DE10349722A1

DE10349722A1 - Zusammensetzung zur Arthrose-/Arthritisbehandlung, insbesondere von Gelenken

Info

Publication number: DE10349722A1
Application number: DE10349722A
Authority: DE
Inventors: Katharina Beschorner
Original assignee: Beschorner Katharina Dr
Current assignee: TROTT, GEB. BESCHORNER, KATHARINA, DR., 30177 HANN
Priority date: 2003-10-23
Filing date: 2003-10-23
Publication date: 2005-06-16
Also published as: EP1689359A2; WO2005039528A2; AU2004283485B2; US20070020245A1; AU2004283485A1; WO2005039528A3

Abstract

Es wird insbesondere eine Zusammensetzung zur Arthrose-/Arthritisbehandlung, insbesondere von Gelenken, bereitgestellt, enthaltend: DOLLAR A - mindestens eine Trägersubstanz zur Aufnahme mindestens eines anti-inflammatorischen Agens und knorpelaufbauender Zellen, DOLLAR A - mindestens ein anti-inflammatorisches Agens und DOLLAR A - knorpelaufbauende Zellen.

Description

Die Erfindung betrifft eine Zusammensetzung zur Arthrose-/Arthritisbehandlung, insbesondere von Gelenken, bei dem implantierbaren Artikel zur Arthrose-/Arthritisbehandlung, insbesondere von Gelenken, diverse Verwendungen sowie ein Arthrose-/Arthritisbehandlungsmittel und einen Arthrose-/Arthritisbehandlungskit.
Verletzungen des Knorpels, des Knies oder anderer Gelenke resultieren oft aus abnorm hohen mechanischen Belastungen, die die entsprechende Gewebematrix deformieren. Die auf das Gelenk applizierten Belastungen können das Kollagen-Netzwerk in der Matrix zerbrechen und die Festigkeit des Gewebes herabsetzen.
Knorpelverletzungen sind schwierig zu behandeln, da artikulärer Knorpel eine beschränkte Kapazität zur Regeneration bei entsprechender Verletzung aufweist. Typ II-Kollagen ist das Hauptstrukturprotein der extrazellulären Matrix im artikulären Knorpel. Typ II-Kollagen, das ähnlich zu anderen Kollagentypen ist, besteht aus drei Kollagen-Polypeptiden, die eine dreifache Helixkonfiguration bilden. Die Polypeptide sind ineinander verschlungen und weisen am jeweiligen Ende Telopeptidregionen auf, die die Verbindung zwischen den Kollagen-Polypeptiden bereitstellen. Kollagenmatrizen in deren natürlichem Zustand weisen zahlreiche vernetzte Dreifach-Helices auf, wobei die einzelnen Moleküle ein Molekulargewicht von ungefähr 300.000 Dalton aufweisen. Typ II-Kollagen wird hauptsächlich ausschließlich in tierischem Knorpel gefunden, während andere Kollagentypen in menschlicher Haut, Membranen und Knochen gefunden werden.
Exzessiver Abbau von Typ II-Kollagen in den äußeren Schichten von Knorpeloberflächen von Gelenken wird ebenso durch Osteoarthrose-/arthritis verursacht. Das Kollagen-Netzwerk wird entsprechend geschwächt, wobei sich anschließend Fibrillierung entwickelt, wodurch Matrixsubstanzen, wie beispielsweise Proteoglykane verlorengehen und gegebenenfalls vollständig verdrängt werden. Solche Fibrillierung von geschwächtem osteoarthritischem Knorpel kann bis zum kalzinierten Knorpel und in den subkontralen Knochen führen (Kempson, G.E. et al., Biochim. Biophys. Acta 1976, 428, 741; Roth, V. and Mow, V.C., J. Bone Joint Surgery, 1980, 62 A, 1102; Woo, S.L.-Y. et al., in Handbook of Bioengineering (R. Skalak and S. Shien Eds), McGraw-Hill, New York, 1987, pp4.1–4.44).
Ein Verfahren zur Regenerationsbehandlung von Knorpel wäre für die Behandlung von Arthrose/Arthritis nützlich und könnte in einem früheren Stadium der Gelenkschädigung durchgeführt werden, was zu einer Reduzierung der Patientenanzahl führen würde, die extensive Verfahren über sich ergehen lassen müßten, wie beispielsweise der Austausch gegen ein künstliches Gelenk. Mit solch einem Behandlungsverfahren könnte die Anzahl der Patienten mit Osteoarthrose-/arthritis verringert werden.

Verfahren zum Züchten und zur Verwendung von chondrozytischen Zellen sind durch Brittberg, M. et al (New Engl. J. Med. 1994, 331, 889) beschrieben. Mittels dieser Methoden wachsende Zellen verwendende autologe Transplantate sind ebenso offenbart. Darüber hinaus untersuchte Kolletas et al. die Expression von knorpelspezifischen Molekülen, wie beispielsweise Kollagenen und Proteoglykanen unter fortgesetzter Zellkultivierung (J. Cell Science 1995, 108, 1991.) Diese fanden heraus, daß abgesehen von morphologischen Veränderungen während der Kultivierung in Monolayer-Kulturen (Aulthouse A. et al., In Vitro Cell Dev. Biol., 1989, 25, 659; Archer, C. et al., J. Cell Sci. 1990, 97, 361; Hänselmann, H. et al., J. Cell Sci. 1994, 107, 17; Bonaventure, J. et al., Exp. Cell Res. 1994, 212, 97) bei Vergleich mit über Agarose-, Alginatperlen oder als Spinnerkulturen durch verschiedene Wissenschaftler getestete, gewachsene Suspensionskulturen, verändern solche Morphologien nicht, die chondrozyten-exprimierten Marker wie beispielsweise Typ II und IX-Kollagene, wobei die großen aggregierten Proteoglykane, Aggrekan, Versikan und Verbindungsproteine sich nicht verändern (Kolletas, E. et al., J. Cell Science 1995, 108, 1991).

Darüber hinaus sind chondrozytische Zellen von Spendern in vitro gezüchtet worden, um Neoknorpel zu bilden, der in Tiere implantiert worden ist, (Adkisson et al., "A Novel Scaffold-Independent Neocartilage Graft for Articular Cartilage Repair, "ICRS 2^nd Symposium International Cartilage Repair Society, Nov. 16–18, 1998). Darüber hinaus sind chondrozytische Zellen auf der Knorpeloberfläche von osteochondralen Kernen gesät worden, um Knorpelregenerationen zu erreichen (Albrecht et al., "Circumferential Seeding of Chondrocytes: Towards Enhacement of Integrative Cartilage Repair, "ICRS 2nd Symposium International Cartilage Repair Society, Nov. 16–18, 1998). Oberflächendefekte in Kniegelenken sind mit verschiedenen kultivierten Chondrozyten behandelt worden (Stone et al., Operative Techniques in Orthopaedics 7 (4), pp. 305–311, Oct. 1997 and Minas et al., Operative Techniques in Orthopaedics 7 (4), pp. 323–333, Oct. 1997).

