CN113087934A - 一种组织粘合水凝胶及其制备方法和应用 - Google Patents

一种组织粘合水凝胶及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种水凝胶。具体地，本发明提供了一种通过可注射方式形成的适用于潮湿和动态生理环境的组织粘合水凝胶，所述的组织粘合水凝胶通过水凝胶前体溶液与偶联剂混合经偶联形成；其中，所述的水凝胶前体溶液包括第一聚合物、第二聚合物和第三聚合物；所述的第一聚合物为氨基化的聚乙二醇‑聚癸二酸甘油酯；所述的第二聚合物的侧链包含氨基和多酚结构；所述的第三聚合物的侧链包含羧基。本发明的水凝胶具有优良的力学强度、流变性能和压缩性能，对于潮湿组织和动态环境具有优异的粘合强度和循环性能。

Description

一种组织粘合水凝胶及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及材料科学和临床医学领域，具体地，涉及一种能够适应潮湿和动态生理环境的可通过注射方式形成的组织粘合水凝胶及其制备方法和应用。
背景技术
现代战场对组织粘合材料的需求量极大，高效的组织粘合材料对于降低战场阵亡率至关重要。同时，临床手术中也急需可替代传统缝合线或缝合钉的组织粘合材料来简化复杂的手术过程。目前临床上针对手术切口或意外创伤主要采用传统的缝合或钉合的手术方式闭合伤口，但是缝合和钉合会对组织造成二次伤害，密封效果差，手术操作难度较大，且在复杂多变的战场环境中无法适用。现有商品化且临床使用较多的组织粘合材料主要包括纤维蛋白胶和氰基丙烯酸酯两类，但纤维蛋白胶粘合强度较弱，且成本较高，而氰基丙烯酸酯类组织粘合剂则面临固化后变硬，降解产物有毒等缺点。此外，上述方式在潮湿和动态生理环境下使用效果均欠佳。
具有一定粘弹性的水凝胶含有大量水分，其结构和性能都更接近天然软组织，在组织粘合领域应用广泛，同时其本身的粘弹性使其能够更好地适应动态环境。此外，为了解决潮湿生理环境和动态生理环境对组织粘合提出的更高要求，增强其潮湿和动态生理环境的粘合效果也十分必要。
因此，开发使用方便，能够适应潮湿和动态生理环境的可通过注射方式形成的组织粘合水凝胶在现代战场和临床中具有重大的实际应用价值。
发明内容
本发明的目的就是提供一种能够适应潮湿和动态生理环境的通过注射快速成胶的组织粘合水凝胶。
在本发明的第一方面，提供了一种组织粘合水凝胶，其特征在于，所述的组织粘合水凝胶通过水凝胶前体溶液与偶联剂混合经偶联形成；
其中，所述的水凝胶前体溶液包括第一聚合物、第二聚合物和第三聚合物。
在另一优选例中，所述的第一聚合物和第三聚合物通过酰胺键共价结合，所述的第二聚合物和第三聚合物通过酰胺键共价结合。
在另一优选例中，所述的第一聚合物、第二聚合物和第三聚合物均为人体可直接接触的无毒聚合物。
在另一优选例中，所述的第一聚合物是主要基体材料。
在另一优选例中，所述的第一聚合物是第一聚合物的前体聚合物经过氨基化修饰得到的。
在另一优选例中，所述的第一聚合物的前体聚合物为聚乙二醇-聚癸二酸甘油酯，含有如式III所示的结构单元：
Figure BDA0003029293780000021
其中，c为1-20，d为5-60。
在另一优选例中，所述的第一聚合物通过将氨基修饰物质取代第一聚合物的前体聚合物侧链中羟基的H得到。
在另一优选例中，所述的第一聚合物为氨基化的聚乙二醇-聚癸二酸甘油酯，其含有如式I所示的结构单元：
Figure BDA0003029293780000022
式中，
a为1-20，b为5-60；
Y各自独立地选自下组基团：H、
Figure BDA0003029293780000024
且在一个结构单元中，平均包含至少1个
Figure BDA0003029293780000025
Figure BDA0003029293780000026
是指氨基通过接枝的链结构连接到第一聚合物。
在另一优选例中，所述的第一聚合物含有如式IV所示的结构单元：
Figure BDA0003029293780000023
式中，
a1为1-20，b1为5-60；
Z各自独立地选自下组基团：H、
Figure BDA0003029293780000031
且在一个结构单元中，平均包含至少1～1.4个
Figure BDA0003029293780000032
较佳地包含至少1.5～1.6个
Figure BDA0003029293780000033
更佳地至少包含1.8个
Figure BDA0003029293780000034
在另一优选例中，所述的第一聚合物具有如下的一个或多个特征：
(a)数均分子量为5000-50000Da，较佳地为8000-30000Da，更佳地为8000-12000Da；
(b)分子量分布系数为1.0～1.60，较佳地为1.20～1.50；
(c)在一个结构单元中，平均包含至少1.4个
Figure BDA0003029293780000035
较佳地包含至少1.6个
Figure BDA0003029293780000036
更佳地至少包含1.8个
Figure BDA0003029293780000037
在另一优选例中，所述的第一聚合物的氨基接枝率，即氨基取代聚乙二醇-聚癸二酸甘油酯中原始羟基的H的比率大于70％，较佳地大于80％，更佳地大于90％。
在另一优选例中，所述的第一聚合物的制备方法包括如下步骤：
