CN111053946B - 一种基于多糖和超支化多肽的双组分组织粘合剂及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种基于多糖和超支化多肽的双组分组织粘合剂及其制备方法，本发明所述的组织粘合剂由质量分数为5％‑25％的氧化多糖，5％‑25％的超支化多肽聚乙二醇接枝共聚物以及水组成；该组织粘合剂是将分别所述氧化多糖和超支化多肽聚乙二醇截至共聚物用pH为7.2‑7.5的磷酸盐缓冲盐水配置成溶液，再将两种组分溶液以1：1或1：2均匀混合后涂覆到伤口处，两组分通过席夫碱反应形成粘合剂并粘附浴伤口表面。本发明的一种基于多糖和超支化多肽的双组分组织粘合剂，具有易调节的化学和物理性质，能够快速牢固的粘附到组织上，提供完全的伤口闭合，同时具有足够的粘弹性和机械强度，制备方法简单，可行性强。

Description

一种基于多糖和超支化多肽的双组分组织粘合剂及其制备 方法

技术领域

本发明属于医用生物材料技术领域，具体涉及一种基于多糖和超支化多肽的双组分组织粘合剂及其制备方法。

背景技术

几十年来，传统临床上对创伤和术后伤口采用的最常见的闭合修复手段一直都是缝合线。然而，随着现代医学的不断发展，人们发现缝合线已经逐渐不能满足许多临床要求，例如对于精密缝合过程耗时过长造成的手术效率低下，不能对伤口达到立即的止血作用，屡次拆线换药给病人带来身体不适，愈合后留下的伤疤造成不美观，对软组织(例如胰腺)缝合时更是可能会造成组织损坏甚至干扰组织功能复原。相对于缝合线，高效安全的医用粘合剂操作更加简便，能够减轻患者疼痛，具有立即的止血、密封作用并兼具高级美容效果。因此，对于各类医用组织粘合剂的开发成为了近些年国内外的研究热点。

尽管医用粘合剂已经有了较长时间的发展，其应用效果也得到了肯定，但真正符合临床要求的理想的医用粘合剂还没有出现，目前的各类粘合剂都或多或少的存在着自身的不足。例如，氰基丙烯酸酯固化速率快，粘合强度高，但聚合过程伴随毒副产物，固化后缺乏弹性。聚乙二醇粘合剂价廉无毒，但是溶胀率过高，固化后会大量吸收伤口处组织液和血液，对伤口组织造成压迫，材料自身强度也会大幅度降低。纤维蛋白胶在人体内能够完全降解，但是自身机械强度和粘合强度都不高，还有可能导致病毒感染。基于多糖及其衍生物的组织粘合剂生物相容性良好，但其主要问题也是机械强度不够高。基于多巴胺的粘合剂材料在湿润环境中仍然具有很强的粘附力，但由于邻苯二酚极易氧化为苯醌，此类粘合剂都呈现深褐色甚至接近黑色，临床应用时可能会影响医生观察伤口形态，导致涂抹不均匀不准确。

理想的医用组织粘合剂应该具有以下特点：(1)安全无毒且具有良好的生物相容性；(2)具有较好的流动性，能够精确涂抹于创面区域；(3)在伤口愈合的过程中持续保持较好的机械强度；(4)在生理状态下可以实现快速粘合；(5)在高湿态和高动态下仍然具有良好的粘合强度及持久性，粘合部分具有一定的弹性和韧性；(6)合适的膨胀系数；(7)达到使用效果后能够逐渐降解、吸收代谢；(8)储存和使用方便，具有较长的保质期；(9)各个性能具有高度可控性，以便满足不同的临床需求。

超支化多肽可以为制备性能优异、高度可控的医用组织粘合剂材料提供新思路。超支化多肽生物相容性良好，并且在人体内可以完全被降解。这种化合物具有单分散结构，制备中可以精确控制其分子量、代数和外围功能性端基的类型，所以在各类生物材料的研究制备中，超支化多肽已经成为了线性聚合物热门的替代材料。此外，超支化多肽独特的刚性树枝状结构大大降低了其溶液粘度，可以在低聚合物浓度下形成交联度高、同质性高的水凝胶网络，同时为组织粘合剂提供了更好的流动性，避免了粘合剂在注射管道中的堵塞，能够更精确地涂抹在创伤区域。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明提供了一种基于多糖和超支化多肽的双组分组织粘合剂，制备方法简单，可行性强，可控性高，具有易调节的化学和物理性质，能够快速牢固的粘附到组织上，提供完全的伤口闭合，同时具有足够的粘弹性和机械强度，加速伤口的愈合。

为了实现上述发明目的，本发明采用如下技术方案：

一种基于多糖和超支化多肽的双组分组织粘合剂，由以下质量百分比的原料组成：氧化多糖5％-25％和超支化多肽聚乙二醇接枝共聚物5％-25％，余量为水。

所述氧化多糖和所述超支化多肽聚乙二醇接枝共聚物的质量比例为1:1或1:2。

优选的，所述氧化多糖分子量为25万，所述多糖的种类为羧甲基纤维素，葡聚糖，透明质酸和海藻酸钠中任意一种。

所述氧化多糖按照以下步骤制备：

步骤1，用蒸馏水将多糖配置成多糖水溶液；

步骤2，室温条件下，将高碘酸钠水溶液避光逐滴加入到步骤1所得多糖水溶液中进行醛基化反应；

步骤3，将步骤2所得产物进行透析、冷冻干燥后，得到氧化多糖。

优选的，所述高碘酸钠与多糖的摩尔比为1:1。

优选的，所述超支化多肽为赖氨酸三代肽类树状分子，两端氨基封端的聚乙二醇分子量为2000。

所述超支化多肽聚乙二醇接枝共聚物按照以下步骤制备：

步骤1，甲酯保护的赖氨酸二代肽类树状分子的制备：将甲酯保护的赖氨酸、Boc保护的赖氨酸、EDCI和HOBT加入反应容器中，抽真空-氮气，然后加入无水二氯甲烷搅拌溶解，接着在冰浴条件下加入DIEA，在室温下搅拌反应24小时，收集反应溶液，旋蒸除去溶剂，并加入氯仿溶解产物，再依次用饱和NaHCO₃水溶液、HC1水溶液和饱和NaCl水溶液洗涤，收集有机相，加入无水硫酸镁干燥，过滤除去无水硫酸镁，将有机相旋干，置于真空干燥箱中过夜，得甲酯保护的赖氨酸肽类二代树状分子；将所述产物甲酯保护的赖氨酸肽类二代树状分子置于反应容器中，抽真空-氮气循环三次，在氮气状态下加入无水二氯甲烷搅拌溶解，在冰浴条件下加入三氟乙酸，之后在室温下搅拌反应6-8小时，减压除去溶剂及三氟乙酸，得到的产物在冰无水乙醚中沉淀，干燥后得脱Boc保护后的赖氨酸二代肽类树状分子；