Membranen und bestimmte Eigenschaften sind in den folgenden Referenzen beschrieben worden:
US 5,837,278 – Geistlich beschreibt eine Kollagen enthaltende Membran, die resorbierbar ist und in geführter Geweberegeneration verwendet wird. Die Membran weist eine fibröse Oberfläche auf, die darauf Zellwachstum erlaubt, und eine glatte, gegenüberliegende Oberfläche, die darauf eine Zelladhäsion verhindert. Das Membranprodukt leitet sich von einer natürlichen Kollagen-Membran ab (von der Haut oder den Sehnen von Kälbern oder Ferkeln) und obwohl behandelt, wird diese beschrieben als deren natürliche Strukturmerkmale aufrechterhaltend. Das Kollagen wird mit alkalischen Agenzien gereinigt, um das Kollagen zu entfetten und Substanzen abzubauen. Anschließend wird das gereinigte Kollagen acidifiziert, gewaschen, getrocknet, entfettet und optional vernetzt. Die Fette werden verseift. Die Membran wird beschrieben als ungefähr 95 Gewichtsprozent natives Kollagen enthaltend.
PCT WO 96/25961 – Geistlich et al. beschreibt eine Matrix zur Rekonstruktion von Knorpelgewebe, das aus Typ II-Kollagen besteht. Bei Herstellung der Matrix wird Knorpel von einem Tier genommen und gefroren, einer Größenreduktion unterworfen, entwässert, entfettet, gewaschen und mit alkalischen Materialien behandelt. Nichtkollagene, alkalische lösliche Proteine werden denaturiert, zerstört, aufgelöst und beseitigt. Dialyse und Gefriertrocknung werden als mögliche Behandlungsschritte erwähnt. Das Matrixmaterial wird in eine er forderliche Form gepreßt und anschließend sterilisiert.
US 4,424,208 – Wallace et al. schreibt ein injizierbares Kollagenimplantat-Material, das besondere verknüpfte Atelopeptidkollagen- und rekonstituierte Atelopeptidkollagenfasern aufweist, die in einem flüssigen Träger dispergiert sind. Dem Atelopeptid von Kollagen mangelt es an der nativen Telopeptidvernetzung. In der in diesem Patent beschriebenen Methode wird bovinem und Schweine-Corium (sub-epiteliale Hautschicht) erhaltenes Kollagen geweicht durch Einweichen in einer milden Säure, enthaart, durch physikalische Behandlung zerstückelt, wie beispielsweise gemahlen, durch Behandlung mit Säure und einem proteolytischen Enzym gelöst, mit einer alkalischen Lösung behandelt und von Enzymen befreit. Die vernetzte Gelform von Kollagen wird gebildet durch bestrahlungsinduziertem oder chemisch induziertem Vernetzen, wie beispielsweise durch Zugabe von Glutaraldehyd. Währenddessen wird die fibröse Form von Kollagen hergestellt durch Neutralisieren der Lösung mit einem Puffer, wie beispielsweise in Na₂HPO₄. Der Kollagengehalt an injizierbarem Implantat enthält 5 bis 30 Prozent fibröses Kollagen und 70 bis 98 Prozent der vernetzten Gelform des Kollagens.
US 4,488,911 – Luck et al. beschreibt die Bildung von Kollagenfasern, die frei vom immunogenen Telopeptidbereich von nativem Kollagen sind. Die Telopeptidregion stellt Vernetzungspunkte im nativen Kollagen bereit. Die Fasern, die vernetzt sein können, werden beschrieben für die Verwendung als Schwämme, Prothesen, Filme, Membran und Nahtmaterial. In der beschriebenen Methode wird aus Sehnen, Haut und Verbindungsgewebe von Tieren, wie beispielsweise einer Kuh, erhaltenes Kollagen in einer essigsauren Lösung dispergiert, durch einen Fleischwolf gedreht, mit Pepsin behandelt, um die Telopeptide zu spalten und das Kollagen zu lösen, ausgefällt, dialysiert, durch Zugabe von Formaldeyd vernetzt, sterilisiert und lyophylisiert. In diesem Verfahren wird die Atelokollagenform des Kollagens enthalten, das frei von Nichtkollagenproteinen ist, wie beispielsweise Glykosaminglykanen und Lipiden. Darüber hinaus kann das Kollagen verwendet werden als ein Gel, um beispielsweise eine Membran, einen Film oder einen Schwamm herzustellen, wobei der Vernetzungsgrad des Kollagens gesteuert werden kann, um dessen Struktureigenschaften zu verändern.
US 6,283,980 – Vibe Hansen et al. beschreibt ein Verfahren zur Behandlung von Gelenkoberflächenknorpel einschließlich der Transplantierung von Chondrozyten in einer geeigneten Matrix auf eine Oberfläche, die zu behandeln ist mittels Formen der zu behandelnden Oberfläche, plazieren von Chondrozyten in einer geeigneten Matrix auf zu behandelnder Oberfläche und Schützen der Oberfläche mit einem Schutzkäppchen.
US 6,379,367 – Vibe Hansen et al. beschreibt sowohl eine Knorpelreparaturstruktur, die eine zellfreie Membran aufweist mit poröser und dichter Oberfläche und benachbarter poröser Chondrozytenoberfläche einer Membran als auch ein Verfahren zur Herstellung einer gesäten niederdichten Chondrozytenkultur in vitro einschließlich das Säen von Chondrozytenzellen in Suspensionsmaterial, um es den Zellen zu erlauben, sich zu teilen und zu differenzieren.
PCT/1B00/01911 – Müller et al. beschreibt eine resorbierbare, vliesähnliche, implantierbare Typ II-kollagenbasierende Matrix einschließlich rekonstituiertem Typ II-Kollagen, das gebildet ist aus solubilisiertem artikulären Gewebe. Darüber hinaus wird ein implantierbarer Artikel beschrieben einschließlich Matrix und auf der Matrix zurückgehaltenen Chondrozyten, ein Verfahren zur Herstellung der Matrix, ein Verfahren zur Behandlung von Knorpeldefekten durch Transplantation des implantierbaren Artikels auf der Defektseite und ein Verfahren zur Herstellung eines implantierbaren Artikels.

Die aus dem Stand der Technik bekannten Präparate weisen jedoch bis zum heutigen Tag keine zufriedenstellenden Eigenschaften bei der Behandlung der Osteoarthrose-/arthritis auf. Ziel der vorliegenden Erfindung ist es daher, eine Zusammensetzung bereitzustellen, die bei der Behandlung der Osteoarthrose-/arthritis ausgezeichnete Ergebnisse liefert.

Das der Erfindung zugrundeliegende Problem und die entsprechende Zielsetzung werden durch eine Zusammensetzung nach Anspruch 1, einen implantierbaren Artikel nach Anspruch 14, Verwendungen nach den Ansprüchen 17 bis 20 sowie ein Arthrose-/Arthritisbehandlungsmittel nach Anspruch 21 und einen Arthrose-/Arthritisbehandlungskit nach Anspruch 22 gelöst.

Die erfindungsgemäße Zusammensetzung zur Arthrose-/Arthritisbehandlung, insbesondere von Gelenken, enthält mindestens eine Trägersubstanz zur Aufnahme mindestens eines anti-inflammatorischen Agens und knorpelaufbauender Substanzen, mindestens ein anti-inflammatorisches Agens und knorpelaufbauende Zellen.

Bei den knorpelaufbauenden Zellen handelt es sich insbesondere um Chondrozyten, während es sich bei der Trägersubstanz insbesondere um Kollagen und beim antiinflammatorischen Agens um insbesondere Hyaluronsäure, Rhein oder insbesondere Diacetylrhein handelt.

Bei der erfindungsgemäßen Zusammensetzung nimmt die Trägersubstanz mindestens ein anti-inflammatorisches Agens zur Bekämpfung der Entzündungsprozesse auf sowie knorpelaufbauende Zellen, die dem aus der Arthrose-/Arthritis entstandenen Knorpelschaden durch Aufbau neuer Knorpelzellen entgegenwirken.

Somit ist sowohl eine nachhaltige Reparatur gewährleistet als auch die mit der Arthrose-/Arthritis verbundene Entzündung wirksam unterdrückt, die eine nachhaltige Regeneration häufig nahezu verhindert.

Zunächst ist es vorteilhaft, daß die Trägersubstanz im Körpergewebe resorbierbar und/oder abbaubar ist, damit nach beispielsweise operativer Anwendung vor Ort am Gelenk keine weitere Operation zur Entfernung der Trägersubstanz stattfinden muß und dies für den Patienten somit weniger invasiv ist.

Weiterhin ist es vorteilhaft, wenn die Trägersubstanz als mechanische Stützstruktur, insbesondere vliesartig, ausgestaltet ist, da sich eine solche Struktur in der Praxis sehr bewährt hat.

Weiterhin ist es vorteilhaft, wenn die Trägersubstanz auf Kollagen und/oder Polyglykolen und/oder Polylactiden basiert, insbesondere besteht, da insbesondere Kollagen ausgezeichnete mechanische Eigenschaften für den Aufbau einer vliesartigen Stützstruktur aufweist.

Dabei hat es sich in der Praxis als vorteilhaft herausgestellt, wenn es sich beim Kollagen im wesentlichen um Kollagen des Typs I, III, I/III oder II handelt, wobei es weiterhin vorteilhaft ist, wenn es sich beim Kollagen um natürliches oder rekonstituiertes Kollagen handelt.