(a1)将癸二酸和四丁基氢氧化铵按照摩尔比1:2投入到95％乙醇中，在55℃下搅拌反应30min，除去乙醇和水得到产物；
(b1)在氮气氛围保护下，将癸二酸、聚乙二醇二缩水甘油醚(PEGDGE)和步骤(a1)得到的产物以摩尔比为1:1:0.006的比例溶解至无水N,N-二甲基甲酰胺中，在100℃下搅拌反应72h；
(c1)透析纯化步骤(b)得到的混合物，得到纯化的线性聚酯聚乙二醇-聚癸二酸甘油酯；
(d1)在氮气氛围保护下，将步骤(c1)得到的线性聚酯聚乙二醇-聚癸二酸甘油酯(按羟基量算)、N-(叔丁氧羰基)氨基乙酸(BOC-glycine)、N,N'-二异丙基碳二亚胺(DIC)和4-二甲氨基吡啶(DMAP)以摩尔比为1:1.2:2:0.05的比例溶解至无水二氯甲烷中，室温搅拌反应24h；
(e1)将步骤(d1)得到的反应混合物抽滤，浓缩后用三氟乙酸脱除叔丁氧羰基，然后透析纯化后得到所述的第一聚合物。
在另一优选例中，所述的第二聚合物的侧链包含氨基和
Figure BDA0003029293780000038
在另一优选例中，所述的第二聚合物是由包含氨基的第二聚合物的前体聚合物经过
Figure BDA0003029293780000041
修饰得到的。
在另一优选例中，所述的包含氨基的第二聚合物的前体聚合物是通过
Figure BDA0003029293780000042
单元聚合形成的无规共聚物。
在另一优选例中，所述的包含氨基的第二聚合物的前体聚合物为壳聚糖及其衍生物。
在另一优选例中，所述的
Figure BDA0003029293780000043
为
Figure BDA0003029293780000044
在另一优选例中，所述的
Figure BDA0003029293780000045
的接枝率，即该基团取代原始氨基中的H的比例为5％～30％。
在另一优选例中，所述的
Figure BDA0003029293780000046
的接枝率，即该基团取代原始氨基中的H的比例为8％～20％，更佳地为8％～12％。
在另一优选例中，所述的第二聚合物的数均分子量为100-150kDa。
在另一优选例中，所述的第二聚合物包含如式II所示的结构：
Figure BDA0003029293780000047
其中，三种单体可随意组合，从而得到无规共聚物；
l为45～80％，m为5～30％，n为15％～25％，l、m、n的计算方式为相对应的重复单元数除以总重复单元数。
在另一优选例中，所述的式II聚合物中m为8％～12％。
在另一优选例中，所述的第二聚合物中用于修饰
Figure BDA0003029293780000051
的物质选自下组：没食子酸、杨梅素，或其组合。
在另一优选例中，所述的第二聚合物为接枝没食子酸的壳聚糖(壳聚糖-没食子酸)，包含如式V所示的结构：
Figure BDA0003029293780000052
其中，三种单体可随意组合，从而得到无规共聚物；
l1为45～80％，m1为5～30％，n1为15％-25％；l1、m1、n1的计算方式为相对应的重复单元数除以总重复单元数。
在另一优选例中，所述的壳聚糖-没食子酸的没食子酸接枝率，即没食子酸取代壳聚糖中原始氨基中的H的比例为8％～12％。
在另一优选例中，所述的第二聚合物的制备方法包括：
在保护气体氛围下，在溶剂存在下，将壳聚糖、EDC、NHS和修饰物质混合，后处理后得到所述的第二聚合物。
在另一优选例中，所述的第二聚合物的制备方法包括如下步骤：
(a2)将壳聚糖溶解在1M的盐酸溶液中，用2M的氢氧化钠溶液调节pH至5.5；
(b2)在氩气氛围保护下，依次将修饰物质、EDC、NHS，按照与步骤(a2)的第二聚合物溶液的摩尔比为1.1:1.5:1.5:1滴加至步骤(a2)的壳聚糖溶液中，并保持反应体系pH在4.5-7.0，较佳为5.0-6.5，更佳为5.3-5.8，加料过程中保持持续搅拌，加料完成后继续搅拌反应12h；
(c2)透析纯化步骤(b2)的产物得到所述的第二聚合物。
在另一优选例中，所述的步骤(b2)的滴加速度为0.5-2滴/秒，更佳地为0.5-1滴/秒。
在另一优选例中，所述的步骤(b2)在冰浴中进行，温度为-10-5℃，更佳地为-5-0℃。
在另一优选例中，所述的第三聚合物的侧链包含羧基。
在另一优选例中，所述的第三聚合物的数均分子量为200-800kDa。
在另一优选例中，所述的第三聚合物选自下组：γ-聚谷氨酸、聚天冬氨酸，或其组合。
在另一优选例中，所述的第三聚合物是γ-聚谷氨酸。
在另一优选例中，所述的第一聚合物与第二聚合物的质量比为5～50：1；和/或
所述的第一聚合物与第三聚合物的质量比为1～8：1；和/或
所述的第二聚合物与第三聚合物的质量比为1：1～10。
在另一优选例中，所述的第一聚合物与第二聚合物的质量比为5～30：1，更佳地为5～20：1；和/或
所述的第一聚合物与第三聚合物的质量比为1～5：1，更佳地为1～3：1；和/或
所述的第二聚合物与第三聚合物的质量比为1：1～8，更佳地为1：1～5。
在另一优选例中，按溶质(g)/溶剂(mL)质量体积百分比计，第一聚合物的浓度为10-40％；第二聚合物的浓度为0.5-4％；γ-聚谷氨酸的浓度为5-15％。
在另一优选例中，按溶质(g)/溶剂(mL)质量体积百分比计，第一聚合物的浓度为20％；第二聚合物的浓度为2％；第三聚合物的浓度为10％。
在另一优选例中，所述的水凝胶前体溶液的溶剂选自下组：超纯水、PBS溶液(pH＝7.2)，或其组合。
