PT103970A

PT103970A - Hidrogéis à base de goma gelana para utilização em medicina regenerativa e engenharia de tecidos, seu sistema e dispositivos de processamento

Info

Publication number: PT103970A
Application number: PT10397008A
Authority: PT
Inventors: Joao Teixeira De Oliveira; Rui Amandi De Sousa; Rui Luis Reis
Original assignee: Ass For The Advancement Of Tis
Priority date: 2008-02-15
Filing date: 2008-02-15
Publication date: 2009-08-17
Also published as: EP2244753A2; WO2009101518A2; WO2009101518A3

Abstract

A PRESENTE INVENÇÃO REFERE-SE AO PROCESSAMENTO E APLICAÇÃO DA GOMA GELANA EM ABORDAGENS DE MEDICINA REGENERATIVA E DE ENGENHARIA DE TECIDOS, FOCANDO PROCESSOS PARA ACONDICIONAMENTO, MANIPULAÇÃO, PROCESSAMENTO PARA DIVERSAS ESTRUTURAS, RETICULAÇÃO IÓNICA CONTROLADA DA GOMA GELANA, ASSIM COMO PARA COMBINAÇÃO DESTA COM BIOMOLÉCULAS E/OU CÉLULAS VIVAS DE FORMA A REDUZIR VARIABILIDADE NAS PROPRIEDADES QUÍMICAS E FÍSICAS E CONSEQUENTEMENTE NOS RESULTADOS BIOLÓGICOS PRODUZIDOS PELA GOMA GELANA, AUMENTANDO A SUA EFICÁCIA NA REGENERAÇÃO DE TECIDOS VIVOS EM ENSAIOS CELULARES ANTES E/OU APÓS IMPLANTAÇÃO EM ANIMAIS E/OU HUMANOS, O QUE IRÁ PERMITIR UMA TRANSFERÊNCIA MAIS EFICAZ DO POTENCIAL DE APLICAÇÃO MÉDICO DA GOMA GELANA PARA O CONTEXTO CLÍNICO.

Description

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DESCRIÇÃO

HIDROGÉIS À BASE DE GOMA GELANA PARA UTILIZAÇÃO EM MEDICINA REGENERATIVA E ENGENHARIA DE TECIDOS, SEU SISTEMA E DISPOSITIVOS DE PROCESSAMENTO

OBJECTO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se ao processamento e aplicação da goma gelana em abordagens de medicina regenerativa e de engenharia de tecidos, focando processos para acondicionamento, manipulação, processamento para diversas estruturas, reticulação iónica controlada da goma gelana, assim como para combinação desta com bio moléculas e/ou células vivas de forma a reduzir variabilidade nas propriedades químicas e físicas e consequentemente nos resultados biológicos produzidos pela goma gelana, aumentando a sua eficácia na regeneração de tecidos vivos em ensaios celulares antes e/ou após implantação em animais e/ou humanos. Tal irá permitir uma transferência mais eficaz do potencial de aplicação médico da goma gelana para o contexto clínico.

ESTADO DA TÉCNICA

Os hidrogéis são normalmente definidos por serem redes de cadeias poliméricas com grande capacidade de absorção de água, significando isto que quando colocados em meio aquoso conseguem absorver água e aumentar de volume através da absorção e retenção de água na malha polimérica. Os hidrogéis têm actualmente várias 1 5608 aplicações no campo alimentar, como espessantes e aditivos de produtos alimentícios, assim como no campo médico, onde são utilizados no fabrico de lentes de contacto e como revestimentos de comprimidos, apenas para citar alguns exemplos.

No campo técnico no qual se insere esta invenção, os hidrogéis têm sido utilizados na libertação controlada de fármacos e na regeneração de diversos tipos de tecidos. Este último campo de conhecimento designa-se comummente por engenharia de tecidos ou medicina regenerativa e a sua abordagem mais frequente consiste em reconstruir um determinado tipo de tecido recorrendo a um biomaterial processado que servirá de suporte ao crescimento e desenvolvimento de células relevantes em condições adequadas ao seu cultivo.

Esta abordagem surge em resposta à ineficiência dos métodos convencionais na regeneração e restabelecimento de função de tecidos danificados. Os métodos convencionais englobam a utilização de tecidos de dadores que, para além de não estarem disponíveis em grande parte das situações, acarretam muitas vezes rejeição imunológica e transmissão de doenças para o receptor. 0 uso de tecidos do uma opção que pode eliminar de existirem em condições métodos efectuados para frequentemente morbidade no próprio paciente é igualmente alguns destes pontos, no caso adequadas. No entanto, os a sua utilização criam local de colheita e requerem 2 5608 tempos muito alargados de cirurgia, situações estas gue são desaconselhadas.

