ES2255707T3 - Uso de una membrana a base de colageno para preparar un implante destinado a la regeneracion guiada de tejidos. - Google Patents
Uso de una membrana a base de colageno para preparar un implante destinado a la regeneracion guiada de tejidos.Info
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Abstract
LA INVENCION SE REFIERE A UNA MEMBRANA DE COLAGENO REABSORBIBLE PARA USARSE EN LA REGENERACION GUIADA DE TEJIDOS, SIENDO FIBROSA UNA CARA DE LA CITADA MEMBRANA Y PERMITIENDO CON ELLO QUE CREZCAN LAS CELULAS SOBRE ELLA, Y SIENDO SUAVE LA CARA OPUESTA DE LA CITADA MEMBRANA, INHIBIENDO DE ESTA FORMA LA ADHESION DE CELULAS SOBRE ELLA. UNA MEMBRANA DE ESTE TIPO ES ESPECIALMENTE UTIL PARA EL TRATAMIENTO DE HERIDAS Y LESIONES.
Description
Uso de una membrana a base de colágeno para
preparar un implante destinado a la regeneración guiada de
tejidos.
La presente invención se refiere a la
cicatrización de heridas y en particular a la utilización de una
membrana que contiene colágeno en la regeneración guiada de
tejidos.
En cualquier situación, por ejemplo tras una
operación quirúrgica, especialmente tras cirugía oral o dental, en
las que resulta deseable la cicatrización de las heridas, ha
demostrado ser difícil proporcionar condiciones que eviten el
crecimiento de otros tejidos hacia el interior del área en la que se
requiere la regeneración. De esta manera, por ejemplo en el caso de
la extracción de una parte sustancial de una raíz dental por caries
o por una enfermedad, resulta deseable que se produzca la
regeneración de hueso sano en sustitución del tejido óseo extraído.
Sin embargo, se ha descubierto que la cavidad dejada por la
extracción del hueso se ve rápidamente rellenada por tejido
conectivo y que este crecimiento hacia dentro de tejido conectivo
impide efectivamente la regeneración ósea.
Con el fin de resolver dichas dificultades, se ha
desarrollado la técnica conocida como "regeneración ósea
guiada". En este procedimiento, se inserta quirúrgicamente una
membrana alrededor de la periferia de la cavidad de la herida. La
membrana impide o dificulta la invasión de la cavidad de la herida
por tipos celulares no deseados y permite de esta manera que las
células preferidas crezcan hacia el interior de la cavidad,
cicatrizando de esta manera la
herida.
herida.
En la actualidad se utilizan dos tipos de
membrana en la regeneración guiada de tejidos:
1) Membranas sintéticas de PTFE no reabsorbibles,
tales como Goretex (marca comercial), y
2) Membranas sintéticas reabsorbibles formadas a
partir de copolímeros de glicólido y láctido.
Sin embargo, ambos tipos de membrana adolecen de
graves desventajas. La membrana de PTFE, aunque muestra
características adecuadas de porosidad, resistencia y flexibilidad,
sigue siendo no reabsorbible y por lo tanto se requiere una segunda
operación quirúrgica para extraerla. La necesidad de procedimientos
quirúrgicos adicionales puede resultar traumática para el paciente
y también puede dañar el nuevo tejido regenerado, extendiendo de
esta manera el periodo de tratamiento.
El segundo tipo de membrana se teje a partir de
fibras de copolímero de glicólido y láctido. Aunque este tipo de
membrana es reabsorbible, los productos de descomposición son
irritantes y esta irritación puede presentar efectos no deseables
sobre el paciente.
Ambos tipos de membrana de la técnica anterior
actúan como filtros, permitiendo el libre paso de líquidos y
formando una barrera a las células. Sin embargo, la superficie de
las membranas no resulta un ambiente favorable para las células, es
decir, no estabiliza los coágulos sanguíneos ni presta soporte al
crecimiento celular. En consecuencia, ninguna de dichos tipos de
membrana de la técnica anterior proporciona condiciones óptimas
para el crecimiento celular ni para la cicatrización de heridas.
Tanto en el ser humano como en los animales,
determinadas membranas que rodean a órganos importantes y que
separan diferentes tejidos y células están constituidas de colágeno.
Entre los ejemplos de estas membranas se encuentran, a escala
macroscópica, las membranas del pericardio y la membrana
placentaria, y a escala microscópica, las membranas basales.