在另一优选例中，所述的水凝胶前体溶液的粘度为70-100mPa·s。
在另一优选例中，所述的偶联剂包含1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)。
在另一优选例中，所述的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为0.6～2:1，优选0.8～1.2:1，更佳地为1:1。
在另一优选例中，所述的偶联剂中1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的浓度为0.4～0.7g/mL。
在另一优选例中，所述的第三聚合物中的羧基与偶联剂中EDC的摩尔比为5～30:1。
在另一优选例中，所述的第三聚合物中的羧基与偶联剂中EDC的摩尔比为10～25:1，例如15:1、20:1，优选15:1。
在另一优选例中，所述的偶联剂的溶剂选自下组：超纯水、PBS缓冲溶液(pH＝7.2)。
在另一优选例中，所述的偶联剂的粘度为0.6-0.8mPa·s。
在另一优选例中，所述的水凝胶具有优异的潮湿和动态生理环境的组织粘合性。
在另一优选例中，所述的水凝胶具有以下一个或多个特征：
(1)压缩应变为80％时的压缩强度为20-100kPa；
(2)压缩释放后100％回复，循环压缩后水凝胶无明显损耗；
(3)断裂伸长率达到200％-450％，更佳地为250％-420％；
(4)对潮湿组织的搭接-剪切粘合强度为10-60kPa，更佳地为12-48kPa；
(5)粘合的潮湿组织经弯曲、拉伸和扭转后不脱落。
在本发明的第二方面，提供了一种本发明第一方面所述的水凝胶的制备方法，所述制备方法包括：在偶联剂存在下，使得本发明第一方面所述的水凝胶前体溶液进行偶联反应，从而形成所述的水凝胶。
在另一优选例中，所述制备方法包括以下步骤：
(a)提供本发明第一方面所述的水凝胶前体溶液：所述的水凝胶前体溶液包含第一聚合物、第二聚合物、第三聚合物；
(b)提供本发明第一方面所述的偶联剂溶液：所述的偶联剂包含1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)；
(c)将所述的水凝胶前体溶液与所述的偶联剂混合，得到所述的水凝胶；
在另一优选例中，所述的水凝胶前体溶液和偶联剂溶液的溶剂选自下组：水和/或PBS溶液。
在另一优选例中，所述的步骤(a)包括：
(a1)将第一聚合物、第二聚合物、第三聚合物分别分散在溶剂中，得到第一聚合物溶液、第二聚合物溶液、第三聚合物溶液；
(a2)将第一聚合物溶液和第二聚合物溶液滴加到第三聚合物溶液中，得到所述的水凝胶前体溶液。
在另一优选例中，所述的步骤(c)包括：将前体溶液和偶联剂的混合物转移至注射器内，注射形成所述的水凝胶。
在另一优选例中，所述的步骤(a1)中的溶剂选自下组：水、PBS缓冲溶液(pH＝7.2)。
在本发明的第三方面，提供了一种可用于制备本发明第一方面所述的水凝胶的前体溶液，所述前体溶液包括本发明第一方面所述的第一聚合物、第二聚合物和第三聚合物。
在另一优选例中，所述的可用于制备水凝胶的前体溶液的制备方法包括如下步骤：
(a)将第一聚合物、第二聚合物、第三聚合物分别分散在溶剂中，得到第一聚合物溶液、第二聚合物溶液、第三聚合物溶液；
(b)将第一聚合物溶液和第二聚合物溶液滴加到第三聚合物溶液中，得到所述的水凝胶前体溶液。
在另一优选例中，所述的水凝胶前体溶液的溶剂选自下组：水、PBS溶液，或其组合。
在另一优选例中，所述的步骤(a1)中的溶剂选自下组：水、PBS缓冲溶液(pH＝7.2)。
在本发明的第四方面，提供了一种用于制备本发明第一方面所述水凝胶的混合物，所述的混合物包含本发明所述的水凝胶前体溶液和偶联剂。
在另一优选例中，所述的混合物的粘度为75-110mPa·s。
在另一优选例中，所述的混合物具有良好的可注射性。
在另一优选例中，所述的混合物注射至需要组织粘合的部位，原位偶联，得到本发明第一方面所述的水凝胶。
在另一优选例中，所述的混合物的成胶时间在1分钟内，更佳地在15-40s范围内。
在本发明的第五方面，提供了一种用于制备本发明第一方面水凝胶的试剂盒，所述试剂盒包括：
(a)第一容器，以及位于所述容器内的水凝胶前体溶液，所述的前体溶液包括本发明第一方面所述的水凝胶前体溶液；
(b)第二容器，以及位于所述容器内的偶联剂，所述的偶联剂包括本发明第一方面所述的偶联剂。
在另一优选例中，所述的试剂盒包括：
(a)第一容器，以及位于所述容器内的第一聚合物和第二聚合物的溶液，所述的溶液包含本发明第一方面所述的第一聚合物和第二聚合物；
(b)第二容器，以及位于所述容器内的第三聚合物溶液，所述的溶液包含本发明第一方面所述的第三聚合物；
(c)第三容器，以及位于所述容器内的偶联剂，所述的偶联剂包括本发明第一方面所述的偶联剂。
在本发明的第六方面，提供了一种医用涂层，所述的医用涂层包括本发明第一方面所述的水凝胶。
在本发明的第七方面，提供了一种医用材料，所述的医用材料包括本发明第一方面所述的水凝胶。
在另一优选例中，所述的医用材料选自下组：医用组织密封剂，医用止血剂，医用伤口敷料。
在本发明的第八方面，提供了本发明第一方面所述的水凝胶的用途，用于制备一医用材料，所述的医用材料用于软组织伤口的粘合，促进组织修复和再生。
