성 섬유아세포 성장 인자(bFGF) 등, 각질 세포 성장 인자(KGF)), 상피 세포 성장 인자(EGF), 신경 성장 인자(NGF), 형질전환 성장 인자(TGF), 혈소판 유래 성장 인자(PDGF), 혈관 내피 성장 인자(VEGF), 간세포 성장 인자(HGF), 뼈 형태발생 단백질(BMP: BMP-2, BMP-3, BMP-7 등)이 예시될 수 있다. 이들 성장 인자는, 재생산의 목적을 위한 조직의 유형에 따라 적당한 선택에 의해 사용될 수 있다. 구체적으로, 예를 들어 표피 세포 재생 목적의 경우에 표피 성장 인자와 진피 재생 목적의 경우에 섬유아세포 성장 인자 각각을 사용하는 것이 가능하다. 구체적으로, 예를 들어 뼈 세포 재생 목적의 경우에 뼈 형태발생 성장 인자와 진피 재생 목적의 경우에 섬유아세포 성장 인자 각각을 사용하는 것이 가능하다. 고려되는 것이 바람직할 경우, 이는 두 종류 이상의 성장 인자와 조합하여 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 건조 분말은 주사기 또는 임의의 용기에 포장될 수 있다. 일부 구현예에서, 건조 분말은 방사선 또는 에틸렌 옥사이드(ETO)에 의해 멸균될 수 있다.
일부 구현예에서, 가교성 단백질은 혼합되고, 가교제는 안정화제, 예를 들어 이에 제한되지 않지만, EDC (1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드), NHS (N-하이드록시숙신이미드), 카르바마이드, 글루타르알데히드, 호스래디시 페록시다아제, 성장 인자, 치료제 및 호르몬으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 제제와 조합된다.
일부 구현예에서, 건조 분말로서 혼합되는 경우, 건조 분말은 침출 및/또는 상호 작용을 감소시킨다. 도 2를 참조하면, 일부 구현예에서, 건조 분말은 생리학적 완충액에 별도로 용해되고, 용해된 성분을 하나의 상호 연결된 주사기로부터 다른 상호 연결된 주사기로 가압함으로써 혼합된다. 그러나, 교반과 같은 임의의 혼합 방법도 충분할 수 있다. 대안적으로, 건조 분말을 함께 혼합하고, 그 다음 상기 혼합물은 활성화를 위해 생리학적 완충액에 용해된다.
일부 구현예에서, 단백질의 가교 결합은 다공성 스캐폴드를 초래한다. 일부 구현예에서, 다공성 스캐폴드는 열적 안정성을 갖는다. 일부 구현예에서, 다공성 스캐폴드는 부착성을 갖는다. 임의의 특정 이론에 의해 제한되고자 하는 의도 없이, 가교 결합은 비가역적인데, 그 이유는 단백질 분자 사이에 가교 결합을 형성하는 공유 결합에 기인하기 때문이다. 일부 구현예에서, 다공성 스캐폴드는 포유류 조직의 세포외 매트릭스와 구조적으로 유사하며, 종종 부드러운 조건 하에서 가공될 수 있고, 최소 침습 방식으로 전달될 수 있다.
가교 결합은 환자의 신체 외부나 내부에서 발생할 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서, 가교 결합은 환자의 부위에서 인시츄로 일어난다. 대안적으로, 다공성 스캐폴드는 신체외에서 형성된 다음 환자에게 도입된다.
일부 구현예에서, 본 발명의 하이드로젤은, 아직 경화되지 않는 동안에 바늘을 통과할 수 있고, 일단 액체 형태로 조직에 전달되고, 접착제는 안정적이고 통합된 물리적 형성(즉, 적어도 0.05 ml 부피의 단일 입자)으로 안정화된다.
실시예 4의 결과는, d(0.5)=15 마이크론 미만으로 입자 크기를 감소시킴으로써, 젤라틴이 잘 용해되지만 미생물 트랜스글루타미나제 효소와 더 느리게 반응함을 나타낸다. 본 발명의 일부 구현예에서, 수화 후 빠르게 안정화되지 않는, 신속하게 용해하는 분말을 제공할 필요가 있다. 그들은 긴 바늘을 통과해야 하며, 외과의사에게 충분히 긴 작업 시간을 허용해야 한다. 일부 구현예에서, 이러한 제형은 1 내지 15 ㎛의 젤라틴 입자 크기를 제어하는 것으로 달성될 수 있다. 일부 구현예에서, 이러한 제형은 8 내지 14 ㎛의 젤라틴 입자 크기로 달성될 수 있다.
일부 구현예에서, 조성물은, (1) 인시츄로 또는 신체외에서 안정화되고 (2) 원하는 형상 또는 체강에 부합하도록 구성된 다공성 스캐폴드를 포함하여, 세포 및 조직의 내부 성장을 허용하도록 구성된 바이오 적합성 실란트 또는 스캐폴드의 형성을 초래한다.
일부 구현예에서, 안정화된 다공성 스캐폴드 구조는 조직 전도성이고 다음의 의료용으로 사용될 수 있다: 조직 리모델링제, 벌크제, 조직 필러 또는 조직 인쇄(예, 3D 티슈 프린팅). 젤라틴의 분쇄 및/또는 가교 결합된 다공성 스캐폴드의 재생(구체적으로 트랜스글루타미나제에 의함)은, 세포 부착 및 움직임을 크게 개선한다. 젤라틴 다공성 스캐폴드에 대한 인테그린 인식 모티프(예컨대 RGD)의 불균일하고 풍부한 표시, 및 이러한 모티프에 대한 세포의 접근성은, 스캐폴드로서 그의 기능을 향상시킨다.
조직 인쇄의 구현예에서, 건조 분말은, 분말형 또는 재생 글루에 의해 서로 접착된 셀의 정확한 2D 또는 3D 구조를 구성하기 위해 살아있는 세포와 함께 프린터를 통해 도포될 수 있다. 예를 들어, 예시하자면 이러한 3D 구조는 스캐폴드 내에 인쇄될 수 있는 혈관 형성용 일부 내피 세포를 포함할 수 있고, 이는 일단 스캐폴드가 이식되면 내부 세포에 혈액 공급을 제공할 것이다.
일부 구현예에서, 다공성 스캐폴드는 밀도를 가지며, 상기 밀도는 다공성 스캐폴드의 분해 및/또는 세포 내부 성장 동역학에 직접 관련된다. 일부 구현예에서, 추가적인 바이오 활성 물질은, 예를 들어 이에 제한되지 않지만, 10% 내지 300%만큼 증가함으로써 세포 내부 성장의 동역학에 또한 영향을 미칠 수 있다(즉, 세포 내부 성장의 동역학을 증가시킴). 일부 구현예에서, 현탁된 바이오 활성 물질 및/또는 세포 및/또는 혈소판 풍부 혈장(PRP) 및/또는 성장 인자 및/또는 뼈 형태발생 단백질은, 실질적으로 신체의 표적 영역 내에 남는다(예를 들어, 환자가 치료된 신체 영역을 불합리하게 장기간 고정시키거나, 정상적으로 실시되는 대로 인자를 이용해 다중 주입되는 경우 없이, 그러나 이에 제한되지 않음).
일부 구현예에서, 발포체는 초기에 0.1 내지 11 KPa의 탄성율(영률)을 갖는 폐쇄형 세포 형태이고, 여기서 상기 탄성률은, 단백질, 가교제 및/또는 생리학적 완충액의 농도를 변화시키고/변화시키거나 그 안에 사용된 젤라틴 블룸을 변화시킴으로써, 변할 수 있다.
일부 구현예에서, 단백질 발포체는 1 내지 11 KPa의 초기 탄성률(영률)을 갖는다. 일부 구현예에서, 단백질 발포체는 2 내지 10 KPa의 초기 탄성률(영률)을 갖는다. 일부 구현예에서, 안정화된 발포체의 초기(즉, 가교 결합 후 약 30분) 신장률은 원래 시작 길이의 0.1 내지 1배이다. 일부 구현예에서, 안정화된 발포체의 초기 신장률은 원래 시작 길이의 0.1 내지 1.5배이다. 일부 구현예에서, 안정화된 발포체의 초기 신장률은 원래 시작 길이의 0.1 내지 2배이다. 일부 구현예에서, 안정화된 발포체의 초기 신장률은 원래 시작 길이의 0.1 내지 3배이다. 일부 구현예에서, 안정화된 발포체의 초기 신장률은 원래 시작 길이의 0.1 내지 4배이다. 일부 구현예에서, 안정화된 발포체의 초기 신장률은 원래 시작 길이의 0.1 내지 5배이다. 일부 구현예에서, 안정화된 발포체의 초기 신장률은 원래 시작 길이의 1 내지 2배이다. 일부 구현예에서, 안정화된 발포체의 초기 신장률은 원래 시작 길이의 1 내지 3배이다. 일부 구현예에서, 안정화된 발포체의 초기 신장률은 원래 시작 길이의 1 내지 4배이다. 일부 구현예에서, 안정화된 발포체의 초기 신장률은 원래 시작 길이의 1 내지 5배이다. 일부 구현예에서, 안정화된 발포체의 초기 신장률은 원래 시작 길이의 1.5 내지 2배이다. 일부 구현예에서, 안정화된 발포체의 초기 신장률은 원래 시작 길이의 1.5 내지 3배이다. 일부 구현예에서, 안정화된 발포체의 초기 신장률은 원래 시작 길이의 1.5 내지 4배이다. 일부 구현예에서, 안정화된 발포체의 초기 신장률은 원래 시작 길이의 1.5 내지 5배이다. 일부 구현예에서, 안정화된 발포체의 초기 신장률은 원래 시작 길이의 2 내지 3배이다. 일부 구현예에서, 안정화된 발포체의 초기 신장률은 원래 시작 길이의 2 내지 4배이다. 일부 구현예에서, 안정화된 발포체의 초기 신장률은 원래 시작 길이의 2 내지 5배이다. 일부 구현예에서, 안정화된 발포체의 초기 신장률은 원래 시작 길이의 3 내지 4배이다. 일부 구현예에서, 안정화된 발포체의 초기 신장률은 원래 시작 길이의 3 내지 5배이다.
단백질로서의 젤라틴과 가교제로서의 mTG를 포함한 발포체의 기계적 측정을 보여주는 구현예가 실시예 5의 표에 나타나 있다.
일부 구현예에서, 다공성 스캐폴드의 기공 크기는 직경이 1 내지 500 ㎛이다. 일부 구현예에서, 다공성 스캐폴드의 기공 크기는 직경이 2 내지 400 ㎛이다. 일부 구현예에서, 다공성 스캐폴드의 기공 크기는 직경이 2 내지 300 ㎛이다. 일부 구현예에서, 다공성 스캐폴드의 기공 크기는 직경이 2 내지 200 ㎛이다.
일부 구현예에서, 다공성 스캐폴드의 기공 크기는 직경이 2 내지 50 ㎛이다. 일부 구현예에서, 다공성 스캐폴드의 기공 크기는 직경이 2 내지 10 ㎛이다.
일부 구현예에서, 다공성 스캐폴드의 기공 크기는 직경이 10 내지 500 ㎛이다. 일부 구현예에서, 다공성 스캐폴드의 기공 크기는 직경이 50 내지 400 ㎛이다. 일부 구현예에서, 다공성 스캐폴드의 기공 크기는 직경이 100 내지 400 ㎛이다. 일부 구현예에서, 다공성 스캐폴드의 기공 크기는 직경이 200 내지 400 ㎛이다. 일부 구현예에서, 다공성 스캐폴드의 기공 크기는 직경이 300 내지 400 ㎛이다.
도 8을 참조하면, 일부 구현예에서, 발포체의 기공 크기는 직경이 1 내지 500 ㎛이다. 일부 구현예에서, 발포체의 기공 크기는 직경이 2 내지 400 ㎛이다. 일부 구현예에서, 발포체의 기공 크기는 직경이 2 내지 300 ㎛이다. 일부 구현예에서, 발포체의 기공 크기는 직경이 2 내지 200 ㎛이다.
일부 구현예에서, 발포체의 기공 크기는 직경이 1 내지 50 ㎛이다. 일부 구현예에서, 발포체의 기공 크기는 직경이 2 내지 10 ㎛이다.
일부 구현예에서, 발포체의 기공 크기는 직경이 10 내지 500 ㎛이다. 일부 구현예에서, 발포체의 기공 크기는 직경이 50 내지 400 ㎛이다. 일부 구현예에서, 발포체의 기공 크기는 직경이 100 내지 400 ㎛이다. 일부 구현예에서, 발포체의 기공 크기는 직경이 200 내지 400 ㎛이다. 일부 구현예에서, 발포체의 기공 크기는 직경이 300 내지 400 ㎛이다.
일부 구현예에서, 예를 들어, 이에 제한되지 않지만 폴리디메틸실록산, 폴리소르베이트 등과 같은 소포제를 첨가하여 더 치밀한 발포체를 달성할 수 있고, 여기서 더 치밀한 발포체는 5 KPa 내지 15 KPa의 전단 탄성률을 갖을수 있다.
임의의 특정 이론에 제한되고자 하는 의도 없이, 일부 구현예에서 바이오 적합성 세제 및/또는 계면활성제를 첨가하면 발포체에 파단을 초래하며, 발포체가 안정화하기 전에 파단이 도입되고, 재생 발포체를 유동성 젤로서 형성한다. 일부 구현예에서, 유동성 젤은 가교제 용액과 (예를 들어, 수동으로, 기계적으로 또는 정적 믹서를 통해 밀어서) 혼합될 수 있어서, 균질한 안정화 젤을 생성할 수 있다. 일부 구현예에서, 융합성 (즉, 발포체에 반대되는) 안정화 젤은 연장된 시간 동안 신체내에서 분해를 견딜 수 있다.
