CN115154650B

CN115154650B - 氨基酸介导的山椒素全天然功能凝胶的制备方法及应用

Info

Publication number: CN115154650B
Application number: CN202210801203.5A
Authority: CN
Inventors: 何忆; 刘剑钊
Original assignee: Sichuan Shengjia Technology Co ltd
Current assignee: Sichuan Shengjia Technology Co ltd
Priority date: 2022-07-08
Filing date: 2022-07-08
Publication date: 2023-07-21
Anticipated expiration: 2042-07-08
Also published as: CN115154650A

Abstract

本发明公开了氨基酸介导的山椒素全天然功能凝胶的制备方法及应用，该方法包括：一、制备醛基化山椒素：在4‑二甲氨基吡啶和N,N'‑二异丙基碳二亚胺的催化下，使山椒素与对醛基苯甲酸进行酯化反应，获得醛基化山椒素；二、按1:1.0～2.5的质量比取醛基化山椒素和精氨酸并制备水凝胶。本发明选取具抗氧化能力的山椒素分子作为功能与结构基元，提供生物活性及抗氧化特性；选取人体必需的氨基酸成分，精氨酸作为另一个水凝胶的构筑单元。两种小分子通过合理的化学设计，一步法构筑形成水凝胶材料，该方法基于化学方法实现，高效可控；所得凝胶产品具有一定的可降解性、生物活性、抗氧化活性，具备十分良好的应用前景。

Description

氨基酸介导的山椒素全天然功能凝胶的制备方法及应用

技术领域

本发明属于水凝胶制备技术领域，特别涉及氨基酸介导的山椒素全天然功能凝胶的制备方法及应用。

背景技术

氧化应激是指体内氧化与抗氧化作用失去平衡，并且倾向于过度氧化状态，导致中性粒细胞炎性浸润，蛋白酶分泌增加，产生大量氧化中间产物。氧化应激是由自由基在体内产生的一种负面作用，会给人体带来许多生理上的损伤，并被认为是导致衰老和疾病的一个重要因素。因此，通过合理的材料设计，用于清除过量的活性氧，平衡机体的氧化状态，实现氧化与抗氧化的平衡，从而调节生理状态具有十分重要的应用价值。

在自然界以及生物机体中，本身存在着许许多多能够调节氧化应激状态的物质，如维生素、硫辛酸、多酚、虾青素等等，这些天然功能产物可以有效地调节人体微环境的氧化状态，维持氧化平衡，消除过量活性氧带来的负面效应，具有良好的生物活性。然而，这些天然产物大多数为小分子化合物，存在着稳定性较低，循环时间短，存在潜在毒性，溶解性受限等，因此在使用中受到了一定的限制，因此如何通过合理的材料设计，实现小分子功能分子的稳定性提升，进一步扩宽其应用前景显得尤为重要。

水凝胶是一类极为亲水的三维网络结构凝胶，它在水中迅速溶胀并在此溶胀状态可以保持大量体积的水而不溶解，近些年来，水凝胶已经成为一种重要的材料形式，其可以负载、集成多种功能组分，具有良好的生物相容性，具有一定的力学性质，且可以通过合理的化学设计使其具有一定的响应性与可降解性，从而可以适应外界环境的变化，调节机体状态。因此将天然功能分子集成到水凝胶之中，构筑一种稳定性提升，可控性强，功能优异的水凝胶材料是十分可行的策略。

发明内容

本发明的目的是提供氨基酸介导的山椒素全天然功能凝胶的制备方法及应用。

本发明选取具抗氧化能力的山椒素分子作为功能与结构基元，提供生物活性及抗氧化特性；选取人体必需的氨基酸成分，精氨酸作为另一个水凝胶的构筑单元。两种小分子通过合理的化学设计，一步法构筑形成水凝胶材料，该方法基于化学方法实现，高效可控；所得凝胶产品具有一定的可降解性、生物活性、抗氧化活性，具备十分良好的应用前景，例如加速伤口愈合等。