在本发明的第九方面，提供了一种粘合软组织伤口的方法，所述方法使用本发明第一方面所述的水凝胶粘合软组织伤口。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了成胶机理研究。(a)氨基化的聚乙二醇-聚癸二酸甘油酯和(b)壳聚糖-没食子酸的合成路线；(c)组织粘合水凝胶制备机理图。
图2显示了本发明的(a)氨基化的聚乙二醇-聚癸二酸甘油酯和(b)壳聚糖-没食子酸的核磁共振氢谱图。
图3显示了本发明组织粘合水凝胶的(a)成胶过程流变曲线图；(b)成胶时间图；(c)成胶后储存模量图以及(d)小瓶倾斜倒置成胶实物图。
图4显示了本发明组织粘合水凝胶的(a)循环压缩曲线；(b)压缩强度图和(c)压缩-释放实物图。
图5显示了本发明组织粘合水凝胶的(a)拉伸曲线；(b)循环拉伸曲线和(c)拉伸示意图。
图6显示了(a)本发明组织粘合水凝胶与猪皮的搭接-剪切拉伸实验实物图；本发明组织粘合水凝胶与商品化纤维蛋白胶、氰基丙烯酸酯的(b)搭接-剪切强度随时间变化图和(c)搭接-剪切强度图；(d)本发明水凝胶在猪皮表面随猪皮弯曲、拉伸、扭转实物图。
图7显示了本发明组织粘合水凝胶与小鼠成纤维细胞(L929细胞)共培养后细胞活力情况。
具体实施方式
本发明人结合现代战场和临床需求，经过广泛而深入的研究，针对现有常用的组织粘合剂粘合强度弱，在潮湿和动态的生理环境下粘合效果差等问题，首次意外地开发了一种可通过注射方式形成的用于组织粘合的水凝胶。
具体地，本发明使用氨基化的聚乙二醇-聚癸二酸甘油酯作为主要基体材料，同时借鉴大自然贻贝强大的水下粘合力引入多酚结构，通过与偶联剂进行混合，借助注射器注射至伤口表面进行原位偶联粘合得到本发明所述的组织粘合水凝胶。此外，所述的水凝胶的流变性能、力学性能、拉伸性能和粘合强度均可通过改变羧基与EDC的比例进行调控和优化。在此基础上完成了本发明。
具体地，本发明的组织粘合水凝胶利用其含有具有良好水溶性和力学强度PEGS-NH2基体材料和独特的粘合增强材料，偶联后与人体组织可形成稳定的化学键和静电相互作用，具有优良的粘弹性(压缩释放后100％回复，循环压缩后水凝胶无明显损耗)、生物相容性，以及优异的组织粘合性(潮湿组织的粘合强度最高可达48kPa)，能够适用于潮湿和动态的生理环境。因此，本发明的组织粘合水凝胶能够通过注射短时间内(1分钟内)形成，用于不规则伤口的原位粘合，促进伤口愈合再生，是一种具有广泛临床应用前景的组织粘合材料。
术语
除非另外定义，否则本文中所用的全部技术与科学术语均具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
如本文所用，术语“含有”或“包括(包含)”可以是开放式、半封闭式和封闭式的。换言之，所述术语也包括“基本上由…构成”、或“由…构成”。
如本文所用，术语“水凝胶前体溶液”指将形成水凝胶的组分(包括但不限于第一聚合物、第二聚合物和第三聚合物)溶解在特定的溶剂后形成的均一的分散液。
如本文所用，术语“偶联组分”是指可使前体溶液中的组分进行偶联，进而形成水凝胶的组分。
如本文所用，术语“偶联剂”是指偶联组分溶解在特定的溶剂后形成的均一的分散液。
如本文所用，术语“分散系数”对长链高分子而言，是指重均分子量与数均分子量之比，D＝Mw/Mn，D≥1。由于高分子的多分散性，质量具有不均一性质，用分散系数表征高分子产物的质量分布，越接近1质量分布越均一。
如本文所用，术语“接枝率”是指以分子链上被取代的原始基团量为基础计算，功能性基团取代分子链侧链上原始基团的比例。
如本文所用，术语“聚乙二醇-聚癸二酸甘油酯”、“PEGS”可互换使用。
如本文所用，术语“氨基化的聚乙二醇-聚癸二酸甘油酯”、“氨基化的PEGS”、“PEGS-NH2”可互换使用。
如本文所用，术语“壳聚糖-没食子酸”、“CS-GA”可互换使用。
如本文所用，术语“γ-聚谷氨酸”、“γ-PGA”可互换使用。
如本文所用，术语“1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐”、“EDC”可互换使用。
如本文所用，术语“N-羟基琥珀酰亚胺”、“NHS”可互换使用。
如本文所用，术语“磷酸缓冲盐溶液”、“PBS”可互换使用。
如本文所用，术语“癸二酸二(四丁基氢氧化铵)酯”、“TBAS”可互换使用。
如本文所用，术语“聚乙二醇二缩水甘油醚”、“PEGDGE”可互换使用。
如本文所用，术语“N-(叔丁氧羰基)氨基乙酸”、“BOC-glycine”可互换使用。
如本文所用，术语“N,N'-二异丙基碳二亚胺”、“DIC”可互换使用。
如本文所用，术语“4-二甲氨基吡啶”、“DMAP”可互换使用。
第一聚合物的前体聚合物
本发明所述的第一聚合物的前体聚合物是指用于制备本发明的第一聚合物的聚合物。所述聚合物具有优良的粘弹性，且具有良好的生物相容性、力学强度和生物降解性。
所述的第一聚合物的前体聚合物是聚酯-聚乙二醇的共聚物。
所述的聚酯的主链上包括游离羟基。
所述的聚酯是长链二酸和三醇的酯化缩聚物。
所述的第一聚合物的前体聚合物含有如式III所示的结构单元：
Figure BDA0003029293780000121
其中，c为1-20，d为5-60。
所述的第一聚合物的前体聚合物为聚乙二醇-聚癸二酸甘油酯，含有如式VI所示的结构单元：
Figure BDA0003029293780000122
其中，所述的PEG嵌段的分子量为250-2000Da，所述结构的聚合度m为5～70。