일부 구현예에서, 조성물은 적어도 하나의 계면 활성제를 포함할 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "계면 활성제"는 물의 표면 장력을 낮추는 화합물을 지칭한다. 일부 구현예에서, 계면 활성제는 이온 계면 활성제, 예컨대 나트륨 라우릴 설페이트, 및 옥탄산; 또는 중성 계면 활성제, 예컨대 폴리옥시에틸렌 에테르, 폴리옥시에틸렌 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄일 수 있다.
일부 구현예에서, 신체내 분해 동력을 감속하기 위해, 덱스트린(덱스트란)을 상기 조성물에 첨가할 수 있다.
일부 비제한적인 예시적 구현예에서, 세포의 내부 성장은, 예를 들어 콘드로이틴 설페이트와 같은 황화 글리코사미노글리칸(GAG)을 첨가함으로써, 훨씬 더 향상될 수 있다. 일부 구현예에서, GAG는 공중합체 분말로서 분말의 건조 제형에 첨가될 수 있고, 단백질/가교제(즉, mTG), 제조의 제트 밀링 단계 이전에 임의의 다른 성분, 또는 이들의 임의의 조합에 화학적으로 결합된다. 일부 구현예에서, GAG의 농도는 조성물의 0.5% w/w 내지 10% w/w일 수 있다.
임의의 특정 이론에 제한되고자 하는 의도 없이, 다공성 스캐폴드 내의 세포는 3차원으로 매트릭스 상호 작용에 관련될 수 있고, 여분의 천연 세포 매트릭스의 섬유성 환경 내에서 그들의 경험과 유사하다. 덜 적합한 2D 스캐폴드 물질 또는스캐폴드와 비교하여, 더욱 자연스런 세포 퍼짐성이 3차원으로 일어나면서 달성된다.
임의의 특정 이론에 제한되고자 하는 의도없이, 3차원 다공성 스캐폴드에서 달성된 세포 형상은 유전자 발현, 단백질 전사 및 결국 기능을 변형시킬 수 있다.
일부 구현예에서, 세포들은 제조시 다공성 스캐폴드에 배합되거나(수화 액체와 혼합되거나), 나중에 다공성 스캐폴드에 진입하여 그들의 천연 3D 구조를 유지한다. 따라서, 임의의 특정 이론에 제한되고자 하는 의도 없이, 일부 구현예에서, 스캐폴드는 개별적인 세포의 고유 3D 형상을 보존할 뿐만 아니라, 더 자연적인 방식으로 세포를 함께 모으는 역할을 한다. 이는, 조직 유사 구조의 형성과 정상적인 조직 기능을 보다 잘 나타낸 세포-대-세포 상호 작용 결과를 갖는다.
젤라틴을 이용하는 일부 구현예에서, 가교 결합된 젤라틴 탄성 특성뿐만 아니라, 인테그린 부착 부위(상기 중합체 상의 세포 결합 부위)의 풍부함은, 세포 내부 성장, 증식을 허용하고 생리학적 조직 재생 결과를 가지며 다양한 조직 엔지니어링 응용을 가능하게 한다. 일부 구현예에서, 가교 결합된 젤라틴은 다수의 세포 유형을 이용해 시험관 내에서 조직 유사 구조체를 생성할 수 있다. 상이한 유형의 세포는, 혼합 집단으로서 또는 상이한 세포 유형의 이산 층으로서, 3D 공동 배양 모델에서 함께 모일 수 있다. 일부 구현예에 따라, 젤라틴, 및 가교제, 예컨대 mTG는 다음 물질: 글루코오스, 안정한 글루타민(알라닐-글루타민), 페니실린, CaCl2 H2O, 질산철 (Fe(NO3)3-9H2O), 염화칼륨(KCl), MgSO4·7H2O, 염화나트륨(NaCl), 중탄산나트륨(NaHCO3), 인산나트륨(NaH2PO4 H2O), D-글루코오스, 페놀 레드, L-알라닐-L-글루타민, L-아르기닌-HCl, L-시스틴, 글리신, L-히스티딘 HCl-H2O, L-이소류신, L-류신, L-라이신-HCl, L-메티오닌, L-페닐알라닌, L-세린, L-트레오닌, L-트립토판, L-티로신, L-발린, D-칼슘 판토테네이트, 콜린 클로라이드, 엽산, i-이노시톨, 니아신아미드, 피리독신 HCl, 리보플라빈, 티아민 HCl 및 소태아혈청을 함유하나 이에 제한되지 않는, 세포 배양 배지와 혼합될 수 있다.
세포 배양 배지와 혼합하면, 다공성 스캐폴드의 가교 결합을 손상시키지 않는다.
일부 구현예에 따라, 젤라틴과 mTG 건식 분말은 혼합될 수 있고, 세포 배양 배지(다음 물질: 글루코오스, 안정한 글루타민(알라닐-글루타민), 페니실린, CaCl2 H2O, 질산철 (Fe(NO3)3-9H2O), 염화칼륨(KCl), MgSO4·7H2O, 염화나트륨(NaCl), 중탄산나트륨(NaHCO3), 인산나트륨(NaH2PO4 H2O), D-글루코오스, 페놀 레드, L-알라닐-L-글루타민, L-아르기닌-HCl, L-시스틴, 글리신, L-히스티딘 HCl-H2O, L-이소류신, L-류신, L-라이신-HCl, L-메티오닌, L-페닐알라닌, L-세린, L-트레오닌, L-트립토판, L-티로신, L-발린, D-칼슘 판토테네이트, 콜린 클로라이드, 엽산, i-이노시톨, 니아신아미드, 피리독신 HCl, 리보플라빈, 티아민 HCl 및 소태아혈청을 함유하나 이에 제한되지 않음)를 이용해 수화될 수 있다. 일부 구현예에서, 이는 초기 젤라틴-세포 매트릭스에서 세포가 더 잘 생존하도록 한다. 세포를 배지와 혼합되고 하나의 주사기에 유지할 수 있는 반면, mTG와 젤라틴 분말은 또 다른 주사기에 있다. 그 다음 주사기를 잠금 기구로 서로 연결해서, 수동으로 밀어 넣어 구성 성분을 함께 혼합한다. 한 주사기에서 다른 주사기로 이들을 여러 번 밀어서, 세포, 배지, 젤라틴, mTG 및 가스가 함께 혼합되어 세포로 씨딩된 최적의 스캐폴드를 형성한다. 본 발명의 가교 결합된 젤라틴 다공성 스캐폴드에서, 세포의 생존 능력을 보여주는 예시적인 구현예가 실시예 19에 상세히 설명되어 있다.
일부 구현예에서, 본 발명의 방법은, 가교 결합된 매트릭스 형성에서 효소 분자의 인지 부피를 변형시키는 단계를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 변형된 인지 부피는 매트릭스를 형성하기 위한 중합체의 가교 결합의 정도에 따라 결정되며, 변형되지 않은 효소 분자와 가교 결합하는 정도에 비해 가교 결합의 정도가 감소하면 증가된 인지 부피를 나타낸다. 일부 구현예에서, 효소 분자의 인지 부피를 증가시키는 하나의 방법은, 효소 분자에 적어도 하나의 분자 또는 일부의 공유 또는 비공유 부착에 의해 분자의 크기 및/또는 유체 역학적 부피를 증가시키는 것에 의한 것이다. 일부 구현예에서, 본 발명의 방법은 변형된 효소의 사용을 포함한다.
일부 구현예에서, 인지 부피를 증가시키는 방법은, 효소 분자의 정전하를 변형하는 것을 통해 이루어지고, 이들의 순 전하가 중합체 또는 공중합체 사슬 상의 순 전하에 반대 극성이도록 한다. 일 구현예에서, 인지 부피의 증가는, 효소의 등전점(pi)을 변화시킴으로써 달성될 수 있다.
본 발명의 조성물의 일부 구현예에 따라, 가교-결합된 다공성 스캐폴드가 제공되고 변형된 효소 분자에 의해 가교 결합된 기재 중합체를 포함하고, 상기 변형된 효소 분자는, 매트릭스가 중합체의 가교 결합을 통해 형성됨에 따라 가교 결합된 매트릭스에서 효소 분자의 인지 부피를 변경하는 변형을 갖는다. 일부 구현예에서, 변형된 효소 분자는, 변형된 효소 분자의 실제 크기를 증가시키는 변형을 갖는다. 일부 구현예에서, 변형된 효소 분자는, 변형된 효소 분자의 유체역학적 부피를 증가시키는 변형을 갖는다. 일부 구현예에서, 변형된 효소 분자는, 상기 변형된 효소의 등전점(pi)을 변형되지 않은 효소와 비교하여 변화시킴으로써, 상기 개질된 효소 분자의 정전하를 상기 기재 중합체의 순 전하에 대해 반대 신호로 변경하는 변형을 갖는다. 일부 구현예에서, 변형은 (숙신 무수물을 이용한) 숙신닐화, (아세트 무수물을 이용한) 아세틸화, (시아네이트를 이용한) 카르바메틸화, 환원성 알킬화(알데히드) 및 말레 무수물 처리로 이루어진 군으로부터 선택된 공정을 통한 효소의 리신의 s-아미노기이다. 일부 구현예에서, 변형은 음전하의 수를 감소시키기 위해 효소의 카르복실산을 함유하는 하나 이상의 측쇄를 포함한다.
일부 구현예에서, 변형은 상기 변형된 효소 분자에 적어도 하나의 분자 또는 일부의 공유 또는 비-공유 부착을 포함한다. 일부 구현예에서, 변형은 상기 변형된 효소 분자에 변형 분자의 공유 부착을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 변형된 효소 분자는 변형되지 않은 효소와 비교하여 감소된 확산 속도 및 감소된 가교율을 갖지만, 변형되지 않은 효소와 비교하여 적어도 유사한 효소 활성을 갖는다(예, 변형되지 않은 효소와 비교하여 약 20% 내지 100% 활성, 그러나 이에 제한되지 않음).
일부 구현예에서, 감소된 가교율은 변형되지 않은 효소의 가교율의 적어도 10%이다. 일부 구현예에서, 감소된 가교율은 변형되지 않은 효소의 가교율의 10% 내지 40%이다.
일부 구현예에서, 변형된 분자는 담체 또는 중합체를 포함한다. 일부 구현예에서, 중합체는 합성 중합체, 셀룰로오스 중합체, 단백질, 다당류, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 셀룰로오스 중합체는 카르복시메틸 셀룰로오스, 히드록시프로필 메틸셀룰로오스, 히드록시에틸 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 또는 이들의 임의의 조합 중 하나 이상을 포함한다. 일부 구현예에서, 다당류는 덱스트란, 콘드로이틴 설페이트, 더마탄 설페이트, 케라탄 설페이트, 헤파린, 헤파란 설페이트, 히알루론산, 전분 유도체, 또는 이들의 임의의 조합 중 하나 이상을 포함한다.
본 발명의 조성물의 일부 구현예에서, 변형 분자는 PEG (폴리에틸렌 글리콜)를 포함한다. 일부 구현예에서, PEG는 PEG 유도체를 포함한다. 일부 구현예에서, PEG 유도체는 활성화된 PEG를 포함한다. 일부 구현예에서, 활성화된 PEG는, 메톡시 PEG (mPEG), 그의 유도체, mPEG-NHS, mPEG(mPEG-숙신산-NHS)의 숙신이미딜 (NHS) 에스테르, mPEG-글루타르산염, -NHS, mPEG-발레르레이트-NHS, mPEG-카보네이트-NHS, mPEG-카르복시메틸-NHS, mPEG-프로피오네이트-NHS, mPEG-카르복시펜틸-NHS), mPEG-니트로페닐 카르보네이트, mPEG-프로필알데히드, mPEG-토실레이트, mPEG-카르보시이미다졸, mPEG-이소시아네이트, mPEG-에폭시드, 또는 이들의 조합 중 하나 이상을 포함한다. 일부 구현예에서, 활성화된 PEG는 효소 상의 아민기 또는 티올기와 반응한다. 일부 구현예에서, 활성화된 효소의 리신 잔기에 대한 활성화된 PEG의 몰비는 0.5 내지 25의 범위이다. 일부 구현예에서, 활성화된 PEG는 단일기능적, 헤테로이기능적, 호모이기능적 또는 다기능적이다. 일부 구현예에서, 활성화된 PEG는 분지형 PEG 또는 다중 아암형 PEG이다. 일부 구현예에서, 활성화된 PEG는 1000 달톤 내지 40,000 달톤 범위의 크기를 갖는다.
일부 구현예에서, 다공성 스캐폴드는, 효소에 또는 기재 중합체에 공유 결합되지 않은 공중합체를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 공중합체는 다당류 또는 셀룰로오스 중합체를 포함한다. 일부 구현예에서, 다당류는 덱스트란, 콘드로이틴 설페이트, 더마탄 설페이트, 케라탄 설페이트, 헤파린, 헤파란 설페이트, 히알루론산, 전분 유도체, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 셀룰로오스 중합체는 카르복시메틸 셀룰로오스, 히드록시프로필 메틸셀룰로오스, 히드록시에틸 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스를 포함한다.
일부 구현예에서, 변형된 효소 분자는, 상기 변형된 효소 분자를 복수의 다른 효소 분자에 가교 결합시켜 복수의 가교 결합된 효소 분자의 집합체를 형성함으로써 변형된다. 일부 구현예에서, 효소 분자의 변형은 매트릭스의 적어도 하나의 특성에 영향을 미친다. 일부 구현예에서, 상기 적어도 하나의 특성은, 인장 강도, 강성도, 기재 중합체의 가교 결합 정도, 점도, 탄성, 유연성, 파단 변형, 파단 응력, 푸아송 비, 팽윤 용량 및 영률, 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 변형된 효소의 변형 정도는, 다공성 스캐폴드에서의 변형된 효소의 이동성 또는 다공성 스캐폴드로부터의 확산성을 결정한다. 일부 구현예에서, 변형된 효소의 변형은, 변형되지 않은 효소와 단백질의 용액 또는 다공성 스캐폴드과 비교하여, 변형된 효소 및 단백질의 용액에서 또는 변형된 효소와 단백질의 다공성 스캐폴드에서의 변형된 효소의 확산 계수를 감소시킨다. 일부 구현예에서, 변형된 효소의 변형 정도는, 하나 이상의 발포체 기계적 특성을 결정한다. 일부 구현예에서, 변형된 효소 분자는, 변형되지 않은 효소 분자와 비교시, 용액보다 가교 결합된 중합체에서 가교 결합 속도의 더 큰 차이를 보여 준다.