Uma outra aproximação usada actualmente consiste no uso de próteses à base de diferentes tipos de materiais como polietileno, silicone, titânio que substituem fisicamente o tecido perdido. Esta não é igualmente a solução ideal dado que as próteses apresentam um tempo de vida definido o que implica a necessidade de nova cirurgia para remoção da prótese antiga e implantação de uma nova, ocorre por vezes o desajuste entre implante e tecido receptor já que a prótese substitui mas não regenera o tecido danificado nem é incluída pelos tecidos circundantes, e por último, pode gerar taxas de infecção maiores decorrentes do processo cirúrgico. A engenharia de tecidos aparece como uma nova forma de abordar estas situações e envolve a regeneração de tecidos como por exemplo osso, cartilagem e pele. Recorre normalmente ao cultivo de células em suporte poliméricos que deverão criar as condições necessárias para a criação de uma matriz extracelular semelhante à que existia anteriormente, fazendo com que deste modo o tecido recupere a sua funcionalidade e possa ser de novo reintegrado na restante estrutura tecidular. Paralelamente, o biomaterial utilizado deverá ser biodegradável e originar produtos de degradação não tóxicos, sendo idealmente removido pelo organismo à mesma taxa de formação do novo tecido formado. 3 5608

Diversas características dos hidrogéis justificam a sua aplicação potencial em medicina regenerativa e engenharia de tecidos, como por exemplo a elevada biocompatibilidade normalmente apresentada, resultado do seu elevado teor em água, e a semelhança estrutural com diversos tipos de tecidos moles. Diversos hidrogéis, que com base na sua origem podem ser divididos em sintéticos e naturais, têm sido usados neste tipo de aplicações.

Muito embora o campo da medicina regenerativa e engenharia de tecidos seja relativamente recente (o artigo cientifico mais relevante nesta área data de 1993), várias descobertas importantes têm sido feitas e o conhecimento cresce a um ritmo impressionante. Ainda assim, a investigação ocorre continuamente indicando que a solução óptima não foi ainda encontrada.

Os produtos pa ra engenharia de tecidos combinam na maioria dos casos materiais, biomoléculas e células, podendo ser várias as condições de cultivo com vista à melhoria da eficáci a na regeneração funcional do tecido em causa. A insatisfação ao nivel dos resultados prende-se com o facto de não existirem ainda sistemas que consigam cumprir todos os pré requisitos normalmente associados a um produto para engenharia de tecidos. Em certa medida, a eficácia na regeneração de tecidos é comprometida pela elevada complexidade metodológica e tecnológica de muitas das abordagens propostas ou em desenvolvimento. Nestes casos, a elevada complexidade das abordagens 4 5608 investigadas, em desenvolvimento ou propostas como produto condiciona, em muitos casos, a sua eficácia em contexto clinico ou veterinário já que variações na manipulação do produto pelo próprio cirurgião ou clinico podem condicionar fortemente o resultado terapêutico do produto.

Deste modo, para a correcta implementação de novos produtos para engenharia de tecidos é fundamental não só desenvolver materiais que cumpram com os pré requisitos necessários a este tipo de aplicação como também é necessário desenvolver processos que maximizem a reprodutibilidade funcional e a eficácia terapêutica do mesmo enquanto produto. Várias patentes têm sido escritas com base na utilização de polissacáridos para formação de hidrogéis que podem ser usados em diferentes aplicações. Entre estas escolheram-se as mais relevantes no âmbito desta invenção e que são a seguir referidas: A patente US 6129761 de 10 de Outubro de 2000 refere-se a composições de hidrogéis injectáveis que lidam com sistemas de hidrogéis poliméricos e células com utilização na área médica, comummente utilizando hidrogéis à base de alginato para tratamento de deformações craniofaciais, refluxo e incontinência. A Patente US 6136334 de 24 de Outubro de 2000 descreve sistemas de libertação controlada de fármacos para aplicações na área oftalmológica utilizando 5 5608 hidrogéis injectáveis que previnem a adesão pós cirúrgica e conferem protecção oftalmológica à córnea. A patente US 6719797 de 13 de Abril de 2004 descreve sistemas de substituição para discos intervertebrais utilizando polímeros que quando inseridos no disco reticulam e formam hidrogéis ín vivo.

Na patente US 6773713 de 10 de Agosto de 2004 são descritas abordagens de moldação por injecção para a produção de tecidos vivos com uma forma predefinida, que envolve a suspensão de células isoladas numa solução, que é posteriormente inj ectado num molde e induzido a formar um hidrogel que pode ser implantado posteriormente. A patente US 6790840 de 14 de Setembro de 2004 descreve métodos de preparação e usos potenciais de hidrogéis que podem ser reticulados reversivelmente através de agentes específicos controlando desta forma características importantes dos hidrogéis como propriedades mecânicas e taxas de degradação.

Na patente US 7078032 de 18 de Julho de 2006 são descritas células modificadas geneticamente para sobreexpressarem agentes biológicos importantes que são normalmente produzidos em pequenas quantidades nas células. Os inventores descrevem o seu uso conjunto com diferentes suportes poliméricos no tratamento de vários tipos de patologias, maioritariamente focadas na área do cancro. 6 5608

