HU220257B

HU220257B - Poliszacharid gélkészítmények

Info

Publication number: HU220257B
Application number: HU9901714A
Authority: HU
Inventors: Bengt Ágerup
Original assignee: Q Med Ab
Priority date: 1995-07-17
Filing date: 1996-05-28
Publication date: 2001-11-28
Also published as: BR9609534B1; CN1083849C; CN1190974A; GR3037065T3; CZ290755B6; JPH11509256A; BR9609534A; EA001500B1; ATE204000T1; PL188071B1; KR100314488B1; AU700215B2; US5827937A; NO315274B1; DE839159T1; DK0839159T3; EA199800133A1; HUP9901714A3; SK6198A3; WO1997004012A1

Description

A találmány biokompatibilis poliszacharid gélkészítményekre, továbbá ezen készítmények előállítására szolgáló új térhálósító eljárásra vonatkozik, amellyel egy új gélszerkezetet alakítunk ki. Az új szerkezet a korábban ismert gélkészítményeknek javított tulajdonságokat biztosít, valamint lehetővé teszi a készítmények új felhasználását is, mind magának a gélkészítménynek, mind a hatóanyagot tartalmazó készítménynek. A vízmegkötő tulajdonságú géleket széles körben alkalmazzák a biomedicinák területén. Ezeket általában a polimerek kémiai térhálósításával állítják elő, amikor is egy óriás hálószerkezetet nyernek. Ha biokompatibilis polimereket alkalmaznak, általában a térhálósítás foka alacsony, hogy megtartsák a biokompatibilitást. Azonban gyakran sűrűbb gélekre van szükség, hogy a hatóanyagok megfelelő hatását ki lehessen használni, és ilyen esetekben a biokompatibilitás veszendőbe megy.

A vízmegkötő gélek vagy hidrogélek másik értékes tulajdonsága, hogy képesek magukba zárni peptideket és nagyobb biológiailag aktív anyagokat, és így nyújtott felszabadulású készítmények alakíthatók ki. Azonban a gyakorlatban problémák merülnek fel a hatóanyag elegendő ideig történő megtartásával, mivel általában a hatóanyag azonos mértékben szabadul fel, mint ahogy oldódik vagy bezáródik a készítménybe. Továbbá, ha a géleket sűrítik a hatóanyag hosszabb időn át történő megtartására, az az állati szövettel érintkezve, amelyben szabadon hozzáférhető víz van jelen, igen gyorsan duzzad.

Egyike a legszélesebb körben alkalmazott biokompatibilis polimereknek a gyógyászati területen a hialuronsav. Mivel ez azonos összetételben jelen van minden élő szervezetben, a legkevesebb reakciót adja és lehetővé válik fokozott gyógyászati felhasználása. Ennek következtében ez az anyag számos módosítási kíséretnek a tárgya. így például térhálósítják különböző anyagokkal, így például aldehidekkel, epoxidokkal, poliaziridilvegyületekkel és divinil-szulfonnal (Laurent és munkatársai, Acta Chem. Scand. 18 (1964) No 1, 274; EP 0 161 887B1; EP 0 265 116A2; és US 4 716 154 számú szabadalmi leírások).

A WO 87/07898 számú közzétételi iratban poliszacharid és polifunkciós epoxidok reakcióját ismertetik, amelynél a reakció után az epoxidfelesleget eltávolítják, majd egy szárítási művelettel a poliszacharidot térhálósítják és filmmé, porított anyaggá vagy más egyéb száraz termékké alakítják. Azonban a leírás nem tesz említést az aktivált poliszacharid hígítására, majd ismételt koncentrálására a kívánt sűrűség vagy konzisztencia elérésére, amely ezután állandó marad.

Az US 5 128 326 számú szabadalmi leírásban módosított hialuronsavakat és ezek alkalmazását ismertetik késleltetett felszabadulású készítményekben. A leírt módszer, amellyel a gélkészítményt „töltik”, az aktív anyagnak a gélbe való diffúzióján alapszik, amely azután felszabadul azonos diffúziós konstanssal. Ezzel szemben a jelen találmány szerinti megoldásnál a hatóanyagot oldjuk, majd a gélkészítményt besűrítjük vagy koncentráljuk addig, amíg a hatóanyag semmilyen vagy csak csekély diffúziója megy végbe.

Az US 5 399 352 számú szabadalmi leírásban gél és polimer oldatok keverékét ismertetik, amely oldatok a gél reológiai tulajdonságainak javítására szolgálnak.

Itt azonban reverzibilisen sűrített géleket ismertetnek, mint az a leírás 6. oszlop 53-58. sorából kitűnik.

Meglepetésszerűen azt találtuk, hogy új szerkezetű és ezáltal új, rendkívüli tulajdonságú poliszacharid gélkészítményeket tudunk előállítani egy új térhálósítási eljárással. Ez az új térhálósítási eljárás az előállított poliszacharid gélkészítmény szerkezetének és tulajdonságainak sokoldalúbb szabályozását teszi lehetővé, ami viszont azt teszi lehetővé, hogy a végső készítményt a kívánt felhasználási területhez igazítsuk.