第一聚合物
本发明所述的第一聚合物是指用于制备本发明的水凝胶的前体溶液的第一组分。
本发明所述的第一聚合物是本发明的水凝胶的主要基体材料，其具有优异的生物相容性、生物可降解性和流动性。所述第一聚合物分子链的侧链上包括大量氨基用于偶联。
所述的第一聚合物可通过与人体组织形成稳定的化学键或静电相互作用，与人体组织紧密结合。
所述的第一聚合物的侧链存在大量氨基。
所述的第一聚合物是第一聚合物的前体聚合物经过氨基化修饰得到的。
所述的第一聚合物具有以下一个或多个特征：
(i)数均分子量为8000-18000Da，较佳地为10000-16000Da，更佳地为12000-15000Da；
(ii)分子量分布系数为1.0～1.60，更佳地1.20～1.50；
(iii)氨基接枝率大于80％，更佳地大于90％，所述的接枝率是指氨基取代聚乙二醇-聚癸二酸甘油酯中原始羟基的H的比率。
所述的第一聚合物含有如式VII所示的结构单元：
Figure BDA0003029293780000131
其中，a2为1-20，b2为5-60；
Figure BDA0003029293780000132
代表氨基在此处接枝，通过接枝的链结构将氨基取代PEGS中主链上羟基的H，并连接在第一聚合物主链上，所述基团接枝于分子链的比例大于70％。
所述的第一聚合物为氨基化的聚乙二醇-聚癸二酸甘油酯，含有如式VIII所示的结构单元：
Figure BDA0003029293780000133
其中，a3为1-20，b3为5-60。
第二聚合物
本发明所述的第二聚合物是指用于制备本发明的水凝胶的前体溶液的第二组分。
本发明所述的第二聚合物的侧链包括游离氨基用于偶联，此外，为提高水凝胶在潮湿和动态的生理环境下的粘合效果，所述的第二聚合物的侧链上还包括
Figure BDA0003029293780000134
其中所述基团的接枝率为5％～30％。
所述的第二聚合物是由包含氨基的第二聚合物的前体聚合物经过
Figure BDA0003029293780000135
修饰得到的。
所述的包含氨基的第二聚合物的前体聚合物是通过
Figure BDA0003029293780000141
Figure BDA0003029293780000142
单元聚合形成的无规共聚物。
所述的包含氨基的第二聚合物的前体聚合物为壳聚糖及其衍生物。
所述的
Figure BDA0003029293780000143
为
Figure BDA0003029293780000144
所述的
Figure BDA0003029293780000145
的接枝率，即该基团取代原始氨基中的H的比例为8％～20％，更佳地为8％～12％。
所述的第二聚合物的数均分子量为100-150kDa。
所述的第二聚合物包含如式II所示的结构：
Figure BDA0003029293780000146
其中，三种单体可随意组合，从而得到无规共聚物；
l为45～80％，m为5～30％，n为15％～25％，l、m、n的计算方式为相对应的重复单元数除以总重复单元数。
所述的式II聚合物中m为8％～12％。
所述的第二聚合物中用于修饰
Figure BDA0003029293780000147
的物质选自下组：没食子酸、杨梅素，或其组合。
所述的第二聚合物为接枝没食子酸的壳聚糖(壳聚糖-没食子酸)，包含如式V所示的结构：
Figure BDA0003029293780000151
其中，三种单体可随意组合，从而得到无规共聚物；
l1为45～80％，m1为5～30％，n1为15％-25％；l1、m1、n1的计算方式为相对应的重复单元数除以总重复单元数。
所述的壳聚糖-没食子酸的没食子酸接枝率，即没食子酸取代壳聚糖中原始氨基中的H的比例为8％～12％。
第三聚合物
本发明所述的第三聚合物是指用于制备本发明的水凝胶的前体溶液的第三组分。本发明所述的第三聚合物的分子链上包括羧基用于偶联。
所述的第三聚合物的数均分子量为200-800kDa。
所述的第三聚合物选自γ-聚谷氨酸、聚天冬氨酸，或其组合。
所述的第三聚合物是γ-聚谷氨酸。
所述的γ-聚谷氨酸是一种天然高分子，是由D-型或L-型谷氨酸通过α-氨基和γ-羧基形成酰胺键而连接成的大分子化合物。γ-聚谷氨酸主链上含有大量的游离羧基。其结构式如式IX所示：
Figure BDA0003029293780000152
其中，聚合度n为1300-5500。
组织粘合水凝胶
水凝胶是一类能够吸收并保有大量水分的具有三维交联网络的聚合物材料。本发明提供了一种组织粘合水凝胶，适用于潮湿和动态生理环境。
所述的水凝胶使用包含两种含氨基的聚合物与一种含羧基的聚合物的水凝胶前体溶液和包含EDC和NHS的偶联剂混合，经偶联反应制备出的水凝胶材料。
如本文所用，术语“组织粘合水凝胶”、“本发明的组织粘合水凝胶”、“本发明的水凝胶”、“可注射组织粘合水凝胶”可互换使用，是指由本发明使用水凝胶前体溶液与偶联剂混合得到的混合物通过注射的形式注射至所需部位，原位偶联得到的可用于组织粘合的水凝胶材料。
本发明所述的水凝胶前体溶液包含本发明所述的第一聚合物、第二聚合物和第三聚合物；
其中，所述的第一聚合物和第三聚合物通过酰胺键共价结合，所述的第二聚合物和第三聚合物通过酰胺键共价结合。
按溶质(g)/溶剂(mL)质量体积百分比计，所述的第一聚合物的浓度为10-40％；第二聚合物的浓度为0.5-4％；γ-聚谷氨酸的浓度为5-15％。