步骤2，甲酯保护的赖氨酸三代肽类树状分子的制备：将步骤1所得产物脱Boc保护后的赖氨酸二代肽类树状分子、Boc保护的赖氨酸、EDCI和HOBT加入反应容器中，抽真空-氮气，然后加入无水二氯甲烷搅拌溶解，接着在冰浴条件下加入DIEA，室温下搅拌反应48小时，收集反应溶液，旋蒸除去溶剂，并加入氯仿溶解产物，再依次用饱和NaHCO₃水溶液、HC1水溶液和饱和NaCl水溶液洗涤，收集有机相，加入无水硫酸镁干燥，过滤除去无水硫酸镁，将有机相旋干置于真空干燥箱中过夜，得甲酯、Boc保护的赖氨酸肽类三代树状分子；

步骤3，脱甲酯保护：将步骤2所得产物甲酯、Boc保护的赖氨酸肽类三代树状分子溶解于NaOH或MeOH溶液中，室温下搅拌反应6-7小时后，旋蒸除去混合物中的NaOH或MeOH，加入氯仿溶解残余物，在搅拌状态下滴加HC1调节溶液pH值至2-3，收集有机相，加入无水硫酸镁，干燥过夜，过滤后旋蒸除去溶剂，减压浓缩后得脱甲酯后的Boc保护赖氨酸肽类三代树状分子；

步骤4，连接氨基聚乙二醇：将步骤3所得产物脱甲酯后的Boc保护赖氨酸肽类三代树状分子、氨基聚乙二醇、EDCI和HOBT置于反应容器中，抽真空-氮气，在氮气状态下加入无水二氯甲烷搅拌溶解，在冰浴条件下加入DIEA，在室温下反应24-48小时，收集反应溶液，旋蒸除去溶剂，并加入乙醚沉淀产物，干燥后得Boc保护的赖氨酸三代肽类树状分子与聚乙二醇接枝共聚物；将所述产物Boc保护的赖氨酸三代肽类树状分子与聚乙二醇接枝共聚物置于反应容器中，抽真空-氮气，在氮气状态下加入无水二氯甲烷搅拌溶解，在冰浴条件下加入三氟乙酸，之后在室温下搅拌反应6-8小时，减压除去溶剂及三氟乙酸，得到的产物在冰无水乙醚中沉淀，干燥后得脱Boc保护后的赖氨酸三代肽类树状分子与聚乙二醇接枝共聚物。

所述基于多糖和超支化多肽的双组分组织粘合剂使用的工艺参数为：反应温度为室温，pH为7.2-7.5，固化时间为5-120秒。

所述基于多糖和超支化多肽的双组分组织粘合剂的制备方法，包括以下步骤：

步骤1，在室温下将所述氧化多糖和所述超支化多肽聚乙二醇接枝共聚物分别溶解在pH 7.2-7.5的磷酸盐缓冲盐水中，配置成溶液；

步骤2，将所述步骤1中得到的氧化多糖和超支化多肽聚乙二醇接枝共聚物溶液分别装入双管注射器，以质量比为1：1或1：2均匀混合后涂覆到伤口处，通过席夫碱反应，室温下在5-120秒内形成所述基于多糖和超支化多肽的双组分粘合剂，且所述基于多糖和超支化多肽的双组分粘合剂牢固持久地粘附于伤口表面。

本发明的有益效果在于：(1)本发明的组织粘合剂所选原料分别为天然多糖和超支化多肽，模仿人体细胞外基质的多糖/多肽结构，生物相容性良好，可以完全被人体吸收降解；(2)本发明的组织粘合剂选用赖氨酸超支化多肽为原料，具有高度可控的单分散结构，制备中可以精确控制其分子量、代数和外围功能性端基的类型。其独特的刚性树枝状结构可以大大降低了成胶前液的粘度，可以在低聚合物浓度下形成交联度高、同质性高的水凝胶网络，同时为组织粘合剂提供了更好的流动性，避免了粘合剂在注射管道中的堵塞，能够更精确地涂抹在创伤区域；(3)本发明的组织粘合剂是基于醛基和氨基的席夫碱反应固化粘合在组织表面的，凝胶、粘合过程温和且安全；(4)本发明的组织粘合剂具有非常简单并且易控制的凝胶化步骤，两组分可以通过双管注射器涂抹在伤口表面，应用便捷安全；(5)本发明的组织粘合剂具有易调节的化学和物理性质，能够快速牢固的粘附到组织上，提供完全的伤口闭合，同时具有足够的粘弹性和机械强度。制备这种性能优异同时可控程度高的医用组织粘合剂对于外科手术效率的提高，病人承受痛苦的减轻是非常有价值的，易于广泛推广使用；(6)本发明的组织粘合剂可作为一种医用组织粘合剂、密封剂或止血剂广泛用于临床创伤修复。可适用于心血管、普外科、整形科、神经外科、眼科手术过程中的伤口组织粘合，也适用于创面渗血和小静脉出血过程中的立即止血，还可用于疝气补片的固定，牢固持久地密封缺损组织，防止组织粘连，促进伤口愈合。