Közelebbről, a találmányunk célja térhálósított poliszacharid gélkészítmények előállítási eljárásának biztosítása, amelyek biokompatibilitása megmarad a nagyfokú térhálósítás vagy polimerizáció ellenére is.

A találmány további célja poliszacharid gélkészítmény biztosítása, amelyek viszkoelasztikus tulajdonságúak annak ellenére, hogy lényeges mértékben térhálósítottak.

A találmány további célja poliszacharid gélkészítmény biztosítása, amely lényegében irreverzibilisen tömörített vagy koncentrált, azaz, amely nem duzzad lényegesen vagy csak igen kis mértékben, amikor vízzel érintkezik.

A találmány további célja poliszacharid gélkészítmény biztosítása, amely biológiailag aktív anyagokat foglal magában, és amely nyújtott felszabadulású vagy késleltetett felszabadulású készítményként alkalmas.

A találmány további célja poliszacharid gélkészítmény biztosítása, amely különböző, biológiailag aktív anyagokat tartalmaz, és amelyek alkalmasak gyógyászati vagy profilaktikus készítményként történő felhasználásra különböző területeken.

A találmány további célja a fenti készítmény alkalmazása gyógyászati vagy profilaktikus készítmények előállítására, valamint emlősöknek, különösen embereknek történő adagolásra.

A találmány további célja részlegesen térhálósított, aktivált poliszacharid gélkészítmények biztosítása, amely intermedierként szolgál a fenti találmány szerinti eljárásnál, és amely intermediert in situ a kívánt helyen térhálósítjuk a végleges formára.

A fenti és további célok részletesen kitűnnek a találmány leírásából.

A fentiek alapján a találmány tárgya eljárás térhálósított, biokompatibilis poliszacharid gélkészítmények előállítására oly módon, hogy

- vizes oldatot állítunk elő egy vízoldható, térhálósítható poliszacharidból;

- megindítjuk a poliszacharid térhálósodását egy polifunkciós térhálósítószer jelenlétében;

- szférikusán gátoljuk a térhálósító reakciót, mielőtt gélesedés bekövetkezne, így egy aktivált poliszacharidot nyerünk; és

- ismételten szférikusán nem gátolt körülményeket alkalmazunk az aktivált poliszacharid számára, és így folytatjuk a térhálósítást, amíg viszkoelasztikus gélt nyerünk.

HU 220 257 Β

Más szavakkal, a találmány szerinti új eljárásnál a vízoldható, térhálósítható poliszacharid térhálósítását legalább két lépésben vagy szakaszban végezzük, amelynél a térhálósítási reakciót megszakítjuk, mielőtt a gélesedés megindulna, ezt a megszakítást a térhálósító reakció szférikus gátlásával végezzük. A térhálósító reakciót ezután egy második lépésben folytatjuk, amikor is ismételten szférikusán nem gátolt körülményeket alkalmazunk.

Ily módon először meglepetésszerűen azt találtuk, hogy a szférikus gátlással olyan aktivált poliszacharidot nyerünk, amelynél a térhálósítást vagy polimerizációt tovább folytathatjuk csupán a szférikusán nem gátolt körülmények ismételt alkalmazásával. Továbbá, meglepetésszerűen azt is találtuk, hogy az így nyert poliszacharid gélkészítmény nem alkot egy kompakt sűrű szerkezetet, amelyet akkor kapnánk, ha a megfelelő térhálósító reakciót egyetlen lépésben végeznénk a teljesen térhálósított, de inkább viszkoelasztikus gél nyeréséig. Továbbá, mint ahogy azt már említettük, a találmány szerinti eljárással nyert új gélszerkezet egy lényegében irreverzibilis gélszerkezetet mutat, amely az elfogadható mértéket meghaladó mértékben nem duzzad vízzel vagy más vizes közeggel való érintkezéskor. Általában ez azt jelenti, hogy ez az ismételt duzzadás kisebb, mint 10 térfogat% viszonyítva ahhoz a térfogathoz, amelyet az eljárás során nyertünk.

Bár nem kívánunk semmilyen elmélethez kötődni, lehetséges, hogy a kapott új szerkezet inkább a meglévő polimer láncok térhálósodásának és a meglévő láncok meghosszabbodásának kombinációja, mint egy merev szerkezetet eredményező igen sűrű háló. Amit ez a mechanizmus biztosít, az a tény, hogy a találmány szerinti eljárással viszkoelasztikus terméket nyerünk.

A „térhálósító reakciót szférikusán gátló” kifejezést igen szélesen kell értelmezni, azaz ez nem jelent szükségszerűen teljes gátlást, hanem sok esetben inkább a reakció részleges gátlását. Azaz, ami fontos, hogy a térhálósítás mértéke lényegesen csökken, és igy lehetséges, hogy a végső térhálósító reakció végbemenetelénél új reakcióképes helyek vesznek részt.

