CN105126157B

CN105126157B - 医用可注射粘合凝胶及其制备方法

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Publication number: CN105126157B
Application number: CN201510593366.9A
Authority: CN
Inventors: 简军; 李睿智; 李东风
Original assignee: Limited By Share Ltd Technology Development
Current assignee: Limited By Share Ltd Technology Development
Priority date: 2015-09-17
Filing date: 2015-09-17
Publication date: 2018-02-09
Anticipated expiration: 2035-09-17
Also published as: CN105126157A

Abstract

本发明涉及一种医用可注射粘合凝胶及其制备方法。将适当改性修饰的右旋糖酐水溶液与多氨基化合物交联剂溶液通过混合后，可原位形成医用可注射粘合凝胶。该粘合凝胶的混合液初期为液体状态，迅速填满创面中的缝隙，随着化学交联反应的进行，混合溶液发生凝胶化，最终形成不可流动且具有一定粘合强度的凝胶。该医用可注射粘合凝胶不会对神经造成压迫，不受体位影响且可承受组织间的压力，其降解时间较长，完全可以创口部位保持长久的粘合强度直至该部位完全愈合，对体内组织无毒且无刺激，最终可在体内被完全降解或吸收。本发明中的粘合凝胶可广泛应用于神经外科、脑外科、普外科、骨科、胸心外科、泌尿外科、妇产科等科室的手术后，身体组织之间、植入材料与身体组织之间的粘合与密封。

Description

医用可注射粘合凝胶及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种医用可注射粘合凝胶及其制备方法。将适当改性修饰的右旋糖酐水溶液与多氨基化合物交联剂溶液通过混合后，可原位形成医用可注射粘合凝胶。该粘合凝胶的混合液初期为液体状态，迅速填满创面中的缝隙，随着化学交联反应的进行，混合溶液发生凝胶化，最终形成不可流动且具有一定粘合强度的凝胶。该医用可注射粘合凝胶不会对神经造成压迫，不受体位影响且可承受组织间的压力，其降解时间较长，完全可以在创口部位保持长久的粘合强度直至该部位完全愈合，对体内组织无毒且无刺激，最终可在体内被完全降解或吸收。本发明中的粘合凝胶可广泛应用于神经外科、脑外科、普外科、骨科、胸心外科、泌尿外科、妇产科等科室的手术后，身体组织之间、植入材料与身体组织之间的粘合与密封。

背景技术

组织粘合凝胶为组织粘合剂中的一种。组织粘合剂，又称医用粘合剂，主要应用于体内活性组织之间的粘合、体内活性组织与无活性部分的粘合以及体内组织与外界植入体之间的粘合等三个主要方向。体内活性组织之间的粘合，在实际应用中出现的频率最多、应用也最为广泛的，就是伤口的封闭粘合。同时，粘合剂还需要起到密封胶的效果，提供一个相对水密性（如组织液）或者气密性（如在肺部手术之后）的环境，以防止这些组织液或气体的渗漏。

组织液是指从毛细血管动脉端渗入到基质内的一部分液体，与组织细胞进行物质交换后，再经毛细血管静脉端或毛细淋巴管回流入血液或淋巴的这一部分液体。其包括基质和从毛细血管渗出的不含大分子的物质的黏性液体，基质是一种无色透明的胶状物质，化学成分主要是蛋白多糖、糖蛋白和水。蛋白多糖是基质的主要成分，由少量蛋白质和大量氨基已糖多糖结合成的大分子复物。氨基已糖多糖的成分主要是透明质酸，另外还有硫酸软骨素A和C，硫酸角质素等。透明质酸是一种卷曲盘绕的长链大分子结构，以其作为主干，能过连接蛋白结合许多蛋白多糖亚单位，共同构成具有很多微小孔隙的结构，称分子筛。每个蛋白亚单位以蛋白质分子为轴心，共价地结合上许多多糖侧链（硫酸软骨素、硫酸角质素等）而共同构成。然而，在外科手术完成之后，由于组织细胞与毛细血管均被破坏，而导致了组织液可以直接从伤口部位渗出。这样，组织液中丰富的营养物质会容易滋生细菌，并造成伤口的感染，增加患者的痛苦，重则有生命危险。目前主要采用缝合的方法使伤口闭合。但缝合时不可避免的会有缝隙产生。此时使用密封胶就可以将这些伤口间的缝隙彻底封死，防止组织液的渗漏。