本发明的技术方案为：

氨基酸介导的山椒素全天然功能凝胶的制备方法，包括步骤：

一、制备醛基化山椒素：在4-二甲氨基吡啶和N,N'-二异丙基碳二亚胺的催化下，使山椒素与对醛基苯甲酸进行酯化反应，获得醛基化山椒素；

二、按1:1.0～2.5的质量比取醛基化山椒素和精氨酸并制备水凝胶。

在一些具体实施方式中，步骤一具体为：

取1质量份山椒素溶解于N,N-二甲基甲酰胺配制山椒素溶液；向山椒素溶液中加入1.3质量份对醛基苯甲酸、0.4～0.8质量份4-二甲氨基吡啶，4.0～8.0质量份 N,N'-二异丙基碳二亚胺，于室温下密闭反应16～36h；反应结束后对反应溶液进行沉淀、离心、洗涤、冻干，得醛基化山椒素。

在一些具体实施方式中，所配制山椒素溶液的浓度为40～100mg/mL。

在一些具体实施方式中，步骤二具体为：

按1:1.0～2.5的质量比取醛基化山椒素和精氨酸混合于磷酸缓冲盐溶液，于 70～90℃加热3～10分钟，之后随室温冷却，即得水凝胶。

在一些具体实施方式中，步骤二中按1:2～2.5的质量比取醛基化山椒素和精氨酸并制备水凝胶。

上述所制备山椒素全天然功能凝胶可用作制作伤口敷料。

上述所制备山椒素全天然功能凝胶可用作制作保水剂。

和现有技术相比，本发明具有如下优点和有益效果：

(1)本发明从化学角度对分子结构进行合理设计，通过一步酯化反应构筑了含有醛基的山椒素分子，具有丰富的化学活性。

(2)通过一步法构筑了山椒素-精氨酸全小分子水凝胶，方法较为简单、快捷。

(3)可以通过简单地控制精氨酸添加量对成胶时间进行调控。

(4)所制备的水凝胶均具有良好的溶胀行为，体现在较高的溶胀率，体现了良好的保水特性。

(5)所制备的水凝胶均具有良好的临界透射率，为其进一步作为伤口敷料奠定了坚实的基础。

(6)所制备的水凝胶具有良好的生物降解性，为其生物应用打下了坚实的基础。

(7)所制备的水凝胶具有良好的自由基清除能力，为其应对氧化应激微环境打下了基础。

(8)所制备的水凝胶具有良好的生物相容性，保证了其生物应用的可能性。

(9)所制备的水凝胶具有细胞层面的抗氧化能力，为其在体内进行应用并清除过量活性氧打下了基础。

(10)所制备的水凝胶具有加速伤口愈合的能力，具有进一步应用转化的潜力。

附图说明

图1为不同山椒素浓度对应的苯环峰接枝率；

图2为实施例2水凝胶样品SA-1～4的成胶时间；

图3为实施例2水凝胶样品SA-1～4的溶胀率数据；

图4为实施例2水凝胶样品SA-1～4的临界透射率数据；

图5为实施例2水凝胶样品SA-1～4的降解率数据；

图6为实施例2水凝胶样品SA-1～4的ABTS自由基清除能力；

图7为实施例2水凝胶样品SA-1～4及对照样品的抗氧化稳定性；

图8为实施例2水凝胶样品SA-2在不同浓度下的细胞存活率；

图9为实施例2水凝胶样品SA-2在细胞层面的抗氧化能力；

图10为实施例2水凝胶样品SA-2对促进伤口愈合的效果。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下将结合具体实施方式以及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明氨基酸介导的山椒素全天然功能凝胶的制备方法，其具体实施过程如下：

一、制备醛基化山椒素：

在4-二甲氨基吡啶和N,N'-二异丙基碳二亚胺的催化下，使山椒素与对醛基苯甲酸进行酯化反应，获得醛基化山椒素。4-二甲氨基吡啶和N,N'-二异丙基碳二亚胺为酯化反应的常见催化剂，可催化对醛基苯甲酸的羧基与山椒素的羟基反应。

具体地，取1质量份山椒素溶解于N,N-二甲基甲酰胺配制浓度为40 ～100mg/mL的山椒素溶液；向山椒素溶液中加入1.3质量份对醛基苯甲酸、0.4～0.8 质量份4-二甲氨基吡啶，4.0～8.0质量份N,N'-二异丙基碳二亚胺，于室温下密闭反应16～36h；反应结束后对反应溶液进行沉淀、离心、洗涤、冻干，得醛基化山椒素。