按溶质(g)/溶剂(mL)质量体积百分比计，所述的第一聚合物的浓度为20％；第二聚合物的浓度为2％；第三聚合物的浓度为10％。
本发明所述的组织粘合水凝胶具有优异的潮湿和动态生理环境的组织粘合性。
所述的水凝胶具有以下一个或多个特征：
(1)压缩应变为80％时的压缩强度在20-100kPa范围内；
(2)压缩释放后100％回复，循环压缩后水凝胶无明显损耗；
(3)对潮湿组织的搭接-剪切粘合强度为12-48kPa。
组织粘合水凝胶的制备方法
本发明提供了一种组织粘合水凝胶的制备方法，所述方法包括步骤：
(a)提供第一聚合物、第二聚合物、第三聚合物、偶联组分和溶剂；
(b)将第一聚合物和第二聚合物分别溶解在溶剂中进行混合，然后加入到第三聚合物溶液中，搅拌均匀得到组织粘合水凝胶的前体溶液；
(c)将上述水凝胶前体溶液与偶联剂共混均匀后转移至注射器内，注射得到所述组织粘合水凝胶。
所述的溶剂为PBS溶液。
所述的第一聚合物的制备方法包括以下步骤：
(a1)将癸二酸和四丁基氢氧化铵按照摩尔比1:2投入到95％乙醇中，在55℃下搅拌反应30min，除去乙醇和水得到产物；
(b1)在氮气氛围保护下，将摩尔比为1:1:0.006的癸二酸、聚乙二醇二缩水甘油醚(PEGDGE)和步骤(a1)得到的产物溶解至无水N,N-二甲基甲酰胺中，在100℃下搅拌反应72h；
(c1)透析纯化步骤(b)得到的产物，得到纯化的线性聚酯PEGS；
(d1)在氮气氛围保护下，将摩尔比为1:1.2:2:0.05的步骤(c1)得到的线性聚酯PEGS(按羟基量算)、N-(叔丁氧羰基)氨基乙酸(BOC-glycine)、N,N'-二异丙基碳二亚胺(DIC)和4-二甲氨基吡啶(DMAP)溶解至无水二氯甲烷中，室温搅拌反应24h；
(e1)将步骤(d1)得到的反应混合物抽滤，浓缩后用三氟乙酸脱除叔丁氧羰基，然后透析纯化后得到所述氨基化的第一聚合物。
优选地，所述的第一聚合物的分子量为8000-18000Da，较佳为10000-16000Da，最佳为12000-15000Da。
所述第二聚合物的制备方法包括以下步骤：
(a2)将壳聚糖溶解在1M的盐酸溶液中，用2M的氢氧化钠溶液调节pH至5.5；
(b2)在氩气氛围保护下，依次将没食子酸、EDC、NHS，按照与壳聚糖溶液(以氨基计算)的摩尔比为1.1:1.5:1.5:1滴加至步骤(a2)的壳聚糖溶液中，并保持反应体系pH在4.5-7.0，较佳为5.0-6.5，更佳为5.3-5.8，加料过程中保持持续搅拌，加料完成后继续搅拌反应12h；
(c2)透析纯化步骤(b2)的产物得到所述壳聚糖-没食子酸。
所述的步骤(b2)的滴加速度为0.5-2滴/秒，更佳地为0.5-1滴/秒。
所述的步骤(b2)在冰浴中进行，温度为-10-5℃，更佳地为-5-0℃。
本发明的主要优点包括：
1)本发明所述的水凝胶使用具有优异粘弹性和力学强度的氨基化的PEGS作为基体材料，并引入独特的粘合增强结构材料提高在潮湿和动态生理环境中的粘合强度；
2)本发明所述的用于制备水凝胶的混合物可通过注射至所需部位原位成胶，其成胶时间在15-40s之间，均在1min以内；
3)本发明所述的水凝胶具有一定的力学强度，且成胶后的储存模量最高可达到4000Pa左右，在较大应变(80％)循环压缩(5次)下能够维持其力学完整性，内部没有发生不可逆破坏，具有优异的抗疲劳性。
4)本发明所述的水凝胶具有优异的组织粘合性(潮湿组织的粘合强度最高可达48kPa)，能够适用于潮湿和动态的生理环境；
5)本发明所述的水凝胶可以通过调节第三聚合物中羧基与偶联剂中EDC的比例，实现流变学性能、拉伸性能、粘合强度等的调控，满足更多种类的应用要求；
6)本发明所述的水凝胶能够用于不规则伤口的原位粘合，促进伤口愈合再生。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
实施例1.组织粘合水凝胶的制备
氨基化PEGS和壳聚糖-没食子酸的合成路线以及组织粘合水凝胶制备机理图如图1所示。
实施例1.1氨基化聚酯PEGS的合成及纯化
(a1)称取1.95g癸二酸(0.01mol)和20g(0.07mol)四丁基氢氧化铵(25wt％水溶液)加入到100mL的95％乙醇中，在55℃下搅拌反应30min，然后在40℃下旋蒸除去乙醇，最后冻干得到产物癸二酸二(四丁基氢氧化铵)酯(TBAS)；
(b1)在氮气氛围保护下称取20.23g癸二酸(0.1mol)，50.00g聚乙二醇二缩水甘油醚和0.41g步骤(a)的产物TBAS，将上述原料共混溶解至180mL无水N,N-二甲基甲酰胺中，在100℃下搅拌反应72h；
(c1)用截留分子量为3500Da的透析袋透析纯化步骤(b)的产物得到纯化的线性聚酯PEGS；
(d1)在氮气氛围保护下称取10.53g步骤(c)得到的线性聚酯PEGS，6.31g N-(叔丁氧羰基)氨基乙酸，7.57g N,N'-二异丙基碳二亚胺(0.06mol)和0.18g 4-二甲氨基吡啶(0.001mol)，将上述原料共混溶解至150mL无水二氯甲烷中，在室温下搅拌反应24h；
(e1)将步骤(d)得到的产物抽滤，浓缩后用25mL三氟乙酸脱除叔丁氧羰基45min，然后用截留分子量为3500Da的透析袋透析纯化得到氨基化聚酯PEGS。
得到的氨基化聚酯PEGS的分子量为8000-18000Da，分子量分布系数为1.20-1.50，实际氨基接枝率为90-95％。核磁共振氢谱如图2a所示。