右旋糖酐为葡萄糖结构单元通过糖苷键相连而形成的多糖类高分子（其中90-95%的D-葡萄糖通过α-1,6-糖苷键相连，其余5-10%通过α-1,3-糖苷键相连），其是蔗糖经肠膜状明串珠菌—1226发酵合成的一种高分子葡萄糖聚合物，是目前最佳的血浆代用品之一。其具有体内相容性好、较稳定、易于储存、易得、价廉、抗原性小和易于代谢等优点。临床上常用的右旋糖酐，主要用作血浆代用品，用于出血性休克、创伤性休克及烧伤性休克等。右旋糖酐分子式如下图所示：

但右旋糖酐中的活性官能团较为单一，仅有羟基可进行改性。不适合用于原位快速交联凝胶的制备，因此，需要对右旋糖酐进行适当的改性。使其具备可以原位成胶的性能，达到防止组织液渗漏的目的。

中国专利CN101035572A公开了一种将聚葡萄糖（又称葡聚糖）进行改性用于组织粘合剂的方法。该专利采用特定氧化剂（如高碘酸钠）将葡聚糖结构单元中的2，3位进行氧化，使其碳碳键断裂而形成醛基，得到氧化葡聚糖。再用多氨基聚合物（如八臂聚乙二醇胺）作为交联剂，利用氨基与醛基的偶联反应快速形成席夫碱而完成原位成胶，发挥凝胶的粘合与密封效果。虽然在该专利中所用的葡聚糖最高分子量达到400千道尔顿（KDa），但由于葡聚糖中存在多种糖苷键，例如α-1,2(3,4)-糖苷键以及-糖苷键，造成葡聚糖的分子排列不规整。因此，当葡聚糖分子量高于100 KDa时，葡聚糖的溶解度会下降，从而造成氧化反应中氧化剂对葡聚糖的氧化效率降低。此外，该专利中采用透析的方法去除氧化葡聚糖中残留的碘酸钠。但在实际操作中，透析的时间过长，并且需要消耗大量的水，并不适合于氧化葡聚糖的大批量生产。综上所述，说明较低分子量的葡聚糖更适合于该专利所公开的工艺方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种医用可注射粘合凝胶及其制备方法。将适当改性修饰的右旋糖酐水溶液与多氨基化合物交联剂通过双联注射装置混合后推注至创面部位，可原位形成医用可注射粘合凝胶。该方法使用双联注射装置为成胶设备，包含两支装有不同溶液的注射器，两支注射器的其中一支为适当改性修饰的右旋糖酐水溶液，另一支为可与修饰右旋糖酐发生化学交联反应的小分子或大分子多氨基化合物交联剂。通过双联注射装置将大分子聚合物溶液与交联剂混合后，混合液初期为液体状态，迅速填满创面中的缝隙，随着化学交联反应的进行，混合溶液发生凝胶化，最终形成不可流动且具有一定粘合强度的凝胶。该医用可注射粘合凝胶不会对神经造成压迫，不受体位影响且可承受组织间的压力，其降解时间较长，完全可以创口部位保持长久的粘合强度直至该部位完全愈合，对体内组织无毒且无刺激，最终可在体内被完全降解或吸收。本发明中的粘合凝胶可广泛应用于神经外科、脑外科、普外科、骨科、胸心外科、泌尿外科、妇产科等科室的手术后，身体组织之间、可植入材料与身体组织之间的粘合与密封。

本发明提供的一种医用可注射粘合凝胶是以改性修饰的右旋糖酐与多氨基化合物交联剂为原料组成，多氨基交联剂中的氨基含量与改性修饰右旋糖酐中的醛基质量含量比为0.01~5:1；

其中，改性修饰的右旋糖酐的原料的质量组成为：右旋糖酐: 氧化剂=1~10:1~3。

制备方法包括以下步骤：分别将改性修饰的右旋糖酐、多氨基交联剂溶解于的磷酸盐缓冲液中，装入等体积注射管中，在双联注射装置中推挤混合成凝胶。

本发明中所采用的右旋糖酐为结构更加规整的聚葡萄糖类多糖材料，其分子结构的特性为葡萄糖结构单元通过糖苷键相连而形成的多糖类高分子（其中90-95%的D-葡萄糖通过α-1,6-糖苷键相连，其余5-10%通过α-1,3-糖苷键相连）。其中，右旋糖酐使用较高分子量的产品，分子量的范围为100至2000 KDa，其中，分子量的优选范围为500至1500 KDa。