Häufig wird in der Praxis das Kollagen aus solubilisiertem, artikulären (Gelenk)Knorpelgewebe und/oder aus solubilisierten Sehnen, Peritoneum, Pericardium, Haut oder Schleimhäuten gebildet, da es sich hierbei um ein relativ kostengünstiges und bewährtes Verfahren handelt.

Darüber hinaus ist es vorteilhaft, wenn es sich beim anti-inflammatorischen Mittel um eine Substanz aus der Gruppe, bestehend aus Hyaluronsäure, sulfatierte Hyaluronsäure, Cyanidanol, Rhein, insbesondere Diacetylrhein, Rheinderivate, die gebildet werden mittels Acylierung von Rhein mit Butansäure oder Propansäure, und ortho-(2,6-Dichloranilino)-phenylessigsäure und (R,S)-2-(4-Isobutylphenyl)-propionsäure, handelt, da sich diese Substanzen in der Praxis als ausgesprochen wirksam herausgestellt haben. Die Hyaluronsäure wird vorteilhafterweise, da praxisbewährt, aus Hahnenkämmen oder aus Streptomyces-Bakterienkulturen gewonnen.

Eine ausgesprochen elegante und somit vorteilhafte Ausgestaltung ist es, wenn die Trägersubstanz mindestens ein Vernetzungsmittel enthält, wobei das Vernetzungsmittel ein oder das anti-inflammatorische Mittel ist, insbesondere wenn das Vernetzungsmittel eine Substanz aus der Gruppe, bestehend aus Cyanidanol, Rhein, Diacethylrhein und Rheinderivaten, die gebildet werden mittels Acylierung von Rhein mit Butansäure oder Propansäure, Hyaluronsäure, sulfatierte Hyaluronsäure sowie Glutaraldehyd und Ethyl-Dimethyl-Aminopropylcarbodiimid, ist. Der Glutaraldehyd und das Ethyl-Dimethyl-Aminopropylcarbodiimid sind Verbindungen, die lediglich als Vernetzungsmittel fungieren und keine anti-inflammatorische Wirkung aufweisen. Die ortho-(2,6-Dichloranilino)-phenylessigsäure und (R,S)-2-(4-Isobutylphenyl)-propionsäure sind Verbindungen, die lediglich eine anti-inflammatorische Wirkung aufweisen und nicht als Vernetzungsmittel fungieren.

Eine vliesartige Ausgestaltung der Zusammensetzung hat sich in der Praxis für die Applikation am Gelenk als mechanisch vorteilhaft herausgestellt.

Die erfindungsgemäßen vorteilhaften Eigenschaften gelten auch für einen erfindungsgemäßen implantierbaren Artikel, insbesondere in Form eines Vlieses, zur Arthrose-/Arthritisbehandlung, insbesondere von Gelenken, der eine erfindungsgemäße Zusammensetzung aufweist.

Dabei ist es aus o.g. Gründen vorteilhaft, wenn der Artikel vliesartig ausgestaltet ist, wobei dieser insbesondere reversibel deformierbar ist, um eine wie auch immer geartete Einschränkung der Bewegungsfreiheit des Gelenkes so gering wie möglich zu halten.

Die Zusammensetzung (im nachfolgenden auch als "Matrix" bezeichnet, wobei der Begriff "Matrix" jedoch häufig lediglich bezüglich der Trägersubstanz verwendet wird) kann rekonstituiertes Kollagen des Typs I, III, I/III und II, Hyaluronsäure oder eine Mischung von rekonstituiertem Kollagen und Hyaluronsäure enthalten, oder aus diesen bestehen, oder es kann ein natürliches Vlies wie Tierhaut, Peritonium, Pericardium oder Mukosa sein, zu welcher Hyaluronsäure absorbiert ist. Diese natürliche und vernetzte Matrix weist eine vliesähnliche Konsistenz auf, die, wenn diese mit Zellen beladen wird, implantiert werden kann in die Seite des Körpers zu Zwecken der Reparatur (beispielsweise von geschädigtem Gewebe) und in die richtige Form zur Ablagerung an der entsprechenden Seite gebracht werden. In deren nicht vernetzter Form weist die Matrix eine liquide oder gelähnliche Konsistenz auf. In vliesähnlicher Form ist die Matrix reversibel deformierbar, so daß ein implantierbares Textil, das die Matrix aufweist, manipuliert werden kann, um die Implantation möglichst zu erleichtern.

Die rekonstituierte Kollagenmatrix kann beispielsweise erhalten werden durch Rekonstituierung von vorherig solubilisiertem tierischen Gewebe wie Knorpel, Sehnen, Peritonium oder Mukosa von einem Tier wie bei spielsweise einem Pferd, Schwein, Kuh (oder Kalb), Ziege, Huhn, Kaninchen, Maus, Ratte oder Känguruh.

Das Hyaluronsäure-Material kann erhalten werden aus unterschiedlichen kommerziellen Quellen (wie Hyalart^®, Synvisc^® oder anderen). Dessen Molekulargewicht kann variieren innerhalb des gesamten Bereiches der erhältlichen Hyaluronsäure.

Die natürliche Matrix wird hergestellt mittels Reinigung tierischen Gewebes wie Peritonium, Sehnen, Pericardium, intestinaler Mukosa oder Haut gemäß den anderweitig veröffentlichten Verfahren (siehe beispielsweise US 5,837,278 ). Zusätzlich zu den bereits veröffentlichten Schritten wird das natürliche Material imprägniert mit Hyaluronsäure unterschiedlichen Molekulargewichts. Darüber hinaus werden die Hyaluronsäure-Moleküle an die natürliche Membran angeheftet.

Das verwendete Kollagenmaterial wird solubilisiert mittels physikalischer und/oder chemischer Behandlung. Der Solubilisierungsprozeß beinhaltet die Behandlung mit verschiedenen Puffern, um Verunreinigungen zu entfernen und um die Feststoff- und Flüssigphasen zu separieren, wobei die physikalische Behandlung zur Separierung von Feststoff- und Flüssigphasen, wie beipielsweise mittels Zentrifugierung, und die Behandlung mit einem proteolytischen Enzym, das die Verknüpfung des Kollagens aufbricht.

Mit Rekonstitution/Rekonstituierung ist gemeint, daß die nichtvernetzte Kollagenform von Kollagen seine Verknüpfung zwischen den variablen Regionen entlang des Kollagen-Moleküls wiedererrichtet. Als Ergebnis davon verliert das Kollagen dessen liquide oder gelartige Konsistenz und wird fester mit einem höheren Grad an struktureller Integrität, so daß dieses für das Wachstum der Zellen darauf als Gerüst dienen kann.

Die Solubilisierungsbehandlungen entfernen ebenso vom Kollagen tote Zellen, Proteoglykane, Glykosamin, Glykane und andere assoziierte Proteine und Moleküle. Die Behandlungen reinigen effektiv das Kollagen, wobei die Ausbeute größer als 90 Prozent an reinem Kollagen ist. Das Kollagen kann anschließend rekonstituiert werden, um eine ausreichende strukturelle Stabilität für die Verwendung als ein Gerüst bereitzustellen mittels Einbringen von Vernetzungen im Kollagen und kann anschließend lyophylisiert werden, um eine vliesähnliche Matrix zu bilden, auf der die Zellen wachsen und anhaften können.

Alternativ dazu können die Matrixzusammensetzungen gebildet werden aus rekombinant hergestelltem Kollagen. Das im wesentlichen reine, rekombinant hergestellte Kollagen ist nicht vernetzt, jedoch weist dieses Telopeptidregionen auf. Es ist löslich und kann gebildet werden in eine vliesähnliche Matrix.

Die Matrix kann zwei glatte Oberflächenseiten oder eine glatte und eine rauhe Oberfläche aufweisen. Eine glatte Oberfläche auf der Matrix behindert ein Zelleinwachsen, während eine rauhe Oberfläche dieses fördert. Die Oberflächeneigenschaften der Matrix können verändert werden mittels langsamer Dazugabe eines Alkohols, beispielsweise Ethanol (in einer 10- bis 30prozentigen Lösung) in der Lyophyilisierungsmischung. Die Bildung einer glatten und einer rauhen Oberfläche kann wesentlich beeinflußt sein durch die Lyophyilisierungsbedingungen.