Hasonlóképpen a „szférikusán nem gátolt körülmények visszaállítása” kifejezést is szélesen kell értelmezni, ez általában azt jelenti, hogy az említett, szférikusán nem gátolt körülményeknek nem kell szükségszerűen pontosan ugyanazoknak a szférikus körülményeknek lenni, amelyeket a térhálósító reakció megindításánál alkalmaztunk. Ily módon, ami általában fontos, hogy a szférikusán nem gátolt körülmények sokkal gyorsabb reakció végbemenetelét teszik lehetővé, mint a szférikusán gátolt körülmények.

A térhálósító reakció szférikus gátlását különböző módon érhetjük el, a találmány egy előnyös kiviteli módja az, amikor a sztérikus gátlást a vizes közeg hígításával érjük el, amely közegben a térhálósító reakciót végezzük, így a közegben a poliszacharid kisebb koncentrációját biztosítjuk.

A szférikusán nem gátló körülmények visszaállítását szintén különböző módon végezhetjük, egy előnyös kiviteli módozatnál ezt a vizes közeg bepárlásával érjük el, amely közegben a térhálósító reakciót végezzük, ily módon a közegben a poliszacharid nagyobb koncentrációját biztosítjuk. Egy másik előnyös kiviteli módozatnál a vizes közeget, amelyben a térhálósító reakció végbemegy, dializáljuk.

A találmány egy előnyös kiviteli módozatánál a térhálósító reakció sztérikus gátlását azelőtt végezzük, mielőtt a térhálósítószer elfogy. Ez viszont általában azt jelenti, hogy a szférikusán nem gátolt körülmények visszaállítását is az említett, nem elfogyott térhálósítószer jelenlétében kell indítani.

A térhálósító reakció sztérikus gátlását általában a találmány szerinti eljárásnál alkalmazott összgélesedési idő 50-90%-ában indítjuk vagy végezzük, figyelembe kell venni továbbá a készítmény kívánt felhasználási területéhez alkalmas elaszticitást vagy konzisztenciát.

A találmányi gondolat alkalmazható bármilyen biokompatibilis poliszacharid esetén, amely térhálósítható és amely vizes közegben oldható. A „vízben oldható” kifejezést szélesen kell értelmezni, az oldószer nem szükségszerűen a tiszta víz. Azaz, a vizes oldat jelenthet bármilyen oldatot, amelyben a víz a fő komponens. A találmány szerinti megoldásnál előnyös poliszacharid alcsoport azonban például a glükóz-amin-glükán, amelynek a hialuronsav egy különösen fontos példája.

A találmány szerinti eljárásnál felhasználásra kerülő térhálósítószer lehet bármilyen, eddig a poliszacharidokkal kapcsolatban ismert térhálósítószer, figyelembe véve azt, hogy a kívánt biokompatibilitásnak eleget tesznek. Előnyösen azonban térhálósítószerként aldehideket, epoxideket, poliaziridilvegyületeket, glicidil-étereket és divinil-szulfonokat alkalmazunk. Ezek közül előnyösek a glicidil-éterek, amelyek közül előnyösként említjük az 1,4-bután-diol-diglicidil-étert. Ezzel kapcsolatban megemlítjük, hogy a „polifunkciós” kifejezés a difunkciós vegyületeket is magában foglalja.

A polifunkciós térhálósítószer jelenlétében végzett kezdeti térhálósító reakciót végezhetjük különböző pHértéken, elsődlegesen függően attól, hogy éter- vagy észterreakciót viszünk-e végbe. Előnyösen ez azt jelenti, hogy a térhálósító reakciót alkalikus pH-értéken, különösen pH=9 felett, így például pH=9-12 közötti értéken végezzük, ha éterkötést akarunk kialakítani. Ha észterkötés kialakítása a cél, a térhálósító reakciót előnyösen savas pH, különösen pH=2-6 közötti értéken végezzük.

Egy különösen fontos szempontja a találmány szerinti megoldásnak az, hogy az előállított térhálósított poliszacharid gélkészítményt önmagában, mint olyat alkalmazzuk, mivel a találmány lehetővé teszi a viszkoelasztikus készítmény előállítását. Az ilyen viszkoelasztikus készítmények alkalmazhatók például a szemsebészetben, ízületifolyadék-helyettesítőként, szemcseppként stb., és mint azt már az előzőekben említettük, a találmány szerinti megoldás lehetővé teszi a viszkoelasztikus tulajdonságok megfelelő kialakítását az ilyen felhasználásokhoz. így a találmány szerinti sztérikus technológia alkalmazásával lehetséges a lánchosszabbítást, láncelágazást, térhálósítást stb. sokkal szabályozottabb

HU 220 257 Β mértékben létrehozni, mint azt a korábban alkalmazott technikák lehetővé teszik a többé-kevésbé randomizált kötési helyekkel.

Továbbá, annak következtében, hogy a találmány szerinti eljárással nyert gélek megtartják eredeti térfogatukat vizes közegben, az új termékek nem okoznak semmiféle zavaró vagy negatív térfogati hatást ennél vagy más gyógyászati felhasználásnál.