일부 구현예에서, 분말화된 가교제는 분말화된 중합체와 반응하기 위한 효소 및/또는 변형된 효소일 수 있다. 일부 구현예에서, 분말화된 중합체는 단백질일 수 있고, 예를 들어 젤라틴일 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
일부 구현예에서, 젤-액체 전이점 저하제는, 비제한적인 예로서, 예컨대 우레아 또는 칼슘이 선택된다. 이러한 우레아 또는 칼슘은 건조 분말 형태로 건조 제형에 첨가될 수 있다. 이러한 첨가는, 얇은 바늘을 통한 혼합 발포체의 주입성을 증가시킬 수 있다. 이는, 다공성 스캐폴드와 벌크 융합성 젤의 조합을 형성하기 위해 발포체를 인시츄로 또한 무너뜨릴 것이다. 이러한 제제의 농도가 높을수록, 더 적은 스캐폴드와 더 많은 융합성 하이드로젤이 형성될 것이다. 이는 일부 응용예에 적합할 수 있지만 다른 응용예에 적합하지 않을 수 있다.
본 발명의 적어도 일부 구현예에 따라, 매트릭스("매트릭스"는 하이드로젤 또는 다공성 스캐폴드를 지칭함)의 형성을 제어하기 위한 방법이 제공되며, 매트릭스가 형성됨에 따라 가교 결합된 매트릭스에서 효소 분자의 인지 부피를 변경시키는 변형으로 효소 분자를 변형시키는 단계; 개질된 효소 분자의 기재인 적어도 하나의 기재 중합체와 상기 변형된 효소 분자를 혼합하는 단계; 및 상기 개질된 효소 분자에 의해 적어도 하나의 기재 중합체의 가교 결합을 통해 상기 매트릭스를 형성하는 단계를 포함하되, 상기 매트릭스를 형성하는 단계는 상기 효소 분자의 변형에 의해 적어도 부분적으로 제어된다. 일부 구현예에서, 변형은, 상기 적어도 하나의 기재 중합체의 가교 결합 정도가 증가함에 따라 상기 변형된 효소 분자의 가교율을 감소시킨다. 일부 구현예에서, 변형된 효소 분자 및 적어도 하나의 기판 중합체는 미분화된 분말 형태로 혼합되어, 용액의 점도가 증가함에 따라 변형은 적어도 하나의 기재 중합체의 가교 결합의 정도를 제어하도록 한다. 일부 구현예에서, 변형 단계는 7 내지 9 범위의 pH에서 효소의 PEG화를 포함한다. 일부 구현예에서, PEG화 반응의 pH는 7.5 내지 8.5이다.
젤라틴 희석("DG") 공식의 계산 지침:
말토덱스트린 담체에서 젤라틴과 mTG를 모두 함유하는 공식의 경우:
ㆍ X 그램 젤라틴 + Y 그램 말토덱스트린 + Z 그램 액체
ㆍ 젤라틴 희석은 DG% w/w = 100*X/(X+Y+Z)와 같다.
ㆍ 예를 들어, 1 그램 젤라틴 + 1 그램 말토덱스트린 + 4 그램 액체 = 1 / 6 = 16.6% w/w.
젤라틴만 함유한 공식의 경우:
ㆍ X 그램 젤라틴 + Z 그램 액체
ㆍ 젤라틴 희석은 DG% w/w = 100*X/(X+Z)와 같다.
ㆍ 예를 들어, 1 그램 젤라틴 + 4 그램 액체 = 1/5 = 20% w/w.
위의 계산은 다음을 가정한다:
ㆍ 1 그램 젤라틴 = 말토덱스트린 담체 내의 1 그램 mTG = 1 그램 액체;
ㆍ 1 ml의 액체= 1 그램의 액체; 및
ㆍ 다른 성분과 비교해 무시할 수 있는 효소의 중량.
효소 희석("DG") 공식의 계산 지침:
말토덱스트린 담체에서 mTG를 함유하는 공식의 경우:
ㆍ X 그램 젤라틴, Y 그램 말토덱스트린, Z 그램 액체
ㆍ 효소의 희석은 DE% w/w = 100* E/(X+Y+E+Z)와 같다.
ㆍ 위 계산은 다음을 가정한다:
ㆍ 1 mg 효소 =10 단위 활성;
ㆍ 1 그램 젤라틴 = 1 그램 말토덱스트린 = 1 그램 액체; 및
ㆍ 1 ml의 액체=l 그램의 액체.
말토덱스트린 없이 mTG를 함유하는 공식의 경우:
ㆍ X 그램 젤라틴, E 그램 효소, Z 그램 액체
ㆍ 효소의 희석은 DE% w/w = 100* E/(X+E+Z)와 같다.
ㆍ 위 계산은 다음을 가정한다:
ㆍ 1 mg 효소 =10 단위 활성;
ㆍ 1 그램 젤라틴 = 1 그램 액체, 효소의 양은 무시할만한 수준이고;
ㆍ 1 ml의 액체=l 그램의 액체.
치료를 필요로 하는 환자의 치료 방법
일 구현예에서, 본 발명은, 섬유아세포를 자극하여 환자에게 새로운 콜라겐을 생성하는 방법을 제공하며, 상기 방법은,
a) 섬유아세포 자극을 유도하기에 충분한 양으로 상기 환자에게 조성물을 형성하는 단계를 포함하되,
b) 상기 조성물은 섬유아세포 자극 및 콜라겐 합성을 촉진하도록 구성되고, 상기 섬유아세포 부착 및 콜라겐 합성은 조직(피부) 재생을 유도하고,
c) 상기 조성물은 다공성 스캐폴드이고,
d) 상기 스캐폴드의 기공은 1 내지 500 μm이고, 상기 조성물은,
i. 콜라겐과 젤라틴으로 이루어진 군으로부터 선택된 가교성 단백질;
ii. 상기 가교성 단백질의 가교 결합을 유도하는 가교제; 및
iii. 액체를 포함한다.
일 구현예에서, 상기 젤라틴은, 액체로 희석된 후 3% w/w 내지 30% w/w 범위의 조성물 내에 존재한다.
일 구현예에서, 상기 젤라틴은, 액체로 희석한 후 8% w/w 내지 25% w/w 범위의 조성물 내에 존재한다.
일 구현예에서, 상기 젤라틴은, 액체로 희석한 후 9% w/w 내지 20% w/w 범위의 조성물 내에 존재한다.
적어도 일부 구현예에 따라, 본원에 설명된 다공성 스캐폴드를 포함하고 국부적인 약물 전달을 위한 비클용 조성물이 제공된다. 적어도 일부 구현예에 따라, 주입 가능한 다공성 스캐폴드로 조정되고, 본원에 기술된 매트릭스를 포함하는, 조직 엔지니어링용 조성물이 제공된다. 적어도 일부 구현예에 따라, 조성물을 변형시키는 방법은, 가교성 작용기를 갖는 변형된 효소, 및 변형된 효소에 의해 가교성인 적어도 하나의 일부를 갖는 단백질을 제공하는 단계; 및 변형된 효소와 단백질을 혼합하는 단계를 포함하되, 상기 변형된 효소는 상기 단백질을 가교 결합시키고 또한 상기 가교성 작용기를 통해 상기 단백질과 가교 결합된다.
일부 구현예에 따라, 조성물은 국부적인 약물 전달용 비클로 사용된다. 일부 구현예에 따라, 조성물은 조직 엔지니어링과 복구를 위해 주입 가능한 스캐폴드 또는 조직 리모델링제이다. 적어도 일부 구현예에 따라, 본원에 설명된 다공성 스캐폴드를 포함하고, 리도카인 또는 다른 진통제의 국부적인 전달을 위한 비클용 조성물이 제공된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "벌크제"는 조직 벌크를 증가시키는 데 사용되는 주입 가능한 공간 충진 물질이다. 이들은 개선된 미용적 결과를 위해 피부 아래에 주입될 수 있고, 요도 주위에 요실금을 치료하고, 항문 주위에 대변실금을 치료한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 조성물은 비이동성, 내구성, 분해성을 갖도록 구성된 벌크제일 수 있고, 장기간의 시간 동안 연성 결합 조직에 의해 대체되도록 구성될 수 있거나, 이들의 조합일 수 있다. 일부 구현예에서, 이동은 입자 크기 및 개수의 함수이다. 일부 구현예에서, 조성물은 시간이 지남에 따라 증식하고 부피 효과를 유지하는 내인성 또는 외인성 세포에 대한 스캐폴드를 제공한다.
일부 구현예에서, 조성물은, 안정적이고 단일 통합된 물리적 형성을 초래하기 위해 인시츄로 가교 결합된 젤이다. 일부 구현예에서, 조성물은 분해성이며, 변위 위험 없이 섬유아세포 및 면역 세포에 의해 점진적으로 침윤될 수 있고, 조직에 의해 교체되도록 구성된다.
일부 구현예에서, 본 발명의 조성물은 시간에 따라 신체에 의해 분해된다. 일부 구현예에서, 상기 조성물의 적어도 70% 내지 100%가 3개월 후에 분해된다. 일부 구현예에서, 상기 조성물의 적어도 70% 내지 100%가 6개월 후에 분해된다. 일부 구현예에서, 상기 조성물의 적어도 75% 내지 100%가 3개월 후에 분해된다. 일부 구현예에서, 상기 조성물의 적어도 75% 내지 100%가 6개월 후에 분해된다. 일부 구현예에서, 상기 조성물의 적어도 80% 내지 100%가 3개월 후에 분해된다. 일부 구현예에서, 상기 조성물의 적어도 80% 내지 100%가 6개월 후에 분해된다. 일부 구현예에서, 상기 조성물의 적어도 90% 내지 100%가 3개월 후에 분해된다. 일부 구현예에서, 상기 조성물의 적어도 90% 내지 100%가 6개월 후에 분해된다. 일부 구현예에서, 상기 조성물의 적어도 70%가 3개월 후에 분해된다. 일부 구현예에서, 상기 조성물의 적어도 75%가 3개월 후에 분해된다. 일부 구현예에서, 상기 조성물의 적어도 80%가 3개월 후에 분해된다. 일부 구현예에서, 상기 조성물의 적어도 85%가 3개월 후에 분해된다. 일부 구현예에서, 상기 조성물의 적어도 90%가 3개월 후에 분해된다. 일부 구현예에서, 상기 조성물의 적어도 95%가 3개월 후에 분해된다. 일부 구현예에서, 상기 조성물의 적어도 100%가 3개월 후에 분해된다. 일부 구현예에서, 상기 조성물의 적어도 70%가 4개월 후에 분해된다. 일부 구현예에서, 상기 조성물의 적어도 75%가 4개월 후에 분해된다. 일부 구현예에서, 상기 조성물의 적어도 80%가 4개월 후에 분해된다. 일부 구현예에서, 상기 조성물의 적어도 85%가 4개월 후에 분해된다. 일부 구현예에서, 상기 조성물의 적어도 90%가 4개월 후에 분해된다. 일부 구현예에서, 상기 조성물의 적어도 95%가 4개월 후에 분해된다. 일부 구현예에서, 상기 조성물의 적어도 100%가 4개월 후에 분해된다. 일부 구현예에서, 상기 조성물의 적어도 70%가 5개월 후에 분해된다. 일부 구현예에서, 상기 조성물의 적어도 75%가 5개월 후에 분해된다. 일부 구현예에서, 상기 조성물의 적어도 80%가 5개월 후에 분해된다. 일부 구현예에서, 상기 조성물의 적어도 85%가 5개월 후에 분해된다. 일부 구현예에서, 상기 조성물의 적어도 90%가 5개월 후에 분해된다. 일부 구현예에서, 상기 조성물의 적어도 95%가 5개월 후에 분해된다. 일부 구현예에서, 상기 조성물의 적어도 100%가 5개월 후에 분해된다. 일부 구현예에서, 상기 조성물의 적어도 70%가 6개월 후에 분해된다. 일부 구현예에서, 상기 조성물의 적어도 75%가 6개월 후에 분해된다. 일부 구현예에서, 상기 조성물의 적어도 80%가 6개월 후에 분해된다. 일부 구현예에서, 상기 조성물의 적어도 85%가 6개월 후에 분해된다. 일부 구현예에서, 상기 조성물의 적어도 90%가 6개월 후에 분해된다. 일부 구현예에서, 상기 조성물의 적어도 95%가 6개월 후에 분해된다. 일부 구현예에서, 상기 조성물의 적어도 100%가 6개월 후에 분해된다.
일부 구현예에서, 벌크제의 조성물은, 안정적이고 단일 통합된 물리적 형성을 초래하기 위해 인시츄로 가교 결합된 다공성 스캐폴드, 발포체, 또는 젤일 수 있다. 일부 구현예에서, 조성물은 젤라틴의 미분화된 건식 분말 및 가교제로 구성된다. 일부 구현예에서, 조성물은 액체 상태 젤라틴 및 가교제로 구성된다(바람직한 구현예에서, 가교제는 트랜스글루타미나제임). 일부 구현예에서, 조성물은 액체 상태 젤라틴과 가교제로 구성되고, 여기서 다른 부형제는 젤라틴과 함께 사용되어 이의 자연스런 고체-젤 전이점을 감소시켜(예컨대 우레아와 칼슘) 그의 점도를 감소시키고, 여기서 액체 트랜스글루타미나제가 부형제를 함유하여 그 안정성을 증강시키고 그 점도를 증가시킨다.