En la actualidad se utilizan ampliamente en
medicina los productos de colágeno. Se encuentran disponibles una
variedad de materiales de colágeno, incluyendo colágeno soluble,
fibras de colágeno, esponjas, membranas e implantes óseos,
permitiendo usos diversos de este material, por ejemplo en fibras y
esponjas de colágeno para la hemostasis, membranas de colágeno para
la cobertura de heridas o para implantes, y las inyecciones de
colágeno soluble en la cirugía plástica.
En la técnica anterior se han descrito y
propuesto diversas membranas artificiales que contienen colágeno
para el vendaje o cobertura de heridas. De esta manera, en la
patente WO nº A-8808305 (The Reagents of The
University of California), se describe un sustituto compuesto de
piel que consiste en una capa de células epidérmicas humanas junto
a una capa de una membrana biosintética que puede estar formada de
colágeno y mucopolisacáridos. Sin embargo, la parte de
colágeno/mucopolisacárido es totalmente de textura uniforme y no
muestra las propiedades de la membrana propuesta en la presente
memoria para la regeneración guiada de tejidos. Además, dichas
membranas son fuertemente inmunorreactivas y únicamente pueden
utilizarse en el donante de las células. En el documento DE nº
A-2631909 (Massachusetts Institute of Technology) se
describe otra membrana artificial que contiene colágeno. Esta
membrana consiste en un mínimo de dos capas, siendo la primera capa
una combinación de colágeno y mucopolisacáridos, y la segunda capa,
un polímero sintético, tal como un poliacrilato. Sin embargo, esta
membrana es totalmente no reabsorbible, estando la capa de colágeno
tan fuertemente reticulada internamente que la reabsorción no puede
producirse.
\newpage
El documento EP nº A-0331786
(Chemokol Gesellschaft zur Entwicklung von Kollagenprodukten)
describe un procedimiento para la preparación de membranas de
colágeno para su utilización en la hemostasis, en el vendaje de
heridas y como material de implante. Las membranas están diseñadas
para presentar una superficie de hinchado rápido y una estructura
suelta similar a una esponja que facilite la detención de la
hemorragia en situaciones en las que la sangre se escapa bajo
presión.
El documento DE nº A-3607075
(American Hospital Supply Corp.) se refiere a un procedimiento para
el tratamiento de las fracturas óseas en las que se aplica tejido
bioprostético a la superficie de hueso alrededor de una fractura
con el fin de prevenir la formación de adhesiones fibrosas entre el
hueso en cicatrización y los tejidos corporales circundantes. El
tejido bioprostético puede ser una membrana de colágeno que presente
caras opuestas lisas y fibrosas. En estas formas de realización la
cara fibrosa puede colocarse contra la superficie ósea con el fin
de permitir un mejor anclaje a la misma; la cara lisa proporciona de
esta manera una superficie externa ventajosamente lubricada. El
tejido bioprostético no participa en el proceso de cicatrización
que tiene lugar entre los extremos fracturados bajo la superficie
del hueso y preferentemente se trata para que sea sustancialmente
resistente a la calcificación, es decir para que inhiba cualquier
crecimiento de tejido óseo hacia el interior del tejido
bioprostético.
El documento WO nº A-9013302
(Brigham and Women's Hospital) da a conocer material reabsorbible
para la utilización en la regeneración guiada de tejidos, que
comprende membranas de colágeno que incluyen una o más sustancias
biológicamente activas, tales como fármacos, hormonas, factores de
crecimiento, péptidos o proteínas.
El documento WO nº A-9302718
(Colectica) da a conocer membranas de colágeno reticulado de
bioabsorción lenta que contienen glicosaminoglicano para la
utilización en la regeneración guiada de tejidos.
La presente invención se basa en el
descubrimiento de que las membranas de colágeno que se derivan
directamente de membranas de origen natural y que, hasta donde sea
posible, conservan sus estructuras de colágeno natural, forman
membranas con características ideales para la regeneración guiada de
tejidos.
De acuerdo con lo anterior, la invención
proporciona la utilización de una membrana de colágeno
fisiológicamente aceptable y reabsorbible que se obtiene mediante
purificación de una membrana de colágeno natural de manera que
conserva sustancialmente su estructura de colágeno natural y que
presenta caras opuestas fibrosa y lisa, en la manufacturación de un
implante de regeneración guiada de tejidos para la orientación en
el cuerpo de un ser humano o de un animal no humano de manera que
dicha cara fibrosa se encuentre encarada hacia el área de dicho
cuerpo en el que se requiere la regeneración de tejidos y permita el
crecimiento celular sobre la misma, y dicha cara opuesta, de
superficie lisa, inhiba la adhesión celular sobre sí misma y actue
como barrera que evite el paso de células a través de la
membrana.