A találmány értelmében lehetséges a poliszacharid gélkészítménybe bármilyen biológiailag aktív anyagot befoglalni, amely számára a poliszacharid gélhordozó kívánt vagy elfogadott. Ezzel kapcsolatban a hígításbetöményítés módszere, amelyet a találmány szerinti eljárásnál alkalmazunk, lehetővé teszi az említett biológiailag aktív anyag befoglalását azelőtt, mielőtt a poliszacharidot a szférikusán nem gátolt körülményeknek vetjük alá. Azaz, míg a szférikusán nem gátolt körülmények általában egy betöményítési műveletet jelentenek, egy ilyen művelet azt jelenti, hogy a biológiailag aktív anyag olyan fázisban lesz jelen, amely tömörebb, mint amikor az anyagot a hordozóba befoglaltuk. Más szavakkal, a biológiailag aktív anyagot sokkal hosszabb ideig megtarthatjuk, viszonyítva a korábban ismert géltérhálósítási reakciókhoz. Ezáltal egy jobb nyújtott felszabadulási profilt biztosítunk a hatóanyagnak.

A biológiailag aktív anyagnak a készítménybe való beépítésénél előnyösen fiziológiai pH és só körülményeket biztosítunk, hogy a készítmény gyógyászati célra felhasználható legyen. Az ilyen fiziológiai beállítás előnyösen vonatkozik mind a reakciókörülményekre, mind az eljárás második lépésére, és ilyen körülmények között az eljárás jól megy végbe.

A találmány nem korlátozódik semmilyen vonatkozásban azon biológiai anyagokra, amelyeket előzőleg alkalmaztak. Ez azt jelenti, hogy a kezelni kívánt tünetek a meghatározók a kiválasztott adott anyagra nézve.

Azonban néhány különösen fontos anyagot a találmány szerinti megoldással kapcsolatban megemlítünk, ezek lehetnek például a következők: hormonok, citokinek, vakcinák, sejtek és szövetfokozó anyagok. így a találmány szerinti új gélkészítmény egyedülálló tulajdonságainak kombinációja a géleket különösen előnyössé teszi ezen anyagokkal kapcsolatban, köszönhetően elsődlegesen a rendkívüli késleltetett vagy nyújtott felszabadulási tulajdonságoknak és a nem duzzadást tulajdonságoknak.

Egy különösen fontos csoportja a biológiailag aktív anyagoknak a szövetfokozó anyagok, mivel a poliszacharid gél egy igen előnyös hordozó ezek számára. Ilyen termékekről részletesebb ismertetés található a WO 94/21299 számú közzétételi iratban. Közelebbről, egy előnyös szövetfokozó anyag egy polimert tartalmaz, amely lehet kollagén, keményítő, dextranomer, polilaktid és ezek kopolimerjei, továbbá ροΐί-β-hidroxibutirát és kopolimerjei.

A hormonok közül különösen előnyös az eritropoeitin és a kalcitonin.

A találmány szerinti eljárás lehetővé teszi továbbá a poliszacharid gélszerkezetbe biológiailag aktív anyagok beépítését kémiai reakció révén vagy a poliszacharid térhálósítószere révén, feltéve, hogy az említett hatóanyag tartalmaz a poliszachariddal reakcióképes funkciós csoportot. Egyedülálló tulajdonságokat vagy tulajdonságkombinációkat lehet ily módon nyerni, mivel például a hatóanyag felszabadulásának mértékét a polimer háló degradációja vagy bomlása dönti el inkább, mint az anyagnak a gélszerkezetből történő kioldódásának vagy migrációjának mértéke.

Ez utóbbiként említett találmány szerinti megoldás módosítását jelenti, ha a hatóanyag funkciós csoportját előreagáltatjuk a poliszacharid térhálósító anyagával. Előnyösen ugyanazt a térhálósítószert alkalmazzuk, mint amit a poliszacharid térhálósításánál alkalmaztunk.

Mivel a találmány szerinti eljárással új poliszacharid gélkészítményt vagy szerkezetet érünk el, a találmány oltalmi körébe tartozik az így előállított új poliszacharid gélkészítmény is. Ebben a vonatkozásban az oltalmi kör magában foglalja nemcsak a poliszacharid gélkészítményt, ha azt a találmány szerinti eljárással állítjuk elő, hanem bármilyen poliszacharid gélkészítményt, amely hasonló módszerrel előállítható.

Más szavakkal, a találmány oltalmi körébe tartoznak a térhálósított biokompatibilis poliszacharid gélkészítmények, amelyek térhálósítható poliszacharid polifunkciós térhálósítószerrel történő térhálósításával vannak előállítva két lépésben, amelynek első térhálósító lépését befejezzük, mielőtt a gélesedés bekövetkezik a térhálósító reakció sztérikus gátlásával, majd egy második térhálósító lépést indítunk a szférikusán nem gátolt körülmények visszaállításával, és a térhálósító reakciót addig folytatjuk, amíg viszkoelasztikus gélt nyerünk.

