CN114272433A

CN114272433A - 一种明胶基生物医用粘合剂及其制备方法

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Publication number: CN114272433A
Application number: CN202111606029.0A
Authority: CN
Inventors: 王海花; 王梦曦; 武竞衡; 刘璇; 魏萌
Original assignee: Shaanxi University of Science and Technology; Beijing Jishuitan Hospital
Current assignee: Shaanxi University of Science and Technology; Beijing Jishuitan Hospital
Priority date: 2021-12-25
Filing date: 2021-12-25
Publication date: 2022-04-05

Abstract

本发明公开一种明胶基生物医用粘合剂及其制备方法，制备方法包括以下步骤：将明胶溶于磷酸盐溶液中，使其溶解，加入有机胺类化合物，调节体系pH值，然后加入羧基活化剂，反应完成后，得到氨基化明胶；将透明质酸溶于超纯水中，搅拌均匀，在室温避光条件下，加入氧化剂的水溶液，进行氧化反应，加入终止剂终止反应，得到醛基化透明质酸；将溶解有氨基化明胶的磷酸缓冲盐溶液与溶解有醛基化透明质酸的磷酸缓冲盐溶液混合，并向所述混合液中加入单宁酸，搅拌均匀后，制得所述明胶基生物医用粘合剂。该制备方法反应条件温和，操作简单。制得的粘合剂具有粘合速度快、粘合强度高、具有良好的生物相容性、可生物降解性、良好抗炎、抗氧化以及抗菌特性。

Description

一种明胶基生物医用粘合剂及其制备方法

技术领域

本发明属于生物医用粘合剂技术领域，涉及一种明胶基生物医用粘合剂及其制备方法。

背景技术

传统的伤口闭合方法采取手术缝合线及铆钉机械固定，但这些方法会进一步损伤受损组织，导致张力增加、炎症和异物反应。而生物医用粘合剂可以快速止血、缩短手术时间、且操作方便。目前商用生物粘合剂主要是纤维蛋白胶类和氰基丙烯酸酯类粘合剂。纤维蛋白胶具有良好的生物相容性、快速固化和生物降解性的优点，但存在粘结强度低、硬度低、感染风险高、且需与传统的伤口闭合方式如缝合线等配合使用等不足；氰基丙烯酸酯类粘合剂具有强粘附性，快速固化，瞬时粘附等优点，但存在组织粘结部位过硬、固化后产生甲醛、生物相容性差等缺陷。这两种商用生物粘合剂用于体内湿态环境下粘附时，粘附效果不太理想，因此它们的实际应用范围受限。现有技术也有使用多巴胺作为主要提供强黏附物质，而多巴胺因为存在易被氧化，无法长时间储存的问题，同时多巴胺对神经系统的神经影响一直是人们关注的问题，因此目前基于多巴胺的组织粘合剂基本不存在。

发明内容

针对现有技术中存在的问题，本发明提供一种明胶基生物医用粘合剂及其制备方法，从而获得一种粘合速度快、粘合强度高、具有良好的生物相容性、可生物降解性、良好抗炎、抗氧化以及抗菌特性的生物粘合剂。

本发明是通过以下技术方案来实现：

一种明胶基生物水凝胶的制备方法，包括以下步骤：

步骤1，将明胶溶于磷酸盐溶液中，加热搅拌使其溶解，加入有机胺类化合物，调节体系pH值，然后加入羧基活化剂引发氨基化反应，反应完成后，得到氨基化明胶；

步骤2，将透明质酸溶于超纯水中，搅拌均匀，在室温避光条件下，加入氧化剂的水溶液，进行氧化反应，加入终止剂终止反应，得到醛基化透明质酸；

步骤3，将溶解有氨基化明胶的磷酸缓冲盐溶液与溶解有醛基化透明质酸的磷酸缓冲盐溶液混合，并向所述混合液中加入单宁酸，搅拌均匀后，制得所述明胶基生物医用粘合剂。

优选的，所述步骤1中，所述有机胺类化合物为乙二胺、己二酸二酰肼或己二胺中的任意一种。

优选的，所述步骤1中氨基化反应完成后，还包括采用透析法除去反应液中未反应的有机胺类化合物；所述步骤2中终止反应完成后，还包括采用透析法除去终止反应的反应液中未反应的氧化剂。