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

Para uma melhor compreensão da invenção, são apresentadas em anexo, a titulo não limitativo, figuras ilustrativas, nas quais: A figura 1 representa discos produzidos a partir de goma gelana. A figura 2 representa membranas produzidas a partir de goma gelana. A figura 3 representa fibras produzidas a partir de goma gelana. A figura 4 representa partículas produzidas a partir de goma gelana. A figura 5 representa suportes 3D com estrutura não orientada produzidos a partir de goma gelana. A figura 6 representa suportes 3D com estrutura orientada produzidos a partir de goma gelana. A figura 7 representa graficamente a avaliação do efeito citotóxico dos discos produzidos a partir de goma gelana. A figura 8 representa colorações para componentes da matriz extracelular cartilaginosa de secções histológicas de sistemas de goma gelana com condrócitos articulares humanos encapsulados cultivados durante 8 semanas. 7 5608 A figura 9 representa graficamente valores guantitativos da produção de componentes da matriz extracelular cartilaginosa pelos sistemas de goma gelana com condrócitos articulares humanos encapsulados. A figura 10 representa os locais de incisão para colocação subcutânea dos discos de goma gelana em ratinhos Balb/c. A figura 11 representa a coloração de secções histológicas dos discos de goma gelana implantados em ratinhos Balb/c em diferentes períodos. A figura 12 representa um sistema de mistura e aplicação da goma gelana. A figura 13 representa um sistema alternativo para mistura e aplicação da goma gelana. A figura 14 representa o sistema alternativo da figura 13 depois do doseamento da goma gelana.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO O objecto da presente invenção é o processamento e aplicação da goma gelana em abordagens de medicina regenerativa e de engenharia de tecidos. Este biomaterial reúne muitos dos pré-reguisitos necessários para a sua aplicação clínica potencial em produtos para engenharia 8 5608 de tecidos e medicina regenerativa, tendo sido até agora pouco investigado para estes casos.

Neste contexto, a presente invenção refere-se ao processamento e aplicação da goma gelana em abordagens de medicina regenerativa e de engenharia de tecidos, descrevendo, para tal, processos para acondicionamento, manipulação, processamento para diversas estruturas, reticulação iónica controlada da goma gelana, assim como para combinação desta com biomoléculas e/ou células vivas de forma a reduzir variabilidade dos resultados biológicos produzidos e aumentar a eficácia da goma gelana na regeneração de tecidos vivos após implantação em animais e/ou humanos. A goma gelana é um polissacárido secretado pela bactéria Sphingomonas paucimobílís tendo sido inicialmente descrita por Moorhouse et al. É um polissacárido aniónico composto por unidades repetitivas de glucose, ácido glucurónico e ramnose. Existe habitualmente em duas formulações: uma com maior grau de acetilação sendo esta o produto bacteriano inicial, e uma com menor grau de acetilação resultante de processamento, sendo esta a mais comum.

Ambas formam géis termoreversiveis com comportamentos mecânicos diferentes. A goma gelana tem um mecanismo de gelificação ionotrópico, semelhante a outros polissacáridos como o alginato ou a carragenina, sendo a presença de iões necessária para a formação de um hidrogel estável. 9 5608 A goma gelana pode ser dispersa homogeneamente numa solução aquosa a uma temperatura que promova a linearização das cadeias e pode, através da diminuição da temperatura e na presença de catiões, organizar-se dando origem a um hidrogel.

Para além da gelificação catalisada pela temperatura, é possivel formar hidrógeis de goma gelana através de variações de pH. A goma gelana pode ser solubilizada em pH alcalino e precipitar a pH ácido, podendo este processo ser conduzido à temperatura ambiente. Podem criar-se diversas estruturas à base de goma gelana recorrendo a métodos simples de processamento que envolvam controlo de temperatura e/ou pH. A preparação dos hidrogéis pode ser feita utilizando: • dispersões de goma gelana em água ultrapura e destilada com constituição mineral controlada de forma a permitir o seu acondicionamento sem ocorrência de gelificação prematura, • soluções de reticulação que consistem num tampão fosfato salino com constituição controlada. • dispersões de goma gelana numa solução alcalina, podendo esta ser, por exemplo, de hidróxido de sódio; 10 5608 soluções de reticulação que consistem numa solução ácida, podendo esta ser, por exemplo, de ácido clorídrico.

Aliadas às caracteristicas já referidas, outras existem que justificam a adequação da goma gelana para aplicações no contexto da medicina regenerativa e engenharia de tecidos. Para além de poder ser facilmente processada recorrendo a métodos simples e não agressivos, a goma gelana exibe um elevado grau de biocompatibilidade, é constituída por monossacáridos que podem servir como fonte de carbohidratos, apresenta semelhanças estruturais com alguns tecidos como é o caso da cartilagem com a qual partilha a molécula de ácido glucurónico presente na matriz extracelular, e é um material abundante e economicamente pouco dispendioso. Para além disto, a goma gelana tem sido utilizada para a libertação controlada de fármacos, como é o caso da utilização em ensaios in vivo com pacientes humanos como um veiculo para libertação controlada de drogas a nível ocular. 1 o r

Os estudos relativos à utilização deste biomateria em medicina regenerativa e engenharia de tecidos sã pouco frequentes à data, estando no entanto a se amplamente desenvolvidos pelos autores desta invenção. aborda o processamento abordagens de medicina tecidos de uma forma e a aplicação regenerativa e não descrita

Esta invenção da goma gelana em de engenharia de previamente. 11 5608

Os autores descrevem aqui novas abordagens para acondicionamento, manipulação, processamento para diversas estruturas, reticulação iónica controlada, e combinação da goma gelana com biomoléculas e/ou células vivas. Estes processos permitem reduzir a variabilidade dos resultados biológicos produzidos e aumentar a eficácia da goma gelana na regeneração de tecidos vivos após implantação em animais e/ou humanos.