二、制备水凝胶：

按1:1.0～2.5的质量比取醛基化山椒素和精氨酸混合，制备水凝胶。

下面将提供若干实施例和对比例。在实施例和对比例中所用原料均为市购，对醛基苯甲酸购于上海市安耐吉化学有限公司，纯度98.0％；4-二甲氨基吡啶 (DMAP)购于上海市安耐吉化学有限公司，纯度98％；N,N'-二异丙基碳二亚胺 (DIPC)购于上海市安耐吉化学有限公司，纯度98％；精氨酸购于上海市安耐吉化学有限公司，纯度99.0％；山椒素为羟基-α-山椒素，购于南京市道斯夫生物科技有限公司，其纯度98％，CAS号：83883-10-7。

实施例1

本实例提供醛基化山椒素的制备方法，具体步骤如下：

(1)取4份1质量份的山椒素，分别充分溶解于N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，配制浓度分别为40mg/mL、60mg/mL、80mg/mL、100mg/mL的4份山椒素溶液；

(2)向山椒素溶液中均加入1.3质量份的对醛基苯甲酸、0.6质量份的4-二甲氨基吡啶以及5.5质量份的N,N'-二异丙基碳二亚胺，在密闭条件下，维持室温温和搅拌24h，以进行酯化反应；

(3)反应结束后，将反应溶液进行去离子水沉淀、离心、洗涤，以除去未反应物和少量副产物；将沉淀物冻干得到淡黄色粉末，即醛基化山椒素。

对本实施例醛基化山椒素进行核磁共振氢谱表征，观察对醛基苯甲酸中含有的苯环峰出现，通过积分计算苯环峰与山椒素本体的比例，即接枝率，结果见图1，从图1可以看出，山椒素浓度为60mg/mL时，具有最高的接枝效率，合成醛基化山椒素效率最高。

实施例2

本实施例提供山椒素全天然功能凝胶的制备方法，具体步骤如下：

按表1所示用量取醛基化山椒素和精氨酸混合于磷酸缓冲盐溶液，将混合溶液于80℃下加热5分钟，醛基化山椒素和精氨酸发生席夫碱反应，并结合氢键等其他非共价作用力，使醛基化山椒素和精氨酸迅速结合；随后在室温下冷却，则形成水凝胶。

表1实施例2中醛基化山椒素和精氨酸的用量

醛基化山椒素	精氨酸	命名
			1质量份	1质量份	SA-1
1质量份	1.5质量份	SA-2
			1质量份	2质量份	SA-3
1质量份	2.5质量份	SA-4

加热完成后，记录对各水凝胶样本SA-1～4的成胶时间，见图2所示。从图2 可以观察到，随着精氨酸含量的提升，成胶时间逐渐缩短。这是由于精氨酸含量提升，极大程度地增加了体系中氨基的含量，从而增强分子间氢键作用力，所以成胶时间逐渐缩短。

实施例3

本实施例中分别测定水凝胶样本SA-1～4的溶胀行为。在37℃条件下，在pH 7.4的PBS中分别测定水凝胶样本SA-1，SA-2，SA-3，SA-4在一段时间内的溶胀动力学。通过以下方程式计算水凝胶在24h后的溶胀率Q＝[(W_t-W_d)/W_d]×100％，其中，W_t是浸泡时间t时水凝胶的重量，W_d是干燥水凝胶样品(不含任何水分) 的重量。溶胀率数据见图3，从图3可以看出，随着精氨酸用量的提升，溶胀率也随之提升，水凝胶样本SA-4具有最高的溶胀比，这是因为精氨酸含量的提升，使体系保水性提升，从而具有更高的溶胀比。

实施例4

本实施例采用重量法分别测定水凝胶样本SA-1～4的临界透射率(WVTR)。称量带有2mm厚水凝胶的玻璃杯，然后置于培养箱中3天。WVTR通过以下公式计算：WVTR＝(W_i–W_t)/A，并以g/m²/天为单元。其中，A表示玻璃杯口面积， (W_i–W_t)表示重量变化。结果见图4，从图4可以看出，随着精氨酸用量的提升， WVTR也随之提升，水凝胶样本SA-4具有最高的WVTR，但对比之前样品差距不大，这为其后续应用提供了重要的保障。