일부 구현예에서, 발포화된 젤라틴은 길고 얇은 카테터 또는 바늘을 통해 전달될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명의 방법은, 적어도 10 ㎝의 길이와 최대 10 프렌치의 직경인, 중공형 전달 튜브를 통해 젤라틴 인시츄 안정화 발포체를 전달하는 것이다. 일부 구현예에서, 본 발명의 방법은, 적어도 15 ㎝의 길이와 최대 6 프렌치의 직경인, 중공형 전달 튜브를 통해 젤라틴 인시츄 안정화 발포체를 전달하는 것이다. 일부 구현예에서, 본 발명의 방법은, 적어도 25 ㎝의 길이와 최대 6 프렌치의 직경인, 중공형 전달 튜브를 통해 젤라틴 인시츄 안정화 발포체를 전달하는 것이다. 일부 구현예에서, 본 발명의 방법은, 적어도 30 ㎝의 길이와 최대 6 프렌치의 직경인, 중공형 전달 튜브를 통해 젤라틴 인시츄 안정화 발포체를 전달하는 것이다. 일부 구현예에서, 발포화된 젤라틴은 직경이 적어도 30 게이지인 바늘을 통해 전달될 수 있다. 일부 구현예에서, 발포화된 젤라틴은 직경이 적어도 27 게이지인 바늘을 통해 전달될 수 있다. 일부 구현예에서, 발포화된 젤라틴은 직경이 적어도 25 게이지인 바늘을 통해 전달될 수 있다. 일부 구현예에서, 발포화된 젤라틴은 직경이 적어도 23 게이지인 바늘을 통해 전달될 수 있다. 일부 구현예에서, 발포화된 젤라틴은 직경이 적어도 21 게이지인 바늘을 통해 전달될 수 있다. 일부 구현예에서, 발포화된 젤라틴은 직경이 적어도 18 게이지인 바늘을 통해 전달될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명의 벌크제는, 여드름 흉터를 제거 또는 개선하고 주름 라인을 보정하고, 기존의 흉터를 상승시키며, 얼굴 윤곽을 표면 조정하거나, 또는 이들의 임의의 조합이도록 구성된다.
일부 구현예에서, 본 발명의 벌크제는 다음의 특성을 갖는 충진 재료이다: (i) 생리학적 - 그 자신을 신체의 조직과 병합; (ii) 간단한 절차 - 주사 가능; (iii) 위험 없음 - 합병증 및 부작용 없음; (iv) 반영구적 - 시간에 따라 분해; (v) 세포의 내부 성장 및 조직 리모델링제용 스캐폴드로서의 기능 또는 이들의 조합 특성.
일부 구현예에서, 본 발명의 조성물은 필러, 예를 들어 진피내 필러이다. 일부 구현예에서, 필러는 젤라틴 및 트랜스글루타미나제 안정화제로 구성될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명의 조성물은 반려 동물, 예를 들어 이에 제한되지 않지만, 고양이와 개를 치료하기 위해 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명은 환자 조직에서 신규 콜라겐을 제조하기 위해 섬유아세포를 자극하기 위한 방법으로, 특히 섬유아세포 초점 부착 기능을 하기 위해 바이오 엔지니어링된 주입 가능한 조직 매트릭스를 사용한다. 일부 구현예에서, 주입 가능한 조직 매트릭스는 가교 결합된 생분해성 단백질(예컨대 젤라틴, 그러나 이에 제한되지 않음) 발포체로 만들어지고, 이는 미생물 트랜스글루타미나제에 의해 인시츄로 가교 결합되어, 이상적인 기계적 특성을 갖고 안정적이고 접착성인 다공성 매트릭스를 형성한다. 이러한 구조체는, 세포 내부 성장을 자극하고 매트릭스와 섬유아세포 사이의 정확한 교화를 허용하는, 최적의 기계적 및 생물학적 지지를 제공한다. 조직 천연 환경의 추가 세포 매트릭스를 모방함으로써, 젊은 피부의 생물학적 및 구조적 특성을 갖는 신규 세포가 풍부한 조직 또는 진피층이 성장될 수 있다. 발포체는 분해되고 결국 천연 아키텍처로 대체된다. 본원에서 설명된 발포체가 상기 신체에 의해 서서히 분해됨으로써 생물학적 조직 및/또는 피부 재생을 생성할 시, 본 발명의 일 구현예에서 제공되고 개시된 조직 매트릭스는, 섬유아세포의 성장 및 증식, 콜라겐의 분비, 및 보강 부위에서 자극된 ECM의 축적을 가능하게 한다.
본 발명의 일부 구현예에서, 젤라틴 발포체 스캐폴드 생체 물질은 섬유아세포 환경에 인테그린 결합 부위를 도입할 수 있다. 또한, 이의 풍부한 RDG(인테그린 부착 부위)와 함께 유리한 기계적 특성 및 접착성을 통해, 이전에 내인성 ECM에 대해 손실된 바이오-기계 신호를 처리된 부위에 가할 것이다. 상기 스캐폴드에 의한 이러한 바이오-기계적 신호는 초점 접착을 형성하고 섬유아세포 콜라겐 제조를 자극하면서 MMP 제조를 약화시킨다. 이는 젤라틴 발포 스캐폴드가 신체와 일체가 되도록 한다. 이는, 임의의 바이오기계 신호를 인근의 환경으로 추가 전달하여 인접 세포에서 표현형의 이동을 야기할 수 있다. 결국, 젤라틴 발포체 스캐폴드 생체물질은 분해될 것이나, 자극된 섬유아세포가 새로운 상호 연결된 콜라겐 ECM을 제조하여 그들 자신 및 이웃하는 세포를 지지하여 피부 재생을 오래 지속시키는 결과를 갖기 전에는 분해되지 않을 것이다.
본 발명의 일부 구현예에서, 젤라틴 발포체 스캐폴드 생체물질은 기존의 섬유아세포로부터 콜라겐 생성을 유도할 수 있고, 그들의 증식을 유도할 수 있고, 간엽 혈통 세포 및 섬유세포로부터 섬유아세포 성숙을 유도할 수 있다. 이는 발포체 부피 내로의 세포 침윤을 추가 장려하여, 섬유아세포로 하여금 발포체 부피 내부에서 ECM을 생성시킬 수 있다. 이러한 발포체 분해 및 ECM 생성의 이러한 공정은, 보강 부위에서 장기적인 효과를 초래할 것이다. 본 발명의 다른 구현예에서, 젤라틴 발포 스캐폴드 물질은, 신규 세포 군집과 매트릭스 생성을 지원하기 위해 혈관의 형성을 또한 유도할 수 있다. 이러한 혈관은 영양소의 유입/유출을 제공하고 이러한 변화의 생존을 촉진함으로써, 장기간 영향을 미칠 것이다. 따라서, 본 발명의 일부 구현예에서, 젤라틴 발포체 스캐폴드 생체물질은, 더 많은 콜라겐 생성이 필요한 곳에 따라, 자연적 또는 병리학적 조건을 겪는 진피 피부의 재생을 지원할 수 있다.
본 발명의 일부 구현예에서, 젤라틴 발포체 스캐폴드 생체물질은 콜라겐 생성을 유도할 수 있고, 비제한적인 예로서, 피부의 모양과 질감을 향상시키는 격막과 같은 하위 피부 지지성 결합 조직의 콜라겐 함량을 보강시킬 것이다.
본 발명의 일부 구현예에서, 본 발명의 분말 또는 젤라틴 발포체 스캐폴드 생체물질은 개방형 세포 구조용 용액을 제공하기 위해 과산화수소로 보강된다. 본 발명의 일부 구현예에서, 폐쇄형 세포 발포체에 대해 개방형 세포 (기공) 발포체의 이점이 있을 수 있다. 따라서, 본 발명의 분말과 혼합된 가용성 포로젠을 혼입하면, 기공의 상호 연결이 증가할 것이라는 점이 제안된다. 포로젠 분말을 본 발명의 다른 분말과 혼합하는 동안, 포로젠이 젤라틴 발포체 스캐폴드 생체물질 내에 포획될 수 있다. 이 포로젠은 액체의 접촉에 의해 활성화되고 가스 형태로 분해된다. 가스 압력은 각각의 폐쇄형 세포 내부에서 축적되어, 크랙과 인접하는 기공 사이의 연결을 생성한다. 이것은, 주어진 병리학적 상태의 경로를 변경할 수 있고 세포 증식 및 콜라겐 합성을 포함하나 이에 제한되지 않는 수복 과정을 촉진할 수 있는, 산소 생성 스캐폴드를 제공한다.
본 발명의 일부 구현예에서, 가교 결합된 젤라틴 발포체 스캐폴드 생체물질은 완전 가교 결합 후에 액체를 추가로 제거할 수 있다. 이것은 습기 제거, 열 건조 또는 동결 건조를 통해 행해질 수 있다. 최종 발포체는 다양한 응용예에서 사용될 수 있는 딱딱한 생체물질이다. 건식 발포체가 수화되는 경우, 이는 유연성 발포체 형태로 복귀하고, 생체내 또는 시험관내 세포에 대한 스캐폴드 역할을 할 수 있다. 발포체의 이러한 건조 형태의 응용은, 예를 들어 정형외과 임플란트와 같은 임플란트 상에 발포체를 건조시켜서 임플란트와의 뼈 통합을 향상시킬 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 다른 적용은 조직 보강 및 세포 활성화를 위해 이를 사용하는 것일 수 있다. 건식 발포체는 50 내지 500 μm의 작은 입자로 미립자화되어서, 예를 들어 진피 조직과 같은 조직 내로 바늘을 통해 주입될 수 있도록 한다.
본 발명의 일부 구현예에서, 가교 결합 효소는 임의의 제조 불순물을 제거하기 위해 정제될 것이며, 최종 생성물은 면역 반응 및 분해에 덜 민감할 것이다. 이와 같이, 생체내 분해 프로파일은 더 느릴 수 있고, 신규 콜라겐 축적(조직 리모델링)을 위해 더 많은 시간을 허용할 수 있다. 더 많은 콜라겐 축적은 향상된 효능을 갖는다.
위의 설명과 함께, 비제한적인 방식으로 본 발명의 일부 구현예를 예시하는 다음의 실시예를 이제 참조한다.
실시예
실시예 1: 본 발명의 일부 구현예에 따른, 조성물에 대한 당김 테스트
성분
(i) 0.25 그램 ACTIVA WM 효소 제조 (스트렙토버티실리움 모바라엔제로부터의 1% 미생물 트랜스글루타미나제, 99% 말토덱스트린) (아지노모토, 일본)
(ii) 0.25 그램 Gelita 275 블룸, A형의 돼지 젤라틴(Gelita, Sioux City) 의료 등급 저 내독성, Superfine 사에 의해 제트 밀링된 입자 사이즈 범위: d(0.1)=4.24 um, d(0.5)= 16.61 um, d(0.9)=31.51 um
(iii) 1 ml 식염수 (+및 액체 첨가제)
방법
분말은 L-3 Communications에 의해 제조된 9.93 KiloGray e-빔에 의해 멸균되었다. 멸균성은 AminOlab사(레초보트, 이스라엘)에 확인되었고, SOP 제50.WI.110- 의료 제품의 멸균 시험에 따라 테스트를 수행하였다. 　 혼합물을 하나의 주사기로부터 다른 주사기로 10 내지 12회 동안 밀어서 분말을 수동으로 혼합하였다. 그 후, 즉시 혼합물을 두 개의 콜라겐 시트 사이에 도포해서, 글루 처리된 중첩부가 대략 2 cm * 2.5 cm이었고 약 10분 동안 경화되도록 두었다. 조성물을 힘 게이지(Lutron FG-20 KG)로 최대 당김(전단) 힘에 대해 테스트하였다.
Figure pct00002
찢김은 글루에서 관찰되지 않았으나, 콜라겐 시트 자체의 파괴에서 관찰되었고, 따라서 찢김은 글루 처리된 세그먼트에 있지 않았다.
결과는 활성을 많이 잃지 않으면서 미분화된 분말을 최종적으로 멸균할 수 있는 능력을 입증한다.
실시예 2: 현미경.
다음 젤라틴은 Gelita 275 블룸, A형의 돼지 젤라틴(Gelita, Sioux City) 의료 등급 저 내독성, Superfine 사에 의해 제트 밀링된 입자 사이즈 범위: d(0.1)=4.24 um, d(0.5)= 16.61 um, d(0.9)=31.51 um을 지칭한다. 하기 mTG는 ACTIVA (아지노모토, 일본)를 지칭한다.
젤라틴-mTG 발포체를 제조하고 광학 현미경 10x 및 40x 배율으로 가시화하여 그것의 발포체 특성을 평가하였다.
결과:
버블은 신체 요소에 걸쳐 무작위 방식으로 고정된 채 검출되었다. 버블은 직경이 1 내지 500 ㎛인 크기로 다양했다.
실시예 3: 본 발명의 일부 구현예에 따른 조성물을 바늘로 전달
다음 젤라틴은 Gelita 275 블룸, A형의 돼지 젤라틴(Gelita, Sioux City) 의료 등급 저 내독성, Superfine 사에 의해 제트 밀링된 입자 사이즈 범위: d(0.1)=4.24 um, d(0.5)= 16.61 um, d(0.9)=31.51 um을 지칭한다. 하기 mTG는 ACTIVA (아지노모토, 도쿄)를 지칭한다.
젤라틴 분말을 mTG와 1:1 비율로 혼합하였다. 혼합물의 0.75 그램을 26℃에서 2.63 ml의 물로 수동으로 발포체 내에 혼합하였다. 발포체를 150 mm 길이의 18 게이지 바늘(D=1.03 mm)로 밀어 냈다.