本发明中采用的氧化剂可以包括高碘酸盐、高锰酸盐、次氯酸盐、臭氧、过氧化物、氢过氧化物、过硫酸盐、过氧有机酸等。

本发明优选其中的一个实施方式，按照Mo等人所述（J. Biomater. Sci. PolymerEdn. 11, 2000: 341-351）的方法，使用各种不同质量的高碘酸钠作为氧化剂，合成不同氧化程度（不同醛基含量）的修饰右旋糖酐。

本发明中采用的多氨基化合物交联剂包括：具有多伯胺基团的多肽类聚合物，其中包括含有精氨酸与赖氨酸等碱性氨基酸基团的多肽；碱性氨基酸聚合物，其中包括碱性氨基酸的低聚物或高聚物，例如三赖氨酸，聚赖氨酸等；水溶性的各种多氨基化合物，包括线性二胺、支化多元胺、环状多元胺、多氨烷基硅烷或硅氧烷、聚酰肼、多臂型多氨基化合物等。

参照中国专利CN104307052A（简军，李睿智等；医用可注射防粘连凝胶及其制备方法）中的方法，本发明可采用双联注射装置将医用可注射粘合凝胶制备原位成型的凝胶。该凝胶从混合时起的最短成胶时间15s，最长成胶时间为300s，具体成胶过程可参照中国专利CN104307052A中的成胶过程。

本发明中采用离子交换法去除修饰右旋糖酐中具有一定毒性的碘酸钠，相比传统的透析方法，离子交换法具有耗时短，产量大等优点，适合大批量地生产修饰右旋糖酐。先采用强碱型阴离子交换树脂去除修饰右旋糖酐中的碘酸根离子，再采用强酸型阳离子交换树脂去除修饰右旋糖酐中的钠离子，达到最终去除碘酸钠的目的。其中，两类离子交换树脂均选用凝胶型树脂，骨架材料包括苯乙烯系、丙烯酸系、醋酸系、环氧系、乙烯吡啶系、脲醛系以及氯乙烯系等。上述材料中，优选聚苯乙烯类树脂。

本发明中采用比色法检测修饰右旋糖酐中碘酸钠的含量，利用碘酸钠与酸性淀粉碘化钾溶液的显色反应，用紫外-可见分光光度计检测溶液在波长620 nm处的吸光度，以确定修饰右旋糖酐中碘酸钠的含量。方法如下：先制作碘酸钠的标准吸光度-浓度曲线，浓度范围覆盖0-10 mg·L^-1；再将待测液的吸光度值带入到标准吸光度-浓度曲线中，计算得到待测液中碘酸钠的含量。

本发明中修饰右旋糖酐中醛基含量的检测方法参照中国药典中戊二醛含量的检测方法（中国药典2010年版二部，617页）。

本发明提供的一种修饰右旋糖酐的制备方法包括以下步骤：

1）配置右旋糖酐水溶液：将右旋糖酐溶解于物质的量浓度为0.05-0.5 mol·L^-1（优选0.1-0.3 mol·L^-1）且pH值为7.5-8.5（优选8.0-8.2）的磷酸盐缓冲溶液中，溶液中右旋糖酐的质量浓度为10-60%，优选浓度为40-60%；

2）配置氧化剂水溶液，前文中所述的氧化剂中，优选高碘酸钠作为氧化剂：在避光的条件下，将高碘酸钠溶解于去离子水中，溶液中高碘酸钠的质量浓度为1%-10%，优选3-5%；

3）在避光的条件下，将右旋糖酐溶液与高碘酸钠溶液混合，其中右旋糖酐结构单元（分子量162 g·mol^-1）与高碘酸钠（分子量214 g·mol^-1）的物质的量之比为：右旋糖酐:高碘酸钠=1:3~10:1，反应温度范围为10-50 °C，（优选30-40 °C），快速搅拌，反应时间范围在2-10小时（优选3-5 小时）；