优选的，所述步骤1中，明胶上的羧基与有机胺类化合物的摩尔比为(1:1)～(1:100)；所述明胶上的羧基与羧基活化剂的摩尔为(1:1)～(1:5)。

优选的，所述步骤1中氨基化反应完成后，对得到的产物进行冷冻干燥，得到所述氨基化明胶；所述步骤2终止反应完成后，对得到的产物进行冷冻干燥，得到所述醛基化透明质酸。

优选的，所述步骤1中，调节体系pH值为5.0～6.0。

优选的，所述步骤2中，所述透明质酸分子量为40～100KDa。

优选的，所述步骤2中，透明质酸中的葡萄糖单元与氧化剂的摩尔比为(1:1)～(1:5)。

一种明胶基生物水凝胶，采用上述的方法制得，所述明胶基生物水凝胶的剪切粘附力大于13KPa。

上述的制备方法制得的明胶基生物水凝胶可在医用粘合剂中应用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

一种明胶基生物水凝胶的制备方法，使用的原料为明胶、透明质酸以及单宁酸，均来源于天然生物材料，具有很好的生物相容性。本发明通过引入有机胺化合物与明胶分子链上的羧基(-COOH)发生酰胺化反应制备氨基化明胶，并进一步提高明胶分子链上的氨基含量；氨基化明胶可与醛基化透明质酸形成更多的交联位点，从而提高交联密度与凝胶效率。同时，由于-COOH与-NH₂之间的静电吸引力被破坏而使氨基化明胶比明胶具有更优异的水溶性和较低的凝胶温度，从而提高明胶基医用粘合剂的操作方便性。此外，本发明采用强氧化剂将透明质酸中的顺式二醇的C-C键醛基化，与氨基化明胶基于席夫碱反应通过共价键交联形成酰胺键，从而形成第一层网络结构。通过引入富羟基的单宁酸，通过氢键作用与氨基化明胶和醛基化透明质酸结合，形成第二层网络结构；单宁酸的引入不仅使生物医用粘合剂在湿态环境下具有强粘附性；此外，单宁酸分子中丰富的苯环可使水凝胶具有一定的疏水性，易与粘合剂和水下基质之间形成非共价键。三者的结合有效解决了传统生物医用粘合剂生物相容性差和应用场所受限等问题，为体内组织和神经等粘合修复提供一种方便可行的新技术。同时该生物医用粘合剂形成的反应条件温和，操作简单，能够迅速成胶并具有粘附力。

进一步的，乙二胺、己二酸二酰肼或己二胺为小分子有机胺化合物，采用小分子有机胺化合物作为氨基化试剂可以使得明胶分子链上接枝极性相对较小的氨乙基，在一定程度上阻碍了分子间氢键的形成，提高明胶的水溶性。

进一步的，未反应完的有机胺类化合物或终止剂可以溶于磷酸缓冲溶液中，透析法用于液液分离，用其他方法，例如抽滤或离心无法除去未反应的有机胺类化合物或终止剂，此类分离方法用于固液分离。

进一步的，在明胶分子中引入的氨基数量受明胶本身所拥有的羧基数量的限制，为了将明胶分子中地羧基转换为氨基，应当适当控制反应物的比例。当明胶上的羧基与有机胺类化合物的摩尔比增加到1:100时，明胶上引入氨基含量增加的并不多，接枝效率有所下降。

进一步的，明胶分子链上的羧基与羧基活化剂反应形成中间产物氧-酰基异脲，该摩尔比范围是活化羧基使其活化能降低的最佳范围，活化能降低有利于反应的进行。

进一步的，低温条件不会对产物造成影响，且通过冷冻干燥得到的产物较溶液稳定，便于长期保存。

进一步的，羧基的活化是在弱酸条件下进行较好，酰胺键偶合在弱碱条件下进行较好，接近中性的环境可以同时兼顾两者，因此调节体系pH值为5.0～6.0。

进一步的，透明质酸分子量在40～100KDa之间属于低分子量透明质酸，其具有促进创伤愈合、骨和血管生成、免疫调节等作用。

进一步的，随着氧化剂用量的，透明质酸的氧化度不同。当透明质酸的葡萄糖单元与氧化剂的摩尔比增加到1:5时，醛基的引入量不再增加，(1:1)～(1:5)是最佳的醛基的引入量范围。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1是氨基化明胶的制备原理图；