결과:
발포체는 주사기를 통해 주사기로부터 성공적으로 전달되었다. 발포체는 약 3분 후에 안정화되며, 50°C에서 안정적으로 유지되었다(열적 가역성이 아니라는 의미임).
실시예 4: 본 발명의 일부 구현예에 따라 다양한 조성물의 테스트
다음 젤라틴은 Gelita 275 블룸, A형의 돼지 젤라틴(Gelita, Sioux City) 의료 등급 저 내독성, Superfine 사에 의해 제트 밀링된 입자 사이즈 범위:
(A): d(0.1)=4.24 μm, d(0.5)=16.61 μm, d(0.9)=31.51 μm.
(B): d(0.1) = 4.415 μm, d(0.5)=13.064 μm, d(0.9)= 29.621 μm.
(C): d(0.1)= 13.451 μm, (C): d(0.5)= 94.66 μm, d(0.9)= 423.785 μm를 지칭한다.
젤라틴 분말을 mTG 효소, ACTIVA (아지노모토, 토쿄)와 혼합하였고, 수동 혼합으로 (두 개의 주사기가 연결되고, 하나는 분말과 함께, 하나는 물과 함께) 수화하였다. 최종 결과는 발포체로, 이는 콜라겐 두 시트를 접착하기 위한 능력을 테스트하였고, 50°C 수욕조에 물품을 담금으로써 열가역성에 대해 테스트하였다.
Figure pct00003
실시예 5: 트랜스글루타미나제를 이용해 가교 결합된 젤라틴 발포체의 결합 및 기계적 특성 분석.
다음 젤라틴은 Gelita 275 블룸, A형의 돼지 젤라틴(Gelita, Sioux City) 의료 등급 저 내독성, Superfine 사에 의해 제트 밀링된 입자 사이즈 범위: d(0.1)=4.24 um, d(0.5)= 16.61 um, d(0.9)=31.51 um을 지칭한다. 다음 mTG는 100 U/gm 의 활성 수준을 갖는 ACTIVA 분말(아지노모토, 토쿄)을 지칭한다. mTG는 1% 효소 및 99% 말토덱스트린을 함유한다. 멸균된 분말이 특정되는 경우 - 젤라틴 및 mTG 미분화된 분말을 감마 방사선 9.38 KGray (소르밴, 이스라앨)을 사용하여 멸균시켰다.
가교 결합된 발포체의 유동학적 파라미터는 Lloyd Materials Testing LS1 기계(Ametek Test & Calibration Instruments)를 사용하여 측정되었고, 생물학적 물질의 기계적 특성을 테스트하기 위해 1kN 고정밀 물질 테스트 기계가 사용되었다. 생물학적 물질은 하기 표에 명시된 비율 당 수동 혼합에 의해 제조되었으며, 혼합 및 테스트 사이에 40분을 허용하였다. 이는, 테플론 표면을 갖는 글라스 커버와 스페이서 사이에서 테플론으로 덮인 글라스 플레이트 상에 주입되어, 일단 안정화된 3 mm 두께의 직사각형 형상을 생성한다. 표준 개뼈 형성품이 생물학적 물질로부터 펀칭되었고 기계적 테스트에 사용되었다. 상부 그립을 상부로 이동시켜 파괴(완전 찢김)까지 생물학적 물질을 신장시킴으로써, 인장 테스트를 수행하였다. 최대 힘에서, 최대 하중 및 총 신장률의 백분율을 샘플 폭 및 두께에 기초하여 결정하였다. 영률은, 그래프의 가장 선형적인 부분을 나타내는 2개의 지점을 선택하여 계산되었다. 테스트 속도는 45 mm/분이었고, 10 N 하중 셀(시리얼 번호. 10N0360)을 사용하였다.
파열 압력 테스트는 ASTM F2392-04, 수술용 실런트의 파열 강도에 대한 표준 테스트 방법에 기초하여 수행되었다. 각 파열 압력 테스트에 대해, 콜라겐 소시지 케이싱(Collta Casings, N.J.)을 기재로서 사용하였다. 각 케이싱 시편에 3 mm 직경의 구멍을 펀칭하고 각각의 시편을 시편 유지 매니폴드에 클램핑하였다. 발포체는, 성분을 수동 혼합하여 40분 경화 시간을 허용함으로써 제조되었다. 그 다음, 조직 매니폴드를 이중 증류수로 채우고, 120 mL/시간의 속도로 활성화된 주사기 펌프(KD Scientific Model 100 시리즈)에 의해 가압되었다. 실리콘 튜브를 통해 물로 충진된 테스트 고정자와 압력 게이지를 사용하여 고장 시까지 최대 압력(PSI)을 측정하였다. 각 테스트 후 파괴 유형(응집성, 부착성)을 기록하였다. 각 그룹에 대해 세 번 반복하여 테스트하였다.
결과:
아래 표에 도시된 결과는, 조직 엔지니어링 또는 수술 밀봉 분야에서 상이한 필요성에 맞도록 제어하기 쉬운 기계적 특성을 갖는, 본 발명에 따른 생물학적 물질을 제조하는 능력을 명확하게 입증한다.
Lloyd 기계적 테스트:
Figure pct00004
Figure pct00005
파열 압력 테스트:
Figure pct00006
실시예 6: 가교 결합된 젤라틴 발포체의 영양소 침투의 특성화.
본 예시는 영양소 순환을 허용하는 본 발명에 따른 조성물의 능력을 입증한다. 다음 조성물의 발포체를, 트랜스글루타미나제/젤라틴 조성물을 포함하는 하나의 주사기로부터 다른 연결된 주사기로 PBS를 통과시키는 방법에 의해 건조 성분을 10회 수동 혼합하여 만들었고, 착색된 배지에 첨가하기 전에 15분 동안 가교 결합되도록 허용하였다. 4 mL PBS + 1 그램 젤라틴과 1 그램 mTG를 혼합하였다. 생물학적 물질은 21 mm의 직경 및 26 mm의 두께를 가졌다. Red Maimon의 식품 착색된 액체 염료를 물 속에 희석시키고, 생물학적 물질을 24시간 동안 착색 액체에 침지하였고 컬러 확산을 측정하기 위해 절반으로 잘랐다.
실시예 7: 젤라틴 성분과 혼합한 후 세포의 생존.
다음 젤라틴은 Gelita 275 블룸, A형의 돼지 젤라틴(Gelita, Sioux City) 의료 등급 저 내독성, Superfine 사에 의해 제트 밀링된 입자 사이즈 범위: d(0.1)=4.24 um, d(0.5)= 16.61 um, d(0.9)=31.51 um을 지칭한다. 젤라틴 미분화된 분말을 감마 방사선 9.38 KGray (소르반, 이스라엘)을 사용하여 멸균시켰다.
다음의 실시예는, 본 발명에 따른 조성물을 제조하는 데 필요한 혼합에 의해 나타나는 전단력을 견디고, 직접 혼합하거나 3 방향 스톱콕을 사용하여 생물학적 물질 내부에서 세포 혼입의 최적 방법을 평가하기 위해, 정상 인간 피부 섬유아세포(NHDF)의 능력을 입증하고자 하는 것이다. 조직 엔지니어링 목적을 위해 세포 스캐폴드로서 사용되는 경우의 혼합 방법으로서, 스캐폴드 부피 내부에서 세포의 균질한 확산 및 생존력을 보장한다.
혈청 함유 배지(Dulbecco's modified eagle's medium, 고 글루코오스, Biological Industries Lot 1530279, 10% Certified Foetal Bovine 혈청, Catalog #: 04-001-1A와 1%의 Penicillin-Streptomycin 용액, Biological Industries 03-031-1C로 보충됨) 6 ml를 이용해 트립신에 대응한 다음, 3 내지 5분 동안 트립신(트립신 EDTA 용액 B (0.25%), EDTA (0.05%), 페놀 레드, Biological industry, 03-052-1A 가짐) 2 ml의 처리를 사용하여 80%의 응집성에 도달시, NHDF 세포를 100 mm 플레이트로부터 분리하였다. 세포를 5분 동안 1500 RPM으로 원심 분리하고, 6 ml의 예열된 배지 중에 재현탁하여, 360,000 NHDF 세포/ml의 스톡 농도를 제공하였다.
하기 표에 설명된 바와 같이 세포를 함유한 배지와 젤라틴 분말을 혼합하는 것을 3번 반복 수행하였고, 세포 함유 배지와 1:1 희석된 트리판 블루(0.5%)을 사용하여 씨딩 후 육안 검사 4, 24 시간으로 세포 생존 능력을 입증하였다. 웰 1에서, 젤라틴 및 세포를 함유한 배지를 2 주사기 시스템(암형 루어 잠금 장치와 연결된 수형 루어 잠금 장치)을 사용하여 직접 혼합하였다. 반면에 웰 2와 웰 3에서, 젤라틴을 8번 혼합된 배지 2.5 ml를 사용하여 처음 용해되었고, 그리고 직후에 3 웨이 스톱 콕(Elcam Medical)을 사용하여 셀을 포함한 배지 1.5 ml를 추가 첨가하였고, 2 번의 추가 혼합을 수행하였다. 젤라틴 혼합물을 함유한 세포를, 조직 배양 처리 플라스틱(Coming Inc., Costar, Product #:3516)의 6개의 웰 플레이트 상에 씨딩하였다.
씨딩한 후 4시간 뒤 세포의 부착은 용이하게 스팟을 형성한 반면, 씨딩한 후 24 시간 뒤 세포는 플레이트 상에 완전히 퍼져서, 세포가 생존 가능하고 혼합 중에 받는 전단 응력을 견딜 수 있음을 증명하였다.
전단 응력으로 인한 세포 생존 분석
Figure pct00007
실시예 8: 가교 결합된 젤라틴 발포체 내부의 세포 생존 능력.
다음 젤라틴은 Gelita 275 블룸, A형의 돼지 젤라틴(Gelita, Sioux City) 의료 등급 저 내독성, Superfine 사에 의해 제트 밀링된 입자 사이즈 범위: d(0.1)=4.24 um, d(0.5)= 16.61 um, d(0.9)=31.51 um을 지칭한다. 다음의 mTG는 ACTIVA WM(아지노모토, 도쿄), 100 U/gm의 활성 수준을 갖는 분말을 지칭한다. mTG는 1% 효소 및 99% 말토덱스트린을 함유한다. 젤라틴 및 mTG 미분화된 분말을 감마 방사선 9.38 KGray (소르반, 이스라엘)을 사용하여 멸균시켰다. 다음 배지는 혈청 함유 배지(Dulbecco's modified eagle's medium, 고 글루코스, Biological Industries (이스라엘), 10% Certified Foidic Bovine 혈청, Catalog #: 04-001-1A, 및 1% Penicillin-Streptomycin 용액, Biological Industries, 03-031-1C로 보충됨)를 지칭한다.
다음의 예는, 섬유아세포 세포가 본 발명에 따른 조성물에 7일 이상 동안 매립되거나 씨딩되는 것을 생존하고 번식할 수 있음을 입증하기 위한 것이다.
혈청 함유 배지를 이용해 트립신에 대응한 다음, 3 내지 5분 동안 트립신(트립신 EDTA 용액 B, Biological Industries, 03-052-1A) 2 ml를 사용하여 80%의 응집성에 도달시, NHDF 세포를 100 mm 플레이트로부터 분리하였다. 세포를 5분 동안 1500 RPM으로 원심 분리하고, 배지 중에 재현탁하여, 1,000,000 세포/ml의 스톡 농도를 제공하였다.
그룹 A: 120 mg의 멸균 mTG와 혼합된 200 mg 멸균 젤라틴 조성을 갖는 젤라틴 생물학적 물질이 수형 루어 잠금 시린지에 로딩되고, 1 ml의 세포 스톡 배지(Dulbecco's modified eagle medium, 고 글루코스, Biological industry Lot 1530279)와 10회 혼합되어 생물학적 물질을 제조하고, 비처리된 플라스틱(Corning Inc., Costar, Reference #: 3736, Lot#: 30015036)의 6개의 웰 플레이트 상에 주입하였다.
그룹 B: 동일한 조성물의 생물학적 물질을 세포가 없는 배지와 혼합하고, 40분 동안 가교 결합시켰고, 1x106 세포를 3 ml의 배지(Dulbecco's modified eagle's medium, 고 글루코오스, Biological Industries Lot 1530279, 10% Certified Foidic Bovine 혈청, Catalog #: 04-001-1A와 1%의 Penicillin-Streptomycin 용액, Biological Industries 03-031-1C로 보충됨)에 첨가하였고, 5% CO2 및 37°C O/N을 갖는 인큐베이터로 이동하기 전에 셰이커에 37°C로 2시간 놓았다. 이 방법은 세포를 젤라틴 스캐폴드에 부착시키고, 그 부피에 매립되기보다는 주변 상에 성장시킨다.
그룹 C: 대조군으로서 사용되고 세포는 함유하지 않으나, 그룹 A 및 B 각각에서 생물학적 물질의 동일한 조성을 가졌다.
그룹 A, B, 및 C를 5% CO2와 37℃인 인큐베이터에서 배양하였다.
씨딩 후 24시간이 지나, 모든 그룹을 메스를 사용하여 1/4로 절단하였다. 그룹 B의 생물학적 물질을 세포 배양에 대해 처리되지 않은 6개의 신규 플라스틱 웰 플레이트에 ?グ? 상기 생물학적 물질에 부착되지 않은 세포로부터 테스트된 것을 분리시키고 난 다음, Alamarblue 10% v/v를 모든 웰에 첨가하였다. 세포 씨딩 후 3일 및 6일에 Alamarblue 감소를 측정하였다. Alamarblue 반응을 위해 거의 24시간 허용되었다.