Weiterhin kann die Konsistenz der Matrix variieren von einer Flüssigkeitsform oder gelähnlichen Form zu einer Feststoff-, vliesähnlichen, flexiblen Form, in Abhängigkeit vom Kontakt mit einer physiologisch kompatiblen Eindickung oder einem Eindickungs- oder Gelie rungs-Agens, einer Wärmebehandlung oder einer chemischen Reaktion wie beispielsweise einer enzymatischen Reaktion (d.h. die Behandlung mit Pepsin) oder einer Reaktion mit einem Vernetzungsagens (Cross Linking Agens). Die resultierenden Eigenschaften der Matrix können dementsprechend variieren. Die Matrix sollte eine Stärke F_max in Newton) von ungefähr 0,7 bis ungefähr 1,3, vorzugsweise ungefähr 1,0 Newton, aufweisen. Darüber hinaus sollte die maximale Elastizität (F_max) ungefähr 4,6 Prozent bis ungefähr 5,6 Prozent, ungefähr 0,176 bis ungefähr 0,184 N/mm², vorzugsweise ungefähr 5,1 Prozent und ungefähr 0,18 N/mm², betragen. Diese Elastizitätsparameter reflektieren die Stärke der zu verwendenden Membran.

Das Vernetzungsmittel kann ein aldehydbasierendes biokompatibles Vernetzungsmittel oder ein polyvalentes Aldehyd wie beispielsweise Glutaraldehyd sein. Ebenso kann das Vernetzungsmittel ein bifunktionales Mittel mit zwei Komponenten sein, die mit der Stützmatrix reagieren. Beispiele der Komponenten sind Aldehyde, Ketone, Acetale, Halbacetale, wobei Komponenten, die brauchbar sind für oxidatives Koppeln, beispielsweise phenolische Gruppen, Chinone, wie beispielsweise Flavoide, Carboxylgruppen und aktivierte Carboxylsäuren sind. Ebenso kann Ethyl-Dimethyl-Aminopropylcarbodiimid (EDC) als ein Vernetzungsmittel verwendet werden.

Bevorzugte Vernetzungsmittel sind chemische Verbindungen, die zwei reaktive Gruppen enthalten. Die reaktiven Gruppen beschleunigen die Vernetzung durch Verbrückung von Aminosäuren wie beispielsweise Lysin-Komponenten auf Telopeptidabschnitt. Besonders bevorzugte Vernetzungsmittel sind Cyanidanol, Rhein und dessen Derivate wie beispielsweise und insbesondere Diacetylrhein, das einen anti-inflammatorischen (entzün dungshemmenden) Effekt zeigt. Andere bevorzugte antiinflammatorische Mittel sind NSAIDs (nicht-steroidale anti-inflammatorische Medikamente) wie beispielsweise Diclofenac (ortho-(2,6-Dichloranilino)-phenylessigsäure) oder Ibuprofen ((R,S)-2-(4-isobutylphenyl)propionsäure). Der Typ an zu verwendendem Vernetzungsmittel und dessen Konzentration wird bestimmt durch Evaluierung der Wirkung auf die Konsistenz und physikalischen Eigenschaften der Matrix und dessen physiologischer Kompatibilität mit dem Bereich auf dem Körper, in der die Matrix und die Zellen zu implantieren sind.

Mittels Erwärmen oder Bestrahlen der Verbindung kann ebenso eine Vernetzung erreicht werden. Darüber hinaus kann die Anwendung von Wärme oder Strahlung auf die Verbindung den Grad der Vernetzung in einer Zusammensetzung erhöhen, die bereits chemisch vernetzt ist, beispielsweise durch vorherige Zugabe einer aldehydenthaltenden Komponente. Der wärmeinduzierte Anstieg der Vernetzung kann ebenso dazu führen, daß die Zusammensetzung weniger gelähnlich ist und eine festere Konsistenz aufweist.

Die Matrix der vorliegenden Erfindung ist insbesondere nützlich für beispielsweise die menschliche Hüfte, wo konventionelle Kollagenmembranen nicht plaziert werden können. Bei Behandlung aller festen Gelenke kann die zu manipulierende Matrix an die Seite des Gelenkes plaziert werden und anschließend an der Seite verbleiben. Ebenso kann die Matrix zusätzlich Zelltypen wie beispielsweise Osteozyten zur Behandlung von Knochenschäden zusammen mit einem geeigneten Stimulationswachstumsenzym aufnehmen.

Eine spezifische Eigenschaft der Matrix, die diese geeignet macht für die Behandlung von Osteoarthrose- /arthritis, ist deren Gehalt an anti-inflammatorischem Agens, das als Vernetzer verwendet wird. Diese Moleküle werden in das Gelenk nach Implantation der Matrix während des biochemischen Abbaus der Matrix freigesetzt, so daß dadurch ein sehr lang andauernder anti-inflammatorischer Effekt an der Applikationsseite erreicht wird.

Bezüglich der inkorporierten Medikamente kann die Matrix als eine neue Form eines biochemisch intelligenten, langsam abgebenden Systems angesehen werden, in dem lebende (menschliche) Zellen in der Matrix inkorporiert sind, die dazu beitragen, daß das anti-inflammatorische Mittel freigesetzt wird.

Die Gelform der mit Zellen beladenen Matrix, wie beispielsweise Chondrozytenzellen, kann für die Inkorporation verwendet werden, wie beispielsweise mittels Injektion in feste Gelenke oder andere Bereiche, wo die Insertion einer vliesähnlichen Matrix (in der die Kollagen-Moleküle bereits vernetzt sind) schwierig werden könnte oder unmöglich.

Da die gelähnliche Matrix in eine Seite des Körpers injiziert werden kann, kann das oben erwähnte Vernetzungsmittel simultan an der Seite injiziert werden, um Vernetzungen in den Kollagen-, beispielsweise Hyaluronsäure- oder beispielsweise Kollagen-Hyaluronsäure-Molekülen der Matrix bereitzustellen. Aus diesem Grund kann die Vernetzungsreaktion in vivo nach Implantation des zellbeladenen Materials auftreten. Die Vernetzung verursacht, daß die Matrix eine höhere Steifigkeit annimmt, da eine erhöhte strukturelle Integrität und Stabilität an der Seite der Implantantion auftritt. Jedes mögliche biokompatible Vernetzungsmittel kann verwendet werden.

Chondrozyten, die autolog oder homolog sind, kön nen auf der Trägermatrix zur Verwendung für die Behandlung von Knorpeldefekten in Gelenken zurückgehalten werden. Chondrozyten können direkt auf der Trägermatrix aufwachsen oder in Standardschalen und/oder auf der Matrix vor Verwendung beladen werden (typischerweise zwei oder drei Tage vor Verwendung). Die chondrozytenbeladene Trägermatrix wird in das Gelenk eingeführt durch ein Arthroskop oder durch minimale invasive oder offene Operationstechniken. Hierbei können ebenso geeignete allogene und xenogene chondrozytische Zellen für die Reparatur von Knorpeldefekten verwendet werden.

Die zellbeladene Matrix kann auf verschiedene Arten und Weisen inkorporiert werden zum Bewerkstelligen oder Stimulieren einer Reparatur eines körperlichen Defektes oder einer Verletzung unter Verwendung verschiedener Vorrichtungen zur Implantierung. Einige dieser Techniken und Vorrichtungen sind in der US-Patentanmeldung Seriennummer 09/373,952, eingereicht am 13. August 1999, in US Provisional Application No. 60/096,597, eingereicht am 14. August 1998 und US Provisional Aplication No. 60/146,683, eingereicht am 02. August 1999, gezeigt, wobei die gesamten Offenbarungen dieser Schriften hiermit durch Bezugnahme Teil der Offenbarung sein sollen.