实施例1.2壳聚糖-没食子酸的合成及纯化
(a2)称取0.81g壳聚糖溶解在50mL 1M的盐酸溶液中，用2M的氢氧化钠溶液调节pH至5.5；
(b2)将0.94g没食子酸(0.005mol)溶解在10mL乙醇溶液中，1.44g EDC(0.007mol)溶解在30mL水中，0.86g NHS溶解在10mL水中，待用；
(c2)在氩气氛围保护下，依次将步骤(b2)得到的没食子酸溶液、EDC溶液、NHS溶液逐滴滴加至步骤(a2)中的壳聚糖溶液中，并保持反应体系pH在5.3-5.8，加料过程中保持持续搅拌并冰浴，加料完成后继续搅拌反应12h；
(d2)透析纯化步骤(c2)的产物得到壳聚糖-没食子酸。
得到的壳聚糖-没食子酸中，没食子酸的实际接枝率为8-12％。核磁共振氢谱如图2b所示。
实施例1.3组织粘合水凝胶的制备
原料配比参见下表1，组织粘合水凝胶的制备方法具体包括以下步骤：
(a)称取一定量的γ-聚谷氨酸溶解至0.3mL超纯水中，搅拌均匀；
(b)分别称取一定量的氨基化PEGS和壳聚糖-没食子酸分别溶解至0.2mL和0.5mL超纯水中，搅拌并共混均匀；
(c)将步骤(b)溶液滴加至步骤(a)溶液中，边滴加边搅拌，得到水凝胶前体溶液；
(d)在步骤(c)所得溶液中加入一定量EDC(0.7g/mL)/NHS(0.4g/mL)水溶液，迅速搅拌均匀即可注射成胶。
表1制备组织粘合水凝胶的原料配比
Figure BDA0003029293780000201
在偶联剂EDC/NHS的作用下，羧基和氨基发生酰胺化反应形成交联点，随着γ-聚谷氨酸中羧基和EDC的摩尔比越大(10:1-20:1)，交联点越少，交联度越低。本发明通过调节γ-聚谷氨酸中-COOH与EDC添加量的摩尔比(10:1-20:1)，调节了水凝胶的交联度，获得了3种交联度不同的水凝胶材料。本发明制备了一种无CS-GA的交联度为15:1的水凝胶，作为对照材料以说明多酚结构对本发明所述水凝胶性能的影响。
实施例2.组织粘合水凝胶的流变学表征
为了评价用于制备组织粘合水凝胶的混合物的可注射性，本研究采用旋转流变仪对水凝胶成胶过程中储存模量和损耗模量的变化以及成胶时间进行了考察。测试温度为37℃，频率固定为10Hz，应变固定为5％，测试时间为10min，记录数据得到水凝胶成胶过程中储存模量和损耗模量对时间的变化曲线，分析计算得到水凝胶的成胶时间和稳定后的储存模量。结果如图3所示。
结果表明，所有组别水凝胶的成胶时间在15-40s之间，均在1min以内(图3中的b)，且组织粘合水凝胶稳定成胶后的储存模量最高可以达到4000Pa左右(图3中的a)。说明可通过注射的方式形成本发明的水凝胶，且具有一定的力学强度。
从成胶时间和稳定后储存模量的变化可以看出(图3中的b,c)，样品2-4(交联度10:1-20:1)中随着γ-聚谷氨酸中的羧基与EDC的比例不断降低，交联度降低，成胶时间延长，稳定后储存模量降低。说明可以通过改变γ-聚谷氨酸中羧基和EDC的比例来调控材料的交联度，进而调控组织粘合水凝胶的流变学性能和成胶时间。此外，样品2和样品3的成胶时间和储存模量相比样品4有显著改善。样品1和样品3交联度相同，成胶时间和储存模量与样品3相差不大。
实施例3.组织粘合水凝胶的压缩性能表征
为了评价组织粘合水凝胶的力学性能和抗疲劳性，本研究采用万能拉力试验机对水凝胶进行循环压缩试验。最大应变固定为80％，循环次数为5次，记录数据并绘制循环压缩曲线，分析评价水凝胶在循环压缩下的稳定性。结果如图4所示。
从图4中的a可以看出，水凝胶的多次循环压缩曲线基本重合，说明水凝胶在较大应变(80％)循环压缩5次后能够维持其力学完整性，压缩强度最高可达100kPa(图4中的a,b)。此外，压缩释放后100％回复，循环压缩后水凝胶无明显损耗，内部没有发生不可逆破坏，具有优异的抗疲劳性。图4中的c表明本发明的水凝胶具有良好的回弹能力。
此外，水凝胶在最大应变点的压缩强度随着交联度的提高(20:1-10:1)逐渐提高(图4中的b)，即可以通过改变交联度来调控组织粘合水凝胶的压缩性能。
实施例5.组织粘合水凝胶的拉伸性能表征
为了评价组织粘合水凝胶的拉伸性能，本研究采用万能拉力试验机对水凝胶进行拉伸试验和循环拉伸试验。拉伸速度固定为10％，其中循环拉伸试验最大应变固定为100％，循环次数为10次，记录数据并绘制拉伸曲线和循环拉伸曲线，分析评价水凝胶的断裂伸长率和在循环拉伸下的稳定性。结果如图5所示。
从图5中的a可以看出，水凝胶的断裂伸长率可以达到250％-420％，说明水凝胶具有良好的拉伸性。从图5中的b可以看出，水凝胶的循环拉伸曲线基本重合，说明水凝胶在较大应变(100％)循环拉伸10次后能够维持其力学完整性，内部没有发生结构破坏，具有优异的抗疲劳性。图5中的c表明水凝胶具有较好的拉伸性能。
实施例6.组织粘合水凝胶对潮湿组织的粘合强度的表征
为了评价组织粘合水凝胶对潮湿组织(用PBS浸润的猪皮)的粘合性能，本研究采用搭接-剪切拉伸实验对水凝胶的粘合强度进行了考察。单片猪皮的长度为6cm，宽为2.5cm，重叠部分为2.5*1cm，且在用水凝胶粘合猪皮之前用PBS浸润猪皮以模拟体内潮湿生理环境，拉伸速率为10mm/min。结果如图6所示。