Mindazok a jellemzők, amelyeket előnyösként vagy különösen fontosként említettünk az igényelt eljárással kapcsolatban, vonatkoznak a poliszacharid gélkészítményre magára is, és nem szükséges ismételni azokat.

A találmány oltalmi körébe tartoznak továbbá az intermedier termékek is, amelyeknél a térhálósító reakció végső lépését a szférikusán nem gátolt körülmények között egy későbbi szakaszra vagy helyre toljuk el, így például azt a készítmény végső felhasználásánál végezzük. így azt találtuk, hogy az intermedier termék, amelyet a térhálósító reakció sztérikus gátlása után nyerünk, olyan stabilitást mutat, hogy a térhálósító reakció befejezését egy későbbi szakaszban is el lehet végezni.

A találmány vonatkozik továbbá a fentiek szerinti készítmény alkalmazására gyógyászati vagy profilaktikus készítményként.

A találmány vonatkozik továbbá az említett készítmény alkalmazására gyógyászati vagy profilaktikus készítmény előállításánál bármilyen, a fentiekben említett gyógyászati vagy terápiás célra, szövetfokozásra, emlősök, különösen emberek hormonkezelésére, ezek az előnyös alkalmazási területek.

A fentiek alapján tehát a találmány szerinti készítmények alkalmazhatók emlősök, különösen emberek gyógyászati vagy profilaktikus kezelésére, amely kezelésnél a találmány szerinti készítményt adagoljuk az emlősöknek.

A következő példákkal a találmányt mutatjuk be közelebbről a korlátozás szándéka nélkül.

HU 220 257 Β

1. példa

Polimer aktiválása

a) Alkalikus körülmények között

A poliszacharidot 10 g hialuronsav formájában, amelyet Streptococcus fermentációjával állítottunk elő, feloldunk 100 ml 1%-os NaOH-ban, pH >9. A térhálósítószert, amely 1,4-bután-diol-diglicidil-éter, 0,2%-ban adagoljuk. Az oldatot 40 °C-on 4 órán át inkubáljuk.

b) Savas körülmények között

A kísérletet az la) pontban leírtak szerint végezzük, de savas körülményeket alkalmazunk (pH=2-6) 1%os ecetsav adagolásával az NaOH-oldat helyett.

2. példa

Viszkoelasztikus gél előállítása

Az la) és lb) példa szerinti inkubált anyagot a kívánt végső térfogat kétszeresére hígítjuk vagy 0,5-1% koncentrációra hígítjuk, majd semlegesítjük. A gélt ezután forgóbepárlással viszkoelasztikus géllé alakítjuk.

3. példa

Dextranomer részecskéket tartalmazó gél előállítása

Az la) és lb) példák szerinti inkubátumokat 1%-ra hígítjuk és elkeverünk benne 20 g száraz dextranomer részecskét (Sephadex®25, Pharmacia), ezek a részecskék bezáródnak a hialuronsav polimer térhálósodása révén néhány perc alatt a hialuronsav koncentrálódása következtében, amely a víznek a dextranomer gömböcskék felületén bekövetkező abszorpciója révén megy végbe.

A kapott viszkoelasztikus gél stabil, autoklávozható, és injekciózható vékony, bőr alatt alkalmazott tűvel.

4. példa

Eritropoetint (EPO) tartalmazó gél előállítása késleltetett felszabadulású gyógyszerként Az la) példa szerinti inkubátumot 1%-ra hígítjuk, majd a pH-értékét citrátpuffer adagolásával a gyártó cég instrukciójának megfelelően (Ortho Biotech Inc., Raritan USA) beállítjuk a vizes oldat jó stabilitásának érdekében. Ezután hozzáadunk 5 χ 10^{5 6} IU EPO-t keverés közben, majd az oldatot 1/4 térfogatra betöményítjük, majd a polimert térhálósítjuk, így egy késleltetett felszabadulású (depót) készítményt nyerünk, amely 20 000 IU EPO/ml koncentrációjú.

5. példa

Kalcitonint tartalmazó késleltetett felszabadulású gélkészítmény előállítása

Lazacból származó kalcitonint 100 IU/ml (Miacalcic® Sandoz) mennyiségben elkeverünk 2%-os polimer oldattal, amelyet az lb. példa szerint állítottunk elő, és a kapott oldatot forgóbepárlóban 5%-ra töményítjük be (250 IU/ml). Krónikusan sántító lovat az első jobb lábán kezelünk 2 ml így nyert s. c. injekcióval hetente, 2 héten át. 6 hét elteltével a ló fájdalommentes. A szérum kalciumszintje csupán 12%-al csökkent.

6. példa

Heparint tartalmazó nyújtott felszabadulású gélkészítmény előállítása

A 4. példa szerinti hígított aktivált polimerben heparint oldunk a polimer mennyiség 5%-ának megfelelő mennyiségben. A kapott keveréket 1 órán keresztül kiegyensúlyozzuk, majd 1/4 térfogatra betöményítjük. A koagulációt gátló anyag felszabadulását 16 napon át figyeltük meg fiziológiai sóoldatban való inkubálásnál.