Aus diesem Grund lehrt die vorliegende Erfindung neben gängigen Verfahren und Systemen für die effektive Reparatur oder Behandlung von Defekten von artiklulärem Knorpel und Knochen, von oestochondralen Defekten, Haut- und Wunddefekten und Defekten von Ligamenten, Menisci und vertebralen Scheiben. Diese Verfahren und Systeme schließen die Verwendung eines implantierbaren Artikels ein, der eine rekonstituierte knorpelähnliche Matrix mit den Zellen, wie beispielsweise chondrozytischen Zellen aufweist. Zu diesen Zwecken ist die Trä germatrix des Implantates hergestellt aus einem Material mit einer ausreichenden physikalischen Integrität, um eine stabile Form über einen gewissen Zeitraum zu erhalten, um ein Wachstum der Zellen vor und nach Transplantierung zu ermöglichen, und um ein System bereitzustellen, das ähnlich der natürlichen Umgebung der Zellen ist, um eine Zellwachstumsdifferenzierung zu optimieren. Innerhalb von zwei bis drei Monaten wird die in einem Körper zu resorbierende Matrix inspiziert, ob diese tatsächlich ohne signifikante Spuren zu hinterlassen und keine Bildung von toxischen Abbauprodukten induziert zu haben, sich aufgelöst hat. Der Begriff "resorbieren" beinhaltet auch Prozesse, durch die die Trägermatrix durch natürliche biologische Prozesse zusammenbricht und die zusammengebrochene Trägermatrix und diesbezügliche Abbauprodukte, beispielsweise durch die Lymphgefäße oder Blutzellen, beseitigt werden. Der Resorptionsprozeß setzt die anti-inflammatorischen Agenzien, die sich auf oder in einer speziellen Ausführungsform sogar in der Matrix befinden (nämlich als Vernetzungsmittel) frei und wirken so dem Entzündungsprozeß in osteoarthritischen Gelenken entgegen. Dies ist eine ganz besondere Ausführungsform der erfindungsgemäßen Zusammensetzung, da das anti-inflammatorische Mittel gleichzeitig als Vernetzungsmittel diente und chemisch fest als immanenter Bestandteil der Trägersubstanz dient, so daß beim gleichzeitigen Abbau der Trägersubstanz ein ensprechend retardierendes Freisetzungs- und damit Wirkungsprofil ermöglicht wird.

Somit ist ein wesentlicher Punkt der vorliegenden Erfindung die Tatsache, daß bei der Behandlung von Arthrose-/Arthritis, insbesondere von Gelenken, die erfindungsgemäße Zusammensetzung eine Trägersubstanz aufweist, die knorpelaufbauende Zellen (insbesondere Chon drozyten) sowie mindestens ein anti-inflammatorisches Agens aufweist. Das anti-inflammatorische Agens kann sowohl rein physikalisch, quasi durch einfaches mechanisches Aufbringen, appliziert werden – was für die knorpelaufbauenden Zellen sowieso gilt – als auch in der oben erwähnten besonderen und vorteilhaften Ausführungsform bei Aufbau der Trägersubstanz bzw. mechanischer Verstärkung der Trägersubstanz als Vernetzungsmittel agieren und somit chemisch Teil der Trägersubstanz werden, so daß – wie schon oben erwähnt – bei entsprechendem Abbau der Trägersubstanz eine besonders wirkungsvolle retardierende Freisetzung des anti-inflammatorischen Agens vonstatten geht und damit eine besonders wirksame Bekämpfung des Entzündungsprozesses bei Arthrose-/Arthritis neben dem gleichzeitigen Aufbau des beschädigten Knorpels durch die knorpelaufbauenden Zellen bewerkstelligt werden kann.

Die nachfolgenden Beispiele dienen lediglich zur näheren Erläuterung der Erfindung.