附图说明

图1为各类氧化多糖，图1a，b，c和d分别为氧化羧甲基纤维素，氧化葡聚糖，氧化透明质酸，和氧化海藻酸钠的合成路线，图1e为氧化羧甲基纤维素的红外谱图；

图2为超支化多肽聚乙二醇接枝共聚物的合成路线；

图3为赖氨酸二代、三代肽类树状分子和超支化多肽聚乙二醇接枝共聚物的质谱的质谱图；

图4为实施例1-4的组织粘合剂在48小时内的溶胀率(a)和14天内的降解行为(b)；

图5为本发明的组织粘合剂的CLSM图像，其中超支化多肽聚乙二醇接枝共聚物由Cy5.5荧光标记，比例尺＝50μm；

图6为实施例1-4的组织粘合剂的流变性能检测：(a)时间扫描；(b)频率扫描；

图7为实施例1-4的组织粘合剂的拉伸试验和压缩试验：(a)拉伸强度(b)断裂伸长率(c)压缩模量(d)能量损耗；

图8为实施例1-4的组织粘合剂的体外剪切粘合强度检测；

图9为NIH 3T3成纤维细胞在实施例1-4的组织粘合剂表面孵育12小时和72小时的CCK-8检测；

图7-9中：

**：p<0.01，

*：p<0.05。

具体实施方式

本说明书中公开的所有特征，或公开的所有方法或过程中的步骤，除了互相排斥的特征和/或步骤以外，均可以以任何方式组合。

下面结合图1-9对本发明作详细说明。

一种基于多糖和超支化多肽的双组分组织粘合剂，由以下质量百分比的原料组成：氧化多糖5％-25％和超支化多肽聚乙二醇接枝共聚物5％-25％，余量为水。

所述氧化多糖和所述超支化多肽聚乙二醇接枝共聚物的质量比例为1:1或1:2。

优选的，所述氧化多糖分子量为25万，所述多糖的种类为羧甲基纤维素，葡聚糖，透明质酸和海藻酸钠中任意一种。

所述氧化多糖按照以下步骤制备：

步骤1，用蒸馏水将1g多糖配置成质量分数1％的多糖水溶液；

步骤2，室温条件下，将高碘酸钠水溶液避光逐滴加入到步骤1所得质量分数为1％的多糖水溶液中进行醛基化反应；

步骤3，将步骤2醛基化反应后所得产物进行透析、冷冻干燥后，得到氧化多糖。

优选的，所述高碘酸钠与多糖的摩尔比为1:1。

优选的，所述超支化多肽为赖氨酸三代肽类树状分子，两端氨基封端的聚乙二醇分子量为2000。

所述超支化多肽聚乙二醇接枝共聚物按照以下步骤制备：

步骤1，甲酯保护的赖氨酸二代肽类树状分子的制备：将甲酯保护的赖氨酸、Boc保护的赖氨酸、EDCI和HOBT加入反应容器中，其中甲酯保护的赖氨酸、Boc保护的赖氨酸、EDCI，HOBT和DIEA的摩尔比为1:2-3:2-3:2-3:6-9，抽真空-氮气循环三次，然后加入50mL无水二氯甲烷搅拌溶解，接着在冰浴条件下加入DIEA 35.60mL，在室温下搅拌反应24小时，收集反应溶液，旋蒸除去溶剂，并加入氯仿溶解产物，再依次用饱和NaHCO₃水溶液、浓度为1M的HC1水溶液和饱和NaCl水溶液洗涤，收集有机相，加入无水硫酸镁干燥，过滤除去无水硫酸镁，将有机相旋干后置于真空干燥箱中过夜，得粘稠状甲酯保护的赖氨酸肽类二代树状分子；将所述产物甲酯保护的赖氨酸肽类二代树状分子置于反应容器中，抽真空-氮气循环三次，在氮气状态下加入14mL无水二氯甲烷搅拌溶解，在冰浴条件下加入14mL三氟乙酸，之后在室温下搅拌反应6-8小时，减压除去溶剂及三氟乙酸，得到的产物在冰无水乙醚中沉淀，干燥后得粉末状的脱Boc保护后的赖氨酸二代肽类树状分子；

步骤2，甲酯保护的赖氨酸三代肽类树状分子的制备：将步骤1所得产物脱Boc保护后的赖氨酸二代肽类树状分子、Boc保护的赖氨酸、EDCI和HOBT加入反应容器中，其中脱Boc保护后的赖氨酸二代肽类树状分子、Boc保护的赖氨酸、EDCI，HOBT和DIEA的摩尔比为1:6-8:6-8:6-8:15-18，抽真空-氮气循环三次，然后加入100mL无水二氯甲烷搅拌溶解，接着在冰浴条件下加入32.6mL DIEA，室温下搅拌反应48小时，收集反应溶液，旋蒸除去溶剂，并加入氯仿溶解产物，再依次用饱和NaHCO₃水溶液、HC1水溶液和饱和NaCl水溶液洗涤，收集有机相，加入无水硫酸镁干燥，过滤除去无水硫酸镁，将有机相旋干置于真空干燥箱中过夜，得粘稠状的甲酯、Boc保护的赖氨酸肽类三代树状分子；

步骤3，脱甲酯保护：将步骤2所得产物甲酯、Boc保护的赖氨酸肽类三代树状分子溶解于100mL浓度为1M的NaOH或MeOH溶液中，室温下搅拌反应6-7小时后，旋蒸除去混合物中的NaOH或MeOH，加入80mL氯仿溶解残余物，在搅拌状态下滴加HC1调节溶液pH值至2-3，收集有机相，加入无水硫酸镁，干燥过夜，过滤后旋蒸除去溶剂，减压浓缩后得脱甲酯后的Boc保护赖氨酸肽类三代树状分子；

步骤4，连接氨基聚乙二醇：将步骤3所得产物脱甲酯后的Boc保护赖氨酸肽类三代树状分子、氨基聚乙二醇、EDCI和HOBT置于反应容器中，抽真空-氮气循环三次，在氮气状态下加入无水二氯甲烷搅拌溶解，在冰浴条件下加入DIEA，在室温下反应24-48小时，收集反应溶液，旋蒸除去溶剂，并加入乙醚沉淀产物，干燥后得Boc保护的赖氨酸三代肽类树状分子与聚乙二醇接枝共聚物；将所述产物Boc保护的赖氨酸三代肽类树状分子与聚乙二醇接枝共聚物置于反应容器中，抽真空-氮气，在氮气状态下加入无水二氯甲烷搅拌溶解，在冰浴条件下加入三氟乙酸，之后在室温下搅拌反应6-8小时，减压除去溶剂及三氟乙酸，得到的产物在冰无水乙醚中沉淀，干燥后得脱Boc保护后的赖氨酸三代肽类树状分子与聚乙二醇接枝共聚物。

所述基于多糖和超支化多肽的双组分组织粘合剂使用的工艺参数为：反应温度为室温，pH为7.2-7.5，固化时间为5-120秒。

所述基于多糖和超支化多肽的双组分组织粘合剂的制备方法，包括以下步骤：

步骤1，在室温下将所述氧化多糖和所述超支化多肽聚乙二醇接枝共聚物分别溶解在pH 7.2-7.5的磷酸盐缓冲盐水中，配置成溶液；

步骤2，将所述步骤1中得到的氧化多糖和超支化多肽聚乙二醇接枝共聚物溶液分别装入双管注射器，以质量比为1：1或1：2均匀混合后涂覆到伤口处，通过席夫碱反应，室温下在5-120秒内形成所述基于多糖和超支化多肽的双组分粘合剂，且所述基于多糖和超支化多肽的双组分粘合剂牢固持久地粘附于伤口表面。

实施例1

一种基于多糖和超支化多肽的双组分组织粘合剂，由以下质量百分比的原料组成：氧化羧甲基纤维素5％和超支化多肽聚乙二醇接枝共聚物5％，余量为水。

其中，氧化羧甲基纤维素和所述超支化多肽聚乙二醇接枝共聚物的质量比例为1:1。

所述氧化羧甲基纤维素分子量为25万，所述超支化多肽为赖氨酸三代肽类树状分子，两端氨基封端的聚乙二醇分子量为2000。

所述氧化多糖按照以下步骤制备：步骤1，用蒸馏水将多糖配置成多糖水溶液；步骤2，室温条件下，将高碘酸钠水溶液避光逐滴加入到步骤1所得多糖水溶液中进行醛基化反应；步骤3，将步骤2所得产物进行透析、冷冻干燥后，得到氧化多糖，其中高碘酸钠与多糖的摩尔比为1:1。