图2是醛基化透明质酸的制备原理图；

图3是氨基化明胶、醛基化透明质酸、单宁酸三元生物医用粘合剂的制备原理图；

图4是实施例4～7的未改性的明胶(Gel)与氨基化明胶(AGel)的红外光谱谱图；

图5是实施例4～7的未改性的透明质酸(HA)与醛基化透明质酸(OHA)的红外光谱谱图；

图6是实施例4的人肝正常细胞(HL7702)的生物相容性图。

具体实施方式

为使本领域技术人员可了解本发明的特点及效果，以下谨就说明书及权利要求书中提及的术语及用语进行一般性的说明及定义。除非另有指明，否则文中使用的所有技术及科学上的字词，均为本领域技术人员对于本发明所了解的通常意义，当有冲突情形时，应以本说明书的定义为准。

本文描述和公开的理论或机制，无论是对或错，均不应以任何方式限制本发明的范围，即本发明内容可以在不为任何特定的理论或机制所限制的情况下实施。

本文中，所有以数值范围或百分比范围形式界定的特征如数值、数量、含量与浓度仅是为了简洁及方便。据此，数值范围或百分比范围的描述应视为已涵盖且具体公开所有可能的次级范围及范围内的个别数值(包括整数与分数)。

本文中，若无特别说明，“包含”、“包括”、“含有”、“具有”或类似用语涵盖了“由……组成”和“主要由……组成”的意思，例如“A包含a”涵盖了“A包含a和其他”和“A仅包含a”的意思。

本文中，为使描述简洁，未对各个实施方案或实施例中的各个技术特征的所有可能的组合都进行描述。因此，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，各个实施方案或实施例中的各个技术特征可以进行任意的组合，所有可能的组合都应当认为是本说明书记载的范围。

本发明提供了一种明胶基生物水凝胶及其制备方法，其制备方法包括以下步骤：

步骤1，按照重量计，将明胶溶于280份、0.01～1mol/L、pH＝4～6的磷酸盐溶液中，搅拌加热至40～60℃使其溶解，并加入有机胺类化合物溶液。其中，明胶上的羧基与有机胺类化合物的摩尔比为(1:1)～(1:100)，明胶与有机胺类化合物的份数比例为5:(0.4～36)，采用浓盐酸调节体系pH值为5.0～6.0，然后加入1.2～5.8份羧基活化剂引发氨基化反应，氨基化反应的反应温度为37～40℃，反应时间为4～8h。反应完成后，采用透析法除去反应液中未反应的有机胺类化合物，并对产物进行冷冻干燥得到氨基化明胶；氨基化明胶的合成原理见图1。

其中，明胶上的羧基与羧基活化剂的摩尔为(1:1)～(1:5)；

有机胺类化合物为乙二胺、己二酸二酰肼或己二胺中的任意一种；

磷酸盐溶液为磷酸二氢钠溶液、磷酸二氢钾溶液的一种。

羧基活化剂为1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC)或1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐与N-羟基丁二酰亚胺、N-羟基硫代琥珀酰亚胺或1-羟基苯并三氮唑水合物的混合物。

步骤2，将透明质酸溶于200份超纯水中，搅拌均匀，在室温避光条件下，加入氧化剂的水溶液，进行氧化反应。其中，透明质与氧化剂份数比例为2:(1.1～5.7)。反应4～8h后，加入0.7～3.3份的终止剂终止反应，反应0.5～2h后，采用透析的方法除去终止反应的反应液中未反应的氧化剂。并对产物进行冷冻干燥，得到醛基化透明质酸；醛基化透明质酸的合成原理见图2。