4）反应结束后，用甘油淬灭未反应的高碘酸钠，甘油的加入量根据高碘酸钠的加入量确定：根据结构单元判断，每个右旋糖酐结构单元可被两个高碘酸钠氧化，但第二步氧化反应难于第一步氧化，可不考虑。因此甘油（分子量92 g·mol^-1）的加入量（物质的量，下同）≥（高碘酸钠加入量-右旋糖酐结构单元的含量）×2。若高碘酸钠的加入量少于右旋糖酐结构单元的含量，在反应结束之后则不需要添加甘油对高碘酸钠进行淬灭；

本发明提供一种修饰右旋糖酐的纯化方法，采用阴阳离子交换树脂去除粘合胶中的离子杂质，再采用冷冻干燥的方法得到纯化的修饰右旋糖酐，具体方法包括以下步骤：

1）分别称取同等质量的干态强碱型阴离子交换树脂与强酸型阳离子交换树脂。

2）将强碱型阴离子交换树脂与强酸型阳离子交换树脂用去离子水进行清洗并溶胀后进行装柱，强酸或强碱型树脂装柱的体积分别为待纯化液体的1~10倍，优选2~3倍。

3）将待纯化液体引入离子交换柱中，顺序为：先通过强碱型离子交换柱，去除体系中的碘酸根离子，交换后溶液为碱性；再通过强酸型离子交换柱，去除体系中的钠等阳离子，彻底脱去体系中的盐分。待纯化液流速控制在1-100 mL·min^-1，优选10-50 mL·min^-1。

4）采用淀粉碘化钾显色法检测交换液中碘酸钠的含量，取1 mL交换液，加入到1mL pH 1~2的淀粉碘化钾溶液中，其中，淀粉浓度为1-100 mg·mL^-1，碘化钾浓度为1-100mg·mL^-1。反应1 min，用紫外-可见分光光度计检测溶液在波长620 nm处的吸光度，通过吸光度-浓度的标准曲线计算出交换液中碘酸钠的含量。

5）将交换液在-70 °C下冷冻，放置与冷冻干燥器中36-48 h直至水完全去除。得到修饰右旋糖酐的冻干粉。

本发明提供的一种医用可注射粘合凝胶的制备方法包括以下步骤：

1）配置修饰右旋糖酐水溶液：将修饰右旋糖酐溶解于pH7.0-7.4的磷酸盐缓冲液中，得到质量浓度为1~500 mg·mL^-1的右旋糖酐溶液，可通过改变修饰右旋糖酐水溶液的浓度调节凝胶化时间，此溶液装入A管；

2）配置多氨基交联剂水溶液：多氨基交联剂中的氨基含量与修饰右旋糖酐质量中的醛基含量比为0.01~5:1（物质的量之比），亦可通过改变多氨基交联剂的浓度调节凝胶化时间，多氨基交联剂的质量浓度范围为1~500 mg·mL^-1。按照上述计量配比将多氨基交联剂溶解于pH=7.0-7.4的PBS缓冲液中，其中PBS缓冲液的加入体积应与大分子聚合物溶液的体积相等，此溶液装入B管；可选地，所述的多氨基交联剂为聚赖氨酸。

3）将修饰右旋糖酐溶液（A管）与多氨基交联剂溶液（B管）装入双联注射装置中，通过推挤双联注射装置将A管溶液与B管溶液相混合，推挤时间最短为5s，最长为30s。并参照中国专利CN103937014A（简军，李睿智等；壳聚糖双网络快速响应型可注射水凝胶及其制备方法）的方法检测凝胶的成胶时间，成胶时间最短为15 s，最长为300 s。

本发明提供一种医用可注射粘合凝胶的粘合力检验方法：采用Kim等人表述的搭接剪切测试法（lap shear testing）检测凝胶的粘合性能（Biomacromolecules 2014, 15:1579-1585）。选用人工硬脑膜代替组织作为粘合样品。本发明中的医用可注射粘合凝胶通过剪切粘合力测试详见附图1。步骤如下：