결과:
도 10에 도시된 결과는, 대조군(그룹 C)에 비해, 생물학적 물질(그룹 A) 내부와 생물학적 물질(그룹 B) 상에서의 세포가 생존 가능하고, Alamarblue 함유 배지의 상이한 착색에 의해 나타낸 지정 시점에서 Alamarblue를 감소시킬 수 있음을 명확하게 입증한다. 이러한 결과는, 가교 결합된 젤라틴 발포체 생물학적 물질이 조직 엔지니어링 목적을 위한 양호한 스캐폴드로서 기능할 수 있음의 청구범위를 지지한다.
실시예 9: 본 발명의 일부 구현예에 따른 조성물의 피하 주사
다음 젤라틴은 Gelita 275 블룸, A형의 돼지 젤라틴(Gelita, Sioux City) 의료 등급 저 내독성, Superfine 사에 의해 제트 밀링된 입자 사이즈 범위: d(0.1)=4.24 um, d(0.5)= 16.61 um, d(0.9)=31.51 um을 지칭한다.
다음의 mTG는 ACTIVA WM(아지노모토, 도쿄), 100 U/gm의 활성 수준을 갖는 분말을 지칭한다. mTG는 1% 효소 및 99% 말토덱스트린을 함유한다. 젤라틴 및 mTG 미분화된 분말을 9.93 KiloGray e-빔 (Sorvan, 이스라엘)에 의해 멸균시켰다. 테스트된 조성물은, 하나의 주사기에 0.25 그램 젤라틴 분말 + 0.25 mTG 분말을 1 ml의 멸균 식염수와 혼합한 것을 포함하였다.
연구를 위해 두 마리의 60 kg SW 돼지를 사용하였다. 동물은 마취되었으며 테스트 조성물(0.3 내지 0.5 ml의 발포체)을 좌측 앞다리에 바늘을 사용하여 피부 아래에 주입하였다. 90일 지난 후, 동물을 안락사시켰고 현미경 분석을 위해 조직을 채취하였다. 조직 샘플을 포르말린에 고정하고 슬라이드 및 헤마톡실린 및 에오신 염색의 준비를 위해 보냈다.
결과:
동물 중 어느 것도 부작용을 나타내지 않았다. 생체물질은 양호한 내약성을 나타내고 대부분 분해되었다. 괴사 및 공동 형성 또는 이동은 관찰되지 않았다.
도 2a는 주입후 90일 시점에 조직을 처리한 위치에서 섬유아세포를 나타낸다. 도 2a에 나타낸 바와 같이, 섬유아세포는, 타원형 또는 둥근 핵이 중앙에 위치한 스핀들 형상 또는 별 형상의 세포로 통통하였다. 이는 그들의 호염기성 염색으로 나타났다. 이들 발견은, 이들 섬유아세포가 활성화되었으며 새로운 콜라겐을 생성할 수 있음을 제시한다.
도 2b는 주입후 90일 시점에 비처리한 조직에서 섬유아세포를 나타낸다. 도 2b에 나타낸 바와 같이, 섬유아세포는 파형 핵을 갖고 얇고 평탄한 상태였고, 그들의 세포질 부피는 감소하였고, 이는 성숙 단계에서 비활성 섬유아세포를 제시한다.
본 발명의 조성물은 섬유아세포 활성화 및 새로운 콜라겐 생성을 자극할 수 있어서, 손상된 ECM을 재건 또는 복구하기 위해 도움이 될 수 있음을 제안한다. 피부 적용의 경우, 피부를 젊은 피부와 같이 보이고 느껴지도록 만들 것으로 예상된다.
실시예 10: 이미징용 주사 전자 현미경을 사용한 스캐폴드 상의 세포 형태.
다음 젤라틴은 Gelita 275 블룸, A형의 돼지 젤라틴(Gelita, Sioux City) 의료 등급 저 내독성, Superfine 사에 의해 제트 밀링된 입자 사이즈 범위: d(0.1)=4.24 um, d(0.5)= 16.61 um, d(0.9)=31.51 um을 지칭한다. 다음의 mTG는 ACTIVA WM(아지노모토, 도쿄), 100 U/gm의 활성 수준을 갖는 분말을 지칭한다. mTG는 1% 효소 및 99% 말토덱스트린을 함유한다. 젤라틴 및 mTG 미분화된 분말을 감마 방사선 9.38 KGray (소르반, 이스라엘)을 사용하여 멸균시켰다. 젤라틴: mTG 비율은 1 U mTG / 10 mg 젤라틴이었다. 다음 배지는 혈청 함유 배지(Dulbecco's Modified Eagle's medium, 고 글루코스, Biological Industries (이스라엘), 10% Certified Foidic Bovine 혈청, Catalog #: 04-001-1A, 및 1% Penicillin-Streptomycin 용액, Biological Industries, 03-031-1C로 보충됨)를 지칭한다.
혈청 함유 배지를 이용해 트립신에 대응한 다음, 3 내지 5분 동안 트립신(트립신 EDTA 용액 B, Biological Industries, 03-052-1 A) 2 ml를 사용하여 80%의 응집성에 도달시, NHDF 세포를 100 mm 플레이트로부터 분리하였다. 세포를 5분 동안 1500 RPM으로 원심 분리하고, 배지 중에 재현탁하여, 1,000,000 세포/ml의 스톡 농도를 제공하였다.
1개의 주사기에 혼합된 마이크로화된 젤라틴 및 mTG 분말을, 세포가 없는 배지와 혼합하고, 40분 동안 가교 결합시켰고, 1x106 세포를 3 ml의 배지(Dulbecco's modified eagle's medium, 고 글루코오스, Biological Industries Lot 1530279, 10% Certified Foidic Bovine 혈청, Catalog #: 04-001-1A와 1%의 Penicillin-Streptomycin 용액, Biological Industries 03-031-1C로 보충됨)에 첨가하였고, 5% CO2 및 37°C O/N을 갖는 인큐베이터로 이동하기 전에 셰이커에 37°C로 2시간 놓았다. 이 방법은 세포를 젤라틴 스캐폴드에 부착시키고, 그 부피에 매립되기보다는 주변 상에 성장시킨다.
7일 동안 인큐베이팅한 후, 스캐폴드의 부분을 부드럽게 절단하였다. 세포를 갖는 스캐폴드를 4°C에서 24시간 동안 4% 파라포름알데히드를 사용하여 고정하였다. 그 다음, 스캐폴드를 등급화된 아세톤 시리즈(30, 50, 70, 80, 90, 95, 100)에서 탈수하였다. 그 다음, balzers CPD 030 Critical Point Dryer(CPD)로 건조하였다. SEM 검사 전에 샘플을 금 스퍼터로 코팅하였다.
도 4는 본 발명의 일부 구현예에 따른 스캐폴드 조성물에서 씨딩된 세포를 나타낸다.
결과:
섬유아세포는 스캐폴드 표면 및 그의 기공에 있는 것으로 밝혀졌다. 씨딩된 섬유아세포는, 시험관 내에서 예상될 수 있듯이, 평평하거나 둥근 것 보다는 스핀들 형상의 형태로 가시화되었다. 이러한 형태는 또한 세장형 것으로 설명될 수 있고, 젊은 섬유아세포의 표현형을 나타낸다. 세포는 또한 그 자체 사이에 결합을 형성할 수 있다. 이러한 결과는, 가교 결합된 젤라틴 발포체가 새로운 콜라겐 생성 및 조직 재생을 촉진하는 섬유아세포 표현형에 영향을 줄 수 있음을 입증한다.
실시예 11: 상이한 진피 필러 대 생체내 mTG 가교 결합된 젤라틴 발포체의 콜라겐 침착 능력 비교.
다음 젤라틴은 Gelita 275 블룸, A형의 돼지 젤라틴(Gelita, Sioux City) 의료 등급 저 내독성, Superfine 사에 의해 제트 밀링된 입자 사이즈 범위: d(0.1)=4.24 um, d(0.5)= 16.61 um, d(0.9)=31.51 um을 지칭한다. 다음의 mTG는 ACTIVA WM(아지노모토, 도쿄), 100 U/gm의 활성 수준을 갖는 분말을 지칭한다. mTG는 1% 효소 및 99% 말토덱스트린을 함유한다. 젤라틴 및 mTG 미분화된 분말을 감마 방사선 9.38 KGray (소르반, 이스라엘)을 사용하여 멸균시켰다. 젤라틴: mTG 비율은 1 U mTG / 10 mg 젤라틴이었다.
레드 듀록 돼지와 교배된 생후 10개월의 90 kg Large White 한 마리를 연구하기 위해 사용하였다. 동물을 마취시키고 테스트된 조성물(1.6 내지 2.4 ml 발포체) 또는 시판 중인 진피 필러를 다음과 같이 주입하였다: 6개의 적어도 5 x 5 cm인 피부 영역을 돼지의 배 영역에서 선택하였다. 상이한 피부 향상 진피 필러, 및 mTG 가교된 젤라틴 발포체의 테스트된 조성물을 균일하게 분포시키기 위해 삽입관을 각 영역의 중앙점에 안쪽으로 삽입하였다.
주입된 진피 필러:
상업용 진피 필러를 제조사(Restylane Vital, SCULPTRA, Radiesse, Restylane)가 지시한 대로 사용하였다.
Figure pct00008
샘플 채취: 7 mm 펀치 생검을 주입후 30일, 60일, 90일 및 150일 시점에 취하고, 10x 부피 4% 파라포름알데히드에 침지시키고, 파라핀에 추가로 매립하였다. 세포 침윤 및 조직 반응 분석을 위해, 블록은 5 μm의 조각으로 절단되고 헤마톡실린 및 에오신에 대해 염색되고 콜라겐 침착 분석을 위한 Masson의 트리크롬 염색하였다.
결과:
주입후 12 및 30일 시점에 상이한 진피 필러 대 mTG 가교 결합된 젤라틴 발포체(그룹 F)의 조직 병리학적 등급 분석.
Figure pct00009
변화의 중증도를 고려하여 5 등급(0, 1, 2, 3, 4)의 반정량적 등급(0 = 병변 없음, 1= 미미한 변화, 2= 경미한 변화, 3 = 중간 변화, 4= 마킹된 변화)을 사용하였다. * - 병변은 바늘 외상에 기인해 형성됨, ** - 림프구의 많은 존재가 관찰됨.
모든 물질은 이물질 과립화 반응을 야기하는 것으로 나타났다. 세포 침윤물은 주로 대식 세포 및 대세포로 구성되었으며, 물질은 이물질을 에워싸는 대세포에 의한 흡수를 특징으로 하는 분해 패턴을 가졌다. 괴사, 부종 또는 석회화와 같은 어떠한 부작용도 테스트된 물질에 나타나지 않았다.
도 5는 주입후 30일 시점에 그룹 F에 비해, 상이한 진피 필러의 콜라겐 침착을 나타낸다.
상이한 진피 필러, 및 mTG 가교 결합된 젤라틴 발포 스캐폴드 생체물질의 Masson 트리크롬 염색은 명확하게 청색으로 콜라겐 침착 염색을 나타낸다. mTG 가교 결합된 젤라틴 발포체의 콜라겐 침착은, 수량과 조직에서 월등하다. 콜라겐 섬유는 병렬로 조직되는 반면, 시판 가능한 진피 필러에서는 콜라겐 섬유가 비조직화된다.
도 6a 내지 도 6e는 본 발명의 일부 구현예에 따라 본 발명의 조성물을 나타낸다.
이미지는, 상기 가교 결합된 젤라틴 발포체 스캐폴드 생체물질로 처리된 피하 조직을 Masson의 트리크롬 염색으로 착색된 조직 병리학적 부위이다. 이미지는 주입후 12일, 30일, 60일, 90일, 150일 시점이다. 처리된 부위에서 새로이 조직화된 콜라겐 섬유의 진행을 입증한다. 주로, 피하의 격막은 더 두꺼운 콜라겐 함량으로 보강된다. 새로운 콜라겐은 청색으로 염색된다.
결론:
12일 시점의 조직학적 검사에서, 풍부한 섬유아세포가 이미 그룹 F(가교 결합된 젤라틴 발포체 스캐폴드 생체물질)의 이식 부위에 존재하였다. 이러한 현상은 다른 공지된 필러에서 관찰되지 않았다.
그룹 F의 주입 후 12일 시점에, 조직학적 검사는 경미한 등급 염증 반응을 나타내었으며, 이는 다른 상업적 물질과 동등하였다. 이미 고도로 정제된 상업용 제품과 비교하여(이는 테스트된 제품의 불순물에 의해 아직 임상 등급이 아닌 것으로 설명될 수 있음), 대세포, 대식 세포 및 림프구가 최소로 더 높게 존재함을 주목한다.
그룹 F의 주입 후 30일 시점에, 많은 콜라겐 섬유가 이식 부위에서 관찰되었다. 그룹 F의 주입 후, 새로운 콜라겐 침착의 양은 다른 테스트 물질(점수 0~1)과 비교하여 상당히 더 높았다(점수 2~3). 그룹 F의 주입 후, 괴사, 공동 형성 또는 부종을 나타내지 않아 양호한 조직 내약성을 입증하였다.
그룹 F의 주입 후 150일 시점에, 피하에서 섬유성 격막을 증강시키고 두껍게 만드는 것을 알 수 있다. 섬유는 흉터 또는 섬유성 조직에서와 같이 비조직화보다는 조직화된 물결 및 자연스럽게 보이고 콜라겐 I형이, 가교 결합된 젤라틴을 주입한 후에 생성되었음을 나타낸다. 괴사, 공동 형성 또는 부종은 존재하지 않았다.
실시예 12: 점성 물질의 주입성 증가.
다음 젤라틴은 Gelita 275 블룸, A형의 돼지 젤라틴(Gelita, Sioux City) 의료 등급 저 내독성, Superfine 사에 의해 제트 밀링된 입자 사이즈 범위: d(0.1)=4.24 um, d(0.5)= 16.61 um, d(0.9)=31.51 um을 지칭한다. 다음의 mTG는 ACTIVA WM(아지노모토, 도쿄), 100 U/gm의 활성 수준을 갖는 분말을 지칭한다. mTG는 1% 효소 및 99% 말토덱스트린을 함유한다. 젤라틴 및 mTG 미분화된 분말을 감마 방사선 9.38 KGray (소르반, 이스라엘)을 사용하여 멸균시켰다. 젤라틴: mTG 비율은 1U mTG / 10 mg 젤라틴이었다.