7. példa

Gélkészítmény előállítása, amely kovalens kötésű heparint tartalmaz szférikusán ellenőrzött helyzetben

Az 1. példa szerint aktivált polimert metanolban erőteljes keverés közben kicsapjuk. A finom eloszlású csapadékot 1 éjszakán át szárítjuk. Heparint aktiválunk az

1. példának megfelelően. Az inkubálást követően (4 óra 40 °C-on) a polimer csapadékot elkeverjük az aktivált heparinoldattal. A kapott keveréket 1 éjszakán át inkubáljuk, majd a következő napon a kapott géloldatot semlegesítjük, szemcsézetté alakítjuk, majd mosással a reagensmaradékokat eltávolítjuk.

A kapott gél képes növekedési faktort megkötni, többek között a bázikus fibroplaszt növekedési faktort (bFGF), de nem mutat semmiféle gátlást a teljes vérkoagulációra.

8. példa

Pozitív töltésű kitozán csoportokat tartalmazó gél előállítása

Az 1. példában leírtak szerint 7,5 g hialuronsav polimerből és 2,5 g kitozánból (See Cure® Protan) álló keveréket inkubálunk. Oldás és semlegesítés után kopolimerizált viszkoelasztikus oldatot nyerünk. A kapott oldat gyógyulást elősegítő tulajdonságú, miután nehezen gyógyuló sebre vittük fel.

9. példa

Szférikusán kapcsolt gél előállítása

7,5 g hialuronsavat az la) példa szerint aktiválunk. Hasonló módon 2,5 g dextránt is aktiválunk. A hialuronsavat metanolban kicsapjuk, a kapott csapadékot 500 ml hígított, aktivált 0,5% dextránoldattal elkeverjük, amikor is keverés és a pH- és sókoncentráció beállítása után viszkoelasztikus oldatot nyerünk. 5 ml így kapott oldatot infúzióval egy Achilles-ínre visszük, amely ismételten gyulladásos tüneteket mutatott sebek kialakulásával és „csikorgással”. 4 hét elteltével az Achilles-ín problémák eltűntek.

10. példa

Gél előállítása GMCSF anyagot tartalmazó késleltetett felszabadulású gyógyszer előállításához A terméket az 5. példában leírtak szerint állítjuk elő, csak a kalcitonin helyett Granulocyte makrofágkolónia stimulálófaktort (Granulocyte macrophage colony stimulating factor, GMCSF, Leucomax®) adagolunk 1 mg/g polimer mennyiségben.

HU 220 257 Β

11. példa

Influenza A2 megölt vírust tartalmazó gélkészítmény

A készítményt a 4. példa szerint állítjuk elő, de az EPO helyett 40 960 HAU megölt influenza lóvírust adagolunk 100 ml hígított, aktivált, 1%-os polimer oldathoz. 4-szeres betöményítés után a készítmény koncentrációja 1600 HAU/ml. Több, mint 100 ló vakcinálásánál, amelyeknél influenzajárvány volt megfigyelhető, azt találtuk, hogy a készítmény igen hatásos a fertőzés elleni védelemben, és ez a védelem hosszú időn át (több, mint 6 hónapon át) megmarad.

12. példa

Elő sejtszuszpenziót tartalmazó friss gél előállítása ml fibroblaszt tenyészetet elkeverünk 100 ml la. példa szerint semlegesített oldattal. A kapott keveréket levegőztetjük, majd fele térfogatra beszárítjuk. Ily módon élő sejteket tartalmazó viszkoelasztikus oldatot nyerünk.

13. példa

Kis peptideket tartalmazó sűrű mikronizált gél előállítása

Az la) példa szerinti aktivált, semlegesített gélhez 5 mg peptidet adagolunk, amely 12 aminosavból épül fel. A gélt keverés közben 10% töménységre betöményítjük, majd ásványi olajban szuszpendáljuk. A metanol adagolása után kapott gélrészecskéket szűrjük, és az olajmaradéktól tisztára mossuk.

14. példa

Gélkészítmény előállítása, amely 13. példa szerinti kis peptideket tartalmazó sűrű mikronizált gélt tartalmaz 1%-os polimer oldathoz, amelyet az la) példa szerint aktiválunk, a 13. példa szerinti mikrogömböcskéket adagoljuk. A gélt ezután fele térfogatra betöményítjük. így homogén, injekciózható stabil gélt nyerünk, amely finom diszperzió formájában tartalmazza a mikrogömböcskéket.

15. példa

Gélkészitmény előállítása, amely 40—120 pm-es gömbformájú polimetil-metakrilát (PMMA) gömböcskéket tartalmaz g 1%-ra hígított polimerhez, amelyet az la) példa szerint semlegesítettünk és aktiváltunk, 100 mg polimetil-metakrilát (PMMA) gömböcskéket adagolunk. A kapott anyagot 3% polimertartalomra betöményítjük, így stabil, injekciózható viszkoelasztikus gélt nyerünk.