1）将人工硬脑膜用胶水（如502胶水）粘在外层平滑的铝制基板上，同时制作两块粘有人工硬脑膜的铝质基板；

2）将1-5 mL医用可注射粘合凝胶涂抹于人工硬脑膜上，并将两块基板进行粘合，固化反应10~20分钟之后可进行粘合力测试；

3）采用拉力试验机对粘合凝胶的粘合力进行检测，其中，拉力试验机的拉伸速率为50~300 mm·min^-1。

本发明中验证了可注射粘合凝胶的水耐受性测试，即将人工硬脑膜用粘合凝胶粘合之后，浸泡于水中，检测在水中浸泡不同时间之后粘合凝胶粘合力的变化，以确定该粘合凝胶的水耐受性。

本发明中采用旋转式椎板流变仪检测粘合凝胶的弹性模量（G'）与粘性模量（G"）随时间的变化，以确定凝胶的成胶时间。具体操作步骤如下：配置可注射粘合凝胶，使用双联注射装置将1 mL凝胶注入直径为40 mm的平面铝板之上，样品缝隙设置为1 mm，样品的温度由一个连接了恒温水浴槽的Peltier底座系统控制，温度保持为37 °C，相关流变仪参数为频率：0.1-10 rad·s^-1，形变目标值为1-100%，检测时间0-600 s，取点间隔1-40 s。

本发明所得到的医用可注射粘合凝胶，将适当改性修饰的右旋糖酐水溶液与多氨基化合物交联剂溶液通过混合后，可原位形成医用可注射粘合凝胶。该粘合凝胶的混合液初期为液体状态，迅速填满创面中的缝隙，随着化学交联反应的进行，混合溶液发生凝胶化，最终形成不可流动且具有一定粘合强度的凝胶。该医用可注射粘合凝胶不会对神经造成压迫，不受体位影响且可承受组织间的压力，其降解时间较长，完全可以创口部位保持长久的粘合强度直至该部位完全愈合，对体内组织无毒且无刺激，最终可在体内被完全降解或吸收。

附图说明

图1：搭接剪切测试法检测粘合凝胶粘合力示意图。

图2：粘合凝胶成胶示意图：左图为溶胶态，右图为凝胶态。

图3：粘合凝胶流变学性能检测结果。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明作进一步的详细说明，这并不限制本发明的保护范围。

实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件以及手册中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件；所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1：修饰右旋糖酐的制备（分子量1 200 KDa，氧化度20%）

称取右旋糖酐粉末250g（含葡萄糖单元1.54mol，分子量1 200 KDa），溶解于2.5 L去离子水中，得到右旋糖酐水溶液。避光条件下，称取高碘酸钠66 g（0.31 mol，占葡萄糖单元总量的20%），溶解于0.2 L去离子水中。将高碘酸钠溶液与右旋糖酐溶液混合，控制水浴温度为30 °C，避光环境下持续反应3 h。反应结束后，将反应液先通过含有7 L强碱型阴离子树脂的阴离子交换柱（材料为强碱型聚苯乙烯凝胶树脂，天津南开和成科技有限公司，型号001×7），再通过相同体积的阳离子交换柱（材料为强酸型聚苯乙烯凝胶树脂，天津南开和成科技有限公司，型号201×7），控制流速在50 mL·min^-1。检测流出液中碘酸钠含量低于1 mg·L^-1之后，将流出液置于-80 °C的冰箱中进行冷冻之后，放置于冷冻干燥器中48-72h。最终获得修饰右旋糖酐共210 g，产率约84%。

实施例2：修饰右旋糖酐的制备（分子量800 KDa，氧化度100%）

称取右旋糖酐粉末250g（含葡萄糖单元1.54 mol，分子量800 KDa），溶解于2.0 L去离子水中，得到右旋糖酐水溶液。避光条件下，称取高碘酸钠395 g（1.85 mol，占葡萄糖单元总量的120%），溶解于1 L去离子水中。将高碘酸钠溶液与右旋糖酐溶液混合，控制水浴温度为30 °C，避光环境下持续反应3 h。加入甘油40 mL（0.55 mol），淬灭未发生反应的高碘酸钠。反应结束后，将反应液先通过含有7 L强碱型阴离子树脂的阴离子交换柱（同前文所述的交换柱），再通过相同体积的阳离子交换柱（同前文所述的交换柱），控制流速在50mL·min^-1。检测流出液中碘酸钠含量低于1 mg·L^-1之后，将流出液置于-80℃的冰箱中进行冷冻之后，放置于冷冻干燥器中48-72 h。最终获得修饰右旋糖酐共196 g，产率约78%。