Allgemeines Beispiel zur Herstellung einer vernetzten Matrix mit Typ II-Kollagen und Hyaluron-Säure (Referenz: PCT/I B00/01911)
In einer Ausführungsform beinhaltet das Verfahren zur Herstellung der Trägermatrix der vorliegenden Erfindung das Abschaben von artikulärem Knorpel (Gelenkknorpel) von der Oberfläche des Gelenkes eines großen Säugers oder anderen Tieres, wie beispielsweise eines Pferdes, Schweines, einer Kuh, einer Ziege, eines Huhnes oder eines Känguruhs. Der abgeschabte Knorpel wird gefroren und in gefrorenem Zustand gemahlen, beispielsweise in einer Flüssigstickstoff- oder Flüssigargon-Atmosphäre. In solch einer Atmosphäre wird der Knorpel schockgefroren, um ein pulverähnliches Material zu er halten. Typischerweise beträgt die Masse des gemahlenen Knorpels ungefähr 300 g Naßgewicht.
Das pulverähnliche Material wird anschließend entfettet mittels einer oder mehrerer Waschungen mit einem geeigneten Solvens, beispielsweise einem Alkohol, Ether, Benzol, Para-Toluol, oder anderen Lösungsmitteln mit einem hohen Grad an Löslichkeit für Fettmoleküle. Beispielsweise können 300 ml Ethanol (in einer 70prozentigen Lösung) verwendet werden. Die Entfettungslösung erlaubt die Extraktion der Fettmoleküle aus dem Knorpel. Die resultierende und Fettmoleküle enthaltende Lösung kann nunmehr getrocknet werden, beispielsweise durch Evaporierung bei Raumtemperatur oder durch Erwärmen auf eine Temperatur über ungefähr 50 Grad Celsius getrocknet, bis ein Feststoff erhalten wird.
Der entfettete Knorpelfeststoff wird anschließend wieder in einem geeigneten acidischen Puffer gelöst, beispielsweise 0,05 M Na-Acetat-Puffer bei einem pH von 1,5. Die erhaltene Lösung wird anschließend mit einem proteolytischen Enzym behandelt, beispielsweise wässrigem Pepsin (0,1 mg/ml), vorzugsweise bei einer reduzierten Temperatur, beispielsweise bei ungefähr +4 Grad Celsius. Die Enzymbehandlung kann bis zu zehnmal wiederholt werden, um die Produktausbeute zu optimieren, wobei jedoch fünf Wiederholungen als in vielen Fällen ausreichend ermittelt werden konnte.
Das behandelte Material wird anschließend zentrifugiert bei einer Temperatur zwischen ungefähr 4 Grad Celsius und 10 Grad Celsius und bei einer Rotationsgeschwindigkeit zwischen ungefähr 10.000 und 20.000 Umdrehungen je Minute (RPM) für ungefähr 30 bis 60 Minuten. Dies kann mehrere Male durchgeführt werden, um eine saubere Phasenseparierung zu erreichen. Drei solcher Wiederholungen sind in der Regel ausreichend.
Sowie eine adäquate Phasenseparierung beobachtet werden kann, wird das Pellet verworfen und der aus der Zentrifugierung in mehreren Vials erhaltene Überstand aufbewahrt. Anschließend wird der Überstand präzipitiert unter Verwendung einer geeigneten Salzlösung und eines Puffers bei einem neutralen pH, beispielsweise mittels Kaliumchlorid (17,5 Gewichtsprozent) in Phosphatpuffer (0,02 M KH₂PO₄, pH 7,4), das das Präzipitat aussalzt. Unter dem Begriff "Aussalzen" ist gemeint, eine Lösung mit einem Salz zu sättigen, so daß ein Feststoff aus einer Salzlösung ausfällt. In einer bevorzugten Ausführung erhält man dann den Überstand aus der Zentrifugierung, die Masse des aus dem ersten Zentrifugierungsschritt erzeugten Präzipitates beträgt ungefähr 82 g und das Kaliumchlorid wird präpariert in einem Gesamtvolumen von 2 Litern des Phosphatpuffers. Anschließend wird das Präzipitat zentrifugiert mit einer Geschwindigkeit zwischen ungefähr 30.000 und ungefähr 100.000 Umdrehungen pro Minute für ungefähr 30 bis 60 Minuten, um weiterhin eine Phasenseparierung vorzunehmen, um ein Pellet zu bilden, wobei der erhaltene Überstand verworfen wird, während das erhaltene Pellet resuspendiert wird in einem geeigneten acidischen Puffer, beispielsweise einer 0,05prozentigen Essigsäure (200 bis 500 ml). Die Konzentration des Knorpelmaterials der Lösung beträgt im allgemeinen mehr als 1 mg/ml.
Ein Aliquot an Hyaluronsäure wird dazugegeben. Das Molekulargewicht des dazugegebenen Materials schwankt zwischen 15.000 und > 6 × 10⁶ Dalton.
Um eine erfindungsgemäße Matrix als physikalische Integrität für das anschließende Handling und Manipulierung bereitzustellen, ist eine Vernetzung notwendig, wie im folgenden beispielhaft gezeigt.
Ein biokompatibles Vernetzungsagens wird anschlie ßend zur knorpel/kollagenenthaltenden Lösung dazugegeben. Wie oben diskutiert, kann das spezifische Vernetzungsmittel dahingehend ausgewählt werden, um eine bestimmte Konsistenz und spezifische physikalische Eigenschaften für die Matrix zu erreichen, d.h., die oben beschriebene Festigkeit und Elastizität. Das Vernetzungsmittel wird in einem geeigneten neutralen Puffer präpariert, beispielsweise 10 bis 40 ml von 0,2 M NaCl/0,05 M Tris-HCl, pH 7,4, auf eine Konzentration von 20 bis 100 mg/ml.
Die das vernetzte Kollagen/Knorpel enthaltende Lösung wird anschließend lyophilisiert, um einen Feststoff zu erhalten. Die Lyophilisierung kann wiederholt werden nach Wiederwässern mit einer wässrigen Lösung, beispielsweise mit 10 bis 20 ml destilliertem Wasser (abhängig von der Größe des lyophilisierten Kollagen-Pellets) bei einer Temperatur zwischen ungefähr 20 Grad Celsius und ungefähr 60 Grad Celsius, vorzugsweise bei ungefähr 25 Grad Celsius, und einem Druck von ungefähr 0,05 mbar. Steigt die Temperatur innerhalb dieses Bereiches, steigt der Grad an Vernetzung und die korrespondierende Stabilität des Materials. Im Gegensatz dazu sinkt der Grad an Vernetzung und die entsprechende Stabilität, wenn die Temperatur innerhalb des Bereiches absinkt. Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung beinhaltet mehrfache Lyophilisierungsschritte und führt zu zwei glatten Oberflächen an den Enden der Matrix. Zusätzlich zur Verwendung eines Vernetzungsmittels und dem Wärmeaussetzen, kann eine Bestrahlung eingesetzt werden, um die Vernetzung des Kollagens zu erhöhen.
Die Lyophilisierungszeiten variieren in Abhängigkeit vom Volumen der zu lyophilisierenden Lösung und der Größe des erhaltenen Pellets. Beispielsweise werden 100 ml Lösung lyophilisiert für ungefähr 36 Stunden, um einen geeigneten, trockenen, pelletförmigen Feststoff zu erhalten. Der erhaltene Feststoff ist hygroskopisch und beinhaltet nicht mehr als ungefähr 20 Prozent Wasser in seiner polymeren Struktur. Abhängig von der Farbe des Vernetzungsmittels variiert die Farbe des Feststoffes von strahlend weiß bis gelb und rötlich. Der Feststoff ist ein vliesähnliches Material.
Dieses vliesähnliche Material kann mechanisch in Bögen gepreßt werden für die Verwendung mit Zellen als ein Implantationsartikel. Ein Beispiel einer für diese Zwecke geeigneten Preßmaschine ist veröffentlicht in PCT/1B 00/01911. Wird das vliesähnliche Material für ungefähr 24 Stunden zwischen diesen Oberflächen gepreßt, wird der vliesähnliche Bogen handhabbarer und ist leichter zu manipulieren. Darüber hinaus ist der Bogen reißfest.
Alternativ dazu kann die Preßvorrichtung jede geeignete Vorrichtung sein mit matten, glatten Oberflächen mit ausreichendem Gewicht, um kontinuierlich eine Kraft auf das Matrixmaterial auszuüben. Die Preßvorrichtung ist vorzugsweise aus rostfreiem Stahl gefertigt, wobei jedoch auch andere Metalle und Materialien, beispielsweise Plastik, Glas oder Keramiken verwendet werden können mit ähnlichen mechanischen Eigenschaften. Im allgemeinen ist ein Gewicht von ungefähr 650 bis ungefähr 850 g, vorzugsweise ungefähr 735 g, ausreichend, um ein vliesähnliches Startstück zu pressen, 5 bis ungefähr 10 mm in der Dicke, mit einem Oberflächenbereich von ungefähr 19 mm. Nach Pressen beträgt die Dicke des vliesähnlichen Bogens ungefähr 0,5 bis ungefähr 2,0 mm.
Das Matrix-Material wird vor dessen Verwendung sterilisiert, beispielsweise mittels Bestrahlung (W- oder Gammastrahlung) oder durch andere Sterilisierungs verfahren, wie beispielsweise mittels Epoxid- oder Ozon-Sterilisation. Strahlungssterilisation ist ein bevorzugtes Verfahren, um den Kontakt des Matrixmaterials durch äußere chemische Größen zu minimieren. Dieser finale Prozeß (Bestrahlungssterilisation) stabilisiert weiterhin das kollagene Trägermatrix-Material.
Die Trägersubstanz (Matrix) erlaubt das anschließende Kultivieren und Wachstum von chondrozytischen Zellen auf der Matrix, wenn diese mit Zellkulturmedium vollgesaugt ist.
Chondrozytische Zellen sollten fest an der Matrix haften oder in ihr integriert sein und sollten deren Phänotyp beibehalten oder wenigstens eine Tendenz zur Redifferenzierung nach Transplantation aufweisen. Zusätzlich sollte das erhaltene Zellmatrix-Biokomposit mechanisch ausreichend stabil sein, um in operativen Prozessen gehandhabt zu werden.
Allgemeines Beispiel zur Herstellung einer natürlichen Matrix mit Typ I/III-Kollagen und Hyaluronsäure (Referenz: US 6,379,367 ).
Chondrozyten werden kultiviert in minimalen essentiellen Kulturmedien, die HAM F12 und 15 mM Hepes-Puffer und 5 bis 7,5 Prozent autologes Serum in einem CO₂-Inkubator bei 37 Grad Celsius enthalten. Andere Bestandteile des Kulturmediums können verwendet werden zur Kultivierung der Chondrozyten. Die Zellen werden trypsiniert unter Verwendung von Trypsin EDTA für 5 bis 10 Minuten und gezählt unter Verwendung von Trypan Blue Lebensfähigkeitsfärbung in einer Bürker-Türk-Kammer. Die Zellzahl wird eingestellt auf 7,5 × 10⁵ Zellen je ml.
Eine natürliche, kommerziell erhältliche Kollagen I/III Matrix von verschiedenen Herstellern (beispiels weise MACI-Maix; Matricel; Chondro-gide und Bio-gide, Geistlich; SIS, DePuy; Colbar Membrane, Colbar) oder andere Kollagen-Matrices von Firmen wie Opocrin, Italien; Baxter, USA und anderen wird/werden auf eine geeignete Größe geschnitten, die auf den Boden des Wells paßt/passen, in der NUNCLON^TM Zellkultur-Platte. In diesem Fall wird ein Kreis mit einer Größe von ungefähr 4 cm (der jedoch auch eine andere Größe aufweisen kann) unter aseptischen Bedingungen auf dem Boden des Wells plaziert.
Die Matrix wird anschließend imprägniert mit einer 0,0001 mmol gesättigten Lösung eines anti-inflammatorischen Agens wie Diacethylrhein, Rhein, Diclofenac, Ibuprofen und anderen geeigneten Substanzen, und unterschiedlicher Lösungsmittel, vorzugsweise jedoch nicht beschränkt auf Wasser, Salzlösung, DMF (= Dimethylformamid) und DMSO (= Dimethylsulfoxid). Andere LÖsungsmittel können im gesamten Bereich organische Lösungsmittel liegen einschließlich Alkohole, Ethern, Ester, Ketonen und halogenierte Kohlenwasserstoffe. Die Imprägnierungszeit kann variieren von 1 Sekunde bis mehrere Wochen.