16. példa

Gélkészítmény előállítása, amely 500 nm-es

PMMA-fragmenseket tartalmaz, amelyekhez hidrofób antigént adagoltunk

A 11. példa szerinti A2 vírusból előállított haemagglutinin antigént hidrofób kölcsönhatással 500 nm méretű PMMA-részecskéken abszorbeálunk. A részecskéket 1%-os 15. példa szerinti oldathoz adagoljuk, majd a térfogatot felére betöményítjük. így stabil, homogén viszkoelasztikus gélt nyerünk, amely alkalmas nagy adjuváns hatású, mint vakcina.

17. példa

Szabadon hozzáférhető víz jelenlétében mutatott ismételt duzzadás mértékének összehasonlítása az ismert módon előállított gélek és a találmány szerinti gélek esetén

Hialuronsavgéleket állítunk elő Laurent és munkatársai, 1963, módszere, valamint az 1. és 2. példákban leírtak szerint, és a géleket a duzzadási térfogatuk felére szárítjuk. Ezután ezeket ismételten az eredeti oldatokba visszük. Az ismert gélek az eredeti térfogatukra duzzadnak, míg a találmány szerinti 1. és 2. példa szerint előállított készítmények duzzadása igen csekély, csak 10%.

18. példa

EPO-tartalmú gélek biológiai aktivitásának összehasonlítása, ahol az egyik készítmény az EPO-t hialuronsavval géllé kopolimerizálva tartalmazza, a másik az 1. példa szerinti, amelynél a gélbe az EPO hatóanyagot a gél betöményítésével foglaltuk be Négy beteget, akiket Eprex® (Cilag) anyaggal kezeltek vérszegénységre, amelyet krónikus uraemia okozott, 2 hónapon át mindegyik hónapban a következő dózisokkal kezeltük:

Betegek száma	1	2	3	4
Dózis IU	60 000	70 000	70 000	50 000
1. hónap	közvetlenül gélesített depót készítmény	közvetlenül gélesített depót készítmény	Kontroll	Kontroll
2. hónap	Kontroll	Kontroll	Koncent- rált	Koncent- rált

Közvetlenül gélesített depót készítmény: epoxiddal végzett térhálósítás enyhe körülmények között all. példának megfelelően EPO jelenlétében.

Kontroll: EPO 4% hialuronsavban oldva, MW körülbelül 6x 10⁶, előállítása az US 4 141 973 számú szabadalmi leírás szerint kakastaréjból (Healon® Pharmacia).

Koncentrált: EPO aktivált gélbe zárva, amelyet betöményítéssel gélesítettünk.

A dózisokat úgy választottuk meg, hogy a havonkénti összdózissal a hemoglobinszintet tartsuk. A szérumban lévő EPO-szintet analízissel határoztuk meg meghatározott intervallumok között, immunokémiai módszerrel.

Eredmények

A szokásos módszer egy késleltetett felszabadulású (depót) készítmény hatásának kifejezésére a görbe alatti terület számolása (EPO egység χ nap). Ezzel a módszerrel megkapjuk a bio hozzáférhetőséget is a vérben lévő hemoglobinszint formájában, 0=megmaradt, + =növekedett, és -=csökkent.

HU 220 257 Β

Táblázat

Betegek szám/ hónap	1/1	1/2	2/1	2/2	3/1	3/2	4/1	4/2
Görbe alatti terület	41	424	57	534	224	952	567	656
Hemoglobin ellenőrzése	-	+	-	+	0	+	+

Következtetések

A koncentrált készítményben az EPO befoglalásával a legnagyobb lehetséges felszabadulást mutattuk ki az analízisek során. A kísérlet, hogy az EPO jelenlétében elvégezzük a gélesítési reakciót, megbontja a hormont, és így egy igen alacsony felszabadulás figyelhető csak meg.

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Eljárás térhálósított biokompatibilis poliszacharid gélkészítmény előállítására azzal jellemezve, hogy

- vizes oldatot állítunk elő egy vízoldható, térhálósítható poliszacharidból;

- megindítjuk a poliszacharid térhálósodását egy polifunkciós térhálósítószer jelenlétében;

- sztérikusan gátoljuk a térhálósító reakciót, mielőtt gélesedés bekövetkezne, így egy aktivált poliszacharidot nyerünk; és