实施例5

本实施例分别测定水凝胶样本SA-1～4的降解行为。将水凝胶浸泡在pH为5.5 的PBS缓冲液中24h，测量37℃下样品质量损失来评估水凝胶样品的降解行为。通过以下公式计算样品的降解率＝[(W₀–W_t)/W₀]×100％，其中W_t是浸泡时间t 时水凝胶的重量，W₀是浸泡前水凝胶样品的重量，结果见图5所示。从图中可以看出，随着精氨酸比例提高，降解率有所下降，这是因为精氨酸的提升使得交联密度提升，其中水凝胶样本SA-1具有最高的降解率，水凝胶样本SA-4相比于其他样品降解率下降较为严重。

实施例6

本实施例使用2,2'-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐(ABTS)方法分别评定水凝胶样本SA-1，SA-2，SA-3，SA-4的水相自由基清除能力及抗氧化稳定性。

(1)样品的水相自由基清除能力评定。

分别制备浓度7mmol/L的ABTS水溶液与浓度2.45mmol/L的过硫酸钾水溶液；将ABTS水溶液与过硫酸钾水溶液以1：2的摩尔比混合，并在室温下静置过夜，使其处于黑暗状态得到ABTS检测试剂。

取100μL的ABTS检测试剂溶液用适当量去离子水稀释，使溶液最终体积保持为3mL，加入5mg形状相似的水凝胶。采用734nm处的吸光度来评价自由基清除效果，30分钟内选不同时间点测定吸光度，得到自由基清除曲线，以评估其水相抗氧化能力。结果见图6所示，从图中可以看出，水凝胶样品SA-1具有最强的 ABTS自由基清除能力，这是因为其具有最高的山椒素含量，所以具有最高的自由基清除能力，随着山椒素含量下降，抗氧化能力逐渐下降。

(2)样品的抗氧化稳定性评定。

样品配制方法同前述的ABTS测试方法，采用734nm处的吸光度来评价其自由基清除能力，室温下保持避光搅拌30min后测定其自由基清除能力。之后，将样品在功率1.5W的模拟太阳光下照射4h，再次分别测定样品在734nm处的吸光度，评价光照后的自由基清除能力。计算抗氧化稳定性：抗氧化稳定性(％)＝照射后自由基清除能力/照射前自由基清除能力×100％。将山椒素以及山椒素及精氨酸直接混合作为对照样本，山椒素及精氨酸直接混合物命名为S+A，样品S+A由山椒素与精氨酸按1：1质量比混合，再溶于去离子水配制得到浓度50μg/mL的水溶液。采用前述方法评定样品S+A的抗氧化稳定性。所有样品的抗氧化稳定性结果见图7。从图7可以看出，水凝胶样品SA-1～4均有较高的抗氧化稳定性，样品S+A的抗氧化稳定性无法得到有效提升。

结合上述水凝胶物理化学性能测试，选定水凝胶样品SA-2用于后续生物性能测试。

实施例7

对水凝胶样品SA-2测试生物相容性。以NIH小鼠胚胎成纤维细胞3T3细胞为细胞株，采用MTT比色法验证样品的细胞毒性。细胞的培养方式为将10％的胎牛血清(FBS)加入到DMEM培养基中共同孵育，培养的氛围为含有5％CO₂的潮湿气氛，温度维持在37℃。将培养好的NIH 3T3细胞以每孔2000个细胞的密度在96孔板中孵育24h，以1，5，10，20，30mg/mL的水凝胶浸提液再处理24h，然后按照MTT比色法测试说明书检测相应细胞存活率，检测结果见图8。从图中可以看出，在不同浓度下水凝胶样品SA-2均具有良好的生物相容性，在10mg/mL 浓度以下，细胞具有95％以上的存活率，因此具有良好的生物应用前景。