Nach der Imprägnierung wird das Material lyophilisiert. Die für die Imprägnierung verwendeten Wasserlösungen können ebenso direkt entfernt werden, wobei jedoch das Material dann wohl eine geringere Konzentration an anti-inflammatorischem Agens aufweisen wird.
Ungefähr 5 × 10⁶ Zellen in 5 ml Kulturmedium werden direkt auf das Gerüstmaterial gegeben und über die Oberfläche dispergiert. Die Platte wird in einem CO₂-Inkubator bei 37 Grad Celsius drei Tage lang inkubiert. Nach dieser Periode haben sich die Chondrozyten in Clustern arrangiert und beginnen auf dem Träger zu wachsen. Sie können nicht entfernt werden vom Träger durch Abspülen mit einem Medium oder sogar durch mechanisches Ausüben von geringem Druck auf die Matrix.
Beispiel 1 beschreibt ein Verfahren zur Herstellung einer Trägersubstanz (Matrix)(in diesem Fall enspricht die Zusammensetzung der Trägersubstanz) in der erfindungsgemäßen Zusammensetzung und das Wachstum und die Retention der Chondrozyten auf der Matrix. Beispiel 2 beschreibt ein zusätzliches Verfahren zur Herstellung der Trägersubstanz in der erfindungsgemäßen Zusammensetzung. Beispiel 3 zeigt das Wachstum und die Retention von chondrozytischen Zellen auf der Matrix.
Beispiel 1
Für die Typ II-Kollagen-Extraktion werden 300 g (Naßgewicht) von Ferkelknorpel gemahlen unter flüssigem Stickstoff zu einem Pulver und dreimal mit 300 ml einer 70prozentigen Ethanol-Lösung gewaschen, um das Kollagen zu entfetten. Die entfettete Kollagen-Lösung wird anschließend bei Raumtemperatur getrocknet. Der erhaltene Kollagen-Feststoff wird wieder gelöst in einer 0,05 M Kalium-Acetat-Lösung (pH 1,5) und Pepsin auf eine Endkonzentration von 0,1 mg/ml dazugegeben. Die Lösung wird anschließend bei 4 Grad Celsius gerührt zwischen 16 und 20 Stunden und bei 20.000 Umdrehungen pro Minute 30 Minuten lang zentrifugiert. Nach einem Zentrifugierungszyklus wird der erhaltene Überstand (geschätzt 300 ml) gesammelt. Das verbleibende Pellet wird resuspendiert in einer 0,05 M Natrium-Acetat-Lösung und die Pepsin-Behandlung, das Rühren und die Zentrifugationsschritte solange wiederholt, bis das meiste des Pellets sich aufgelöst hat.
Um einen Typ II-kollagen-enthaltenden Feststoff zu präzipitieren (auszufällen), werden die Überstände gesammelt (Gesamtvolumen annähernd 500 ml) und festes KCl dazugegeben, um eine Endkonzentration von 17,5 Prozent KCl zu erhalten. Festes KH₂PO₄ wird anschließend zugegeben, um eine Endkonzentration von 0,02 M in einer wässrigen Lösung zu erhalten. Die Lösung wird anschließend 30 Minuten lang bei 95.000 Umdrehungen pro Minute zentrifugiert und das Sediment (Pellet) wieder gelöst in einer 0,05prozentigen essigsauren Lösung und zweimal 16 Stunden lang gegen 5.000 ml einer 0,05prozentigen essigsauren Lösung bei 4 Grad Celsius dialysiert.
Ein aldehydbasierendes biokompatibles Vernetzungsmittel wird zur dialysierten Probe dazugegeben bei einer Konzentration von 20 bis 100 mg/ml in 10 bis 40 ml einer 0,2 M NaCl, 0,05 M Tris-HCL-Lösung bei einem pH von 7,4. Die erhaltene Lösung wird anschließend zweimal lyophilisiert gemäß dem oben beschriebenen allgemeinen Beispiel, um einen Feststoff zu erhalten. Eine Erhöhung der Vernetzung wird durch eine zwölfstündige UV-Bestrahlung des erhaltenen Feststoffes verbessert. Die Bestrahlng erhöht die mechanische Stabilität der erhaltenen Typ II-Kollagen-Matrix, die anschließend mittels Röntgenstrahlung (Gamma-Strahlung) sterilisiert wird.
Chondrozytische Zellen werden enzymatisch vom Knie-Gelenkknorpel eines erwachsenen Schafes unter Verwendung von Kollagenase und Hyaluronidase (bezogen von Sigma, St. Louis, MO) freigesetzt und im Kulturmedium resuspendiert (Ham's F-12), wobei das Kulturmedium 12 Prozent fetales Kalbsserum, 50 μl/ml Pennicillin/Streptomycin, 50μl/ml Glutamin (sämtliche Stoffe von Biochrom KG, Berlin, Deutschland erhältlich), 50 μl/ml nicht essentielle Aminosäuren (Gibco BRL, Paisley, Schottland) und 2,3 mM MgCl₂ enthält. Zellen werden in einer 80 cm² Kulturflasche kultiviert, die beschichtet ist mit 0,1 Prozent Gelatine (Nalge Nunc, Rochester, New York) und bei 37 Grad Celsius inkubiert in einer befeuchteten 5% CO₂-Umgebung für 4 bis 6 Wo chen. Erreichen die Zellen einen Zusammenfluß, werden diese trypsinisiert und auf der Typ II-Kollagen-Matrix eingesät, die wie im obigen Beispiel beschrieben, hergestellt wurde, bei einer Konzentration von ungefähr 4 × 10³ Zellen/ml.
Kollagen-Membranen (Matrices) werden drei Tage lang im oben beschriebenen Medium in Petri-Schalen inkubiert. Nicht besäte Membranen und Chondrozyten-Zellen, die auf Thermanox-Plastikgerüsten (Nunc, Rochester, New York) wuchsen, werden als Kontrollen im Experiment verwendet.
Die gesamte Morphologie der getrockneten Typ II-Kollagen-Matrices zeigt eine bruchartige und papierähnliche Erscheinung. Ein Schrumpfen oder Auflösen des Vlieses tritt während des Kulturprozesses nicht auf. Lichtmikroskopie von nicht besäten Typ II-Kollagen-Matrices zeigen eine dreidimensionale, poröse Architektur mit einer unterschiedlichen Porengröße. Zell Detritus oder Lacunae kann nicht beobachtet werden.
Auf Plastikoberflächen gewachsene Chondrozyten zeigen eine dichte Monoschicht von spinozellularen, fibroblastähnlichen Zellen mit ovoiden Nuclei und fehlenden interzellularen Kontakten.
Auf Typ II-Kollagen-Matrices gesäte Chondrozyten bilden eine Membran von multischichtigen Zellbögen mit verschiedenen Zellen, die mit den verbindenden Typ II-Kollagen-Fibern sich verwickeln/verfangen. Die Ultrastruktur dieser Zellen erinnert mehr an Chondrozyten als an einen fibroblastischen Zelltyp. Die meisten der Zellen weisen irreguläre Nuclei, ein granuläres endoplasmatisches Reticulum und prominente Golgi-Felder auf. Solche Zellen weisen einen hohen Gehalt an Glykogen auf und zeigen schmal extrudierte Vesikel an ihren Oberflächen auf.
Ein Vergleich der oben erwähnten morphologischen Differenzen zwischen den auf Plastikoberflächen und den auf Kollagen Typ II-Matrix gewachsenen Zellen legt den Verdacht nahe, daß die auf den Kollagen-Typ II-Matrices gewachsenen Chondrozyten redifferenziert sind.
Die Studien in diesem Beispiel zeigen, daß in vitro-Produktionen von autologem knorpelähnlichen Gewebe etabliert werden kann und Verwendung von Typ II-Kollagen-Matrices in der erfindungsgemäßen Zusammensetzung. Der erfindungsgemäße implantierbare Artikel trägt aktive Chondrozytenzellen mit dem Potential, einzuwachsen und Knorpeldefekte zu reparieren. Die mechanische Stabilität des Artikels stellt ein leichtes Handling bereit, so daß dieser in Knorpeldefekte quasi eingebracht werden kann.
Beispiel 2
300 g (Naßgewicht) von von Kalbsgelenken gekratztem artikulären Knorpel (Gelenkknorpel) werden gemahlen unter flüssigem Stickstoff, um ein pulverähnliches Material zu erhalten. Das Pulver wird anschließend durch drei Waschungen entfettet, jedesmal mit 300 ml 70prozentigem Ethanol und bei Raumtemperatur getrocknet. Der Feststoff wird wieder gelöst in 0,05 M Natrium-Acetat Puffer, pH = 1,5, und wiederholten Behandlungen mit Pepsin (0,1 mg/ml) in der Kälte unterworfen. Die Behandlung wird 16 bis 20 Stunden fortgesetzt. Nach dreimaligem Zentrifugieren bei einer Temperatur zwischen 4 Grad Celsius und 10 Grad Celsius und 10.000 bis 20.000 Umdrehungen pro Minute für ungefähr 30 bis 60 Minuten, wird der Überstand gesammelt und präzipiziert durch Zugabe von Kaliumchlorid (17,5 Prozent) in Phosphat-Puffer. Das Präzipitat (Niederschlag) wird gesammelt mittels Zentrifugierung bei 30.000 bis 40.000 Umdrehun gen pro Minute (45 Minuten) und resuspendiert in 0,05prozentiger Essigsäure zu einer ungefähren Konzentration > = 1 mg/ml.
Die erhaltene Lösung wird anschließend dialysiert gegen dreimal fünf Liter einer verdünnten Essigsäure (0,05 Prozent)(16 Stunden), um jedes überschüssige Salz zu entfernen. 10 bis 40 ml des Vernetzungsmittels Glutaraldehyd (präpariert in 0,2 M NaCl/0,05 M Tris-HCl, pH 7,4, bei einer Konzentration von 50 mg/ml) werden zur dialysierten Probe dazugegeben. Daraus entsteht eine homogene Lösung, die lyophilisiert wird, mit destilliertem Wasser gewässert/gewaschen und anschließend wieder lyophilisiert wird.
Das erhaltene vliesähnliche Material wird mechanisch in Blätter unter Verwendung der oben beschriebenen Vorrichtung mechanisch gepreßt und mittels W- und Röntgen (Gamma)-strahlung sterilisiert. Der Sterilisationsprozeß stabilisiert weiterhin das kollagene Material.
Beispiel 3
Chondrozyten werden in minimal essentiellem Kultur-Medium, das HAM's F12 und 15 mM Hepes-Puffer und 5 bis 7,5 Prozent autologes Serum enthält, gezogen in einem CO₂-Inkubator bei 37 Grad Celsius. Andere Zusammensetzungen von Kultur-Medien, beispeilsweise Kalbsserum, können ebenso verwendet werden für die Kultivierung der Chondrozyten. Die Zellen werden trypsinisiert unter Verwendung von EDTA (Trypsin: 2,5 Prozent-Lösung ohne Ca²⁺ und Mg²⁺ in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS), EDTA: 1Prozent-Lösung ohne Ca²⁺ und Mg²⁺ in PBS, die Endlösung enthält 0,05 Prozent Trypsin) (5 bis 10 Minuten) unter Verwendung von Trypan Blue-Lebensfähigkeits-Färbung in einer Bürker-Türk Kammer gezählt. Die Zellzahl wird eingestellt auf 7,5 × 10⁵ Zellen pro ml.
Eine Bio-gide Membran (Geistlich, Schweiz) wird imprägniert mit einer 0,1 m-Lösung an DAR (Diacetylrhein) in DMF (Dimethylformamid) oder DMSO (Dimethylsulfoxid). Die Membran wird anschließend fünfmal mit sterilem PBS gewaschen. Die Waschwässer werden verworfen. Die Membran wird anschließend in eine geeignete Größe geschnitten, die in den Boden des Wells in der NUNCLON^TM Zell-Kultur-Platte paßt. In diesem speziellen Fall wird ein Kreis einer Größe von ungefähr 4 cm (auch andere Größen möglich) unter aseptischen Bedingungen auf dem Boden des Wells plaziert. Ungefähr 5 × 10⁶ Zellen in 5 ml Kultur-Medium werden direkt auf das Trägermaterial gegeben und über die Oberfläche dispergiert. Die Platte wird in einem CO₂-Inkubator bei 37 Grad Celsius drei Tage lang inkubiert.
Am Ende der Inkubationsperiode wird das Medium dekantiert und eine kalt geeiste 2,5prozentige Glutaraldehydlösung, die 0,1 M Natriumsalz von Dimethylarsensäure enthält, als ein Fixativ dazugegeben. Die Matrix wird anschließend mit Safranin O für eine histologische Bewertung angefärbt.
Es kann beobachtet werden, daß die chondrozytischen Zellen, die sich in Clustern arrangiert haben, beginnen auf dem Träger zu wachsen und nicht vom Träger durch Abspülen mit einem Medium oder sogar mit einem mechanischen Ausüben eines geringfügigen Druckes auf die Matrix entfernt werden können. Es scheint daher so zu sein, daß die Zellen sich an der Matrix festgehaftet haben.