其中，透明质酸分子量为40～100KDa，透明质酸中的葡萄糖单元与氧化剂的摩尔比为(1:1)～(1:5)；

终止剂可以是乙二醇、丙三醇或二乙二醇中的任意一种；

氧化剂为高碘酸钠、高碘酸钾、高氯酸、高氯酸钠的一种；

步骤1和步骤2中的透析均包括以下过程：将产物装入截留分子量为3000～14000的透析袋中，透析3～5天，期间每隔4～8h换水一次；

步骤1和步骤2中的冷冻干燥均包括以下过程：先在-50～-90℃冷冻4～6h，然后放入真空冷冻干燥机中进行冻干24～48h。

步骤3，将等体积的溶解有氨基化明胶的磷酸缓冲盐溶液与溶解有醛基化透明质酸的磷酸缓冲盐溶液混合，其中磷酸缓冲盐溶液的摩尔浓度为0.01mol/L，pH＝7.4。并向所述混合液中加入单宁酸，搅拌均匀后，制得明胶基生物医用粘合剂。其中，氨基化明胶的磷酸缓冲盐溶液中氨基化明胶的质量体积浓度为7～40％w/v，醛基化透明质酸的磷酸缓冲盐溶液中醛基化透明质酸的质量体积浓度为3～40％w/v，单宁酸的质量体积浓度为0.1～33％w/v。以上三组份的浓度范围为最终共混可以形成水凝胶，高于或者低于此范围不能形成水凝胶。

明胶基生物水凝胶的合成原理见图3。

一般而言，作为理想的生物粘合剂需满足以下要求：

1、无毒性、无致癌、无致畸和致突变，且无菌或可抑菌。

2、在人体内可以使用(血液或组织液)。

3、粘合速度快，粘合强度高。

4、与组织粘合部分有一定的柔韧性。

5、具有良好的生物相容性和可生物降解性。

6、价格相对低廉，使用方便，易于保存。

因此，针对这两类生物粘合剂的不足，本发明设计了一种以天然高分子为主的生物粘合剂。天然高分子由天然存在的结构单元组成，这促使其更容易构建完全可生物降解和生物相容的材料，不会诱导免疫反应。通过特定的结构设计，天然高分子亦可具有抗菌特性，有助于预防手术后的细菌感染。本发明以天然生物聚合物明胶(Gel)、透明质酸(HA)和仿贻贝粘附的单宁酸(TA)为基础，通过化学改性制备氨基化明胶(AGel)和醛基化透明质酸(OHA)。然后将氨基化明胶(AGel)、醛基化透明质酸(OHA)和单宁酸(TA)三组份通过席夫碱反应和氢键相互作用制备了一种明胶基生物医用粘合剂。其中，明胶具有诸多优异的独特性质，如优异的生物相容性、无皮肤刺激、高组织渗出物吸收、理想的细胞附着、良好的透氧性和保持潮湿伤口环境的能力。透明质酸(HA)是由N-乙酰-D-氨基葡萄糖和D-葡萄糖醛酸组成的线性糖胺聚糖多糖，是细胞外基质的主要成分，是皮肤、软骨和结缔组织的天然成分，具有良好的生物相容性和生物降解性，可促进伤口愈合，因此在药物递送、组织工程、伤口愈合和粘度补充领域具有重要应用。单宁酸(TA)广泛存在于多种树木的树皮与果实中，是一种植物来源的多元酚酸，具有仿贻贝粘附的特性，即在潮湿环境中仍具有强黏附性，可作为生物粘合剂中的交联剂，代替传统使用的醛类交联剂，并同时具有抗炎、抗氧化和抗菌的特性。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

下列实施例中使用本领域常规的仪器设备。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。下列实施例中使用各种原料，除非另作说明，都使用常规市售产品，其规格为本领域常规规格。在本发明的说明书以及下述实施例中，如没有特别说明，“％”都表示重量百分比，“份”都表示重量份，比例都表示重量比。