결과:
젤라틴 입자의 크기를 감소시키고 입자 분포 범위를 좁히기 위해, 미분화된 젤라틴 분말을 스크리닝하였다(더 큰 입자를 차단함). 특정 범위의 기공 크기를 함유한 거름체를 이용해 젤라틴 분말을 스크리닝하는 경우, 발포체 초기 점도는 혼합 후에 조정될 수 있고, 따라서 다양한 게이지의 바늘을 통해 주입될 수 있다. 이는, 발포체 주입성을 변형시킬 수 있으며, 이는 의사가 환자의 피부를 손상시키지 않고 미세한 주름을 쉽게 치료할 수 있게 한다.
하기 표는 주입 가능성의 개선을 설명한다.
Figure pct00010
실시예 13: 생체내 스캐폴드의 기능 조정
다음 젤라틴은 Gelita 275 블룸, A형의 돼지 젤라틴(Gelita, Sioux City) 의료 등급 저 내독성, Superfine 사에 의해 제트 밀링된 입자 사이즈 범위: d(0.1)=4.24 um, d(0.5)= 16.61 um, d(0.9)=31.51 um을 지칭한다. 다음의 mTG는 ACTIVA WM(아지노모토, 도쿄), 100 U/gm의 활성 수준을 갖는 분말을 지칭한다. mTG는 1% 효소 및 99% 말토덱스트린을 함유한다. 젤라틴 및 mTG 미분화된 분말을 감마 방사선 9.38 KGray (소르반, 이스라엘)을 사용하여 멸균시켰다. 젤라틴: mTG 비율은 1 U mTG/ 10g 젤라틴이었다.
레드 듀록 돼지와 교배된 생후 10개월의 90 kg Large White 한 마리를 연구하기 위해 사용하였다. 동물을 마취시키고 테스트 조성물, 액체 희석액에 대해 다양한 젤라틴의 주입을 테스트하고, 주입 후 30일 시점에서 콜라겐 생성에 대해 평가하였다.
결과:
성분(즉, 액체, 젤라틴, mTG)의 비율을 조정함으로써 콜라겐 생성의 양을 최적화할 수 있음을 감지하였다. 아래 표는, 젤라틴과 액체 사이의 비율(mTG 효소가 일정하게 유지됨)에 따라 생성된 콜라겐의 양을 설명한다. 12.5 내지 8% w/w의 젤라틴% w/w는, 16.6% w/w와 같이 더 높은 젤라틴 테스트 농도보다 더 효과적일 가능성이 높다.
Figure pct00011
도 11의 a는, 주입후 30일 시점에서, 상기 8% w/w 젤라틴 가교 결합된 발포 스캐폴드 생체물질로 처리된 조직을 염색한 Masson의 트리크롬에 의해 착색된 조직 병리학적 부위를 나타낸다. 도 11의 a의 결과는 처리된 부위에서 새로이 조직화된 콜라겐 섬유의 진행을 입증한다. 새로운 콜라겐은 청색으로 염색된다. 도 11의 b는 조직의 헤마톡실린 및 에오신 염색을 나타내고, 주입 후 대식 세포 및 대세포의 제한된 존재를 입증한다. 전반적으로 양호한 생체적합성 결과를 제공하는 물질의 잔여물은 보이지 않는다.
실시예 14: 가교 결합된 생분해성 젤라틴 발포체를 사용하여 흉터를 방지,
다음 젤라틴은 Gelita 275 블룸, A형의 돼지 젤라틴(Gelita, Sioux City) 의료 등급 저 내독성, Superfine 사에 의해 제트 밀링된 입자 사이즈 범위: d(0.1)=4.24 um, d(0.5)= 16.61 um, d(0.9)=31.51 um을 지칭한다. 다음의 mTG는 ACTIVA WM(아지노모토, 도쿄), 100 U/gm의 활성 수준을 갖는 분말을 지칭한다. mTG는 1% 효소 및 99% 말토덱스트린을 함유한다. 젤라틴 및 mTG 미분화된 분말을 감마 방사선 9.38 KGray (소르반, 이스라엘)을 사용하여 멸균시켰다. 젤라틴: mTG 비율은 1 U mTG / 10 mg 젤라틴이었다. 희석액은 16.6% (w/w)의 젤라틴이었다.
레드 듀록 돼지와 교배된 생후 10개월의 90 kg Large White 한 마리를 연구하기 위해 사용하였다. 동물을 마취시키고, 동물 등쪽의 좌측부 및 우측부 각각에 7개의 외과적 자상을 만들었다. 좌측부는 임상 관찰용으로 및 우측부는 조직학적 분석을 위해 사용되었다. 타원형 피부 조각을 제거하였다. 전기 지짐기를 사용하여 상처 바닥에 대한 열 손상을 추가하여, 외상 및 가능한 흉터를 보강시켰다. 임의로 개입하기 전에, 자상 에지에 근접하기 위해 하나의 봉합을 자상의 중간에 배치하였다. 두 개의 추가 봉합을 자상의 중간부 위 아래에 대략 1 cm로 배치하였다. 1 내지 2 mm 상처 개방 부위가 보여질 수 있고 봉합은 너무 단단히 폐쇄되지 않도록, 봉합을 배치하였다.
아래 표는 상처와 치료 요법을 설명한다.
Figure pct00012
결과:
흉터 처리 피부과 의사 전문가에 의해 모든 병변을 블라인드로 평가하였다. 그의 관찰에 따라, 대조군(그룹 7)과 초기 단계 주입(그룹 1 및 그룹 2)에 비해, 그룹 3 내지 그룹 6은 상당히 우수한 거시적 결과를 입증했다.
수술 후 3 내지 20일 시점에서, 가교성 젤라틴 발포체로 개방된 상처를 처리하는 것이 흉터 형성을 방지하는 데 유익함을 나타냈다. 또한, 0일차에 발포체로 상처를 처리하는 것은 유익하지 않음을 또한 나타냈다.
도 7a 내지 도 7d는 각각 그룹 1, 4, 6 및 7로부터 상처 형성 후 150일 이후의 형성된 흉터를 나타낸다.
실시예 16: 생체내 물질 안정성 손실 없이, 가교 결합된 젤라틴 조성물과 히알루론산(HA)의 혼합
다음 젤라틴은 Gelita 275 블룸, A형의 돼지 젤라틴(Gelita, Sioux City) 의료 등급 저 내독성, Superfine 사에 의해 제트 밀링된 입자 사이즈 범위: d(0.1)=4.24 um, d(0.5)= 16.61 um, d(0.9)=31.51 um을 지칭한다. 다음의 mTG는 ACTIVA WM(아지노모토, 도쿄), 100 U/gm의 활성 수준을 갖는 분말을 지칭한다. mTG는 1% 효소 및 99% 말토덱스트린을 함유한다. 젤라틴 입자의 크기를 감소시키고 입자 분포 범위를 좁히기 위해, 100 마이크론 메쉬를 사용하여 미분화된 젤라틴 분말을 스크리닝하였다(더 큰 입자를 차단함). 젤라틴 및 mTG 미분화된 분말을 감마 방사선 9.38 KGray (소르반, 이스라엘)을 사용하여 멸균시켰다.
레드 듀록 돼지와 교배된 생후 10개월의 90 kg Large White 한 마리를 연구하기 위해 사용하였다. 동물을 마취시키고 테스트 조성물(1.5 mL 희석액)을 1 U mTG / 10 mg 젤라틴을 이용해 8% 젤라틴 %w/w에 상응하는 콜라겐 생성에 대해 테스트하였다. 화합물을 주입하기 전에, 1 ml의 히알루론산(Belotero soft)을 주사기에 첨가하고 다시 혼합하였다. 상기 물질을 21 게이지 바늘을 사용하여 피하 내로 주입하였다.
결과:
도 12는, 조직의 헤마톡실린 및 에오신 염색된 조직 병리학적 부위가 주입 후 대식 세포 및 대세포의 존재를 입증하는 것을 나타낸다. 물질의 잔여물이 보일 수 있으며, 전반적으로 양호한 생체 적합성 결과를 제공하고, 상기 물질은 pH 영향 효소에 의한 젤라틴 가교 결합을 손상시키지 않으면서 히알루론산으로 주입될 수 있음을 나타낸다.
결론: 미생물 트랜스글루타미나제에 의한 젤라틴 가교 결합된 조성물은 HA로 만들어진, 다른 인기 있는 진피 필러와 함께 주입될 수 있다.
실시예 17: 가교 결합된 젤라틴을 프로 콜라겐 I형으로 염색한 돼지 생체내 모델의 150일 추적 연구
다음 젤라틴은 Gelita 275 블룸, A형의 돼지 젤라틴(Gelita, Sioux City) 의료 등급 저 내독성, Superfine 사에 의해 제트 밀링된 입자 사이즈 범위: d(0.1)=4.24 um, d(0.5)= 16.61 um, d(0.9)=31.51 um을 지칭한다. 다음의 mTG는 ACTIVA WM(아지노모토, 도쿄), 100 U/gm의 활성 수준을 갖는 분말을 지칭한다. mTG는 1% 효소 및 99% 말토덱스트린을 함유한다. 젤라틴 입자의 크기를 감소시키고 입자 분포 범위를 좁히기 위해, 100 마이크론 메쉬를 사용하여 미분화된 젤라틴 분말을 스크리닝하였다(더 큰 입자를 차단함). 젤라틴 및 mTG 미분화된 분말을 감마 방사선 9.38 KGray (소르반, 이스라엘)을 사용하여 멸균시켰다.
레드 듀록 돼지와 교배된 생후 10개월의 90 kg Large White 한 마리를 연구하기 위해 사용하였다. 동물을 마취시키고 테스트 조성물(1.5 mL 희석액)을 1 U mTG / 10 mg 젤라틴으로 12.5% 젤라틴 %w/w에 상응하는 콜라겐 생성에 대해 테스트하였다. 21 게이지 바늘을 사용하여 상기 물질을 5x5 cm 영역의 피하로 주입하였다. 생검은 주입 후 15일, 30일, 90일 및 150일 시점에 취해졌으며, 프로콜라겐 I형 항체 abeam 64409로 염색되었다.
결과: 도 13의 a 내지 d는 주입 후 염색된 프로콜라겐 I형 세포를 예시한다. 프로콜라겐 I형 세포는 주입 후 15일 및 30일 시점에 주로 염색된다. 일부 염색은 주입 후 90일 시점에서도 볼 수 있다. 주입 후 150일 시점에서 염색은 볼 수 없다.
결론: mTG 가교 결합된 젤라틴 조성물은 프로콜라겐 I형의 제조를 통해 콜라겐 I형의 생성을 유도할 수 있다. 주입 후 약 30일 시점에서 피크이고, 주입 후 150일에서 진정된다.
실시예 18: 가교 결합된 젤라틴과 정제된 mTG는 콜라겐 생성을 유도할 수 있다.
다음 젤라틴은 Gelita 275 블룸, A형의 돼지 젤라틴(Gelita, Sioux City) 의료 등급 저 내독성, Superfine 사에 의해 제트 밀링된 입자 사이즈 범위: d(0.1)=4.24 um, d(0.5)= 16.61 um, d(0.9)=31.51 um을 지칭한다. 정제되고, 대장균 성장된 재조합 mTG를 25 mM 트리스-아세테이트 pH 6.5, 300 mg/mL 말토덱스트린 "Formula 204"로부터 동결 건조시키거나, 정제된 mTG를 25 mM 트리스-아세테이트 pH 6.5 "Formula 203"로부터 동결 건조시켰다. 천연 mTG는 ACTIVA WM(아지노모토, 도쿄), 100 U/gm의 활성 수준을 갖는 분말을 지칭한다. 효소 활성을 Zedira GmbH Z009로부터 구매한 히드록시메이트 분석 키트를 사용하여 측정하였다.
젤라틴 입자의 크기를 감소시키고 입자 분포 범위를 좁히기 위해, 100 마이크론 메쉬를 사용하여 미분화된 젤라틴 분말을 스크리닝하였다(더 큰 입자를 차단함). 젤라틴 및 mTG 미분화된 분말을 감마 방사선 9.38 KGray (소르반, 이스라엘)을 사용하여 멸균시켰다.
레드 듀록 돼지와 교배된 생후 10개월의 90 kg Large White 한 마리를 연구하기 위해 사용하였다. 동물을 마취시키고 테스트 조성물(1.5 mL 희석액)을 1 U mTG / 10 mg 젤라틴으로 12.5 및 14% 젤라틴 %w/w에 상응하는 콜라겐 생성에 대해 테스트하였다. 21 게이지 바늘을 사용하여 상기 물질을 5x5 cm 영역의 피하로 주입하였다. 주입 후 30일 시점에서 생검을 취하였다.
결과:
도 14는 콜라겐 생성을 보여주는 Masson의 트리크롬 염색(좌측)과 헤마톡실린 및 에오신 염색(우측)을 나타낸다. 콜라겐 생성 및 면역 반응은, Activa-WM mTG를 함유하는 천연 제조법과 견줄만 하였다.
실시예 19: 보다 느린 젤화 시간과 더 치밀화된 임플란트(더 적은 기포)를 달성하기 위한 젤라틴, mTG 및 우레아의 혼합.