实施例3：医用可注射粘合凝胶的制备（修饰右旋糖酐分子量1 000 KDa，氧化度50%）

称取右旋糖酐粉末250g（含葡萄糖单元1.54 mol，分子量1 000 KDa），溶解于2.0L去离子水中，得到右旋糖酐水溶液。避光条件下，称取高碘酸钠165 g（0.77 mol，占葡萄糖单元总量的50%），溶解于0.8 L去离子水中。将高碘酸钠溶液与右旋糖酐溶液混合，控制水浴温度为30 °C，避光环境下持续反应3 h。反应结束后，将反应液先通过含有7 L强碱型阴离子树脂的阴离子交换柱，再通过相同体积的阳离子交换柱，控制流速在50 mL·min^-1。检测流出液中碘酸钠含量低于1 mg·L^-1之后，将流出液置于-80 °C的冰箱中进行冷冻之后，放置于冷冻干燥器中48-72 h。最终获得修饰右旋糖酐共200 g，产率约80%。

称取上述步骤中获得的修饰右旋糖酐5.0 g（醛基含量约为30.0 mmol），溶解于50mL pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液（PBS），从中取出2 mL作为A液。称取聚赖氨酸（分子量4 000Da）5.0 g（氨基含量约为39.0 mmol），溶解于50 mL pH 7.4的PBS溶液中，从中取出2 mL作为B液。

将A液与B液分别对应地装入A管与B管中，其中A管与B管装液量均为2mL，且A管与B管的长度相同。再将AB管安装在无菌双联注射装置（上海米沙瓦医科工业有限公司，3mL）上，同时将A液与B液推出混合，推注时间为10s，推出混合液后参照中国专利CN103937014A的方法检测凝胶的成胶时间。经检测，凝胶的成胶时间在25 s左右。

实施例4：医用可注射粘合凝胶的制备（修饰右旋糖酐分子量1 200 KDa，氧化度20%）

称取实施例1中获得的修饰右旋糖酐5.0 g（醛基含量约为12.3 mmol），溶解于50mL pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液（PBS），从中取出2 mL作为A液。称取聚赖氨酸（分子量4 000Da）3.3 g（氨基含量约为26.1 mmol），溶解于50 mL pH 7.4的PBS溶液中，从中取出2 mL作为B液。

将A液与B液分别对应地装入A管与B管中，其中A管与B管装液量均为2mL，且A管与B管的长度相同。再将AB管安装在无菌双联注射装置上，同时将A液与B液推出混合，推注时间为10s，推出混合液后参照中国专利CN103937014A的方法检测凝胶的成胶时间。经检测，凝胶的成胶时间在80s左右。

实施例5：可注射粘合凝胶粘合力测试

按照实施例3中的方法配置可注射粘合凝胶，选用人工硬脑膜作为粘合材料（冠昊生物科技股份有限公司，原料为猪心包膜）。选用两块铝制基板，长约5 cm，宽约1 cm。将人工硬脑膜裁制成两片边长1 cm的正方形薄片，用502胶水固定在铝板上。将可注射你那和凝胶涂抹在硬脑膜拨片的表面，涂抹完成后将两片硬脑膜薄片粘合，5 min后粘合完毕，可用万能试验机进行粘合力测试。室温下，万能试验机的拉伸速率为200 mm·min^-1。经粘合力检测，得到粘合凝胶对人工硬脑膜的粘合力为4.7 N·cm^-1。

实施例6：可注射粘合凝胶粘合力的水耐受性测试

选取实施例3中的可注射粘合凝胶，按照实施例5中的方法，采用可注射粘合凝胶将人工硬脑膜粘合，并将粘合完毕的人工硬脑膜样品浸泡在1 L已灭菌的pH 7.4的PBS溶液中，分别于7、14以及28天之后将样品取出进行粘合力测试，测试条件同实施例5。经粘合力检测，可注射粘合凝胶在PBS溶液中浸泡7、14以及28天之后的粘合力分别为4.4、3.9以及3.1 N·cm^-1。