Los dos lados o caras opuestas de la membrana
presentan diferentes texturas que afectan al crecimiento celular de
maneras diferentes. De esta manera, la cara lisa actúa como barrera
o filtro que impide el crecimiento hacia adentro de células e
impide que tipos celulares no deseables colonicen la cavidad
descrita por la membrana al separarla físicamente. En contraste, el
lado fibroso de la membrana es hemostático (estabiliza los coágulos
sanguíneos) y ayuda al crecimiento celular al proporcionar un
soporte adecuado para las nuevas células. Por este motivo la
membrana debe insertarse con el lado liso orientado hacia afuera y
el lado fibroso enfrentado a las células donde se desea la
regeneración.
Debido a su origen natural, la membrana para la
utilización en la presente invención es totalmente reabsorbible en
el cuerpo y no forma productos tóxicos de degradación.
Además, la membrana presenta una resistencia al
desgarro y a la propagación del desgarro que resultan comparables a
las de un material textil tanto en estado mojado como seco. Por lo
tanto, la membrana puede suturarse quirúrgicamente si resulta
necesario. El material de membrana es fuertemente hidrófilo y
presenta una buena adherencia cuando se encuentra mojado,
permitiendo apilar varias capas. En estado húmedo, el material es
muy elástico, permitiendo cubrir adecuadamente heridas de forma
irregular o de superficie no lisa.
Entre los orígenes naturales de las membranas de
colágeno se incluyen las secciones de piel animal con una cara de
pelo, los tendones, diversas membranas animales, etc. Una fuente
preferente de membrana es la membrana peritoneal de origen natural,
especialmente la procedente de un ternero o lechón. Las membranas
peritoneales procedentes de lechones de 6 a 7 semanas de edad (de
peso entre 60 y 80 kg) resultan especialmente preferentes.
El material de membrana fisiológicamente
aceptable para la utilización de acuerdo con la presente invención
debe consistir preferentemente de colágeno puro, nativo (es decir,
no desnaturalizado) e insoluble. Sin embargo, en el cuerpo de un
animal, el colágeno se encuentra acompañado de varias sustancias que
presentan propiedades no deseables químicas, físicas y/o
fisiológicas. Por lo tanto, el colágeno debe liberarse de estas
sustancias mediante purificación. Debido a que la naturaleza de
estas sustancias varía considerablemente, la purificación
enzimática resulta prácticamente imposible. De esta manera, resulta
preferente llevar a cabo la purificación químicamente, procurando
minimizar cualquier alteración de la estructura química del colágeno
y mantener de esta manera sus propiedades originales nativas.
De acuerdo con una forma de realización
preferente de la presente invención, la membrana fisiológicamente
aceptable requerida se prepara sometiendo una membrana de colágeno
de mamífero que presenta una cara lisa y una cara fibrosa, a
tratamiento con álcali para saponificar las grasas y eliminar las
sustancias sensibles a álcali y seguidamente a acidificación para
eliminar las sustancias sensibles a ácido, seguido del lavado,
secado, desgrasado y opcionalmente, reticulado.
Durante la purificación, tienen lugar los cambios
siguientes:
- -
- las proteínas no colágenas resultan eliminadas
- -
- los glicosaminoglicanos y proteoglicanos resultan disueltos y eliminados
- -
- las grasas resultan parcialmente saponificadas y totalmente eliminadas.
Durante dicho tratamiento, también pueden tener
lugar los siguientes cambios no deseables:
- -
- la hidrólisis de los grupos amida de la asparagina y de la glutamina
- -
- un desplazamiento del punto isoeléctrico
- -
- la rotura de los enlaces de entrecruzamiento
- -
- la transamidación, con la formación de isopéptidos
- -
- la racemización de los aminoácidos
- -
- la rotura de los enlaces peptídicos.