다음 젤라틴은 Gelita 275 블룸, A형의 돼지 젤라틴(Gelita, Sioux City) 의료 등급 저 내독성, Superfine 사에 의해 제트 밀링된 입자 사이즈 범위: d(0.1)=4.24 um, d(0.5)= 16.61 um, d(0.9)=31.51 um을 지칭한다. 다음의 mTG는 ACTIVA WM(아지노모토, 도쿄), 100 U/gm의 활성 수준을 갖는 분말을 지칭한다. mTG는 1% 효소 및 99% 말토덱스트린을 함유한다. 젤라틴 입자의 크기를 감소시키고 입자 분포 범위를 좁히기 위해, 100 마이크론 메쉬를 사용하여 미분화된 젤라틴 분말을 스크리닝하였다(더 큰 입자를 차단함). 젤라틴 및 mTG 미분화된 분말을 감마 방사선 9.38 KGray (소르반, 이스라엘)을 사용하여 멸균시켰다.
우레아는 Sigma Aldrich로부터 구입하였다.
PBS 및 0, 1, 2, 4 M 우레아를 함유하는 용액을 제조하였다.
이러한 용액 1.5 ml를 주사기에 로딩하고, 1:1인 젤라틴:mTG(총 500 mg)의 혼합물을 함유한 다른 주사기에 연결하여 발포체를 생성하였다.
결과:
혼합 후, 발포체를 37℃에서 인큐베이션하고 젤화 시간(혼합물이 90°로 뒤집힐 경우 흐르지 않고, 안정적일 때까지의 시간) 및 가교 결합 시간(55°C 수조 내에 삽입되는 경우 젤라틴:mTG 혼합물이 안정적일 때까지의 시간)을 측정하였다. 우레아의 농도가 증가함에 따라, 젤화 시간 및 가교 결합 시간은 증가하였다(30분 후조차도 가교 결합은 4 M 우레아에서 달성되지 않았다). 결과는, 우레아를 첨가하면 발포체의 주입성을 증가시킬 수 있고 의사의 작업 시간을 (특히 얇은 바늘을 통해) 개선할 수 있음을 보여준다. 이는, 수화된 젤라틴의 물리적 젤화 시간의 지연과 또한 효소 활성의 억제에 기인하기 때문이다. 또한, 우레아는 발포체 내에서 기포의 양을 감소시켰고, 많은 주입양에서 발포체의 많은 양을 응집성 하이드로젤로 파열시킴을 또한 주목할 수 있다.
본 문서 전반에 걸쳐 인용된 문헌은 본원에 전체가 참고로 포함된다. 본 발명의 다양한 양태가 실시예 및 바람직한 구현예를 참조하여 위에서 예시되었지만, 본 발명의 범주는 전술한 설명에 의해서가 아니라, 특허법의 원칙에 따라 적절히 해석되는 하기 청구범위에 의해 정의된다는 것을 이해할 것이다.

Claims (35)

  1. 조성물로서,
    상기 조성물은 다공성 스캐폴드이고,
    상기 스캐폴드의 기공은 1 내지 500 μm이고, 상기 조성물은,
    콜라겐 및 젤라틴으로 이루어진 군으로부터 선택된 가교성 단백질;
    상기 가교성 단백질의 가교 결합을 유도하는 가교제; 및
    액체를 포함하는 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 액체는 생리학적 완충액인, 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 발포체인, 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 가교성 단백질은, 5 내지 200 μm의 평균 입자 크기를 갖는 미분화된 단백질 분말로서 상기 조성물 내에 도입되는, 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 가교성 단백질은 200 내지 300 블룸의 젤라틴을 포함하는, 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 가교성 젤라틴은 0.5% w/w 내지 25% w/w 범위로 조성물 내에 존재하는, 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 상기 가교제는 트랜스글루타미나제인, 조성물.
  8. 제1항에 있어서, 상기 가교제는 정제된 트랜스글루타미나제인, 조성물.
  9. 제1항에 있어서, 상기 가교제는 미생물 트랜스글루타미나제인, 조성물.
  10. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 환자의 피부 결함 치료를 필요로 하는 부위에서, 환자에게 인시츄로 형성되는, 조성물.
  11. 제1항에 있어서, 상기 조성물은, 환자의 피부 결함 치료를 필요로 하는 부위에서, 환자에게 도입되기 전에 형성되는, 조성물.
  12. 제1항에 있어서, 상기 조성물은, 환자의 피부 콜라겐 재생을 필요로 하는 부위에서, 환자에게 도입되기 전에 형성되는, 조성물.
  13. 제1항에 있어서, 상기 가교성 단백질의 양은, 다공성 스캐폴드의 형성시 약 0.5 내지 10 KPa의 영률을 갖는 다공성 스캐폴드가 형성되도록 하기에 충분한 양인, 조성물.
  14. 제1항에 있어서, 상기 가교성 단백질의 양은, 다공성 스캐폴드의 형성시 원래 길이의 5배 미만의 신장률을 갖는 다공성 스캐폴드가 형성되도록 하기에 충분한 양인, 조성물.
  15. 제1항에 있어서, 상기 가교제의 양은, 다공성 스캐폴드의 형성시 약 0.5 내지 10 KPa의 영률을 갖는 다공성 스캐폴드가 형성되도록 하기에 충분한 양인, 조성물.
  16. 제1항에 있어서, 상기 가교제의 양은, 다공성 스캐폴드의 형성시 원래 길이의 5배 미만의 신장률을 갖는 다공성 스캐폴드가 형성되도록 하기에 충분한 양인, 조성물.
  17. 조성물로서,
    콜라겐 및 젤라틴으로 이루어진 군으로부터 선택된 가교성 단백질;
    상기 가교성 단백질의 가교 결합을 유도하는 가교제;
    액체; 및
    히알루론산을 포함하되,
    상기 조성물은 1 내지 500 μm의 기공 크기를 갖는 다공성 스캐폴드인, 조성물.
  18. 조성물로서,
    가교성 젤라틴
    (상기 가교성 젤라틴은, 5 내지 200 μm의 입자 크기를 갖는 미분화된 젤라틴 분말이고,
    상기 가교성 젤라틴은 200 내지 300 블룸이고,
    상기 가교성 젤라틴은 0.5 % w/w 내지 25 % w/w 범위임);
    상기 가교성 젤라틴의 가교 결합을 유도하는 트랜스글루타미나제
    (상기 트랜스글루타미나제는 0.0001% w/w 내지 2% w/w 범위임); 및
    액체를 포함하되,
    상기 조성물은 1 내지 500 μm의 기공 크기를 갖는 다공성 스캐폴드인, 조성물.
  19. 제18항에 있어서, 상기 액체는 생리학적 완충액인, 조성물.
  20. 제18항에 있어서, 상기 조성물은 발포체인, 조성물.
  21. 제18항에 있어서, 상기 조성물은 환자의 피부 결함 치료를 필요로 하는 부위에서, 환자에게 인시츄로 형성되는, 조성물.
  22. 제18항에 있어서, 상기 조성물은 환자의 피부 결함 치료를 필요로 하는 부위에서, 환자에게 도입되기 전에 형성되는, 조성물.
  23. 제18항에 있어서, 상기 조성물은 환자의 피부 콜라겐 재생을 필요로 하는 부위에서, 환자에게 도입되기 전에 형성되는, 조성물.
  24. 제18항에 있어서, 상기 가교성 젤라틴의 양은, 다공성 스캐폴드의 형성시 약 0.5 내지 10 KPa의 영률을 갖는 다공성 스캐폴드가 형성되도록 하기에 충분한 양인, 조성물.
  25. 제18항에 있어서, 상기 가교성 젤라틴의 양은, 다공성 스캐폴드의 형성시 원래 길이의 5배 미만의 신장률을 갖는 다공성 스캐폴드가 형성되도록 하기에 충분한 양인, 조성물.
  26. 제18항에 있어서, 상기 트랜스글루타미나제의 양은, 다공성 스캐폴드의 형성시 약 0.5 내지 10 KPa의 영률을 갖는 다공성 스캐폴드가 형성되도록 하기에 충분한 양인, 조성물.
  27. 제18항에 있어서, 상기 트랜스글루타미나제의 양은, 다공성 스캐폴드의 형성시 원래 길이의 5배 미만의 신장률을 갖는 다공성 스캐폴드가 형성되도록 하기에 충분한 양인, 조성물.
  28. 피부 조직에서의 피부 결함 치료 또는 콜라겐 보강을 필요로 하는 환자에게 피부 결함을 치료하거나 콜라겐을 보강하는 방법으로서,
    상기 환자의 조직 결함 부위에 제18항의 조성물을 피부를 치료하기에 충분한 양으로 도입하는 단계를 포함하되,
    상기 조성물은 상기 결함 부위의 조직에 부착되는, 방법.
  29. 피부 결함의 치료 또는 피부 콜라겐의 보충 또는 피부 섬유아세포를 활성화시켜 새로운 콜라겐 섬유의 생성을 필요로 하는 환자에게, 피부 결함을 치료하거나 피부 콜라겐을 보충하거나 피부 섬유아세포를 활성화시켜서 새로운 콜라겐 섬유를 생성하는 방법으로서,
    상기 환자의 조직 결함 부위에 제18항의 조성물을 피부를 치료하기에 충분한 양으로 형성하는 단계를 포함하되,
    상기 조성물은 상기 결함 부위의 조직에 부착되고,
    상기 조성물은 섬유아세포 부착 및 콜라겐 합성을 촉진하도록 구성되는, 방법.
  30. 제28항 또는 제29항에 있어서, 상기 조성물은, 다공성 스캐폴드의 형성시 약 0.5 내지 10 KPa의 영률을 갖는 다공성 스캐폴드가 형성되도록 하기에 충분한 양의 가교성 젤라틴과 트랜스글루타미나제를 갖는, 방법.
  31. 제28항 또는 제29항에 있어서, 상기 조성물은, 다공성 스캐폴드의 형성시 원래 길이의 5배 미만의 신장률을 갖는 다공성 스캐폴드가 형성되도록 하기에 충분한 양의 가교성 젤라틴과 트랜스글루타미나제를 갖는, 방법.
  32. 제28항 또는 제29항에 있어서, 상기 조성물은 적용 부위에서 조직 내인성 콜라겐 생성을 유도하는, 방법.
  33. 제28항 또는 제29항에 있어서, 상기 조성물은 적용 부위에서 조직 내인성 프로-콜라겐 생성을 유도하는, 방법.
  34. 제28항 또는 제29항에 있어서, 상기 조성물은 적용 부위에서 조직 내인성 I형 콜라겐 생성을 유도하는, 방법.
  35. 제28항 또는 제29항에 있어서, 상기 조성물은 적용 부위에서 조직 내인성 콜라겐 생성을 유도하고,
    상기 조성물의 적어도 80%가 3개월 후에 분해되는, 방법.
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Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2019079672A1 (en) 2017-10-19 2019-04-25 Lifecell Corporation ACELLULAR TISSUE MATRIX PRODUCTS FLUIDS AND METHODS OF PRODUCTION
US11998654B2 (en) 2018-07-12 2024-06-04 Bard Shannon Limited Securing implants and medical devices
WO2020247822A1 (en) * 2019-06-07 2020-12-10 Lifecell Corporation Coated polymeric material
WO2020247793A1 (en) * 2019-06-07 2020-12-10 Lifecell Corporation Injectable mesh
CN110591126A (zh) * 2019-09-20 2019-12-20 西安交通大学 一种可注射磁性水凝胶及其制备方法
CN112870453B (zh) * 2020-07-07 2022-01-07 深圳市第二人民医院(深圳市转化医学研究院) 一种明胶-iii型胶原蛋白水凝胶以及制备方法和应用
CN113941031B (zh) * 2021-10-09 2023-04-07 昆明理工大学 一种程序性释放no促血管生成多肽水凝胶的制备方法
WO2024053602A1 (ja) * 2022-09-06 2024-03-14 国立研究開発法人物質・材料研究機構 多孔質シート、組織接着膜、これらの止血剤もしくは癒着防止材としての使用、およびこれらの製造方法

Family Cites Families (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4530905A (en) 1984-10-25 1985-07-23 The Dow Chemical Company Crosslinked gelatin foams
WO2003007786A2 (en) 2001-07-16 2003-01-30 Depuy Products, Inc. Porous delivery scaffold and method
GB0420091D0 (en) * 2004-09-10 2004-10-13 Univ Nottingham Trent Medical implant materials
US8133484B2 (en) 2006-12-15 2012-03-13 Lifebond Ltd Hemostatic materials and dressing
JP5581056B2 (ja) 2006-12-15 2014-08-27 ライフボンド リミテッド ゼラチン−トランスグルタミナーゼ止血ドレッシング及びシーラント
JP5450612B2 (ja) * 2008-06-18 2014-03-26 ライフボンド リミテッド 改良された架橋組成物
US20110112573A1 (en) * 2008-06-18 2011-05-12 Orahn Preiss Bloom Methods and devices for use with sealants
AU2014201672B2 (en) 2008-06-18 2015-05-21 Lifebond Ltd Improved cross-linked compositions
US9943302B2 (en) 2008-08-12 2018-04-17 Covidien Lp Medical device for wound closure and method of use
WO2010076798A1 (en) 2009-01-02 2010-07-08 Ramot At Tel Aviv University Ltd. Fibrin and fibrinogen matrices and uses of same
US8617206B2 (en) * 2009-10-08 2013-12-31 Covidien Lp Wound closure device
EP2515957B1 (en) * 2009-12-22 2015-07-29 Lifebond Ltd Modification of enzymatic crosslinkers for controlling properties of crosslinked matrices
US8961544B2 (en) 2010-08-05 2015-02-24 Lifebond Ltd. Dry composition wound dressings and adhesives comprising gelatin and transglutaminase in a cross-linked matrix
GB201014388D0 (en) 2010-08-31 2010-10-13 Fujifilm Mfg Europe Bv Biocompatible compositions for tissue augmentation
JP7442969B2 (ja) 2015-04-03 2024-03-05 バイオチェンジ・リミテッド 架橋タンパク質泡を発生するための粉末組成物およびその使用方法
US20200016295A1 (en) 2018-07-12 2020-01-16 Lifebond, Ltd. Injectable scaffolds for soft tissue repair

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