- ismételten sztérikusan nem gátolt körülményeket alkalmazunk az aktivált poliszacharid számára, és így folytatjuk a térhálósítást, amíg viszkoelasztikus gélt nyerünk.
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy poliszacharidként valamely glükóz-amin-glükánt alkalmazunk.
3. A 2. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy glükóz-amin-glükánként hialuronsavat tartalmazó anyagot alkalmazunk.
4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy térhálósító anyagként valamely következő anyagot alkalmazzuk: valamely epoxid, poliaziridilvegyület vagy glicidil-éter.
5. A 4. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy glicidil-éterként 1,4-bután-diol-diglicidil-étert alkalmazunk.
6. Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a térhálósító reakció szférikus gátlásához a térhálósító reakció vizes közegét hígítjuk, így a közegben alacsony poliszacharidkoncentrációt biztosítunk.
7. Az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a sztérikusan nem gátolt reakciókörülmények visszaállításához a reakcióközeget, amelyben a térhálósító reakció végbemegy, betöményítjük, így a közegben egy magasabb poliszacharidkoncentrációt biztosítunk.
8. Az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a sztérikusan nem gátolt reakciókörülmények visszaállítását a vizes közeg, amelyben a térhálósító reakció végbemegy, dializálásával végezzük.
9. Az 1-8. igénypontok bármelyike szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a kezdeti térhálósító reakciót polifunkciós térhálósítószer jelenlétében alkalikus pHnál, előnyösen pH=9 feletti értéken végezzük az éterkötésű térhálósító reakciók elősegítésére.
10. Az 1-8. igénypontok bármelyike szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a kezdeti térhálósító reakciót polifunkciós térhálósítószer jelenlétében savas pH-n, előnyösen pH=2-6 közötti értéken végezzük az észterkötésű térhálósítás elősegítésére.
11. Az 1-10. igénypontok bármelyike szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a térhálósító reakció szférikus gátlását azelőtt végezzük, mielőtt a térhálósítószer elfogyna.
12. Az 1-11. igénypontok bármelyike szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a biológiailag aktív anyagot a térhálósított poliszacharid gélkészítménybe annak készítése során foglaljuk be, előnyösen fiziológiai pHnak és sókoncentrációnak megfelelő körülmények között.
13. A 12. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a biológiai anyagot a gélkészítménybe úgy foglaljuk be, hogy az aktivált poliszacharidban oldjuk vagy diszpergáljuk, mielőtt a poliszacharidot a sztérikusan gátolt körülményeknek tennénk ki.
14. A 12. vagy 13. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy biológiailag aktív anyagként hormonokat, citokineket, vakcinákat, sejteket vagy szövetfokozó anyagokat alkalmazunk.
15. A 14. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy szövetfokozó anyagként valamely következő polimert alkalmazunk: kollagén, keményítő, dextranomer, polilaktid vagy ezek polimerjei vagy ροΐί-β-hidroxi-butirát vagy kopolimerjei.
16. A 14. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy hormonként eritropoeitint vagy kalcitonint alkalmazunk.
17. A 12-16. igénypontok bármelyike szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy olyan biológiailag aktív anyagot alkalmazunk, amely a poliszachariddal szemben reakcióképes funkciós csoportot tartalmaz, és az említett biológiailag aktív anyagot a gélszerkezetbe kémiai reakcióval foglaljuk be.
18. A 17. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a funkciós csoportokat tartalmazó biológiailag aktív anyagot előreagáltatjuk a poliszacharid térhálósítószerével, előnyösen ugyanazzal a térhálósítószerrel, amelyet a poliszacharid térhálósításához alkalmazunk.
19. Térhálósított biokompatibilis poliszacharid készítmény az 1-18. igénypontok bármelyike szerint előállítva.
20. Részlegesen térhálósított biokompatibilis aktivált poliszacharid gélkészítmény az 1-18. igénypontok bármelyikében leírt eljárások szerint, anélkül a lépés nélkül előállítva, amelyben az aktivált poliszacharid tér7

HU 220 257 Β hálósítása folytatva van a sztérikusan nem gátolt reakciókörülmények visszaállításával.
21. Térhálósított biokompatibilis poliszacharid gélkészítmény térhálósítható poliszacharidokból és polifunkciós térhálósítószerekből előállítva két térhálósítási lé- . 5 pésben, amelynél az első térhálósító lépés be van fejezve, mielőtt a gélesedés bekövetkezne a térhálósító reakció szférikus gátlásával, és a második térhálósító lépés a sztérikusan nem gátolt reakciókörülmények visszaállításával van indítva a viszkoelasztikus gél előállításáig. 10
22. A 21. igénypont szerinti térhálósított biokompatibilis poliszacharid gél, amelyre a 2-14. igénypontok bármelyikében ismertetett jellemzők vonatkoznak.
23. A 21. vagy 22. igénypontok bármelyike szerinti térhálósított biokompatibilis poliszacharid, amely bioló- 15 giailag aktív anyagot foglal magában.
24. A 23. igénypont szerinti biokompatibilis poliszacharid, amely biológiailag aktív anyagként valamely

12-18. igénypont szerint alkalmazott anyagot foglal magában.
25. Gyógyászati vagy profilaktikus poliszacharid gélkészítmény a 21-24. igénypontok bármelyike szerint.
26. A 25. igénypont szerinti készítmény, amely késleltetett felszabadulású készítmény.
27. A 21-24. igénypontok bármelyike szerinti készítmény gyógyászati vagy profilaktikus készítményként való alkalmazására.
28. A 21-24. igénypontok bármelyike szerinti készítmény alkalmazása emlősöknél, különösen embereknél szövetfokozásra alkalmas gyógyászati vagy profilaktikus készítmény előállítására.
29. A 21-24. igénypontok bármelyike szerinti készítmény alkalmazása emlősöknél, különösen embereknél, különösen hormonterápiára alkalmas gyógyászati vagy profilaktikus késleltetett felszabadulású készítmények előállítására.