El nivel de nitrógeno amídico en la membrana
sirve de indicador de dichos cambios. Por ejemplo, se ha
descubierto que si el contenido de nitrógeno amídico cae a
aproximadamente la mitad (es decir, de 0,7 mmoles/g a 0,35
mmoles/g), más del 95% del colágeno todavía se encontrará presente
en su estado nativo. La base de esta medición es la hidrólisis de
los grupos amida en los aminoácidos asparagina y glutamina:
\melm{\delm{\para}{\delm{CO}{\para}}}{C}{\uelm{\para}{\uelm{NH}{\para}}}H -- CH_{2} -- CH_{2} -- CONH_{2} {}\hskip0,2cm NaOH {}\hskip0,2cm
\melm{\delm{\para}{\delm{CO}{\para}}}{C}{\uelm{\para}{\uelm{NH}{\para}}}H -- CH_{2} -- CH_{2} -- COONa + NH_{3}
El grado de purificación del colágeno puede
determinarse mediante análisis de los aminoácidos. El colágeno se
hidroliza para formar aminoácidos, lo que significa que este
análisis indica si el colágeno es puro y si se han eliminado las
proteínas no colágenas pero no si se ha desnaturalizado el
colágeno.
Junto al análisis de los aminoácidos del
colágeno, también puede analizarse el contenido de glicosamina y de
proteoglicanos. Estos contaminantes resultan hidrolizados y el
contenido de glicosamina y hexosamina monoméricas de la membrana se
determina mediante cromatografía. Se ha descubierto que la cantidad
de glicosamina y de galactosamina tras la purificación es de
aproximadamente 1 molécula por cada 10.000 moléculas de
amino-
ácido.
ácido.
En un procedimiento de preparación de las
membranas, las materias primas en primer lugar se tratan con
álcali. Para esta etapa, se utilizan soluciones de NaOH en
concentraciones de entre el 0,2 y el 4% en peso. Las grasas se
saponifican y cualquier proteína acompañante sensible a los álcalis
se elimina junto con cualquier otra sustancia sensible a los
álcalis, tal como glicosaminoglicanos, proteoglicanos, etc. El
procedimiento se controla determinando el nitrógeno amídico. Al
final del tratamiento alcalino, el nivel de nitrógeno amídico debe
encontrarse entre 0,3 y
0,5 mmoles/g.
0,5 mmoles/g.
La segunda etapa es el tratamiento del material
con un ácido inorgánico, habitualmente HCl. Los contaminantes
sensibles a los ácidos resultan eliminados, las fibras se hinchan
mucho y de esta manera se afloja la estructura fibrosa. La
acidificación se continúa hasta que la materia queda acidificada
homogéneamente.
Tras lo anterior, se lava el material. Ha
demostrado ser útil lavar el material hasta que el pH ha cambiado
de valores entre 0,5 y 1,5 (durante la acidificación con HCl) y
valores entre 2,5 y 3,5. El lavado preferentemente se lleva a cabo
con agua destilada.
El material hinchado a continuación puede
nivelarse (dividido) con el fin de conseguir un grosor uniforme.
Entre las etapas adicionales se incluyen una operación de
deshinchado, la neutralización y el lavado profundo del material.
Para ello, en primer lugar el material se trata con una solución
salina común (concentración en peso entre el 5 y el 10%) ácida (pH
entre 2,8 y 3,5). De esta manera, el material se deshincha por
completo. A continuación se lava con un exceso de agua destilada
ligeramente alcalina hasta que el pH del material alcanza valores
entre 5,8 y 6,5. Después, el material se lava en profundidad con
agua destilada (pH 6,0). Con ello se finaliza la primera etapa de
la producción, es decir, la purificación. Seguidamente se lleva a
cabo el secado y el desgrasado.
El material se seca mediante lavado repetido con
acetona. Esto provoca el encogimiento de las fibras de colágeno y,
en consecuencia, queda una estructura abierta. El desgrasado se
lleva a cabo con n-hexano. Ello elimina los últimos
restos de sustancias hidrofóbicas del material.
El grosor seco de la membrana para la utilización
en la regeneración guiada de tejidos de acuerdo con la presente
invención idealmente debe encontrarse entre 0,1 y 1,0 mm, aunque
puede verse influido por el hinchado del material.
De esta manera, la membrana puede dividirse o
seccionarse con el fin de conseguir el grosor deseado, con la
condición de que se mantenga la doble textura de la membrana.
La membrana puede tratarse adicionalmente con el
fin de adaptar sus propiedades para adecuarlas a un tipo particular
de herida. De esta manera, puede reticularse el colágeno de la
membrana con el fin de estabilizarla y reducir su tasa de absorción
por parte del cuerpo.