实施例1

步骤1，按照重量计，将5份明胶溶于280份，0.01mol/L，pH＝4的磷酸二氢钠溶液中，40℃下加热搅拌溶解后，加入0.4份乙二胺溶液，明胶上的羧基与乙二胺的摩尔比为1:1；调节pH为5.0，然后加入1.2份羧基活化剂引发氨基化反应，其中羧基活化剂为摩尔比为1:1的1-(3-二甲基胺基丙基)-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐与N-羟基丁二酰亚胺的混合液，明胶上的羧基与羧基活化剂的摩尔比为1:1，氨基化反应温度保持在37℃。反应时间为4h后，通过透析法除去未反应的乙二胺，冷冻干燥后得到氨基化明胶；

步骤2，按照重量计，将2份透明质酸溶于200份超纯水中，搅拌均匀，在室温避光条件下，加入1.1份氧化剂高碘酸钠配成的水溶液，按照透明质酸中葡萄糖单元与氧化剂的摩尔比为1:1，进行氧化反应4h，加入0.7份的乙二醇终止反应0.5h，透析除去多余未反应的氧化剂，冷冻干燥，得到醛基化透明质酸；

步骤3，将氨基化明胶、醛基化透明质酸分别溶于0.01mol/L磷酸缓冲盐溶液(PBS溶液，pH＝7.4)中，制得浓度为7％w/v的氨基化明胶溶液、浓度为3％w/v的醛基化透明质酸溶液。

步骤4，将等体积的氨基化明胶溶液与醛基化透明质酸溶液在室温下混合，向混合液中添加单宁酸，单宁酸的浓度为0.1％w/v，搅拌均匀后复合制得明胶基生物水凝胶。

实施例2

步骤1，按照重量计，将5份明胶溶于280份，0.03mol/L，pH＝5的磷酸二氢钠溶液中，60℃下加热搅拌溶解后，加入36份乙二胺溶液，明胶上的羧基与乙二胺的摩尔比为1:100；采用浓盐酸调节pH为6.0，然后加入5.8份羧基活化剂引发氨基化反应，其中羧基活化剂为摩尔比为1:1的1-(3-二甲基胺基丙基)-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐与N-羟基硫代琥珀酰亚胺，明胶上的羧基与羧基活化剂的摩尔比为1:5，氨基化反应温度保持在40℃。反应时间为8h后，通过透析法除去未反应的乙二胺，冷冻干燥后得到氨基化明胶；

步骤2，按照重量计，将2份透明质酸溶于200份超纯水中，搅拌均匀，在室温避光条件下，加入5.7份氧化剂高碘酸钾配成的水溶液，按照葡萄糖单元与氧化剂的摩尔比为1:5进行氧化反应8h，加入3.3份的乙二醇终止反应2h，透析除去多余未反应的氧化剂，冷冻干燥，得到醛基化透明质酸；

步骤3，将氨基化明胶、醛基化透明质酸分别溶于0.01mol/L磷酸缓冲盐溶液(PBS溶液，pH＝7.4)中，制得浓度为40％w/v的氨基化明胶溶液、浓度为40％w/v的醛基化透明质酸溶液。

步骤4，将等体积的氨基化明胶溶液与醛基化透明质酸溶液在室温下混合，向混合液中添加单宁酸，单宁酸的浓度为33％w/v，搅拌均匀后复合制得明胶基生物水凝胶。

实施例3

步骤1，按照重量计，将5份明胶溶于280份，0.1mol/L，pH＝5的磷酸二氢钾溶液中，50℃下加热搅拌溶解后，加入11份乙二胺溶液，明胶上的羧基与乙二胺的摩尔比为1:30；调节pH为5.0，然后加入2.9份羧基活化剂引发氨基化反应，其中羧基活化剂为摩尔比为1:1的1-(3-二甲基胺基丙基)-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐与1-羟基苯并三氮唑水合物，明胶上的羧基与羧基活化剂的摩尔比为1:2.5，氨基化反应温度保持在37℃。反应时间为6h后，通过透析法除去未反应的乙二胺，冷冻干燥后得到氨基化明胶；

步骤2，按照重量计，将2份透明质酸溶于200份超纯水中，搅拌均匀，在室温避光条件下，加入2.8份氧化剂高氯酸配成的水溶液，按照葡萄糖单元与氧化剂的摩尔比为1:2.5进行氧化反应6h，加入1.7份的丙三醇终止反应1h，透析除去多余未反应的氧化剂，冷冻干燥，得到醛基化透明质酸；