所述超支化多肽聚乙二醇接枝共聚物按照以下步骤制备：

步骤1，甲酯保护的赖氨酸二代肽类树状分子的制备：将甲酯保护的赖氨酸5g、Boc保护的赖氨酸22.34g、EDCI 12.38g和HOBT 8.71g加入反应容器中，抽真空-氮气循环三次，然后加入50mL无水二氯甲烷搅拌溶解，接着在冰浴条件下加入DIEA 35.60mL，在室温下搅拌反应24小时，收集反应溶液，旋蒸除去溶剂，并加入氯仿溶解产物，再依次用饱和NaHCO₃水溶液、浓度为1M的HC1水溶液和饱和NaCl水溶液洗涤，收集有机相，加入无水硫酸镁干燥，过滤除去无水硫酸镁，将有机相旋干后置于真空干燥箱中过夜，得粘稠状甲酯保护的赖氨酸肽类二代树状分子；将所述产物甲酯保护的赖氨酸肽类二代树状分子置于反应容器中，抽真空-氮气循环三次，在氮气状态下加入14mL无水二氯甲烷搅拌溶解，在冰浴条件下加入14mL三氟乙酸，之后在室温下搅拌反应6-8小时，减压除去溶剂及三氟乙酸，得到的产物在冰无水乙醚中沉淀，干燥后得粉末状的脱Boc保护后的赖氨酸二代肽类树状分子；

步骤2，甲酯保护的赖氨酸三代肽类树状分子的制备：将步骤1所得产物脱Boc保护后的赖氨酸二代肽类树状分子10g、Boc保护的赖氨酸23.82g、EDCI13.18g和HOBT 9.28g加入反应容器中，抽真空-氮气循环三次，然后加入100mL无水二氯甲烷搅拌溶解，接着在冰浴条件下加入32.6mL DIEA，室温下搅拌反应48小时，收集反应溶液，旋蒸除去溶剂，并加入氯仿溶解产物，再依次用饱和NaHCO₃水溶液、HC1水溶液和饱和NaCl水溶液洗涤，收集有机相，加入无水硫酸镁干燥，过滤除去无水硫酸镁，将有机相旋干置于真空干燥箱中过夜，得粘稠状的甲酯、Boc保护的赖氨酸肽类三代树状分子；

步骤3，脱甲酯保护：将步骤2所得产物甲酯、Boc保护的赖氨酸肽类三代树状分子溶解于100mL浓度为1M的NaOH或MeOH溶液中，室温下搅拌反应6-7小时后，旋蒸除去混合物中的NaOH或MeOH，加入80mL氯仿溶解残余物，在搅拌状态下滴加HC1调节溶液pH值至2-3，收集有机相，加入无水硫酸镁，干燥过夜，过滤后旋蒸除去溶剂，减压浓缩后得脱甲酯后的Boc保护赖氨酸肽类三代树状分子；

步骤4，连接氨基聚乙二醇：将步骤3所得产物脱甲酯后的Boc保护赖氨酸肽类三代树状分子4g、氨基聚乙二醇1.86g、EDCI 0.45g和HOBT 0.32g置于支口反应瓶中，抽真空-氮气循环三次，在氮气状态下加入40mL无水二氯甲烷搅拌溶解，在冰浴条件下加入0.82mLDIEA，在室温下反应24-48小时，收集反应溶液，旋蒸除去溶剂，并加入乙醚沉淀产物，干燥后得粉末状Boc保护的赖氨酸三代肽类树状分子与聚乙二醇接枝共聚物；将所述产物Boc保护的赖氨酸三代肽类树状分子与聚乙二醇接枝共聚物置于反应容器中，抽真空-氮气，在氮气状态下加入20mL无水二氯甲烷搅拌溶解，在冰浴条件下加入20mL三氟乙酸，之后在室温下搅拌反应6-8小时，减压除去溶剂及三氟乙酸，得到的产物在冰无水乙醚中沉淀，干燥后得白色粉末状的脱Boc保护后的赖氨酸三代肽类树状分子与聚乙二醇接枝共聚物。

所述基于氧化羧甲基纤维素和超支化多肽的双组分组织粘合剂反应温度为室温，pH为7.2-7.5。

所述基于多糖和超支化多肽的双组分组织粘合剂的制备方法，包括以下步骤：

步骤1，在室温下将所述氧化多糖和所述超支化多肽聚乙二醇接枝共聚物分别溶解在pH为7.2-7.5的磷酸盐缓冲盐水中，配置成5g/L的溶液；

步骤2，将所述步骤1中得到的氧化多糖和超支化多肽聚乙二醇接枝共聚物溶液分别装入双管注射器，以质量比为1：1均匀混合后涂覆到伤口处，通过席夫碱反应，室温下形成所述基于多糖和超支化多肽的双组分粘合剂，且所述基于多糖和超支化多肽的双组分粘合剂牢固持久地粘附于伤口表面。

实施例2

一种基于多糖和超支化多肽的双组分组织粘合剂，由以下质量百分比的原料组成：氧化羧甲基纤维素15％和超支化多肽聚乙二醇接枝共聚物15％，余量为水。

其中，氧化羧甲基纤维素和所述超支化多肽聚乙二醇接枝共聚物的质量比例为1:1。

所述氧化羧甲基纤维素分子量为25万，所述超支化多肽为赖氨酸三代肽类树状分子，两端氨基封端的聚乙二醇分子量为2000。

所述氧化多糖按照以下步骤制备：步骤1，用蒸馏水将多糖配置成多糖水溶液；步骤2，室温条件下，将高碘酸钠水溶液避光逐滴加入到步骤1所得多糖水溶液中进行醛基化反应；步骤3，将步骤2所得产物进行透析、冷冻干燥后，得到氧化多糖，其中高碘酸钠与多糖的摩尔比为1:1。

所述超支化多肽聚乙二醇接枝共聚物按照以下步骤制备：

步骤1，甲酯保护的赖氨酸二代肽类树状分子的制备：将甲酯保护的赖氨酸5g、Boc保护的赖氨酸22.34g、EDCI 12.38g和HOBT 8.71g加入反应容器中，抽真空-氮气循环三次，然后加入50mL无水二氯甲烷搅拌溶解，接着在冰浴条件下加入DIEA 35.60mL，在室温下搅拌反应24小时，收集反应溶液，旋蒸除去溶剂，并加入氯仿溶解产物，再依次用饱和NaHCO₃水溶液、浓度为1M的HC1水溶液和饱和NaCl水溶液洗涤，收集有机相，加入无水硫酸镁干燥，过滤除去无水硫酸镁，将有机相旋干后置于真空干燥箱中过夜，得粘稠状甲酯保护的赖氨酸肽类二代树状分子；将所述产物甲酯保护的赖氨酸肽类二代树状分子置于反应容器中，抽真空-氮气循环三次，在氮气状态下加入14mL无水二氯甲烷搅拌溶解，在冰浴条件下加入14mL三氟乙酸，之后在室温下搅拌反应6-8小时，减压除去溶剂及三氟乙酸，得到的产物在冰无水乙醚中沉淀，干燥后得粉末状的脱Boc保护后的赖氨酸二代肽类树状分子；