Estes processos podem ser reproduzidos utilizando dois sistemas complementares, podendo ambos estar incorporados num mesmo dispositivo:

Sistema de processamento para mistura e doseamento (extrusão/injecção) da goma gelana que monitoriza parâmetros como a temperatura e o pH e possibilita o ajuste destes em tempo real; • Sistema de define as solução de solução de solventes e ajuste da composição da goma gelana que relações entre o volume/concentração da goma gelana e o volume/concentração da reticulação através da adição de solutos, agentes reticulantes.

Com base nestes dois sistemas podem ser fabricadas diferentes estruturas como membranas, partículas, fibras, ou estruturas porosas. Estes hidrogéis podem também ser directamente injectados no preenchimento de cavidades ou defeitos de geometria diversa em animais e/ou humanos. 12 5608

Os hidrógeis produzidos podem ser constituídos apenas pelo material, pelo material combinado com diferentes tipos de biomoléculas, pelo material combinado com diferentes tipos de células, ou pelo material combinado com diferentes tipos de biomoléculas e tipos de células.

Os referidos hidrogéis podem ser combinados com qualquer tipo de biomoléculas utilizadas na reqeneração de tecidos músculo-esqueléticos, podendo estas incluir factores angiogénicos, antibióticos, anti-inflamatórios, factores de crescimento, e compostos indutores de diferenciação celular, entre outros. O hidrogel poderá ser combinado com células utilizadas na regeneração de tecidos músculo- esqueléticos, podendo estas ser de origem autóloga, serem provenientes de um dador ou de uma linha celular previamente estabelecida, sendo exemplos de células passíveis de serem incluídas, condrócitos ou células que possam dar origem a condrócitos, células ósseas ou células que possam dar origem a células ósseas, células musculares ou células que possam dar origem a células musculares. A novidade da invenção face ao actual estado da técnica recai nos seguintes pontos: • Uso de um material especifico, a goma gelana, para abordagens de medicina regenerativa e engenharia de tecidos; 13 5608 • Controlo rigoroso dos parâmetros de gelificação e consequentemente das propriedades da goma gelana com base na utilização de sistema de processamento para mistura e doseamento (extrusão/injecção), que monitoriza parâmetros como a temperatura e o pH e possibilita o ajuste destes em tempo real, e de sistema de ajuste da composição da goma gelana que define as relações entre o volume/concentração da solução de qoma qelana e o volume/concentração da solução de reticulação, podendo ambos os sistemas estar incorporados num mesmo dispositivo. • Desenvolvimento de sistemas que reduzem a manipulação directa de hidrogéis baseados em goma gelana pelo próprio cirurgião ou clinico de forma a reduzir variabilidade nas propriedades químicas e físicas e consequentemente os resultados biológicos produzidos pela goma gelana, o que irá permitir uma transferência mais eficaz do potencial de aplicação médico da goma gelana para o contexto clínico.

Os sistemas de mistura e aplicação de goma gelana vão ser detalhadamente descritos de seguida recorrendo ao auxílio das figuras 12 e 13 de forma a proporcionar uma melhor compreensão da invenção. 0 sistema de mistura e aplicação da goma gelana representado pela figura 12 é constituído por um cilindro (1) no qual é realizada a mistura da goma gelana através de um veio de mistura (2) semi-flexível alinhado 14 5608 concentricamente com o eixo longitudinal do cilindro (1) que possui acoplado sol idariamente uma ou mais pás de agitação (3). As pás de agitação (3) asseguram a mistura da goma gelana com biomoléculas e/ou células através da rotação do veio de mistura (2). Parâmetros como a temperatura e o pH do hidrogel podem ser medidos através de sensores de monitorização (4) colocados no cilindro (1) em contacto directo com o hidrogel ligados a um aparelho controlador (10) gue contém igualmente um motor na parte superior responsável pela rotação do veio semi-flexível (2). A temperatura do cilindro pode ser ajustada em tempo real através de um revestimento térmico (5) colocado no cilindro (1). 0 doseamento/injecção da goma gelana ou da mistura desta com biomoléculas e/ou células é realizado através do movimento do pistão (6) ao longo do eixo longitudinal do cilindro (1). O ajuste da composição da goma gelana, e que define as relações entre o volume/concentração da solução de goma gelana e o volume/concentração da solução de reticulação, pode ser realizado através de portas de alimentação (7) anexas ao cilindro (1) para adição de solução de goma gelana e/ou solução de reticulação antes ou durante a mistura da goma gelana com biomoléculas e/ou células. O sistema de mistura e aplicação da goma gelana representado pela figura 13 é constituído por um cilindro (1) no qual é realizada a mistura da goma gelana através de um veio de mistura (2) semi-flexível alinhado concentricamente com o eixo longitudinal do cilindro (1) que possui acoplado solidariamente um fole (8) extensível e assimétrico. O fole (8) assegura a mistura da goma 15 5608 gelana com biomoléculas e/ou células através da rotação do veio de mistura (2). O fole (8) extensível e assimétrico possui diversas configurações em serrilha (9) que facilitam a deformação por extensão ou compressão do fole (8). Parâmetros como a temperatura e o pH do hidrogel podem ser medidos através de sensores de monitorização (4) colocados no cilindro (1) em contacto directo com o hidrogel ligados a um aparelho controlador (10) que contém igualmente um motor na parte superior responsável pela rotação do veio semi-flexivel (2). A temperatura do cilindro pode ser ajustada em tempo real através de um revestimento térmico (5) colocado no cilindro (1). O doseamento/injecção da goma gelana ou da mistura desta com biomoléculas e/ou células é realizado através do movimento do pistão (6) ao longo do eixo longitudinal do cilindro (1). O ajuste da composição da goma gelana pode ser realizado através de portas de alimentação (7) anexas ao cilindro (1) para adição solução de goma gelana e/ou solução de reticulação antes ou durante a mistura da goma gelana com biomoléculas e/ou células. A descrição da presente invenção é complementada fazendo referência aos exemplos seguintes que se destinam a proporcionar uma melhor compreensão da mesma, não devendo estes exemplos ser abordados com um carácter limitativo.