步骤3，将氨基化明胶、醛基化透明质酸分别溶于0.01mol/L磷酸缓冲盐溶液(PBS溶液，pH＝7.4)中，制得浓度为24％w/v的氨基化明胶溶液、浓度为24％w/v的醛基化透明质酸溶液。

步骤4，将等体积的氨基化明胶溶液与醛基化透明质酸溶液在室温下混合，向混合液中添加单宁酸，单宁酸的浓度为17％w/v，搅拌均匀后复合制得明胶基生物水凝胶。

实施例4

步骤1，按照重量计，将5份明胶溶于280份，0.4mol/L，pH＝4的磷酸二氢钠溶液中，50℃下加热搅拌溶解后，加入7.2份乙二胺溶液，明胶上的羧基与乙二胺的摩尔比为1:20；调节pH为5.0，然后加入2.3份羧基活化剂引发氨基化反应，其中羧基活化剂为1-(3-二甲基胺基丙基)-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐，明胶上的羧基与羧基活化剂的摩尔比为1:2，氨基化反应温度保持在37℃。反应时间为6h后，通过透析法除去未反应的乙二胺，冷冻干燥后得到氨基化明胶；明胶以及本步骤中合成的氨基化明胶的FTIR图谱见图4，从图中可以看出，明胶和氨基化明胶在2939.23cm^-1和2881.37cm^-1处的吸收峰，分别对应于亚甲基的C-H不对称和对称拉伸振动；在16442.86cm^-1和1544.81cm^-1处的吸收峰，分别对应于酰胺I带和酰胺II带。氨基化明胶的酰胺吸收带强度明显强于明胶，这可能是由于氨基化明胶中明胶和乙二胺之间形成了更多的酰胺带。最终表明氨基化明胶成功制备。

步骤2，按照重量计，将2份透明质酸溶于200份超纯水中，搅拌均匀，在室温避光条件下，加入1.7份氧化剂高氯酸钠配成的水溶液，按照葡萄糖单元与氧化剂的摩尔比为1:1.5进行氧化反应5h，加入1份的乙二醇终止反应0.5h，透析除去多余未反应的氧化剂，冷冻干燥，得到醛基化透明质酸；透明质酸以及本步骤中合成的醛基化透明质酸的FTIR图谱见图5，从图中可以看出，与透明质酸的FTIR图谱对比，醛基化透明质酸在1722.26cm^-1处出现了一个新的吸收峰,该吸收峰为醛基(-CH＝O)的伸缩振动吸收峰，表明醛基化透明质酸成功制备。

步骤4，将等体积的氨基化明胶溶液与醛基化透明质酸溶液在室温下混合，向混合液中添加单宁酸，单宁酸的浓度为7％w/v，搅拌均匀后复合制得明胶基生物水凝胶。

采用人肝正常细胞(HL7702)对本实施例合成的明胶基生物医用粘合剂的生物相容性进行测试，结果如图6所示，从图中可以看出，不同浓度的产品与人肝正常细胞(HL7702)共培养24h、72h后细胞活力均在80％以上。表明了该产品对人肝正常细胞(HL7702)无明显的细胞毒性。

实施例5

步骤1，按照重量计，将5份明胶溶于280份，0.1mol/L，pH＝5的磷酸二氢钠溶液中，50℃下加热搅拌溶解后，加入7.2份乙二胺溶液，明胶上的羧基与乙二胺的摩尔比为1:20；调节pH为5.0，然后加入2.3份羧基活化剂引发氨基化反应，其中羧基活化剂为1-(3-二甲基胺基丙基)-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐，明胶上的羧基与羧基活化剂的摩尔比为1:2，氨基化反应温度保持在37℃，反应时间为6h后，通过透析法除去未反应的乙二胺，冷冻干燥后得到氨基化明胶；明胶以及本步骤中合成的氨基化明胶的FTIR图谱见图4。