步骤2，甲酯保护的赖氨酸三代肽类树状分子的制备：将步骤1所得产物脱Boc保护后的赖氨酸二代肽类树状分子10g、Boc保护的赖氨酸23.82g、EDCI13.18g和HOBT 9.28g加入反应容器中，抽真空-氮气循环三次，然后加入100mL无水二氯甲烷搅拌溶解，接着在冰浴条件下加入32.6mL DIEA，室温下搅拌反应48小时，收集反应溶液，旋蒸除去溶剂，并加入氯仿溶解产物，再依次用饱和NaHCO₃水溶液、HC1水溶液和饱和NaCl水溶液洗涤，收集有机相，加入无水硫酸镁干燥，过滤除去无水硫酸镁，将有机相旋干置于真空干燥箱中过夜，得粘稠状的甲酯、Boc保护的赖氨酸肽类三代树状分子；

步骤3，脱甲酯保护：将步骤2所得产物甲酯、Boc保护的赖氨酸肽类三代树状分子溶解于100mL浓度为1M的NaOH或MeOH溶液中，室温下搅拌反应6-7小时后，旋蒸除去混合物中的NaOH或MeOH，加入80mL氯仿溶解残余物，在搅拌状态下滴加HC1调节溶液pH值至2-3，收集有机相，加入无水硫酸镁，干燥过夜，过滤后旋蒸除去溶剂，减压浓缩后得脱甲酯后的Boc保护赖氨酸肽类三代树状分子；

步骤4，连接氨基聚乙二醇：将步骤3所得产物脱甲酯后的Boc保护赖氨酸肽类三代树状分子4g、氨基聚乙二醇1.86g、EDCI 0.45g和HOBT 0.32g置于支口反应瓶中，抽真空-氮气循环三次，在氮气状态下加入40mL无水二氯甲烷搅拌溶解，在冰浴条件下加入0.82mLDIEA，在室温下反应24-48小时，收集反应溶液，旋蒸除去溶剂，并加入乙醚沉淀产物，干燥后得粉末状Boc保护的赖氨酸三代肽类树状分子与聚乙二醇接枝共聚物；将所述产物Boc保护的赖氨酸三代肽类树状分子与聚乙二醇接枝共聚物置于反应容器中，抽真空-氮气，在氮气状态下加入20mL无水二氯甲烷搅拌溶解，在冰浴条件下加入20mL三氟乙酸，之后在室温下搅拌反应6-8小时，减压除去溶剂及三氟乙酸，得到的产物在冰无水乙醚中沉淀，干燥后得白色粉末状的脱Boc保护后的赖氨酸三代肽类树状分子与聚乙二醇接枝共聚物。

所述基于氧化羧甲基纤维素和超支化多肽的双组分组织粘合剂反应温度为室温，pH为7.2-7.5。

所述基于多糖和超支化多肽的双组分组织粘合剂的制备方法，包括以下步骤：

步骤1，在室温下将所述氧化多糖和所述超支化多肽聚乙二醇接枝共聚物分别溶解在pH 7.2-7.5的磷酸盐缓冲盐水中，配置成15g/L的溶液；

步骤2，将所述步骤1中得到的氧化多糖和超支化多肽聚乙二醇接枝共聚物溶液分别装入双管注射器，以质量比为1：1均匀混合后涂覆到伤口处，通过席夫碱反应，室温下形成所述基于多糖和超支化多肽的双组分粘合剂，且所述基于多糖和超支化多肽的双组分粘合剂牢固持久地粘附于伤口表面。

实施例3

一种基于多糖和超支化多肽的双组分组织粘合剂，由以下质量百分比的原料组成：氧化羧甲基纤维素25％和超支化多肽聚乙二醇接枝共聚物25％，余量为水。

其中，氧化羧甲基纤维素和所述超支化多肽聚乙二醇接枝共聚物的质量比例为1:1。

所述氧化羧甲基纤维素分子量为25万，所述超支化多肽为赖氨酸三代肽类树状分子，两端氨基封端的聚乙二醇分子量为2000。

所述氧化多糖按照以下步骤制备：步骤1，用蒸馏水将多糖配置成多糖水溶液；步骤2，室温条件下，将高碘酸钠水溶液避光逐滴加入到步骤1所得多糖水溶液中进行醛基化反应；步骤3，将步骤2所得产物进行透析、冷冻干燥后，得到氧化多糖，其中高碘酸钠与多糖的摩尔比为1:1。

所述超支化多肽聚乙二醇接枝共聚物按照以下步骤制备：

步骤1，甲酯保护的赖氨酸二代肽类树状分子的制备：将甲酯保护的赖氨酸5g、Boc保护的赖氨酸22.34g、EDCI 12.38g和HOBT 8.71g加入反应容器中，抽真空-氮气循环三次，然后加入50mL无水二氯甲烷搅拌溶解，接着在冰浴条件下加入DIEA 35.60mL，在室温下搅拌反应24小时，收集反应溶液，旋蒸除去溶剂，并加入氯仿溶解产物，再依次用饱和NaHCO₃水溶液、浓度为1M的HC1水溶液和饱和NaCl水溶液洗涤，收集有机相，加入无水硫酸镁干燥，过滤除去无水硫酸镁，将有机相旋干后置于真空干燥箱中过夜，得粘稠状甲酯保护的赖氨酸肽类二代树状分子；将所述产物甲酯保护的赖氨酸肽类二代树状分子置于反应容器中，抽真空-氮气循环三次，在氮气状态下加入14mL无水二氯甲烷搅拌溶解，在冰浴条件下加入14mL三氟乙酸，之后在室温下搅拌反应6-8小时，减压除去溶剂及三氟乙酸，得到的产物在冰无水乙醚中沉淀，干燥后得粉末状的脱Boc保护后的赖氨酸二代肽类树状分子；

步骤2，甲酯保护的赖氨酸三代肽类树状分子的制备：将步骤1所得产物脱Boc保护后的赖氨酸二代肽类树状分子10g、Boc保护的赖氨酸23.82g、EDCI13.18g和HOBT 9.28g加入反应容器中，抽真空-氮气循环三次，然后加入100mL无水二氯甲烷搅拌溶解，接着在冰浴条件下加入32.6mL DIEA，室温下搅拌反应48小时，收集反应溶液，旋蒸除去溶剂，并加入氯仿溶解产物，再依次用饱和NaHCO₃水溶液、HC1水溶液和饱和NaCl水溶液洗涤，收集有机相，加入无水硫酸镁干燥，过滤除去无水硫酸镁，将有机相旋干置于真空干燥箱中过夜，得粘稠状的甲酯、Boc保护的赖氨酸肽类三代树状分子；