Nota: A não ser que seja previamente referido, todos os reagentes são da empresa Sigma-Aldrich Co. 16 5608

Exemplo 1 — Produção de discos e membranas à base de goma gelana utilizando processos dependentes da ternperatura A goma gelana (G1910, Sigma, St. Louis, MO, USA) foi processada utilizando métodos dependentes da temperatura dando origem a diversas estruturas. Discos e membranas de goma gelana foram produzidos da seguinte forma. A goma gelana foi misturada com água destilada e mantida sob agitação constante à temperatura ambiente, resultando numa concentração final de 0.7% peso sobre volume (p/v). A mistura foi progressivamente aquecida até atingir a temperatura de 90°C e mantida a esta temperatura durante 20-30 minutos. Observou-se após este tempo uma completa e homogénea dispersão da goma gelana. Seguidamente, foi adicionado cloreto de cálcio (Merck, DE) à mistura para uma concentração final 0.03% (p/v) e a temperatura foi progressivamente reaj ustada para 50°C. A mistura foi depositada em moldes cilíndricos e permitida a sua permanência durante 2-5 minutos à temperatura ambiente até que se formasse um gel sólido. Discos de goma gelana foram produzidos utilizando uma ferramenta de corte circular (0 6+0.01 mm x 5.5+0.46 mm altura). (Figura 1)

Em relação à produção de membranas de goma gelana o procedimento foi o seguinte. A mistura foi depositada em placas de Petri e permitida a sua permanência durante 2-5 minutos à temperatura ambiente até que se formasse um gel sólido. As placas de Petri foram depois colocadas num forno à temperatura de 37°C durante 90 minutos. Após este tempo, as placas de Petri foram retiradas do forno e as 17 5608 membranas destacadas com o auxílio de uma espátula. (Figura 2)

Exemplo 2 - Produção de fibras e partículas à base de goma gelana utilizando processos dependentes do pH A goma gelana (G1910, Sigma, St. Louis, MO, USA) foi processada utilizando métodos dependentes da temperatura dando origem a diversas estruturas. Fibras e partículas de goma gelana foram produzidas da seguinte forma. A goma gelana foi misturada com uma solução de hidróxido de sódio 0.10 M e agitada à temperatura ambiente resultando numa concentração final de 4% (p/v) . Fibras de goma gelana foram produzidas através da extrusão da mistura por uma agulha para uma solução de L-ácido ascórbico 20% (v/v) a uma taxa de fluxo contínuo de 0.2 ml/min, utilizando uma agulha de calibre 21. As fibras foram ressuspendidas em água destilada, colocadas à pressão em moldes cilíndricos e mantidas numa estufa a 37°C durante 24 horas. Após esse período foram retiradas dos moldes com o auxílio de uma espátula. (Figura 3)

Em relação à produção de partículas de goma gelana o procedimento foi o seguinte. A mistura foi extrudida por uma agulha gota a gota para uma solução de L-ácido ascórbico 20% em volume (v/v) sob uma taxa de fluxo contínuo a 0.8 ml/min, utilizando uma agulha de calibre 21. As partículas foram retiradas da solução de L-ácido ascórbico e ressuspendidas em água destilada. (Figura 4) 18 5608

Exemplo 3 — Produção de estruturas porosas à base de goma gelana utilizando técnicas simples de processamento de materiais A goma gelana (G1910, Sigma, St. Louis, MO, USA) foi processada sob a forma de discos como descrito no exemplo 1 utilizando métodos dependentes da temperatura, embora este exemplo também possa ser referido para estruturas processadas utilizando métodos dependentes do pH. As estruturas porosas à base de goma gelana foram produzidas com perfis de porosidade distintos, sendo que uns apresentam-se não orientados e outros apresentam-se orientados à escala do micrómetro.