Pueden utilizarse para las membranas todos los
agentes de entrecruzamiento conocidos hasta el momento y que han
sido utilizados para productos médicos (por ejemplo formaldehído,
glutardialdehído, hexametilendiisocianato,
diciclohexilcarbodiimida, etc.). Físicamente el entrecruzamiento
puede llevarse a cabo mediante la aplicación de calor. En este
caso, el efecto de entrecruzamiento realmente es menor pero resulta
suficiente para la mayoría de aplicaciones. Convenientemente el
colágeno de la membrana se entrecruza físicamente calentando hasta
temperaturas entre 100ºC y 120ºC (durante 30 minutos a 5 horas),
extendiendo de esta manera el tiempo de degradación.
Convenientemente, el grado de entrecruzamiento
introducido será uno con el que la tasa de reabsorción de la
membrana se correlacione con el crecimiento de tejido nuevo y de
cicatrización de la herida. Por ejemplo, los osteocitos tardan
aproximadamente 6 semanas en regenerar una cavidad dental y de esta
manera resultaría adecuada para recubrir este tipo de herida una
membrana que fuese absorbida en un periodo de 8 a 12 semanas.
Evidentemente la membrana no debe encontrarse fuertemente
reticulada, o de otro modo la tasa de absorción sería demasiado
lenta y en casos extremos la membrana llegaría a no ser
reabsorbible.
Otra modificación de la membrana que puede
llevarse a cabo es el recubrimiento o impregnación del lado fibroso
con un glicosaminoglicano (GAG), tal como el ácido hialurónico, el
condroitín sulfato, el dermatán sulfato o el queratán sulfato.
Los glicosaminoglicanos tales como el ácido
hialurónico son importantes como moléculas reguladoras que afectan
a la estructura de los tejidos. Presentan una influencia favorable
sobre:
- -
- la infiltración celular
- -
- la formación y degradación de la matriz de fibrina
- -
- el hinchado de la matriz
- -
- la fagocitosis
- -
- la vascularización
Poco después de producirse la lesión, el
contenido de GAG en una herida se incrementa. El ácido hialurónico
y los GAGs relacionados se unen a la fibrina y forman una matriz
tridimensional (coágulo) que se entrelaza dentro de la matriz de
fibrina. De esta manera, la matriz de fibrina original se deforma,
se hincha y se hace más porosa. Esto permite una mejor y más rápida
infiltración y migración de las células hacia el interior de la
matriz.
El ácido hialurónico y el fibrinógeno reaccionan
específicamente entre sí, incluso si cualquiera de las dos
moléculas se encuentra en estado sólido.
En la etapa inflamatoria de la lesión, el ácido
hialurónico estimula la función de los granulocitos, altera las
propiedades de la superficie de los leucocitos polimorfonucleares y
regula la actividad fagocítica de las células.
Durante la conversión y degradación de la matriz
de fibrina-ácido hialurónico, se producen fragmentos más pequeños
de ácido hialurónico. Los fragmentos pequeños de ácido hialurónico
estimulan la construcción de nuevos vasos sanguíneos.
Además, los GAGs tales como el ácido hialurónico
hacen que el colágeno sea incapaz de provocar una reacción
inmunológica en un animal huésped. Con el fin de conseguir esto, el
colágeno debe reaccionar con por lo menos un uno por ciento en peso
de ácido GAG.
Los GAGs son portadores para las proteínas
estructural y biológicamente activas. Se ha descubierto que el
complejo de proteína-GAG desempeña un papel muy
importante en la curación sin cicatrices que se produce en el
feto.
Por dichos motivos, la impregnación de la
membrana de colágeno con GAGs tales como el ácido hialurónico causa
una mejor regeneración de los tejidos en una herida o lesión
ósea.
Preferentemente, la concentración de GAG se
incrementa en todo el grosor de la membrana, estando la
concentración más elevada de GAG en el lado fibroso de la
membrana.
El material GAG puede introducirse en la membrana
en forma de un gel que se esparce sobre el lado fibroso de la
membrana y después se deja secar. Este enfoque consigue un gradiente
decreciente de concentraciones hacia el interior de la membrana
aunque sin que el GAG atraviese completamente la membrana.
Aunque sin deseo de limitarse a consideraciones
teóricas, se cree que las cadenas de los GAGs de elevado MW (PM)
actúan guiando las nuevas células sobre la superficie de la
membrana, la cual puede entonces actuar como soporte para el
crecimiento celular.