步骤3，脱甲酯保护：将步骤2所得产物甲酯、Boc保护的赖氨酸肽类三代树状分子溶解于100mL浓度为1M的NaOH或MeOH溶液中，室温下搅拌反应6-7小时后，旋蒸除去混合物中的NaOH或MeOH，加入80mL氯仿溶解残余物，在搅拌状态下滴加HC1调节溶液pH值至2-3，收集有机相，加入无水硫酸镁，干燥过夜，过滤后旋蒸除去溶剂，减压浓缩后得脱甲酯后的Boc保护赖氨酸肽类三代树状分子；

步骤4，连接氨基聚乙二醇：将步骤3所得产物脱甲酯后的Boc保护赖氨酸肽类三代树状分子4g、氨基聚乙二醇1.86g、EDCI 0.45g和HOBT 0.32g置于支口反应瓶中，抽真空-氮气循环三次，在氮气状态下加入40mL无水二氯甲烷搅拌溶解，在冰浴条件下加入0.82mLDIEA，在室温下反应24-48小时，收集反应溶液，旋蒸除去溶剂，并加入乙醚沉淀产物，干燥后得粉末状Boc保护的赖氨酸三代肽类树状分子与聚乙二醇接枝共聚物；将所述产物Boc保护的赖氨酸三代肽类树状分子与聚乙二醇接枝共聚物置于反应容器中，抽真空-氮气，在氮气状态下加入20mL无水二氯甲烷搅拌溶解，在冰浴条件下加入20mL三氟乙酸，之后在室温下搅拌反应6-8小时，减压除去溶剂及三氟乙酸，得到的产物在冰无水乙醚中沉淀，干燥后得白色粉末状的脱Boc保护后的赖氨酸三代肽类树状分子与聚乙二醇接枝共聚物。

所述基于氧化羧甲基纤维素和超支化多肽的双组分组织粘合剂反应温度为室温，pH为7.2-7.5。

所述基于多糖和超支化多肽的双组分组织粘合剂的制备方法，包括以下步骤：

步骤1，在室温下将所述氧化多糖和所述超支化多肽聚乙二醇接枝共聚物分别溶解在pH 7.2-7.5的磷酸盐缓冲盐水中，配置成25g/L的溶液；

步骤2，将所述步骤1中得到的氧化多糖和超支化多肽聚乙二醇接枝共聚物溶液分别装入双管注射器，以质量比为1：1均匀混合后涂覆到伤口处，通过席夫碱反应，室温下形成所述基于多糖和超支化多肽的双组分粘合剂，且所述基于多糖和超支化多肽的双组分粘合剂牢固持久地粘附于伤口表面。

实施例4

一种基于多糖和超支化多肽的双组分组织粘合剂，由以下质量百分比的原料组成：氧化羧甲基纤维素25％和超支化多肽聚乙二醇接枝共聚物25％，余量为水。

其中，氧化羧甲基纤维素和所述超支化多肽聚乙二醇接枝共聚物的质量比例为1:2。

所述氧化羧甲基纤维素分子量为25万，所述超支化多肽为赖氨酸三代肽类树状分子，两端氨基封端的聚乙二醇分子量为2000。

所述氧化多糖按照以下步骤制备：步骤1，用蒸馏水将多糖配置成多糖水溶液；步骤2，室温条件下，将高碘酸钠水溶液避光逐滴加入到步骤1所得多糖水溶液中进行醛基化反应；步骤3，将步骤2所得产物进行透析、冷冻干燥后，得到氧化多糖，其中高碘酸钠与多糖的摩尔比为1:1。

所述超支化多肽聚乙二醇接枝共聚物按照以下步骤制备：

步骤1，甲酯保护的赖氨酸二代肽类树状分子的制备：将甲酯保护的赖氨酸5g、Boc保护的赖氨酸22.34g、EDCI 12.38g和HOBT 8.71g加入反应容器中，抽真空-氮气循环三次，然后加入50mL无水二氯甲烷搅拌溶解，接着在冰浴条件下加入DIEA 35.60mL，在室温下搅拌反应24小时，收集反应溶液，旋蒸除去溶剂，并加入氯仿溶解产物，再依次用饱和NaHCO₃水溶液、浓度为1M的HC1水溶液和饱和NaCl水溶液洗涤，收集有机相，加入无水硫酸镁干燥，过滤除去无水硫酸镁，将有机相旋干后置于真空干燥箱中过夜，得粘稠状甲酯保护的赖氨酸肽类二代树状分子；将所述产物甲酯保护的赖氨酸肽类二代树状分子置于反应容器中，抽真空-氮气循环三次，在氮气状态下加入14mL无水二氯甲烷搅拌溶解，在冰浴条件下加入14mL三氟乙酸，之后在室温下搅拌反应6-8小时，减压除去溶剂及三氟乙酸，得到的产物在冰无水乙醚中沉淀，干燥后得粉末状的脱Boc保护后的赖氨酸二代肽类树状分子；

步骤2，甲酯保护的赖氨酸三代肽类树状分子的制备：将步骤1所得产物脱Boc保护后的赖氨酸二代肽类树状分子10g、Boc保护的赖氨酸23.82g、EDCI13.18g和HOBT 9.28g加入反应容器中，抽真空-氮气循环三次，然后加入100mL无水二氯甲烷搅拌溶解，接着在冰浴条件下加入32.6mL DIEA，室温下搅拌反应48小时，收集反应溶液，旋蒸除去溶剂，并加入氯仿溶解产物，再依次用饱和NaHCO₃水溶液、HC1水溶液和饱和NaCl水溶液洗涤，收集有机相，加入无水硫酸镁干燥，过滤除去无水硫酸镁，将有机相旋干置于真空干燥箱中过夜，得粘稠状的甲酯、Boc保护的赖氨酸肽类三代树状分子；

步骤3，脱甲酯保护：将步骤2所得产物甲酯、Boc保护的赖氨酸肽类三代树状分子溶解于100mL浓度为1M的NaOH或MeOH溶液中，室温下搅拌反应6-7小时后，旋蒸除去混合物中的NaOH或MeOH，加入80mL氯仿溶解残余物，在搅拌状态下滴加HC1调节溶液pH值至2-3，收集有机相，加入无水硫酸镁，干燥过夜，过滤后旋蒸除去溶剂，减压浓缩后得脱甲酯后的Boc保护赖氨酸肽类三代树状分子；

步骤4，连接氨基聚乙二醇：将步骤3所得产物脱甲酯后的Boc保护赖氨酸肽类三代树状分子4g、氨基聚乙二醇1.86g、EDCI 0.45g和HOBT 0.32g置于支口反应瓶中，抽真空-氮气循环三次，在氮气状态下加入40mL无水二氯甲烷搅拌溶解，在冰浴条件下加入0.82mLDIEA，在室温下反应24-48小时，收集反应溶液，旋蒸除去溶剂，并加入乙醚沉淀产物，干燥后得粉末状Boc保护的赖氨酸三代肽类树状分子与聚乙二醇接枝共聚物；将所述产物Boc保护的赖氨酸三代肽类树状分子与聚乙二醇接枝共聚物置于反应容器中，抽真空-氮气，在氮气状态下加入20mL无水二氯甲烷搅拌溶解，在冰浴条件下加入20mL三氟乙酸，之后在室温下搅拌反应6-8小时，减压除去溶剂及三氟乙酸，得到的产物在冰无水乙醚中沉淀，干燥后得白色粉末状的脱Boc保护后的赖氨酸三代肽类树状分子与聚乙二醇接枝共聚物。