步骤2，按照重量计，将2份透明质酸溶于200份超纯水中，搅拌均匀，在室温避光条件下，加入1.7份氧化剂高碘酸钠配成的水溶液，按照葡萄糖单元与氧化剂的摩尔比为1:1.5进行氧化反应5h，加入1份的乙二醇终止反应0.5h，透析除去多余未反应的氧化剂，冷冻干燥，得到醛基化透明质酸；透明质酸以及本步骤中合成的醛基化透明质酸的FTIR图谱见图5。

实施例6

步骤1，按照重量计，将5份明胶溶于280份，0.1mol/L，pH＝5的磷酸二氢钠溶液中，60℃下加热搅拌溶解后，加入7.2份乙二胺溶液，明胶上的羧基与乙二胺的摩尔比为1:20；调节pH为5.0，然后加入2.3份羧基活化剂引发氨基化反应，其中羧基活化剂为1-(3-二甲基胺基丙基)-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐，明胶上的羧基与羧基活化剂的摩尔比为1:2，氨基化反应温度保持在37℃，反应时间为6h后，通过透析法除去未反应的乙二胺，冷冻干燥后得到氨基化明胶；明胶以及本步骤中合成的氨基化明胶的FTIR图谱见图4。

步骤2，按照重量计，将2份透明质酸溶于200份超纯水中，搅拌均匀，在室温避光条件下，加入1.7份氧化剂高碘酸钠配成的水溶液，按照葡萄糖单元与氧化剂的摩尔比为1:1.5进行氧化反应5h，加入1份的乙二醇终止反应1h，透析除去多余未反应的氧化剂，冷冻干燥，得到醛基化透明质酸；透明质酸以及本步骤中合成的醛基化透明质酸的FTIR图谱见图5。

步骤4，将等体积的氨基化明胶溶液与醛基化透明质酸溶液在室温下混合，向混合液中添加单宁酸，单宁酸的浓度为0.8％w/v，搅拌均匀后复合制得明胶基生物水凝胶。

实施例7

步骤1，按照重量计，将5份明胶溶于280份，0.1mol/L，pH＝5的磷酸二氢钠溶液中，40℃下加热搅拌溶解后，加入7.2份乙二胺溶液，明胶上的羧基与乙二胺的摩尔比为1:20；调节pH为5.0，然后加入2.3份羧基活化剂引发氨基化反应，其中羧基活化剂为1-(3-二甲基胺基丙基)-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐，明胶上的羧基与羧基活化剂的摩尔比为1:2，氨基化反应温度保持在37℃，反应时间为6h后，通过透析法除去未反应的乙二胺，冷冻干燥后得到氨基化明胶；明胶以及本步骤中合成的氨基化明胶的FTIR图谱见图4。

步骤2，按照重量计，将2份透明质酸溶于200份超纯水中，搅拌均匀，在室温避光条件下，加入1.7份氧化剂高碘酸钠配成的水溶液，按照葡萄糖单元与氧化剂的摩尔比为1:1.5进行氧化反应5h，加入1份的二乙二醇终止反应0.5h，透析除去多余未反应的氧化剂，冷冻干燥，得到醛基化透明质酸；透明质酸以及本步骤中合成的醛基化透明质酸的FTIR图谱见图5。

步骤4，将等体积的氨基化明胶溶液与醛基化透明质酸溶液在室温下混合，向混合液中添加单宁酸，单宁酸的浓度为3.2％w/v，搅拌均匀后复合制得明胶基生物水凝胶。

实施例8

步骤1，按照重量计，将5份明胶溶于280份，0.1mol/L，pH＝5的磷酸二氢钠溶液中，40℃下加热搅拌溶解后，加入7.2份己二胺溶液，明胶上的羧基与己二胺的摩尔比为1:20；调节pH为5.0，然后加入2.3份羧基活化剂引发氨基化反应，其中羧基活化剂为1-(3-二甲基胺基丙基)-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐与N-羟基丁二酰亚胺混合物，明胶上的羧基与羧基活化剂的摩尔比为1:2，氨基化反应温度保持在37℃，反应时间为6h后，通过透析法除去未反应的己二胺，冷冻干燥后得到氨基化明胶。