结果表明，所有组别的组织粘合水凝胶的粘合强度均优于对照组商品化纤维蛋白胶，最高可达到48kPa(图6中的b,c)，该粘合强度虽然与氰基丙烯酸酯相比没有明显优势，但是氰基丙烯酸酯类组织粘合剂固化后变硬，不适用于动态环境，同时降解产物具有一定毒性。说明本发明的水凝胶具有优异的对潮湿组织的粘合性能。其中γ-聚谷氨酸中羧基与EDC的摩尔比为15:1的水凝胶具有最高的粘合强度，与商业化的氰基丙烯酸酯相当。
值得注意的是，加入壳聚糖-没食子酸得到的样品2-4相比未加入该材料得到的样品1对于潮湿组织的粘合效果有显著提升(图6中的c)，说明多酚结构可作为粘合增强剂，显著提升潮湿组织的粘合强度。
从图6中的d还可以看出组织粘合水凝胶可以粘附在猪皮表面随猪皮进行弯曲、拉伸和扭转而不脱落。说明本发明的水凝胶适用于动态生理环境。
实施例7.组织粘合水凝胶的细胞相容性表征
为了评价组织粘合水凝胶的细胞相容性，本研究采用小鼠成纤维细胞(L929)与水凝胶共培养的方式对其在1d、3d、7d的细胞毒性进行了考察。
从图7可以看出，所有组别组织粘合水凝胶在与L929细胞共培养的1d、3d、7d相对空白孔板对照(TCP)对细胞均没有明显毒性，说明本发明所述组织粘合水凝胶具有良好的细胞相容性。
综上所述，本发明的高效组织粘合水凝胶成胶时间短，可通过注射的方式快速成胶，具有优异的组织粘合强度、良好的细胞相容性且能够适应潮湿和动态生理环境，并且可以通过调节羧基与EDC的比例调控和优化本发明所述水凝胶的流变性能、成胶时间、力学性能和粘合强度。其中，羧基与EDC的比例为15:1的样品具有最高的对潮湿组织的粘合强度，较高的储存模量和较短的成胶时间。因此，本发明的水凝胶可用于不规则伤口的原位粘合，促进伤口愈合再生，是一种具有现代战场和临床应用前景的组织粘合材料。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种组织粘合水凝胶，其特征在于，所述的组织粘合水凝胶通过水凝胶前体溶液与偶联剂混合经偶联形成；
其中，所述的水凝胶前体溶液包括第一聚合物、第二聚合物和第三聚合物；
所述的第一聚合物为氨基化的聚乙二醇-聚癸二酸甘油酯，其包含如式I所示的结构单元：
Figure FDA0003029293770000011
a为1-20，b为5-60；
Y各自独立地选自下组基团：H、
Figure FDA0003029293770000012
且在一个结构单元中，平均包含至少1个
Figure FDA0003029293770000013
所述的第二聚合物的侧链包含氨基和
Figure FDA0003029293770000014
所述的第三聚合物的侧链包含羧基。
2.如权利要求1所述的组织粘合水凝胶，其特征在于，所述的第一聚合物为主要的基体材料，其具有如下的一个或多个特征：
(a)数均分子量为5000-50000Da；
(b)分子量分布系数为1.0～1.60；
(c)在一个结构单元中，平均包含至少1.4个
Figure FDA0003029293770000015
3.如权利要求1所述的组织粘合水凝胶，其特征在于，所述的第二聚合物为功能化的壳聚糖，数均分子量为100-150kDa，其包含如式II所示的结构：
Figure FDA0003029293770000016
其中，三种单体可随意组合，从而得到无规共聚物；
l为45～80％，m为5～30％，n为15％-25％，l、m、n的计算方式为相对应的重复单元数除以总重复单元数。
4.如权利要求1所述的组织粘合水凝胶，其特征在于，所述的第三聚合物选自下组：γ-聚谷氨酸、聚天冬氨酸，或其组合。
5.如权利要求1所述的组织粘合水凝胶，其特征在于，所述的第一聚合物与第二聚合物的质量比为5～50：1；和/或
所述的第一聚合物与第三聚合物的质量比为1～8：1；和/或
所述的第二聚合物与第三聚合物的质量比为1：1～10。
6.如权利要求1所述的组织粘合水凝胶，其特征在于，所述的偶联剂包含1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)；
其中，所述的第三聚合物侧链中的羧基与偶联剂中EDC的摩尔比为5～30:1。
7.如权利要求1-6中任一项所述的组织粘合水凝胶的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：
在偶联剂存在下，使得权利要求1所述的水凝胶前体溶液进行偶联反应，从而形成所述的水凝胶。
8.一种用于形成权利要求1所述的组织粘合水凝胶的混合物，其特征在于，所述的混合物包含权利要求1所述的水凝胶前体溶液和偶联剂；
其中，所述混合物的粘度为75-110mPa·s，满足可注射要求。
9.一种用于制备权利要求1所述的组织粘合水凝胶的试剂盒，所述试剂盒包括：
(a)第一容器，以及位于所述容器内的水凝胶前体溶液，所述的水凝胶前体溶液包括权利要求1所述的水凝胶前体溶液；
(b)第二容器，以及位于所述容器内的偶联剂，所述的偶联剂包括权利要求1所述的偶联剂。
10.如权利要求1中所述的水凝胶的用途，其特征在于，用于制备一医用材料，所述的医用材料用于软组织伤口的粘合，促进组织修复和再生。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN115490841A (zh) * 2022-11-22 2022-12-20 颢箔医疗科技(上海)有限公司 聚醚类二醇聚壬二酸脂肪三醇酯及其制备方法和应用

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