实施例8

将实施例8所培养的NIH 3T3细胞按15万/孔接种于12孔板，在孔板中孵育 24小时。孵育完成后，去掉培养基，加入500μL由DMEM培养基配制的含有不同浓度的凝胶浸提液，进一步补加500μL全组分培养液以及100μL稀释双氧水(浓度为100μmol/L)。而后去掉培养液，加入200μL胰酶消化细胞并加入200μL培养基以终止胰酶消化作用；离心去除上清液，加入1ml PBS溶液重新悬浮，再加入准备好的探针250μL；最终细胞样品经离心处理后重新悬浮于PBS中，并采用流式细胞仪进行定量分析，分析时间分别为24h，得到图9所示的相对荧光强度结果。其中NC为阴性对照，未经双氧水与材料处理；PC为阳性对照，经过双氧水处理，未进行材料处理；样品SA-2-5为水凝胶样品SA-2材料处理浓度为5mg/mL，SA-2-10为水凝胶样品SA-2材料处理浓度为10mg/mL。从图中可以看出，相比阳性对照，施加不同浓度的材料，强度均有所下降，且浓度越高下降越多，显示了良好的细胞层面抗氧化能力。

实施例9

从实施例7～8可以看出，本发明水凝胶在化学层面与细胞层面均具有良好的抗氧化效果，且生物相容性较为良好，因此具备进一步探索其在动物层面的具体应用。

将水凝胶样品SA-2用于大鼠的皮肤损伤修复动物模型中，所选用的动物为健康的雌性大鼠，来自成都硕大动物公司，大鼠体重约为200g。具体操作为：首先对大鼠的背部毛发进行剔除并消毒，在大鼠背部切开两个直径15毫米的全厚圆形皮肤创面，SA-2水凝胶施加于伤口表面，进行生物学评估。对照组无施加任何材料。在此期间，分别于第1、5、10、15天对大鼠创口进行清创处理并施加材料，采用拍照方式记录伤口变化过程，结果见图10所示。从图中可以观察到，施加了水凝胶样品SA-2的伤口愈合速度远高于对照组，因此说明水凝胶样品SA-2对于加速伤口愈合过程具有良好的促进作用，显示了其良好的生物应用前景。

本领域技术人员在考虑说明书及实践这里发明地公开后，将容易想到本发明的其他实施方案。本申请旨在涵盖本发明的任何变型、用途或者适应性变化，这些变型、用途或者适应性变化遵循本发明的一般性原理并包括本发明未公开的本技术领域中的公知常识或惯用技术手段。说明书和实施例仅被视为示例性的，本发明的真正范围和精神由下面的权利要求指出。

应当理解的是，本发明并不局限于上面已经描述，并且可以在不脱离其范围进行各种修改和改变。本发明的范围仅由所附的权利要求来限制。

Claims

1.氨基酸介导的山椒素全天然功能凝胶的制备方法，其特征是：

二、按1:1.0～2.5的质量比取醛基化山椒素和精氨酸并制备水凝胶；

步骤一具体为：

取1质量份山椒素溶解于N,N-二甲基甲酰胺配制山椒素溶液；向山椒素溶液中加入1.3质量份对醛基苯甲酸、0.4～0.8质量份4-二甲氨基吡啶，4.0～8.0质量份N,N'-二异丙基碳二亚胺，于室温下密闭反应16～36h；反应结束后对反应溶液进行沉淀、离心、洗涤、冻干，得醛基化山椒素。

2.如权利要求1所述的氨基酸介导的山椒素全天然功能凝胶的制备方法，其特征是：

所配制山椒素溶液的浓度为40～100mg/mL。

3.如权利要求1所述的氨基酸介导的山椒素全天然功能凝胶的制备方法，其特征是：

步骤二具体为：

按1:1.0～2.5的质量比取醛基化山椒素和精氨酸混合于磷酸缓冲盐溶液，于70～90℃下加热3～10分钟，之后随室温冷却，即得水凝胶。

4.如权利要求1所述的氨基酸介导的山椒素全天然功能凝胶的制备方法，其特征是：

步骤二中按1:2～2.5的质量比取醛基化山椒素和精氨酸并制备水凝胶。

5.权利要求1～4中任一项所述的制备方法所制备的山椒素全天然功能凝胶在制备伤口敷料中的应用。

6.权利要求1～4中任一项所述的制备方法所制备的山椒素全天然功能凝胶在制备保水剂中的应用。