实施例9

步骤1，按照重量计，将5份明胶溶于280份，0.1mol/L，pH＝5的磷酸二氢钠溶液中，40℃下加热搅拌溶解后，加入7.2份己二酸二酰肼溶液，明胶上的羧基与己二酸二酰肼的摩尔比为1:20；调节pH为5.0，然后加入2.3份羧基活化剂引发氨基化反应，其中羧基活化剂为1-(3-二甲基胺基丙基)-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐与1-羟基苯并三氮唑水合物的混合物，明胶上的羧基与羧基活化剂的摩尔比为1:2，氨基化反应温度保持在37℃，反应时间为6h后，通过透析法除去未反应的己二胺，冷冻干燥后得到氨基化明胶。

表1.不同样品的性能汇总表

本发明提供了一种制备简单、成本低廉、具有强粘附、生物相容性、可降解性的明胶基生物医用粘合剂。本发明所选用的明胶分子链中含有羧基(-COOH)和氨基(-NH₂)等反应活性高的侧基，为进一步的改性提供了活性位点。通过引入乙二胺与明胶分子链的-COOH发生酰胺化反应，接枝上-NH₂，从而进一步增加明胶分子链上-NH₂基团含量。本发明中使用高碘酸钠作为强氧化剂将透明质酸中的顺式二醇的C＝C键醛基化；醛基化透明质酸通过席夫碱反应与氨基化明胶结合形成交联网状结构；同时通过引入富羟基的单宁酸，通过氢键作用与氨基化明胶和醛基化透明质酸结合，形成多重网络。单宁酸的引入不仅使生物医用粘合剂可在湿态环境下具有强粘附性；此外，单宁酸分子中丰富的苯环可使水凝胶具有一定的疏水性，可通过疏水缔合与湿态基质之间形成非共价键。本发明通过分子设计构筑的三元明胶基生物医用粘合剂解决了传统生物医用粘合剂的生物相容性差、粘附性能差和应用场所受限等问题，为体内应用提供一种方便可行的粘合新技术。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims

1.一种明胶基生物水凝胶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤3，将溶解有氨基化明胶的磷酸缓冲盐溶液与溶解有醛基化透明质酸的磷酸缓冲盐溶液混合，并向所述混合液中加入单宁酸，搅拌均匀后，制得所述明胶基生物水凝胶。

2.根据权利要求1所述的一种明胶基生物水凝胶的制备方法，其特征在于，所述步骤1中，所述有机胺类化合物为乙二胺、己二酸二酰肼或己二胺中的任意一种。

3.根据权利要求2所述的一种明胶基生物水凝胶的制备方法，其特征在于，所述步骤1中氨基化反应完成后，还包括采用透析法除去反应液中未反应的有机胺类化合物；所述步骤2中终止反应完成后，还包括采用透析法除去终止反应的反应液中未反应的氧化剂。

4.根据权利要求2所述的一种明胶基生物水凝胶的制备方法，其特征在于，所述步骤1中，明胶上的羧基与有机胺类化合物的摩尔比为(1:1)～(1:100)；所述明胶上的羧基与羧基活化剂的摩尔为(1:1)～(1:5)。

5.根据权利要求1所述的一种明胶基生物水凝胶的制备方法，其特征在于，所述步骤1中氨基化反应完成后，对得到的产物进行冷冻干燥，得到所述氨基化明胶；所述步骤2终止反应完成后，对得到的产物进行冷冻干燥，得到所述醛基化透明质酸。

6.根据权利要求1所述的一种明胶基生物水凝胶的制备方法，其特征在于，所述步骤1中，调节体系pH值为5.0～6.0。

7.根据权利要求1所述的一种明胶基生物水凝胶的制备方法，其特征在于，所述步骤2中，所述透明质酸分子量为40～100KDa。

8.根据权利要求1所述的一种明胶基生物水凝胶的制备方法，其特征在于，所述步骤2中，透明质酸中的葡萄糖单元与氧化剂的摩尔比为(1:1)～(1:5)。

9.一种明胶基生物水凝胶，其特征在于，采用权利要求1-8任一项所述的方法制得，所述明胶基生物水凝胶的剪切粘附力大于13KPa。

10.权利要求1-8任一项所述的制备方法制得的明胶基生物水凝胶在医用粘合剂中的应用。