实施例7：可注射粘合凝胶的流变学性能检测

采用旋转式椎板流变仪（TA Instruments，型号AR2000ex）检测粘合凝胶的弹性模量（G'）与粘性模量（G"）随时间的变化。按照实施例3中的方法配置可注射粘合凝胶，使用双联注射装置将1 mL凝胶注入直径为40 mm的平面铝板之上，样品缝隙设置为1 mm，样品的温度由一个连接了恒温水浴槽的Peltier底座系统控制，温度保持为37 °C，相关流变仪参数为频率：1 rad·s^-1，形变目标值为10%，检测时间0-300 s，取点间隔25 s。检测结果如图3所示，成胶时间在30 s左右。

实施例8：可注射粘合凝胶的细胞毒性检测

本实施例中的凝胶采用实施例3中所制备得到的可注射粘合凝胶。

将正常传代培养的L-929细胞，经0.25%胰酶消化制成浓度为1×10⁴mL^-1的细胞悬液，接种于96孔板，每孔200µL，每组6孔，与5%二氧化碳培养箱内37 °C培养24h。细胞培养24h后，舍弃原培养液，空白组用浸提介质交换，阴性对照组用浸提比例为6cm²·mL^-1高密度聚乙烯浸提液交换，阳性对照组用含5%二甲基亚砜的浸提介质交换，凝胶样品组用浸提液进行交换。置5%二氧化碳培养箱内37 °C，分别培养24、48和72h。更换培养液后，分别取培养24、48与72h的孔板，每孔加入40µL 5g·L^-1四唑盐（MTT）溶液继续培养4h后弃去孔内液体，加入150µL二甲基亚砜，与振荡器上振荡10min，在酶标仪（芬兰雷勃公司，MK3）570nm与630nm处测定个孔吸光度，按照下式计算相对增值率（RGR）：

RGR= [A_570nm-A_630nm）/（A_{0 570nm}-A_{0 630nm}）] × 100%

A：凝胶组（阴性，阳性组）吸光度；A₀：空白对照组吸光度。

检测结果：在本实验条件下，阴性与阳性对照出现预期的效果，用凝胶样品浸提液培养L-929小鼠成纤维细胞24、48与72h的相对增值率分别为：106.5%，110.6%，101.0%。该凝胶所体现的细胞毒性反应均为0级。

Claims

1.一种医用可注射粘合凝胶，其特征在于该粘合凝胶是以氧化改性修饰的右旋糖酐与多氨基化合物交联剂为原料组成，多氨基化合物交联剂中的氨基含量与改性修饰右旋糖酐中的醛基质量含量比为0.01~5:1；

其中，改性修饰的右旋糖酐的原料的质量组成为：右旋糖酐: 氧化剂=1~10:1~3；

所述的右旋糖酐为结构更加规整的聚葡萄糖类多糖材料，其分子结构的特性为葡萄糖结构单元通过糖苷键相连而形成的多糖类高分子，其中90-95%的D-葡萄糖通过α-1,6-糖苷键相连，其余5-10%通过α-1,3-糖苷键相连，右旋糖酐分子量的范围为100至2000 KDa；

所述的多氨基化合物交联剂包括：多伯胺基团的多肽类聚合物、多臂型多氨基化合物；所述的多氨基化合物交联剂包括：含有精氨酸或赖氨酸碱性氨基酸基团的多肽、三赖氨酸、聚赖氨酸；

制备方法经过以下步骤：

1）配置修饰右旋糖酐水溶液：将修饰右旋糖酐溶解于pH7.0-7.4的磷酸盐缓冲液中，得到质量浓度为1~500 mg·mL^-1的大分子聚合物溶液，此溶液装入A管；

2）配置多氨基交联剂水溶液：多氨基交联剂中的氨基含量与修饰右旋糖酐质量中的醛基质量含量比为0.01~5:1，通过改变多氨基交联剂的浓度调节凝胶化时间，多氨基交联剂的质量浓度范围为1~500 mg·mL^-1；按照上述计量配比将多氨基交联剂溶解于pH7.0-7.4的PBS缓冲液中，其中PBS缓冲液的加入体积应与大分子聚合物溶液的体积相等，此溶液装入B管；