所述基于氧化羧甲基纤维素和超支化多肽的双组分组织粘合剂反应温度为室温，pH为7.2-7.5。

所述基于多糖和超支化多肽的双组分组织粘合剂的制备方法，包括以下步骤：

步骤1，在室温下将所述氧化多糖和所述超支化多肽聚乙二醇接枝共聚物分别溶解在pH 7.2-7.5的磷酸盐缓冲盐水中，配置成25g/L的溶液；

步骤2，将所述步骤1中得到的氧化多糖和超支化多肽聚乙二醇接枝共聚物溶液分别装入双管注射器，以质量比为1：2均匀混合后涂覆到伤口处，通过席夫碱反应，室温下形成所述基于多糖和超支化多肽的双组分粘合剂，且所述基于多糖和超支化多肽的双组分粘合剂牢固持久地粘附于伤口表面。

实施例5

1.粘合剂两组分结构验证

如图1e所示，通过红外光谱表征了本发明的氧化多糖(氧化羧甲基纤维素)的成功制备，如图3a，3b和3c所示，通过大分子飞行质谱表征了本发明的超支化多肽聚乙二醇接枝共聚物，及其合成中间产物赖氨酸二代、三代肽类树状分子的成功制备。

如图1e所示，红外光谱中1733cm^-1波数处的出峰为醛基特征峰，证明了氧化多糖链的成功制备。如图3所示，赖氨酸二代、三代肽类树状分子、氨基聚乙二醇和超支化多肽聚乙二醇接枝共聚物的质谱证明了超支化多肽聚乙二醇接枝共聚物的成功制备。

2.固化时间测试

如图6所示，通过倾斜法和流变实验分别定性和定量表征了本发明的基于氧化多糖和超支化多肽聚乙二醇接枝共聚物组织粘合剂的凝胶化时间，通过将粘合剂质量分数从5％调节至25％w/v，两组分质量比从1：1调节至1：2，固化时间就对应地从几分钟秒变为几秒钟，表明了固化时间的良好可控性。

3.溶胀率和降解性能测试

37℃下，将本发明的氧化多糖和超支化多肽聚乙二醇接枝共聚物组织粘合剂孵育在pH 7.2-7.5的磷酸盐缓冲盐水中，通过在固定时间点对湿态和冻干态的粘合剂进行称重检测其溶胀率和降解速率。如图4所示，本发明的组织粘合剂具有相对低的溶胀率和可控的降解速率。溶胀度较小的粘合剂被报道具有更好的粘附性能，且不会对创伤区域造成压迫。

4.激光共聚焦显微镜(CLSM)扫描

采用CLSM揭示本发明的氧化多糖/超支化多肽聚乙二醇接枝共聚物组织粘合剂的内部形态。如图5所示，本发明的组织粘合剂截面呈连续的多孔结构。粘合剂内部高度均一的多孔结构被报道有利于改善其机械强度。

5.动态流变仪测量

图6a中，凝胶化时间(G'和G”之间的交叉点对应的横坐标)表现出对粘合剂质量分数和超支化多肽质量比的高度依赖性。通过将粘合剂质量分数从5％调节至25％w/v，两组分质量比从1：1调节至1：2，固化时间就对应地从几分钟秒变为几秒钟，表明了固化时间的良好可控性。并且材料弹性模量(G')也呈现出对质量分数和超支化多肽质量比的高度依赖性，随着粘合剂质量分数从5％调节至25％w/v，两组分质量比从1：1调节至1：2，G'从4kPa显着增加到80kPa。频率扫描实验进一步证实了本发明粘合剂的弹性模量的良好可控性，如图6b所示。

6.拉伸和压缩试验

使用万能试验机检测本发明组织粘合剂的力学性能，如图7所示。粘合剂的拉伸强度，断裂伸长率，压缩模量和能量损耗都表现出对质量分数和超支化多肽质量比的高度依赖性，与流变实验结果一致。超支化多肽的浓度越高，粘合剂的拉伸强度和压缩模量越高，断裂伸长率越低。

实施例1-4的组织粘合剂都呈现较低的能量损耗，表明本发明的氧化多糖/超支化多肽聚乙二醇接枝共聚物组织粘合剂具有较好的抗形变能力，能在承受较大的外力破坏下能够保持结构完整性。这种优异的机械性质完全符合临床上医用组织粘合剂应用的期望，因为生物体内属于高动态环境，组织粘合剂需要抵抗伤口区域或动脉血管中的高压。

7.粘附性能测试

使用万能试验机检测本发明组织粘合剂的粘附性能，如图8所示。粘结强度的测定方法是按照美国材料与试验协会(ASTM)标准试验方法中组织粘合剂粘接性能试验方法第1部分F2255-05：搭接-剪切拉伸承载强度进行。

本发明的组织粘合剂显示出高达180kPa的粘附强度，远远大于商业化的聚乙二醇粘合剂Coseal。

8.体外生物相容性测试

通过CCK-8定量检测本发明组织粘合剂的细胞毒性。将NIH 3T3成纤维细胞直接接种在本发明组织粘合剂的表面上孵育3天。以空白培养基表面培养的NIH 3T3细胞为对照组。

如图9所示，NIH 3T3成纤维细胞在12至72小时内呈现良好的生长趋势，所有细胞在第三天都保持高于85％的活性，证实了本发明的组织粘合剂具有良好的生物相容性。

对于上述实验的结果汇总如表1所示，可以看出按照实施例4的方案所得到的粘合剂固化时间、弹性模量以及粘合强度相较于其他实施例的较好。

表1为实施例1-4的组织粘合剂对应的各个性能指标(固化时间，溶胀率，弹性模量，和粘合强度)的总结

综上所述，本发明提供了一种基于多糖和超支化多肽的双组分组织粘合剂，具有易调节的化学和物理性质，能够快速牢固的粘附到组织上，提供完全的伤口闭合，同时具有足够的粘弹性和机械强度。这种组织粘合剂制备方法简单，可行性强，可控性高，具有巨大的临床应用潜力。

Claims (8)

1.一种基于多糖和超支化多肽的双组分组织粘合剂，其特征在于，由以下质量百分比的原料组成：氧化多糖5％-25％和超支化多肽聚乙二醇接枝共聚物5％-25％，余量为磷酸盐缓冲盐水；