Claims

Zusammensetzung zur Arthrose-/Arthritisbehandlung, insbesondere von Gelenken, enthaltend: – mindestens eine Trägersubstanz zur Aufnahme mindestens eines anti-inflammatorischen Agens und knorpelaufbauender Zellen, – mindestens ein anti-inflammatorisches Agens und – knorpelaufbauende Zellen.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Trägersubstanz in Körpergewebe resorbierbar und/oder abbaubar ist.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Trägersubstanz als mechanische Stützstruktur, insbesondere vliesartig, ausgestaltet ist.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Trägersubstanz auf Kollagen, Hyaluronsäure, sulfatierter Hyaluronsäure und/oder Polyglykolen und/oder Polylactiden basiert, insbesondere besteht.
Zusammensetzung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß es sich beim Kollagen im wesentlichen um Kollagen des Typs I, III, I/III oder II handelt.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 4 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß es sich beim Kollagen um natürliches oder rekonstituiertes Kollagen handelt.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 4 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Kollagen gebildet wird aus solubilisiertem, artikulären Knorpelgewebe und/oder aus solubisierten Sehnen, Peritoneum, Pericardium, Haut oder Schleimhäuten.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß es sich beim anti-inflammatorischen Mittel um eine Substanz aus der Gruppe, bestehend aus Hyaluronsäure, sulfatierte Hyaluronsäure, Cyanidanol, Rhein, Diacetylrhein, Rheinderivate, die gebildet werden mittels Acylierung von Rhein mit Butansäure oder Propansäure, und ortho-(2,6-Dichloranilino)-phenylessigsäure und (R,S)-2-(4-Isobutylphenyl)-propionsäure, handelt.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Hyaluronsäure aus Hahnenkämmen oder aus Streptomyces-Bakterienkulturen gewonnen wird.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Trägersubstanz mindestens ein Vernetzungsmittel enthält.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß das Vernetzungsmittel ein oder das anti-inflammatorische Mittel ist.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß das Vernetzungsmittel eine Substanz aus der Gruppe, bestehend aus Cyanidanol, Rhein, Diacetylrhein und Rheinderivaten, die gebildet werden mittels Acylierung von Rhein mit Butansäure oder Propansäure, Hyaluronsäure, sulfatierte Hyaluronsäure sowie Glutaraldehyd und Ethyl-Dimethyl-Aminopropylcarbodiimid, ist.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß diese vliesartig ist.
Implantierbarer Artikel zur Arthrose-/Arthritisbehandlung, insbesondere von Gelenken, aufweisend eine Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 13.
Artikel nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß dieser vliesartig ausgestaltet ist.
Artikel nach einem der Ansprüche 14 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß dieser reversibel deformierbar ist.
Verwendung einer Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 13 zur Arthrose-/Arthritisbehandlung, insbesondere von Gelenken.
Verwendung eines Artikels nach einem der Ansprüche 14 bis 16 zur Arthrose-/Arthritisbehandlung, insbesondere von Gelenken.
Verwendung einer Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 13 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Arthrose-/Arthritisbehandlung, insbesondere von Gelenken.
Verwendung eines Artikels nach einem der Ansprüche 14 bis 16 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Arthrose-/Arthritisbehandlung, insbesondere von Gelenken.
Arthrose-/Arthritisbehandlungsmittel, insbesondere Gelenkarthrose-/arthritisbehandlungsmittel, enthaltend eine Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 13 und/oder einen Artikel nach einem der Ansprüche 14 bis 16.
Arthrose-/Arthritisbehandlungskit enthaltend eine Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 13 und/oder einen Artikel nach einem der Ansprüche 14 bis 16.