De esta manera, resulta particularmente
beneficioso que el lado fibroso de la membrana se encuentre en la
forma de una matriz compuesta que incluya GAGs.
El ácido hialurónico y otros GAGs se encuentran
presentes naturalmente en el cuerpo, con un contenido de ácido
hialurónico del 19% en la piel y del 13% en el peritoneo (en peso).
Debido a que son sustancias naturales, los GAGs no provocan ningún
problema de toxicidad ni de reabsorción, sino que se cree que actúan
como una sustancia nutricional natural para las células.
El ácido hialurónico y otros GAGs se producen
industrialmente y de esta manera se encuentran fácilmente
disponibles en cantidades comerciales.
Convenientemente, las membranas para la
utilización de acuerdo con la presente invención contienen entre el
0,1 y el 30,0% en peso de un GAG, por ejemplo de ácido hialurónico,
ventajosamente entre el 2 y el 10% en peso.
Si resulta necesario, también pueden incorporarse
en las membranas otros fármacos, tales como antibióticos (por
ejemplo la tetraciclina), fármacos quimioterapéuticos (por ejemplo
la taurolidina) y otros fármacos.
Una aplicación particularmente beneficiosa de las
membranas para la utilización en la regeneración guiada de tejidos
de acuerdo con al invención es tras la cirugía orofacial o dental.
En éstas con frecuencia es importante que tenga lugar la
regeneración ósea, por ejemplo tras la extracción parcial de una
raíz dental o de una sección de mandíbula. La estrechez del área
orofacial complica la cirugía y de esta manera un implante
completamente reabsorbible y no tóxico para la regeneración guiada
de tejidos resulta altamente ventajosa. Además, la naturaleza de la
membrana resulta particularmente adecuada para estimular el
crecimiento de los osteocitos (tejido óseo).
La Figura 1 muestra una membrana de acuerdo con
la presente invención siendo utilizada para la regeneración ósea de
un diente (1) que ha sufrido de una pérdida grave de hueso alrededor
de la raíz (2), resultando en una cavidad (3) normalmente ocupada
por una raíz sana. La raíz (2) sobresale a través de una capa de
tejido conectivo o encía (4) hacia el interior de una cavidad ósea
(5). Con el fin de evitar el crecimiento de tejido conectivo (4)
hacia el interior de la cavidad (3), se coloca una cubierta de
membrana (6) alrededor del margen más externo de la herida. La
membrana (6) se extiende en toda la periferia de la cavidad de la
herida (3). La membrana (3) presenta un lado liso (7) que se encara
hacia afuera de la cavidad (3) y un lado fibroso (8) que se encara
hacia el interior de la cavidad (3). El lado fibroso (8) proporciona
una superficie de soporte para las nuevas células que crecen hacia
afuera desde la raíz (2), mientras que el lado liso (7) de la
membrana (6) evita que las células de tejido conectivo (4) invada la
cavidad de la herida. La membrana (6) resulta lentamente
reabsorbida por el cuerpo, en condiciones óptimas la absorción de la
membrana se correlaciona con el tiempo necesario para la
cicatrización de la herida.
La presente invención puede ilustrarse
adicionalmente por medio del siguiente Ejemplo no limitativo:
Ejemplo
Se separaron las membranas peritoneales de carne
y tejido adiposo por medios mecánicos en terneros jóvenes, se
lavaron bajo agua corriente y se trataron con una solución de NaOH
al 2% durante 12 horas. A continuación, las membranas se lavaron
bajo agua corriente y se acidificaron con HCl al 0,5%. Tras
acidificar el material en todo su grosor (aproximadamente 3 horas),
el material se lavó hasta obtener un pH de 3,5. Después, el material
se encogió con solución salina al 7%, se neutralizó con solución de
NaHCO_{3} al 1% y se lavó bajo agua corriente. Seguidamente, el
material se deshidrató con acetona y se desgrasó con
N-hexano. El contenido de nitrógeno de las amidas
del material era de 0,47 mmoles/g.
(Eastoe, E.; Courts, A.; Practical Analytical
Methods for Connective Tissue Proteins (1963)).
- 1.
- HCl 2 N (160 ml de HCl concentrado enrasado a 1 litro)
- 2.
- Borax 0,05 M -solución de NaOH 0,15 N (19,1 g de Na_{2}B_{4}O_{7}·10H_{2}O) + 6 g de NaOH en 1 litro, enrasado con H_{2}O destilada fría)
- 3.