Para a produção de estruturas não orientadas, os discos de goma gelana previamente produzidos segundo o descrito no exemplo 1 foram imersos em azoto liquido durante 1-2 minutos e rapidamente transferidos para um liofilizador (Telstar Cryodos-80, Telstar, Espanha) onde foram liofilizados durante 2 dias. (Figura 5)

Para a produção de estruturas orientadas, os discos de goma gelana previamente produzidos segundo o descrito no exemplo 1 foram colocadas num frigorifico a -80°C durante pelo menos 4 horas e rapidamente transferidos para um liofilizador (Telstar Cryodos-80, Telstar, Espanha) onde foram liofilizados durante 2 dias. (Figura 6) A caracterização da microestrutura foi feita através de tomografia micro-computorizada (μ-CT) utilizando um 19 5608 equipamento Skyscan 1072 (Skyscan, Kontich, Bélgica) de alta resolução. Foram criados modelos virtuais 3D (altura lmm x 0 3mm) de regiões representativas da parte central das estruturas à base de goma gelana.

Exemplo 4 - Avaliação da citotoxicidade dos hidrogéis à base de goma gelana A avaliação da eventual citotoxicidade das estruturas processadas à base de goma gelana foi realizada utilizando o teste normalizado MTS (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-5(3-carboximetoxifenil)-2(4-sulfofenil)-2H-tetrazólio) de acordo com a norma ISO/EN 10993 parte 5. Este teste determina se as células estão metabolicamente activas quando em contacto com os extractos retirados das estruturas e é comummente usado em ensaios de viabilidade celular. Utilizou-se látex como controlo positivo para a morte celular dada a sua elevada citotoxicidade, e meio de cultura como controlo negativo para a morte celular. As células utilizadas nos testes são provenientes duma linha celular de fibroblastos pulmonares de rato - L929, adquirida no Banco Europeu de Culturas Celulares (ECACC) e foram cultivadas em monocamada em meio de cultura Eagle Dulbecco modificado (DMEM) suplementado com 10% (v/v) de soro fetal bovino (Biochrom, Berlim, Alemanha) e 1% (v/v) de uma mistura de antibiótico-antimicótico.

Discos de goma gelana processados com base na descrição do exemplo 1 foram incubados com meio de cultura durante 24 horas a 37°C com agitação constante, 20 5608 tendo sido seguido o mesmo procedimento em relação ao latex. Células L929 em cultura foram tripsinisadas utilizando uma mistura de tripsina-EDTA (Gibco, Invitrogen Corporation) e postas em cultura a uma densidade de 6.6xl04 células/poço em placas de cultura de 96 poços (200 μΐ/poço). As placas foram incubadas durante 24 horas a 37 °C numa atmosfera húmida com 5% (v/v) de CO2. Após este período, o meio de cultura foi substituído pelos extractos previamente recolhidos (goma gelana e látex) usando meio de cultura como controlo negativo. Após 72 horas, as culturas celulares foram incubadas com o reagente (utilizando meio de cultura sem vermelho de fenol para evitar interferências nas leituras posteriores) durante 3 horas a 37°C numa atmosfera húmida com 5% (v/v) de CO2. O meio de cultura com MTS foi então transferido para novos poços. A densidade óptica, que é directamente proporcional à actividade celular já que reflecte uma medição actividade mitocondrial foi lida num leitor de microplacas (Synergy HT, Bio-TeK Instruments, E.U.A.) a 490 nm (Figura 7). Foi realizada uma análise estatística aos resultados obtidos utilizando um teste estatístico paramétrico, t-test para duas amostras assumindo variâncias desiguais tendo sido usado um n=3.

Exemplo 5 - Ensaios in vitro com culturas primárias de condrócitos articulares humanos

As amostras para isolamento dos condrócitos foram retiradas da cabeça femoral de pacientes adultos (40-65 21 5608 anos) sujeitos a processos de cirurgia reconstrutiva. O procedimento foi feito sob consentimento informado do paciente de acordo com um protocolo estabelecido com o Hospital de S. Marcos, Braga, Portugal tendo sido previamente aprovado pelo seu Comité de Ética. Os condrócitos humanos foram isolados por digestão enzimática e cultivados em meio de expansão constituído por meio de cultura Eagle Dulbecco modificado (DMEM), 10 mM tampão HEPES pH 7.4, 10000 unidades/ml penicilina/10000 gg/ml estreptomicina, 20 mM L-alanina glutamina, lx MEM aminoácidos não essenciais e 10% (v/v) soro fetal bovino (FBS; Biochrom, Berlim, Alemanha) e suplementado com 10 ng/ml de FGF-2 (PeproTech, Reino Unido). As células foram expandidas até um número adequado para serem encapsuladas nos hidrogéis de goma gelana. O procedimento para o encapsulamento dos condrócitos articulares humanos nos hidrogéis de goma gelana e sua posterior cultura nestes suportes foi o seguinte. A goma gelana foi misturada com água destilada e mantida sob agitação constante à temperatura ambiente, resultando numa concentração final de 1% (p/v). A mistura foi progressivamente aquecida até atingir a temperatura de 90°C e mantida a esta temperatura durante 20-30 minutos. Observou-se após este tempo uma completa e homogénea dispersão da goma gelana. Seguidamente, foi adicionado cloreto de cálcio (Merck, Alemanha) à mistura para uma concentração final 0.03% (p/v) e a temperatura progressivamente reajustada para 41-42°C sempre sob agitação constante. Condrócitos articulares humanos (P2) 22 5608 foram recolhidos por tripsinização, misturados com meio de expansão e centrifugados a 200g durante 7 minutos. O sobrenadante foi descartado, as células ressuspendidas numa solução de tampão fosfato salino, contadas utilizando um hemocitómetro e novamente centrifugadas a 200g durante 7 min. O sobrenadante foi novamente descartado e o pellet de condrócitos foi deixado no fundo do tubo. A solução de goma gelana anteriormente preparada e mantida sob agitação constante a uma temperatura de 41-42°C foi então adicionada ao pellet de condrócitos e esta mistura ressuspendida para obtenção de uma distribuição celular homogénea, sendo a concentração final de 8xl06 células/ml. Foram produzidos discos de goma gelana com condrócitos articulares humanos encapsulados através da transferência desta mistura para moldes estéreis de poliestireno, permitindo a permanência da mistura à temperatura ambiente durante 1-2 minutos para permitir a gelificação. Seguidamente, foram cortados discos (0 6+0.01 mm x 5.510.46 mm altura) utilizando uma ferramenta de corte.