3）将A管的修饰右旋糖酐溶液与B管的多氨基交联剂溶液装入双联注射装置中，通过推挤双联注射装置将A管溶液与B管溶液相混合，推挤时间最短为5s，最长为30s；

所述的氧化改性修饰的氧化剂包括高碘酸盐、高锰酸盐、次氯酸盐、臭氧、过氧化物、过硫酸盐。

2.按照权利要求1所述的医用可注射粘合凝胶，其特征在于所述的氧化改性修饰的氧化剂为高碘酸钠。

3.按照权利要求1所述的医用可注射粘合凝胶，其特征在于所述的凝胶从混合时起的最短成胶时间15s，最长成胶时间为300s。

4.权利要求1所述的医用可注射粘合凝胶的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

3）将A管的修饰右旋糖酐溶液与B管的多氨基交联剂溶液装入双联注射装置中，通过推挤双联注射装置将A管溶液与B管溶液相混合，推挤时间最短为5s，最长为30s。

5.按照权利要求1所述的医用可注射粘合凝胶，其特征在于所述的修饰右旋糖酐的制备方法包括以下步骤：

1）配置右旋糖酐水溶液：将右旋糖酐溶解于物质的量浓度为0.05-0.5 mol·L^-1且pH值为7.5-8.5的磷酸盐缓冲溶液中，溶液中右旋糖酐的质量浓度为10-60%；

2）配置氧化剂水溶液，在避光的条件下，将高碘酸钠溶解于去离子水中，溶液中高碘酸钠的质量浓度为1%-10%；

3）在避光的条件下，将右旋糖酐溶液与高碘酸钠溶液混合，其中，右旋糖酐:高碘酸钠=1:3~10:1，反应温度范围为10-50℃，快速搅拌，反应时间范围在2-10小时；

4）反应结束后，用甘油淬灭未反应的高碘酸钠，甘油的加入量根据高碘酸钠的加入量确定，甘油的加入量≥（高碘酸钠加入量-右旋糖酐结构单元的含量）×2。

6.按照权利要求1所述的医用可注射粘合凝胶，其特征在于所述的修饰右旋糖酐的纯化方法包括以下步骤：

1）分别称取同等质量的干态强碱型阴离子交换树脂与强酸型阳离子交换树脂；

2）将强碱型阴离子交换树脂与强酸型阳离子交换树脂用去离子水进行清洗并溶胀后进行装柱，强酸或强碱型树脂装柱的体积分别为待纯化液体的1~10倍；

3）将待纯化液体引入离子交换柱中，顺序为：先通过强碱型离子交换柱，去除体系中的碘酸根离子，交换后溶液为碱性；再通过强酸型离子交换柱，去除体系中的钠等阳离子，彻底脱去体系中的盐分，待纯化液流速控制在1-100 mL·min^-1；

4）采用淀粉碘化钾显色法检测交换液中碘酸钠的含量，取1 mL交换液，加入到1 mL pH1~2的淀粉碘化钾溶液中，其中，淀粉浓度为1-100 mg·mL^-1，碘化钾浓度为1-100 mg·mL^-1，反应1 min，用紫外-可见分光光度计检测溶液在波长620 nm处的吸光度，通过吸光度-浓度的标准曲线计算出交换液中碘酸钠的含量；

5）将交换液在-70℃下冷冻，放置与冷冻干燥器中36-48 h直至水完全去除，得到修饰右旋糖酐的冻干粉。

7.权利要求1所述的医用可注射粘合凝胶的粘合力检验方法，其特征在于采用搭接剪切测试法检测凝胶的粘合性能；选用人工硬脑膜代替组织作为粘合样品，其特征在于包括以下步骤：

1）将人工硬脑膜用胶水粘在外层平滑的铝制基板上，同时制作两块粘有人工硬脑膜的铝质基板；

8.权利要求1所述的医用可注射粘合凝胶的成胶时间检验方法，其特征在于采用旋转式椎板流变仪检测粘合凝胶的弹性模量（G'）与粘性模量（G"）随时间的变化，以确定凝胶的成胶时间，具体操作步骤如下：配置可注射粘合凝胶，使用双联注射装置将1 mL凝胶注入直径为40 mm的平面铝板之上，样品缝隙设置为1 mm，样品的温度由一个连接了恒温水浴槽的Peltier底座系统控制，温度保持为37 °C，相关流变仪参数为频率：0.1-10 rad·s^-1，形变目标值为1-100%，检测时间0-600 s，取点间隔1-40 s。