- Indicador - mezclado en etanol (azul de metileno al 0,33% + rojo de metileno al 0,05%)
- 4.
- Ácido bórico al 1% con el indicador
- 10 g de ácido bórico en 1 litro de H_{2}O destilada fría
- 8 ml de indicador
- 0,7 ml de NaOH 0,1 N
- 5. HCl 0,01 N
- 1.
- Se dispersó 1 g de masa seca de colágeno en 50 ml de HCl 2 N y se sometió a ebullición durante 1 hora. El volumen se enrasó a 50 ml a 20ºC.
- 2.
- 5 ml de la dispersión anterior se introdujo en un matraz microkjehldahl junto con 20 ml de solución 2; la mezcla se destiló en 20 ml de solución 4. La destilación tardó 6 minutos.
- 3.
- La solución se valoró con reactivo 5.
ml de ácido consumido x 20 = % de mmoles de N
amídico
Ejemplo
1,36 ml de HCl 0,01 N x 20 {}\hskip0,4cm= 27,2
% mmoles
{}\hskip4,4cm= 0,27 mmoles/g de N amídico
Claims (17)
1. Utilización de una membrana de colágeno
fisiológicamente aceptable y reabsorbible obtenida mediante
purificación de una membrana de colágeno natural de manera que se
conserva sustancialmente su estructura de colágeno natural y que
presenta lados opuestos fibroso y liso, para la manufacturación de
un implante de regeneración guiada de tejidos para la orientación
en el cuerpo de un ser humano o de un animal no humano, de manera
que dicha membrana se introduce con dicho lado fibroso encarado
hacia el área de dicho cuerpo en el que se requiere la regeneración
de tejidos y se permite el crecimiento celular sobre el mismo, y
dicho lado liso opuesto inhibe la adhesión celular sobre sí mismo y
actúa como barrera que evite el paso de células a través de la
membrana.
2. Utilización según la reivindicación 1, en la
que dicha membrana se deriva de una membrana peritoneal o
pericárdica de mamífero, de membrana placentaria o de membrana
basal.
3. Utilización según la reivindicación 2, en la
que dicha membrana peritoneal se deriva de terneros o lechones.
4. Utilización según la reivindicación 3, en la
que dicha membrana peritoneal se deriva de lechones de 6 a 7
semanas de edad.
5. Utilización según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, en la que dicha membrana se encuentra
sustancialmente libre de grasa.
6. Utilización según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, en la que dicha membrana presenta un grosor
de entre 0,1 y 1,0 mm en estado seco.
7. Utilización según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, en la que el colágeno se encuentra
entrecruzado sin llegar a ser no reabsorbible.
8. Utilización según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7, en la que el lado fibroso de la membrana se
encuentra impregnado con un glicosaminoglicano.
9. Utilización según la reivindicación 8, en la
que el glicosaminoglicano es el ácido hialurónico.
10. Utilización según la reivindicación 8, en la
que el glicosaminoglicano es condroitín sulfato, dermatán sulfato
y/o queratán sulfato.
11. Utilización según cualquiera de las
reivindicaciones 8 a 10, en la que la membrana impregnada contiene
entre el 0,1 y el 30,0% en peso de glicosaminoglicano.
12. Utilización según la reivindicación 11, en la
que la membrana impregnada contiene entre el 2 y el 10% en peso de
glicosaminoglicano.
13. Utilización según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 12, en la que el implante manufacturado
contiene uno o más fármacos.
14. Utilización según la reivindicación 13, en la
que el implante manufacturado contiene taurolidina.
15. Utilización según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 14, en la que el implante manufacturado es
para la regeneración guiada de tejido óseo dentro de dicho
cuerpo.
16. Utilización según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 15, en la que el implante manufacturado es
para la regeneración guiada de tejidos en la región orofacial de
dicho cuerpo.
17. Utilización según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 16, en la que una membrana de colágeno de
mamífero que presenta una cara lisa y una cara fibrosa se somete a
tratamiento con álcali con el fin de saponificar las grasas y
eliminar las sustancias sensibles a álcali y después se acidifica
con el fin de eliminar las sustancias sensibles a ácidos, seguido
del lavado, secado y desgrasado, de manera que se forma la membrana
de colágeno fisiológicamente aceptable y reabsorbible que se
requiere, que conserva sustancialmente su estructura de colágeno
natural.
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