Os hidrogéis de goma gelana com condrócitos articulares humanos foram cultivados a 37 °C numa atmosfera húmida com 5% (v/v) CO2 utilizando meio de expansão durante 7 dias, sendo posteriormente substituído o FGF-2 por insulina (1 μρ/ιηΐ) e L-ácido ascórbico (50 μς/πιΐ) durante os restantes períodos de cultura que se estenderam até 8 semanas.

Os hidrogéis de goma articulares humanos foram gelana com condrócitos analisados por métodos 23 5608 histológicos e moleculares para avaliação de formação de tecido cartilaginoso e componentes da matriz extracelular, nomeadamente hematoxi1ina-eosina, azul de toluidina, azul de alcian, e safranina-0 na parte histológica (Figura 8), e PCR semi-quantitativo em tempo real para Sox9, colagénio I, colagénio II e agrecano, utilizando GAPDH como gene conservado (Figura 9).

Exemplo 6 - Implante subcutâneo de discos de goma gelana em ratinhos Balb/c para avaliação de resposta inflamatória

Discos de goma gelana foram preparados num ambiente estéril como descrito no exemplo 1, utilizando neste caso uma concentração final 1% (p/v). Os discos foram implantados subcutaneamente em ratinhos Balb/c (com 2-3 meses, aproximadamente 20 g) até periodos máximos de 3 semanas, tendo sido colocados 4 discos por animal. O procedimento utilizado foi o seguinte. Os ratinhos foram sujeitos a tricotomia na zona da incisão para colocação dos implantes e posteriormente foi administrada intramuscularmente uma mistura 5:1 constituída por Imalgene® 1000 e Domitor® em soro fisiológico. Após verificação de analgesia/anestesia, foram realizadas duas incisões (até um máximo de 1.5 cm) sendo uma na zona intrascapular e outra na zona lombar e criadas bolsas lateralmente a cada incisão (Figura 10). Os hidrogéis de goma gelana foram colocados um por cada bolsa e as incisões suturadas posteriormente. Os animais foram transferidos para câmaras de aquecimento para recuperação da anestesia e quando tal foi verificado foram devolvidos 24 5608 aos compartimentos respectivos. Após os períodos definidos, os animais foram eutanasiados por exposição a um ambiente saturado de dióxido de carbono e os hidrogéis de goma gelana recuperados cirurgicamente. Estes foram posteriormente analisados por métodos histológicos, nomeadamente coloração das secções histológicas com hematoxilina-eosina, Figura 11, onde se encontram apresentados os resultados para 7 dias (à esquerda), 14 dias (ao centro) e 21 dias (à direita).

Qualquer pessoa hábil na técnica a que a presente invenção diz respeito, pode ser capaz de fazer modificações não descritas no presente pedido, cuja aplicação dessas modificações numa estrutura determinada ou no processo de fabrico da mesma, requeira a matéria reclamada nas seguintes reivindicações, as referidas estruturas deverão portanto estar compreendidas dentro do âmbito da presente invenção.