所述氧化多糖和所述超支化多肽聚乙二醇接枝共聚物的质量比例为1:2；

所述超支化多肽聚乙二醇接枝共聚物按照以下步骤制备：

步骤1，利用摩尔比为1:2-3:2-3:2-3:6-9的甲酯保护的赖氨酸、Boc保护的赖氨酸、EDCI，HOBT和DIEA制备脱Boc保护后的赖氨酸二代肽类树状分子；

步骤2，利用摩尔比为1:6-8:6-8:6-8:15-18的脱Boc保护后的赖氨酸二代肽类树状分子、Boc保护的赖氨酸、EDCI，HOBT和DIEA制备甲酯、Boc保护的赖氨酸肽类三代树状分子；

步骤3，对所述甲酯、Boc保护的赖氨酸肽类三代树状分子进行脱甲酯保护，得到脱甲酯后的Boc保护赖氨酸肽类三代树状分子；

步骤4，所述脱甲酯后的Boc保护赖氨酸肽类三代树状分子连接氨基聚乙二醇，得到脱Boc保护后的赖氨酸三代肽类树状分子与聚乙二醇接枝共聚物，即超支化多肽聚乙二醇接枝共聚物。

2.根据权利要求1所述的一种基于多糖和超支化多肽的双组份组织粘合剂，其特征在于，所述氧化多糖分子量为25万，所述多糖的种类为羧甲基纤维素，葡聚糖，透明质酸和海藻酸钠中任意一种。

3.根据权利要求2所述的一种基于多糖和超支化多肽的双组份组织粘合剂，其特征在于，所述氧化多糖按照以下步骤制备：

步骤1，用蒸馏水将多糖配置成多糖水溶液；

步骤2，室温条件下，将高碘酸钠水溶液避光逐滴加入到步骤1所得多糖水溶液中进行醛基化反应；

步骤3，将步骤2所得产物进行透析、冷冻干燥后，得到氧化多糖。

4.根据权利要求3所述的一种基于多糖和超支化多肽的双组份组织粘合剂，其特征在于，步骤2中所述高碘酸钠与多糖的摩尔比为1:1。

5.根据权利要求1所述的一种基于多糖和超支化多肽的双组份组织粘合剂，其特征在于，所述超支化多肽为赖氨酸三代肽类树状分子，两端氨基封端的聚乙二醇分子量为2000。

6.根据权利要求5所述的一种基于多糖和超支化多肽的双组份组织粘合剂，其特征在于，所述超支化多肽聚乙二醇接枝共聚物按照以下步骤制备：

步骤1，甲酯保护的赖氨酸二代肽类树状分子的制备：将甲酯保护的赖氨酸、Boc保护的赖氨酸、EDCI和HOBT加入反应容器中，抽真空-氮气，然后加入无水二氯甲烷搅拌溶解，接着在冰浴条件下加入DIEA，在室温下搅拌反应24小时，收集反应溶液，旋蒸除去溶剂，并加入氯仿溶解产物，再依次用饱和NaHCO₃水溶液、HC1水溶液和饱和NaCl水溶液洗涤，收集有机相，加入无水硫酸镁干燥，过滤除去无水硫酸镁，将有机相旋干，置于真空干燥箱中过夜，得甲酯保护的赖氨酸肽类二代树状分子；将所述产物甲酯保护的赖氨酸肽类二代树状分子置于反应容器中，抽真空-氮气循环三次，在氮气状态下加入无水二氯甲烷搅拌溶解，在冰浴条件下加入三氟乙酸，之后在室温下搅拌反应6-8小时，减压除去溶剂及三氟乙酸，得到的产物在冰无水乙醚中沉淀，干燥后得脱Boc保护后的赖氨酸二代肽类树状分子；

步骤2，甲酯保护的赖氨酸三代肽类树状分子的制备：将步骤1所得产物脱Boc保护后的赖氨酸二代肽类树状分子、Boc保护的赖氨酸、EDCI和HOBT加入反应容器中，抽真空-氮气，然后加入无水二氯甲烷搅拌溶解，接着在冰浴条件下加入DIEA，室温下搅拌反应48小时，收集反应溶液，旋蒸除去溶剂，并加入氯仿溶解产物，再依次用饱和NaHCO₃水溶液、HC1水溶液和饱和NaCl水溶液洗涤，收集有机相，加入无水硫酸镁干燥，过滤除去无水硫酸镁，将有机相旋干置于真空干燥箱中过夜，得甲酯、Boc保护的赖氨酸肽类三代树状分子；

步骤3，脱甲酯保护：将步骤2所得产物甲酯、Boc保护的赖氨酸肽类三代树状分子溶解于NaOH或MeOH溶液中，室温下搅拌反应6-7小时后，旋蒸除去混合物中的NaOH或MeOH，加入氯仿溶解残余物，在搅拌状态下滴加HC1调节溶液pH值至2-3，收集有机相，加入无水硫酸镁，干燥过夜，过滤后旋蒸除去溶剂，减压浓缩后得脱甲酯后的Boc保护赖氨酸肽类三代树状分子；

步骤4，连接氨基聚乙二醇：将步骤3所得产物脱甲酯后的Boc保护赖氨酸肽类三代树状分子、氨基聚乙二醇、EDCI和HOBT置于反应容器中，抽真空-氮气，在氮气状态下加入无水二氯甲烷搅拌溶解，在冰浴条件下加入DIEA，在室温下反应24-48小时，收集反应溶液，旋蒸除去溶剂，并加入乙醚沉淀产物，干燥后得Boc保护的赖氨酸三代肽类树状分子与聚乙二醇接枝共聚物；将所述产物Boc保护的赖氨酸三代肽类树状分子与聚乙二醇接枝共聚物置于反应容器中，抽真空-氮气，在氮气状态下加入无水二氯甲烷搅拌溶解，在冰浴条件下加入三氟乙酸，之后在室温下搅拌反应6-8小时，减压除去溶剂及三氟乙酸，得到的产物在冰无水乙醚中沉淀，干燥后得脱Boc保护后的赖氨酸三代肽类树状分子与聚乙二醇接枝共聚物。

7.根据权利要求1所述的基于多糖和超支化多肽的双组分组织粘合剂，其特征在于，该粘合剂使用的工艺参数为：反应温度为室温，pH为7.2-7.5，固化时间为5-120秒。

8.根据权利要求1-7任意一项所述基于多糖和超支化多肽的双组分组织粘合剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1，在室温下将所述氧化多糖和所述超支化多肽聚乙二醇接枝共聚物分别溶解在pH 7.2-7.5的磷酸盐缓冲盐水中，配置成溶液；

步骤2，将所述步骤1中得到的氧化多糖和超支化多肽聚乙二醇接枝共聚物溶液分别装入双管注射器，以质量比为1：2均匀混合后涂覆到伤口处，通过席夫碱反应，室温下在5-120秒内形成所述基于多糖和超支化多肽的双组分粘合剂，且所述基于多糖和超支化多肽的双组分粘合剂牢固持久地粘附于伤口表面。

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