Lisboa, 15 de Fevereiro de 2008 25

Claims

5608 REIVINDICAÇÕES 1. Hidrogéis à base de goma gelana caracterizados por poderem ter graus de acetilação variados e serem passíveis de modificações químicas para incorporarem biomoléculas e/ou células vivas, podendo os hidrogéis ser processados para diversas morfologias tais como partículas, membranas, fibras, discos, estruturas porosas, ou directamente injectado no preenchimento de cavidades ou defeitos de geometria diversa em animais e/ou humanos.
2. Hidrogéis à base de goma gelana de acordo com a reivindicação 1, caracterizados por a sua preparação compreender: • dispersões de goma gelana em água ultrapura e destilada com constituição mineral controlada de forma a permitir o seu acondicionamento sem ocorrência de gelificação prematura, • soluções de reticulação gue consistem num tampão fosfato salino com constituição controlada.
3. Hidrogéis reivindicação compreender: a base de goma gelana de acordo com a 1, caracterizados por a sua preparação 1 5608 • dispersões de goma gelana numa solução alcalina, podendo esta ser, por exemplo, de hidróxido de sódio; • soluções de reticulação que consistem numa solução ácida, podendo esta ser, por exemplo, de ácido clorídrico.
4. Processo para processamento e ajuste de hidrogéis à base de goma gelana caracterizado por compreender: • sistema de processamento para mistura e doseamento (extrusão/injecção) da goma gelana que monitoriza parâmetros como a temperatura e o pH e possibilita o ajuste destes em tempo real, • sistema de ajuste da composição da goma gelana que permite variar as relações entre o volume/ concentração da solução de goma gelana e o volume/concentração da solução de reticulação, através da adição de solutos, solventes e agentes reticulantes.
5. Hidrogéis à base de goma gelana de acordo com as reivindicações lai, caracterizado por o hidrogel ser combinado com qualquer tipo de biomoléculas utilizadas na regeneração de tecidos músculo-esqueléticos, podendo estas incluir factores angiogénicos, antibióticos, anti-inflamatórios, factores de crescimento, e compostos indutores de diferenciação celular. 2 5608
6. Hidrogéis à base de goma gelana de acordo com as reivindicações 1 a 5, caracterizado por o hidrogel ser combinado com células utilizadas na regeneração de tecidos músculo-esqueléticos, podendo estas ser de origem autóloga, serem provenientes de um dador ou de uma linha celular previamente estabelecida, sendo exemplos de células passíveis de serem incluídas, condrócitos ou células que possam dar origem a condrócitos, células ósseas ou células que possam dar origem a células ósseas, células musculares ou células que possam dar origem a células musculares.
7. Hidrogéis à base de goma gelana caract eri zados por serem aplicados na área da engenharia de tecidos e medicina regenerativa, em produtos para investigação no campo da engenharia de tecidos e medicina regenerativa, em testes pré-clínicos ou como produtos para engenharia de tecidos musculo-esqueléticos ou medicina regenerativa.
8. Processo para processamento e ajuste de hidrogéis à base de goma gelana, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por definir as relações entre o volume/concentração da solução de goma gelana e o volume/concentração da solução de reticulação por adição de solutos, solventes e agentes reticulantes, através de portas de alimentação (7) anexas ao cilindro (1) para adição solução de goma gelana e/ou solução de reticulação antes ou durante a mistura da goma gelana com biomoléculas e/ou células. 3 5608
9. Dispositivo para processamento de hidrogéis à base de goma gelana caracterizado por incorporar: • um sistema de processamento para mistura e doseamento (extrusão/injecção) da goma gelana gue monitoriza parâmetros como a temperatura e o pH e possibilita o ajuste destes em tempo real, • um sistema de ajuste da composição da goma gelana que define as relações entre o volume/concentração da solução de goma gelana e o volume/concentração da solução de reticulação,
10. Dispositivo para processamento de hidrogéis à base de goma gelana de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por compreender: • um cilindro (1) para mistura da goma gelana através de um veio de mistura (2) semi-flexivel alinhado concentricamente com o eixo longitudinal do cilindro (1) com uma ou mais pás de agitação (3), • um veio de mistura (2) que através do movimento de rotação e consequentemente das pás de agitação (3),assegura a mistura de biomoléculas com a goma gelana • um veio de mistura (2) que através do movimento de rotação e consequentemente das pás de agitação (3),assegura a dispersão de células na goma gelana 4 5608 • um aparelho controlador (10) de parâmetros como a temperatura e o pH do hidrogel medidos através de sensores de monitorização (4) colocados no cilindro (1) em contacto com o hidrogel, • um revestimento térmico (5) localizado no cilindro (1), que possibilita o ajuste da temperatura em tempo real • um pistão (6) que permite o doseamento/injecção da goma gelana ou da mistura desta com biomoléculas e/ou células através do movimento ao longo do eixo longitudinal do cilindro (1).
11. Dispositivo para processamento de hidrogéis à base de goma gelana de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por compreender: • um cilindro (D para mistura da goma gelana através de um veio de mistura (2) semi-flexível alinhado concentricamente com o eixo longitudinal do cilindro (1), com um fole (8) semirígido retráctil e não simétrico, • um veio de mistura (2) que através do movimento de rotação e consequentemente do fole (8) semirígido retráctil e não simétrico, assegura a mistura de biomoléculas com a goma gelana 5 5608 • um veio de mistura (2) que através do movimento de rotação e consequentemente do fole (8) semirígido retráctil e não simétrico, assegura a dispersão de células na goma gelana • um aparelho controlador (10) de parâmetros como a temperatura e o pH do hidrogel medidos através de sensores de monitorização (4) colocados no cilindro (1) em contacto com o hidrogel, • um revestimento térmico (5) localizado no cilindro (1), que possibilita o ajuste da temperatura em tempo real • um pistão (6)que permite o doseamento/injecção da goma gelana ou da mistura desta com biomoléculas e/ou células através do movimento ao longo do eixo longitudinal do cilindro (1) • diversas configurações em serrilha (9) no fole (8) extensível e assimétrico, que facilitam a deformação por extensão ou compressão do fole (8). Lisboa, 15 de Fevereiro de 2008 6